雙gRNA、雙gRNA文庫、雙gRNA載體文庫及其制備方法和應用與流程

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種雙grna、雙grna文庫、雙grna載體文庫及其制備方法和應用。

背景技術：

眾所周知，蛋白質編碼基因的轉錄只占全基因組轉錄的大約2％，其余的轉錄則均為非編碼rna如microrna和lncrna的轉錄。其中，lncrna被定義為一組分子量大于200個核苷酸長度的非編碼rnas，越來越多的研究表明，lncrna可能在各種機制中作為主要基因調控者，lncrna表達的紊亂通常與多種人類疾病，如癌癥，密切相關。

到目前為止，已經有超過50,000的lncrna被發現，這比蛋白質編碼基因的數量要多得多，這也為我們人類基因組的復雜性提供了進一步證據。lncrna是新型癌癥生物標志物或治療靶點的豐富來源，而且絕大部分lncrna的生物學功能還是未知，對lncrna進行功能性研究非常重要。

目前最常用的基因功能性研究平臺是通過rna干擾(rnai)對細胞中的目標基因進行敲除，特異性剔除或關閉特定基因的表達，然后檢測干擾結果，通過分析該干擾結果了解相關基因的功能。

遺憾的是，rnai主要在細胞質中發揮功能性作用，而risc復合物也位于細胞質中。然而許多lncrna都位于細胞核中，這大大增加了通過rna干擾敲除lncrna的難度。同時，rnai存在以下不足：(1)很難進行“回復實驗”，因為外源性的配對物也受到rnai試劑的約束；(2)敲 除效率不高，極易出現高水平的假陰性表達，尤其在shrna載體中。因此尋找新的基因功能性研究方法具有十分重大的意義。

crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)是最新出現的一種由rna指導的cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術。crispr/cas9是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制，在這一系統中，crrna(crispr-derivedrna)通過堿基配對與tracrrna(trans-activatingrna)結合形成雙鏈rna，此tracrrna/crrna二元復合體指導cas9蛋白在crrna引導序列靶定位點切斷雙鏈dna。在基因組編輯過程中，tracrrna和crrna可以融合成為1條rna(singleguiderna，簡稱sgrna)表達，sgrna同樣可以起到靶向剪切的作用。sgrna的序列中含有一段固定序列(即crrna支架序列)和一段目的dna識別序列，其中目的dna識別序列可與目的基因兩條鏈中的其中一條進行堿基互補配對，而固定序列則用于招募cas9核酸酶。

鑒于crispr/cas9系統的高效性，針對蛋白質編碼基因的敲除是比較容易的，因為一個微小的堿基缺失或插入就可以破壞開放閱讀框，從而導致功能性基因產物的不表達。然而，非編碼基因尤其是lncrna的情況則十分不同，一個小的堿基缺失或者插入不一定會導致lncrna功能缺失，如何對crispr/cas9基因編輯技術進行進一步改進、以實現對包括lncrna在內的所有基因或遺傳元件的高效敲除是目前研究需要思考和解決的問題。

技術實現要素：

本發明提供了一種雙grna，該雙grna比sgrna分子具有更高的敲除效率。

一種雙grna(dualgrna)，由第一啟動子、grna-a、crrna支架序列、第二啟動子和grna-b順次連接而成。一個雙grna分子靶向作用于相同的基因或遺傳元件，其中，grna-a和grna-b分別由不同的啟動子控制其獨立表達，并分別與同一靶基因上的兩個靶位點互補配對。從而該雙grna能夠招募cas9核酸酶在兩個sgrna作用位點對靶基因進行剪切，大大提高了靶基因的敲除效率。

本發明還提供了一種雙grna文庫，該雙grna文庫包括針對靶基因的多個雙grna，所述雙grna的序列結構為：第一啟動子-(grna-na)-crrna支架序列-第二啟動子-(grna-nb)；

其中，n表示雙grna的個數，n為≥1的整數。

同一雙grna文庫中的雙grna可以是僅針對一個靶基因設計的，也可以是針對多個靶基因設計的若干個雙grna集的組合，一個雙grna集針對一個靶基因。

本發明中，所述第一啟動子和第二啟動子為互不相同的聚合酶iii啟動子，如h1啟動子或u6啟動子。

本發明還提供了一種雙grna載體文庫，該載體文庫由所述雙grna文庫與載體連接而成。本發明對載體無特殊要求，只要能夠順利轉染細胞，使雙grna能夠在細胞內表達即可。

作為優選，所述載體上帶有報告基因或抗性基因。報告基因或抗性基因有利于挑取靶基因被敲除的陽性克隆。

由于人工合成只能一次性獲得長度大約為200nt的混合寡核苷酸，而本發明的雙grna[第一啟動子-(grna-a)-crrna支架序列-第二啟動子-(grna-b)]的總長度超過400nt，難以一次性合成獲得。

因此，本發明還提供了一種所述雙grna載體文庫的構建方法，該構建方法包括：

(1)針對一個雙grna作用位點，合成序列結構為“pcr擴增短序列i-(grna-a)-間隔序列-(grna-b)-pcr擴增短序列ii”的單鏈寡核苷酸，其中，間隔序列的兩端均帶有ii類限制性內切酶的酶切位點；

其中，所述酶切位點可以是bsmbi、sapi、bsai；

所述pcr擴增短序列i的堿基序列為(如seqidno.1所示)：

5’-gtatgagaccacttggatcc-3’；

所述pcr擴增短序列ii的堿基序列為(如seqidno.2所示)：

5’-ccttattttaacttgctatt-3’；

將針對同一靶基因合成的所有單鏈寡核苷酸等量混合，或者，將針對所有靶基因合成的單鏈寡核苷酸等量混合，獲得混合單鏈寡核苷酸庫；

上述混合單鏈寡核苷酸庫可以由美國customarray公司通過“定制芯片”的方法合成；

(2)以步驟(1)中的混合單鏈寡核苷酸庫為模板，利用相應的引物進行pcr擴增，獲得混合雙鏈寡核苷酸庫；

上下游引物分別與單鏈寡核苷酸中的pcr擴增短序列i和pcr擴增短序列ii相結合，擴增獲得混合雙鏈寡核苷酸庫；通過pcr擴增不僅可以獲得雙鏈寡核苷酸，以便后續連入載體中，而且能增加單鏈寡核苷酸的克隆數。

(3)取經ii類限制性內切酶線性化的載體，將步驟(2)中的混合雙鏈寡核苷酸庫連入該載體的第一啟動子下游，獲得前期文庫；

本步驟中的ii類限制性內切酶可以與步驟(1)相同，也可以不同，只要該ii類限制性內切酶能夠在步驟(1)所述的酶切位點進行剪切即可。

本發明對第一啟動子、第二啟動子的來源均無要求，第一啟動子可以是載體自身帶有的，也可以是重組到載體上的外源性第一啟動子。

(4)合成序列結構為“pcr擴增短序列i-crrna支架序列-第二啟動 子-pcr擴增短序列ii”的單鏈寡核苷酸庫；

其中，所述crrna支架序列的堿基序列為(如seqidno.3所示)：

5’-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc-

-gttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct-3’；

本步驟中，pcr擴增短序列i和pcr擴增短序列ii的堿基序列與步驟(1)中相同；

(5)以步驟(4)中的單鏈寡核苷酸庫為模板，利用相應的引物進行pcr擴增，獲得雙鏈寡核苷酸庫；

(6)在ii類限制性內切酶存在下，通過gibson組裝法將步驟(5)中的雙鏈寡核苷酸庫連入步驟(3)中的前期文庫中，獲得所述雙grna載體文庫。

本步驟中的ii類限制性內切酶可以與步驟(1)相同，也可以不同，只要該ii類限制性內切酶能夠在步驟(1)所述的酶切位點進行剪切即可。

ii類限制性內切酶在前期文庫中的間隔序列兩端進行酶切，從而步驟(5)的雙鏈寡核苷酸庫能連入間隔序列所在位置，獲得具有完整雙grna序列結構的雙grna載體文庫。

鑒于本發明的雙grna對靶基因優異的靶向敲除性能，本發明還提供了所述雙grna載體文庫在基因敲除中的應用。

并且，本發明的雙grna載體文庫尤其適用于lncrna的敲除。

對此，本發明提供了兩種利用所述雙grna載體文庫敲除lncrna的策略：

①對于序列連貫的lncrna，針對該lncrna兩端設計grna-a和grna-b，構建雙grna載體文庫，并利用該雙grna載體文庫轉染或感染細胞，對細胞內的靶lncrna進行敲除；

②對于序列中插入有其他基因或遺傳元件的lncrna，以該lncrna 中第一個外顯子及其上游的啟動子作為靶點，設計grna-a和grna-b，構建雙grna載體文庫，并利用該雙grna載體文庫轉染或感染細胞，對細胞內的靶lncrna進行敲除。

本發明還提供了一種用于研究相應基因功能的基因敲除細胞文庫，該基因敲除細胞文庫是通過向穩定表達cas9核酸酶的細胞中轉染或感染所述雙grna載體文庫獲得的。

雙grna載體文庫轉染或感染至穩定表達cas9核酸酶的細胞內后，能夠招募cas9核酸酶將與雙grna相對應的靶基因敲除，靶基因被敲除后的細胞表現型發生改變，從而可以用于確定靶基因功能。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

(1)與grna相比，本發明的雙grna中，grna-a和grna-b分別由不同的啟動子控制其獨立表達，并分別與靶基因上的兩個靶位點互補配對，這使得該雙grna能夠招募cas9核酸酶在兩個grna作用位點對靶基因進行剪切，對于蛋白編碼基因敲除效率可達100％，而grna的敲除效率最高只能達到66.7％；

(2)與sirna、shrna相比，本發明的雙grna可以回復實驗，驗證敲除基因的功能。

附圖說明

圖1為本發明雙grna載體文庫的構建流程圖；

其中，h1、u6分別表示h1、u6啟動子，lenti-hygro表示lenti-hygro載體，cutwithbsmbi表示用限制性內切酶bsmbi對lenti-hygro載體進行剪切，hygro表示潮霉素抗性基因，scaffold表示支架，firststepcloning表示第一步克隆，spacer表示間隔序列，grna1、grna2分別表示一條sgrna，secondstepcloning表示第二步克隆，lenti-dual grna-hygro-prelibrary表示前期文庫，lenti-dualgrna-hygro-library表示雙grnas載體文庫；下同；

圖2為雙grna對lncrna的敲除機制示意圖；

其中，lncrna表示長片段非編碼rna，grna-1、grna-2分別表示一條sgrna，flanking表示側翼(序列或區域)，1^stexon表示第一個外顯子，lastexon表示最后一個外顯子，myc表示myc基因，hcas9表示人類密碼子優化的cas9核酸酶基因，nls表示核定位信號，deleted表示原lncrna已被雙grna敲除；下同；

圖3為sgrna和雙grna的基因敲除效率比較結果；

其中，singlegrna表示單條sgrna，dualgrna表示兩條sgrna即雙grna，ef1表示啟動子，e1、e2、e3分別表示uca1基因的三個外顯子，marker表示dna分子量標準，vector表示載體，uca1ko(2、4、14、16、19)表示uca1基因被singlegrna敲除的克隆(克隆編號為2、4、14、16、19)，uca1ko(3、5、12、17)表示uca1基因被dualgrna敲除的克隆(克隆編號為3、5、12、17)，genomicpcr表示基因組dna的pcr結果；下同；

圖4為不同敲除策略下雙grna對長lncrna的敲除效率比較結果；

其中，chr8表示8號染色體，1～8表示ptv1基因上的八個外顯子、且第3～5個外顯子分別是mir-1205,1206,1207，exon1、exon8表示第1、8個外顯子，e1ko表示ptv1基因第1個外顯子被敲除的克隆，e1+pko表示ptv1基因第1個外顯子及其上游啟動子區域被敲除的克隆，relativepvt1level(％)表示ptv1基因的相對表達水平(％)；

圖5為雙grna對ak023948基因的敲除效果圖；

其中，ak023948ko(#13、#28、#32)表示ak023948基因被敲除的克隆(克隆編號為#13、#28、#32)，relativeak0level(％)表示ak023948 基因的相對表達水平(％)。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發明的技術方案作進一步詳細說明。

實施例1雙grna載體文庫的構建

在非編碼數據庫(www.http://noncode.org/)中列出的lncrna超過50000，原則上本發明雙grna載體文庫的構建沒有數量上限，但考慮到當前美國customarray公司通過“定制芯片”的方法合成單鏈寡核苷酸的數量上限，我們從中篩選除了大約45000條可以適用于sgrna標記的lncrna，為每個lncrna設計了兩個雙grna，以構成總數為9000的雙grnako文庫。此外，還設置了100個非人類基因陰性對照雙grna。

本實施例雙grnako文庫的構建方法(構建流程如圖1所示)包括：

(1)制備混合單鏈寡核苷酸庫

委托美國customarray公司(http://www.customarrayinc.com/)通過“定制芯片”的方法合成相應的單鏈寡核苷酸，獲得混合單鏈寡核苷酸庫；

(2)制備混合雙鏈寡核苷酸庫

以混合單鏈寡核苷酸庫為模板，利用引物進行pcr擴增：

在1ml管中依次加入：5×pcr反應緩沖液80μl、dntp混合物(10mm)8μl，phusion聚合酶(2u/μl)2μl，h1-5.1引物(10μm)10μl，scaffold-adaptor引物(10μm)10μl，模板(80ng/μl)2μl，加去離子水至總體積為400μl。

其中，h1-5.1引物(如seqidno.4所示)即結合在前文所述“pcr擴增短序列i”位置處，scaffold-adaptor引物(如seqidno.5所示)即 結合在前文所述“pcr擴增短序列ii”位置處。兩者的堿基序列分別為：

h1-5.1引物：5’-gtatgagaccacttggatcc-3’；

scaffold-adaptor引物：5’-ccttattttaacttgctatt-3’。

將pcr反應體系混勻后稍離心，分裝至8個pcr管中(50μl/tube)，在pcr儀中進行擴增反應，反應參數為：98℃1min，1個循環，98℃0.5min，42℃1min，72℃0.5min，循環33個，72℃4min，1個循環，4℃保存。

采用美國zymoresearch公司純化試劑盒對pcr產物進行純化：

對于每200μlpcr溶液，加入1ml連接緩沖液，轉移到純化柱中，離心機(eppendoff)15,000rpm離心0.5min。丟棄離心液，加200μlwashbuffer,15,000rpm離心0.5min；加200μlwashbuffer,15,000rpm離心1min，將離心柱轉移至一個新管中，加40μl水至柱中，15,000rpm離心1min，保存洗脫液(即為混合雙鏈寡核苷酸庫)，用于后續第一步克隆。

(3)載體的制備

用bsmbi(美國neb公司)消化lenti-hygro載體。消化體系為：buffer3.110μl，lenti-hygro載體2μg，bsmbi(10units/μl)2μl，加水至100μl，55℃消化3小時。

1％瓊脂糖凝膠，80恒定電流30min，分離消化后的dna(用美國zymoresearch公司dna割膠回收試劑盒)，切割線性dna條帶，在1.5ml管中，加入溶膠液(zymoresearch)，每100μg膠加300μl溶膠液，55℃約5min、或者直至膠全部溶解。轉移至純化柱，離心機(eppendoff)15,000rpm離心0.5min，加200μlwashbuffer,15,000rpm離心0.5min；加200μlwashbuffer,15,000rpm離心1min；將離心柱轉移至一個新管中，加40μl水至柱中，15,000rpm離心1min，保存洗脫液，用于第一步克隆。

(4)第一步克隆(制備前期文庫)

在管中加入4μlpcr產物(即混合雙鏈寡核苷酸庫)，4μllenti-hygro載體/bsmb1，2μlcoldfusion(sbi)，室溫下靜置混合5min，轉移到冰上靜置10min后加入50μl感受態細胞(10g購自美國lucigen公司)，在冰上放30min，42℃水浴1min，再轉移到冰上靜置2～5min，加500μllb培養基，于37℃、250rpm下震蕩培養60min，取250μl平鋪在氨芐青霉素(100μg/ml)lb平板上，在37℃下孵育過夜，第二天計克隆數。

根據文庫的大小，我們需要5～10倍的覆蓋范圍，即10000個雙grna庫，我們需要50,000到100,000的克隆。

用美國的zymoresearch公司的質粒提取試劑盒分離含有雙grna表達載體的轉化細菌中的質粒，提取步驟為：

前期文庫dna2μg，10xbuffer3.1(美國neb公司)10μl，bsmbi(10units/μl)2μl,加水至100μl，55℃消化3小時。

1％瓊脂糖凝膠，80恒定電流30min，分離消化后的dna(用美國zymoresearch公司dna割膠回收試劑盒)，切割線性dna條帶，在1.5ml管中，加入溶膠液((zymoresearch)，每100μg膠加300μl溶膠液，55℃約5mins或者至膠全部溶解。轉移至純化柱，離心機(eppendoff)15,000rpm離心0.5min，加200μlwashbuffer,15,000rpm離心0.5min；加200μlwashbuffer,15,000rpm離心1min；將離心柱轉移至一個新管中，加40μl水至柱中，15,000rpm離心1min，保存洗脫液(質粒dna，即前期文庫)用于第二步克隆。

(5)scaffold-u6片段的制備

在管中依次加入5×pcr反應緩沖液80μl，支架-u6的上游引物(scaffold-u6-5.1：5’-gttttagagctagaaat-3’)(如seqidno.6所示)和下游引物(scaffold-u6-3.1：5’-acggtgtttcgtcctttc-3’) (如seqidno.7所示)各10μl(10μm)，dntp混合物(10mm)8μl，帶有scaffold-u6的質粒(100ng/μl)1μl(委托美國genscript公司合成)，phusion聚合酶(2u/μl)2μl，加去離子水至總體積為400μl。混勻后稍離心分裝分裝至8個pcr管中，每個管50μl，在pcr儀中進行擴增反應，pcr反應參數為：98℃1min，1個循環，98℃0.5min，42℃1min，72℃0.5min，循環33個，72℃4min，1個循環，4℃保存，備用。

(6)第二步克隆

在管中加入4μlpcr產物(scaffold-u6片段)，4μl用bsmbi酶切的前期文庫，2μlcoldfusion(sbi)，室溫下靜置5min后轉移到冰上靜置10min；加入50μl感受態細胞(10g購置美國lucigen公司)，在冰上放30min后42℃下水浴1min，再轉移到冰上靜置2～5min，加入500μllb培養液，于37℃、250rpm下震蕩培養60min，取250μl培養液平鋪在氨芐青霉素(100μg/ml)lb平板上，在37℃孵育過夜，第二天數克隆數。

根據文庫的大小，我們需要5～10倍的覆蓋范圍，即10000個雙grna庫，我們需要50,000到100,000的克隆。

用美國的zymoresearch公司的質粒提取試劑盒分離含有雙grna表達載體的轉化細菌中的質粒(即雙grna載體文庫)，純化保存，用于后續包病毒用。

雙grna載體文庫可以用于篩選在基因調控與疾病進程中發揮顯著作用的必需基因，也可以用于鑒定必不可少的編碼基因或者其他遺傳元件的功能。

雙grna對lncrna的敲除機制如圖2所示。

實施例3singlegrna和雙grna的基因敲除效率比較

本實施例以帶有3個外顯子的uca1基因為例，比較sgrna和雙 grna的基因敲除效率(如圖3)。

(1)雙grna的基因敲除效率

以uca1基因作為靶基因，在靶基因上選擇靶位點(如圖3中d部分所示)，設計uca1-dualgrna，uca1-dualgrna中兩條grna的正義鏈的堿基序列分別為：

uca1-grna1(seqidno.8)：5’-gtgcatggtggagagatgat-3’；

uca1-grna2(seqidno.9)：5’-ttctggaatggtgaacccaa-3’；

委托美國genscript公司構建含有hcas9和uca1-dualgrna的表達載體(每個dna含量均為0.5μg)，并利用該表達載體對293t細胞進行轉染敲除，敲除步驟如下：

1)傳代293t細胞，并保持細胞密度大約30％，37℃過夜；

2)含hcas9和uca1-dualgrna的表達載體(如圖3中b部分所示)在6孔板中用轉染試劑如dnafectin(美國abm公司)或者lipofectin(美國thermofisher公司)轉染細胞；

3)轉染后6小時換血清培養基；

4)第二天，通過facs細胞分選儀分離單個細胞；

5)在96孔板中讓單個細胞生長10日左右；

6)轉移克隆到24孔板生長5天以上；

7)用美國viagenbiotech公司試劑盒分離uca1敲除克隆的基因組dna：

a)在10cm平板細胞加200-300μldirectpcr裂解試劑(cell)，同時加新鮮配制0.2～0.4mg/ml的蛋白酶k(sigma)；55℃水浴旋轉管1小時，或觀察直到無團塊；85℃水浴裂解45分鐘。離心10秒，-20℃保存；

b)取0.5μl裂解液作為模板，進行pcr反應，反應體系包含：10×pcr反應緩沖液1μl，上游引物(uca1-inside-5.3：5’-ccttaactaattaac- -ccacc-3’)(如seqidno.10所示)和下游引物(uca1-inside-3.3：5’-aagagagtcagcgaagggag-3’)(如seqidno.11所示)各0.5μl(10μm)，dntp混合物(10mm)0.2μl，dmso0.3μl，taq聚合酶(美國neb公司)(2u/μl)0.2μl，加去離子水6.8μl至總體積為10μl；

c)在pcr儀中進行dna擴增反應，pcr反應參數為：94℃1min，1個循環，94℃0.5min，55℃0.5min，72℃0.5min，循環33個，72℃10min，1個循環，4℃保存；

d)反應結束后取4μl反應液，進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測uca1的缺失狀況(如圖3中f部分所示)。

(2)singlegrna的基因敲除效率

以uca1基因作為靶基因，在靶基因上選擇靶位點(如圖3中c部分所示)，設計uca1-grna，uca1-grna與上述uca1-grna1相同。

采用與本實施例第(1)部分相同的方法構建含hcas9和uca1-grna的表達載體(如圖3中a部分所示)，利用該表達載體轉染目標細胞，分離uca1敲除克隆的總rna進行rt-pcr，檢測uca1的表達量(如圖3中e部分所示)。

rt-pcr的步驟為：

a)rna的提取：用direcozoltmrnamin/prep試劑盒提取293t細胞中的rna，24孔每孔加500μl(trlreagent)(cat.r2050-100)樣品需放冰上；

b)冰凍樣品需用槍頭混合，加入等量的95％乙醇混勻；

c)將混合液移入專用(zymo-spin)iic柱子，13500rpm離心1min，將離心柱換到新的收集管；

d)加400μldirecozoltmrnaprewash到(zymo-spin)iic柱子，.13500rpm離心1min；

e)重復步驟d)；

f)加700μlrnawashbuffer到(zymo-spin)iic柱子，13500rpm離心1min。丟去離心液，13500rpm空離心2min；

g)加25μldnease/rnaeasefreewater到(zymo-spin)iic離心柱，13500rpm空離心1min；

h)利用核酸儀nanodrop2000c測rna濃度(美國thermoscientific公司)；

i)逆轉錄：所用試劑均放冰上，逆轉錄體系：rna0.5μg，隨機引物(randomprimermix#s1330s)0.5μl，depch2o加至7μl，pcr儀70℃10minutes后放冰上；

j)rt-每個樣本加以下：thermoscicentiitic5xfirststandbuffer(lot00168122)2μl，dntp(signadeoxynuclrotidemix,lotsusf-45360us)0.5μl，rnaseinhibitor(munne#mo314l)(lot10081460)0.25μlrevertaidrt(revertaid.lt00205481)reversetanscrripatse#epo4410.25μl，混勻，反應參數設置為25℃10min，37℃1hour,70℃10min(eppendorforbio-radt100thermalcycler)，得到模板cdna；

k)qpcr：在新的0.2mlpcr反應管中依次加入10μlreal-timepcrmastermix，0.4μl50×roxreference，相應的pcr正向和反向引物(10μm)各0.4μl，2μl模板cdna(上面逆轉錄步驟所得)和6.8μl去離子水；混勻后進行pcr反應，反應條件為：95℃3min，循環條件為95℃10s和60℃0.5min，65℃0.05s，共39個循環，每個樣本重復3次，通過該反應可得uca1基因敲除后的表達量。

由圖3可見，在隨機選取的uca1敲除克隆中，經uca1-grna敲除的uca1敲除克隆中還含有uca1基因，而經uca1-dualgrna敲除的uca1敲除克隆中則檢測不到uca1基因，表明雙grna比sgrna具有 更高的敲除效率。

實施例3雙grna對長lncrna的敲除策略

當lncrna基因太長時，一些其他的基因如microrna將插入到其中。比如pvt1基因有8個外顯子，而且其基因區間長度超過200kb(chr8:128,902,874-129,113,499)，三個micrornas(mir-1205～1207)都位于這段區域內(如圖4中a部分)。如果采用與實施例3相同的敲除策略將這段超過200kb區域全部剪切掉，可能也會將這三個micrornas以及其他一些潛在的基因或者基因元件同時刪減掉，這將導致我們無法明確地判斷剪切后的表現型到底是跟pvt1有關還是跟其他因素有關。

因此，針對pvt1基因設計了兩種敲除策略：

(1)采用與實施例3相同的方法設計用于剪切pvt1基因第一個外顯子的雙grna(如圖4中b部分)；

(2)采用與實施例3相同的方法設計用于剪切pvt1基因第一個外顯子以及第一個外顯子轉錄上游1.1kb區域的雙grna(如圖4中c部分)；

采用與實施例3第(1)部分相同的方法，分別構建含hcas9和pvt1-dualgrna(grna1-grna2)的表達載體、含hcas9和pvt1-dualgrna(grna1p-grna2)的表達載體，并分別利用這兩種表達載體轉染目標細胞，分離ko克隆的基因組dna進行pcr，檢測ko克隆中pvt1基因的缺失情況(如圖4中c、d部分所示)。

由圖4可見，第一種敲除策略雖然將pvt1基因的第一個外顯子敲除了，但pvt1基因的其他外顯子仍舊表達。而第二種敲除策略將pvt1基因的第一個外顯子以及第一個外顯子轉錄上游1.1kb區域敲除了之后，則沒有檢測到外顯子1和外顯子8的表達。

這是因為與蛋白質編碼基因類似，絕大多數lncrna是通過rna聚 合酶ii轉錄的。雖然啟動子可能包含一個非常大的區域，但是一些增強區域和基本轉錄元件都是位于轉錄上游500bp區間之內的。為了保險起見，我們設計了帶有從1kb～轉錄上游的sgrna1p。例如，pvt1的grna1p在1.1kb區域而grna2位于第一個外顯子底端，總共包含了長達1.5kb區域。從而含有grna1p-grna2的雙grna能夠完成對pvt1整個轉錄的敲除。

另外，含有grna1p-grna2的雙grna對于mir-2015～mir-2017沒有任何影響，顯示了它們可能有相應的啟動子。

實施例4雙grnako文庫的應用

雖然在各種生理和病理條件下已經越來越多地認識到長非編碼rna(lncrna)的作用，但是大量lncrna在乳腺癌的潛在作用還鮮為人知。我們通過rt-pcr研究了lncrna的表達譜，確定了一組分別為相對于正常乳腺組織中的患者乳腺癌組織差異表達的lncrna。其中，ak023948在乳腺癌中上調，同時在乳腺癌細胞系(mcf-7和mda-mb-231)中相比于人乳腺上皮細胞(hmle)中也上調，這個結果我們也通過乳腺癌組織芯片原位雜交得到了進一步驗證。

本實施例以ak023948作為靶基因，在靶基因上選擇靶位點(如圖5中a部分所示)，設計ak023948-dualgrna，ak023948-dualgrna中兩條grna的正義鏈的堿基序列分別為：

ak023948-grna1(如seqidno.12所示)：

5’-gagttttagtcacctatcta-3’；

ak023948-grna2(如seqidno.13所示)：

5’-ggtgatccttgtgcacggcc-3’；

采用與實施例3第(1)部分相同的方法，分別構建含hcas9和 ak023948-dualgrna的表達載體，并利用該表達載體轉染目標細胞，分離ko克隆的基因組dna進行pcr，檢測ko克隆中ak023948基因的缺失情況(如圖5中b部分所示)；同時采用與實施例3第(2)部分相同的方法，分離ko克隆的總rna，進行rt-pcr驗證相應ko克隆中ak023948基因的缺失情況(如圖5中c部分所示)。

由圖5可見，采用本實施例雙grna能夠完全敲除ak023948基因。