一種AMY2B信使RNA的特異性擴增引物和肝癌輔助診斷試劑盒的制作方法

本發明涉及生物技術及醫學領域，更具體地，涉及一種amy2b信使rna的特異性擴增引物，和包括該特異性擴增引物的肝癌輔助診斷試劑盒。

背景技術：

肝細胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是肝臟最常見的原發性惡性腫瘤，在世界癌癥相關性死因中排第三位。目前公認能治愈肝癌的手段只有手術，包括肝部分切除術及肝移植。而手術成功率及術后腫瘤復發率與腫瘤的臨床分期密切相關，腫瘤體積的大小和生長的部位是影響手術難度和風險的決定性因素。因此盡早發現肝癌是治療肝癌的關鍵。而目前臨床上發現早期肝癌是很困難的。一方面，早期肝癌癥狀不典型，當出現疼痛、黃疸、肝功能不全等臨床表現時多已處于中晚期。另一方面，肝癌篩查手段匱乏。臨床上目前用于篩查肝癌的方法有影像學檢查(超聲波，ct，mri)及甲胎蛋白(afp)血液檢測。但是這些手段的敏感性及特異性都不能令人滿意。因此，發明一種敏感性高、特異性好且操作方便的檢查手段很有必要。

技術實現要素：

本發明的目的是針對上述臨床需求，提供一種amy2b信使rna的特異性擴增引物以及包括該特異性擴增引物的肝癌輔助診斷試劑盒。

本發明的發明人在研究中發現amy2b基因(cdna序列為seqidno：1)在晚期肝癌患者中顯著下調，用rt-pcr技術在早期肝癌病人標本中驗證得知，amy2b的表達量在肝癌早期中也有部分降低。進一步分析肝 癌患者預后生存期發現，低表達amy2b的患者生存期顯著縮短。

基于上述發現，本發明的第一方面是提供一種amy2b信使rna的特異性擴增引物，該特異性擴增引物包括：

正向引物：5’-atcaacctagccatccaacct-3’(seqidno：2)；

反向引物：5’-aaccgaattttcaattgttttcaca-3’(seqidno：3)。

本發明的第二方面是提供一種肝癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒包括：

(1)上述amy2b信使rna的特異性擴增引物；

(2)pcr反應用酶和試劑，和/或參照基因標志物的信使rna的特異性引物。

所述參照基因標志物優選為hprt。參照基因的選擇基于國際腫瘤研究權威雜志journalofcancerresearchandclinicaloncology在2008年的研究文章：selectionofreferencegenesforreal-timepcrinhumanhepatocellularcarcinomatissues。該文章的作者為：gaoq1,wangxy,fanj,qiusj,zhouj,shiyh,xiaoys,xuy,huangxw,sunj。

參照基因hprt的信使rna的特異性引物可以為常規的用于驗證hprt的特異性引物，優選為：

正向引物：5’-cctggcgtcgtgattagtgat-3’(seqidno：4)；

反向引物：5’-agacgttcagtcctgtccataa-3’(seqidno：5)。

根據本發明，所述pcr反應用酶和試劑優選為用于pcr反應的各種常規試劑，包括但不限于：taq酶、4×dntp混合液、mgcl2溶液和去離子水。

優選地，所述試劑盒還包括：標準品amy2b基因序列。

優選地，所述試劑盒還包括：對照品hprt基因序列。

通過分析肝癌患者組織樣品及正常組織的amy2b的信使rna的豐度，發現amy2b的豐度與肝癌的病理級別和預后生存高度關聯，并研制出可便于臨床應用的肝癌輔助診斷試劑盒，為肝癌的診斷提供分子指標的 支持，并為臨床用藥提供指導信息。

本發明的效果如下：

(1)利用qpcr進行腫瘤標志物的檢測具有非常高的敏感性和特異性，而且定量精確，有助于肝癌的輔助診斷，也為其他疾病的生物標志物提供借鑒，同時amy2b的表達量為臨床上判斷患者病程提供信息支持。

(2)利用大樣本量的生物組織庫，驗證了本發明試劑盒的有效性，并且對肝癌病人預后生存狀況進行了分析，證明了本發明試劑盒能夠有效地預測病人的生存期長短。為臨床檢測病人康復情況和制定個性化治療方案提供了幫助。

本發明的其它特征和優點將在隨后具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

通過結合附圖對本發明示例性實施方式進行更詳細的描述。

圖1為人類amy2b的基因圖譜。

圖2顯示利用本發明的試劑盒對肝癌和正常肝臟樣本中amy2b信使rna的擴增情況。

圖3顯示利用本發明的試劑盒檢測肝癌樣本中amy2b的表達量情況，并分析病人的病理進程。其中，p表示差異的統計學檢驗，采用t檢驗。

圖4顯示利用本發明的試劑盒檢測肝癌樣本中amy2b的表達量情況，并以此為依據分析病人的預后以及生存期限。其中，橫軸表示病人生存時間(天)，p表示差異的統計學檢驗，采用logrank檢驗。

具體實施方式

本發明的肝癌輔助診斷試劑盒的研制過程包括：(1)系統收集病人肝癌組織和臨床資料，并長時間跟蹤病人預后情況；(2)研究肝癌組織中amy2b信使rna的豐度與臨床指標和病人預后生存之間的關聯；(3)建 立數學模型，驗證amy2b信使rna的豐度用于臨床診斷的可重復性；(4)研制基于amy2b的肝癌輔助診斷試劑盒。

在上述步驟(3)中，amy2b信使rna的豐度采用qpcr進行檢測，具體的操作步驟為：

(1)分離純化肝癌組織樣品中的總rna；

(2)將步驟(1)的總rna逆轉錄成cdna；

(3)在熒光實時定量pcr儀上將amy2b和參照基因進行擴增檢測；

amy2b信使rna的特異性擴增引物為：

正向引物：5’-atcaacctagccatccaacct-3’(seqidno：2)；

反向引物：5’-aaccgaattttcaattgttttcaca-3’(seqidno：3)。

參照基因hprt的信使rna的特異性引物為：

正向引物：5’-cctggcgtcgtgattagtgat-3’(seqidno：4)；

反向引物：5’-agacgttcagtcctgtccataa-3’(seqidno：5)。

上述步驟均可以為本領域常規實驗步驟。

例如，步驟(1)的具體操作步驟包括：

a.組織勻漿：在液氮浴中把組織標本研磨為粉狀，加入適量trizol試劑，轉移至1.5mleppendorf管中，放置室溫下5分鐘。

b.每ml組織研磨液中加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15秒，室溫下靜置3分鐘，之后放入離心機，12000g離心15分鐘。

c.小心移取上清至新管，加入相同體積的異丙醇，顛倒混勻。4℃下靜置15分鐘，之后7500g離心15分鐘。

d.移棄上清，加入1ml75％乙醇，7500g離心5分鐘。

e.空氣干燥rna沉淀10分鐘，用20μldepc水溶解沉淀。

f.用紫外分光光度計檢測od260和od280的值。

步驟(2)的具體操作包括：

將步驟(1)提取的1μg總rna溶解于14μldepc水中，加入2μl10×緩沖液、2μl10mmdntp混合液、1μloligo(dt)18引物(0.5μg/ul)和1μl逆轉錄酶，輕微震蕩。42℃孵育60分鐘，置于95℃3分鐘。冰上冷卻之后短暫離心，加入380μl去離子水，備用。

步驟(3)的具體操作包括：

采用12μl反應體系，每個樣本設置3個重復管，以保證結果的可靠性。sybrgreen聚合酶鏈式反應體系6μl，正反向引物各1μl，步驟(2)的反應產物4μl。擴增程序為：94℃，5分鐘，(94℃，15秒；60℃，60秒)×40個循環。在熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應。

圖2顯示了利用本發明的試劑盒對肝癌和正常肝臟樣本中amy2b信使rna的擴增情況。驗證了本發明的試劑盒對肝癌樣品檢測的有效性。從結果可以看出，本發明的試劑盒可以有效檢測肝癌組織樣品中amy2b信使rna的豐度，依據擴增曲線可以計算出amy2b信使rna的相對量。

為了繼續評估本發明在肝癌臨床輔助診斷中的價值，發明人運用本試劑盒對臨床收集的369例肝癌樣品和50例癌旁正常組織樣品進行了檢測。其中，50例癌旁組織樣品作為對照組。

首先比對了本試劑盒的檢測結果和肝癌臨床病理分級的結果。如圖3所示，在肝癌早期病人中，amy2b信使rna的豐度略有下調但不明顯；而在肝癌晚期病人中，amy2b信使rna的豐度降低了一倍以上，并在統計學上表現出極高的顯著性。這一結果提示，監測amy2b信使rna的豐度可以用來輔助判斷肝癌病人的疾病發展狀況，對于出現amy2b信使rna的豐度下降的病人要予以密切關注和積極治療。

發明人還比較了本試劑盒的檢測結果和肝癌病人的預后評估。如圖4所示，依據369例肝癌病人的監測結果將病人分為amy2b信使rna高水平組和低水平組。我們發現，amy2b信使rna高水平組的生存預期顯著優于低水平組，前者的5年生存率是后者的1.6倍，前者的中位生存時間是 后者的2倍以上。該結果顯示，用本發明的試劑盒對肝癌病人的預后生存評估具有十分重要的參考價值，可以提示病人的生存預期。

以上已經描述了本發明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本技術領域的普通技術人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。