一種用于3D打印的生物墨水材料及其制備方法和應用與流程

本發明涉及一種生物墨水，尤其是涉及一種用于3D打印的生物墨水材料及其制備方法和應用。

背景技術：
3D打印技術用于臨床醫療的案例已不再罕見，該技術與醫療的結合方式主要有以下幾種：①術前診斷及手術預演模型；②植入物制備(骨骼、牙齒、軟組織器官等)；③外用醫療耗材(頜面塑形支具等)。目前硬組織支架如骨、牙齒的打印技術目前已較為成熟，但軟組織支架的打印仍有待進一步完善。現有可供軟組織打印的生物墨水多為高分子水凝膠，包括人工合成高分子材料及膠原等天然水凝膠：(1)合成凝膠如聚富馬酸二羥丙酯(PPF)、聚D，L-丙交酯(PDLLA)、聚ε-己內酯(PCL)、聚碳酸酯等作為打印墨水使用時成型速度快，但配制時需加入光敏樹脂(主要由齊聚物、活性單體、光引發劑及其他助劑)，因此安全性尚需進一步謹慎評估；(2)天然水凝膠如明膠、明膠-殼聚糖、明膠-藻酸鹽、藻酸鹽等具有良好的生物相容性以及與人體軟組織相似的生物力學性質。使用這些材料進行3D打印可獲得大小在微米級別的彼此連通的孔隙結構。但圍繞著這些材料開展的進一步研究結果顯示：①打印支架對細胞的分化促進作用較弱；②接種于打印支架上的細胞在整個培養過程中都僅在原位生長，無法進一步與支架結合并降解支架。這些細胞與生物墨水、支架作用不良的問題，可能是由于3D打印精度僅在微米級別，無法重現ECM的納米級結構所導致的(該結構對細胞的表型、功能具有至關重要的作用)。另外，豬、牛或羊的真皮結構與人相似，脫細胞處理后形成的真皮基質免疫原性低，可用于臨床，但其內部纖維排列過于致密，材料營養滲透差，細胞化、血管化速度慢，移植成活率低，僅能作為創面臨時覆蓋物應用，無法作為軟組織支架用于組織工程材料構建。綜上所述，現有技術中的生物3D軟組織打印技術尚不成熟，不能滿足臨床需要。

技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明的目的之一旨在提供一種用于3D打印的生物墨水材料，該生物墨水材料在打印過程中容易擠出，不會堵塞打印針頭，擠出后又容易定型；而且它在生物體內抗原性小，引起排斥反應小，具有生物降解性，對機體本身無毒害，安全性高。本發明的目的之二旨在提供一種用于3D打印的生物墨水材料的制備方法以及打印后的定型加固方法本發明的目的之三旨在提供一種用于3D打印的生物墨水材料的應用，用于制作3D打印軟組織支架。為實現上述目的，本發明的第一個目的采用如下技術方案：一種用于3D打印的生物墨水材料，其特征在于，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子5％-18％水或者預交聯劑76％-93.5％促凝劑1.5％-6％。上述原料的質量濃度百分比之和為100％。且上述生物墨水材料打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。作為優選，所述生物大分子為豬、牛或羊真皮源性細胞外基質(Extralcellularmatrix，ECM)納米纖維微粉。豬、牛或羊脫細胞真皮基質納米纖維微粉為豬、牛或羊真皮源性細胞外基質采用現有技術中的粉碎方法粉碎后制成的微粉，其主要成分為Ⅰ型及Ⅲ型膠原，該微粉D50為27.33±2.83μm。利用該微粉制備的生物墨水內保留真皮原有天然納米結構，可進行快速打印成型，交聯后成為設計結構的3D打印軟組織支架。作為優選，所述水為蒸餾水或超純水。作為優選，所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為0.5-6mol/L。作為優選，所述預交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為0.01-0.2％。作為優選，所述生物墨水材料的終濃度為50-180mg/g本發明的第二個目的采用如下技術方案：一種用于3D打印的生物墨水材料的制備方法,其特征在于，按以下步驟進行：常溫下，將配方量的豬、牛或羊真皮源性細胞外基質納米纖維微粉、預交聯劑或者超純水，促凝劑混合，攪拌混合均勻，進行離心，得到凝膠，即生物墨水材料。作為優選，所述制備方法還包括以下步驟：3D生物打印：利用3D生物打印機將生物墨水材料按照建好的模型打印出來，打印后，冰凍1h-2h進行加固定型，得到定型的凝膠材料；交聯：將定型的凝膠材料進行水洗，去除氫離子；然后加入交聯劑，于4℃的條件下交聯反應24h-48h；最后再進行水洗，洗去殘余交聯劑。作為優選，步驟1中，在磁力攪拌器中進行攪拌，攪拌速度為500-1500r/min，攪拌時間為30min；攪拌后置于離心管中，在離心機中進行離心，離心速度5000-10000r/min，離心時間5-15min；凝膠的pH值為1-5。作為優選，所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為2％-10％。本發明的第三個目的采用如下技術方案：一種用于3D打印的生物墨水材料的應用，用于制作3D打印軟組織支架。本發明的有益效果在于：1、本發明的凝膠在打印過程中容易噴出，不會堵塞打印針頭，噴出后又容易定型，交聯之后力學性質優良。2、本發明的生物墨水材料在人體內抗原性小，引起排斥反應小，生物可降解性高，對機體本身無毒害，安全性高。3、本發明中的凝膠材料有利于促進細胞的粘附生長，孔隙大小和孔隙率可以通過3D打印來進行調節，對材料血管化及整體性能提高有促進作用。4、本發明提供的軟組織3D打印生物墨水材料，通過3D打印技術，可以實現個體針對性，為不同的病人可以有不同的設計，更加符合臨床上的需要。5、本發明利用該微粉制備的生物墨水材料內保留真皮原有天然納米結構，在特定溫度下可進行快速打印成型，交聯后成為設計結構的3D打印軟組織支架。全過程需時短，步驟簡單，全部摻入物均已有多年臨床使用經驗，安全性高。利用該生物墨水材料制備的3D打印軟組織支架，具有納米級天然納米級孔隙及打印出的微米級別孔隙，其結構可依據不同應用目的進行優化調整，以該種支架為基礎，加入細胞或其他成分后可實現組織工程材料/器官的個性化定制并用于醫學用途上。附圖說明圖1a為微粉的照片，圖1b、圖1c為微粉在環境掃描電子顯微鏡的不同放大倍數下的拓撲結構圖。圖2a為生物墨水材料的粘滯度-溫度變化曲線圖，圖2b為流動狀態的凝膠的照片，圖2c為定型的凝膠材料的照片。圖3：利用該生物墨水材料制備的3D打印軟組織支架，并進行移植復合植皮實驗的過程圖。具體實施方式本發明所采用原料均可由市場購得，本發明所采用3D生物打印機使用的德國GeSIMBioscaffolder3.13D生物打印機。本發明所述生物大分子為豬、牛或羊真皮源性細胞外基質(Extralcellularmatrix，ECM)納米纖維微粉。豬、牛或羊脫細胞真皮基質納米纖維微粉為豬、牛或羊真皮源性細胞外基質采用現有技術中的粉碎方法粉碎后制成的微粉，其主要成分為Ⅰ型及Ⅲ型膠原，該微粉D50為27.33±2.83μm。利用該微粉制備的生物墨水內保留真皮原有天然納米結構，可進行快速打印成型，交聯后成為設計結構的3D打印軟組織支架。本發明所述水為超純水。本發明所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為0.5-6mol/L。。本發明所述預交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為0.01-0.2％。本發明所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為2％-10％。下面通過實施例的方式對本發明作進一步的說明，但是不局限于下述實施例。實施例1本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子5％水93.5％促凝劑1.5％。且上述生物墨水材料打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為豬真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述水為超純水。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為3mol/L。一種用于3D打印的生物墨水材料的制備方法,按以下步驟進行：常溫下，使用電子分析天平稱取配方量的生物大分子(即豬真皮源性ECM納米纖維微粉)置于燒杯中，加入配方量的超純水，再加入一顆小磁珠，整個燒杯置于磁力攪拌器上，調整轉速為800rpm，充分攪拌均勻，再用膠頭滴管逐滴添加配方量的促凝劑(即鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為3mol/L)，以調節pH至，攪拌后置于離心管中，在離心機中進行離心，離心速度5000-10000r/min，離心時間5-15min；得到凝膠(即生物墨水材料)。該制備方法還包括如下步驟：3D生物打印：利用3D生物打印機將凝膠(即生物墨水材料)按照建好的模型打印出來，打印后，冰凍2h進行加固定型，得到定型的凝膠材料；交聯：將定型的凝膠材料用第一部分水進行水洗，水洗的水洗次數為5-6次，去除氫離子，為交聯提供條件；然后加入配方量的交聯劑(即戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為10％)，于4℃的條件下交聯反應48h；最后用第二部分水進行水洗，洗去殘余交聯劑。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為10％。參照圖1a、圖1b、圖1c，豬真皮源性細胞外基質納米纖維微粉經粒徑分析檢測D50為27.33±2.83μm，微粉內仍保留著原有的納米級天然拓撲結構。參照圖2a、圖2b、圖2c,該墨水隨溫度改變可由流動轉為半流動狀態并最終凝固，其狀態變化速度依溫度變化速度而定，可保證3D打印在簡單的溫度調控下進行，打印物無需添加光敏劑或其他化學物質即可成型。凝膠在打印過程中容易擠出，不會堵塞打印針頭，擠出后又容易定型。可以看出，本實施例的凝膠在打印過程中容易擠出，不會堵塞打印針頭，擠出后又容易定型，交聯之后力學性質優良。參照圖3，植皮處無明顯排斥反應發生，切開植皮片周圍皮膚觀察，植皮片已血管化。可以看出，本實施例的生物墨水材料在人體內抗原性小，引起排斥反應小，生物可降解性高，對機體本身無毒害，安全性高。實施例2本實施例的特點是：本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子18％水76％促凝劑6％。且上述生物墨水材料墨水打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為豬真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述水為超純水。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為3mol/L。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為10％。其制備方法的不同之處在于：凝膠時調節PH至1，其它具體操作步驟同實施例1。實施例3：本實施例的特點是：本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子8.5％水90％促凝劑1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為豬真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述水為超純水。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為3mol/L。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為10％。其它具體操作步驟同實施例1。實施例4：本實施例的特點是：本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子8.5％預交聯劑90％促凝劑1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為豬真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為3mol/L。所述預交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為0.01％。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為10％。其它具體操作步驟同實施例1。實施例:5：本實施例的特點是：本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子8.5％水90％促凝劑1.5％；且上述生物墨水材料墨水打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為牛真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述水為超純水。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為3mol/L。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為5％。其制備方法的不同之處在于：凝膠時調節PH至4，其它具體操作步驟同實施例1。實施例6：本實施例的特點是：本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子8.5％水85.5％促凝劑6％。且上述生物墨水材料墨水打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為豬真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述水為超純水。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為3mol/L。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為10％。其制備方法的不同之處在于：凝膠時調節PH至1，其它具體操作步驟同實施例1。實施例7：本實施例的特點是：本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子8.5％水90％促凝劑1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為豬真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述水為超純水。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為3mol/L。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為2％。其它具體操作步驟同實施例1。實施例8：本實施例的特點是：本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子8.5％水90％促凝劑1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為羊真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述水為超純水。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為3mol/L。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為10％。其它具體操作步驟同實施例1。實施例9：本實施例的特點是：本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子8.5％水90％促凝劑1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為羊真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述水為超純水。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為0.5mol/L。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為10％。其它具體操作步驟同實施例1。實施例10：本實施例的特點是：本實施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按質量濃度百分比計的如下原料制備而成：生物大分子8.5％水90％促凝劑1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出來后將會進行水洗、交聯以定型。所述生物大分子為羊真皮源性細胞外基質納米纖維微粉。所述水為超純水。所述促凝劑為鹽酸溶液，鹽酸的摩爾濃度為6mol/L。所述交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛的質量濃度為10％。其它具體操作步驟同實施例1。對于本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發明權利要求的保護范圍之內。