一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法與流程

本發明涉及量子點應用領域和生物熒光標記領域，具體涉及一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法。

背景技術：

探索和發現生物體內及生命過程中蛋白質、核酸、多肽等重要生物分子的高靈敏分析檢測方法，是生物醫學領域研究的熱點和難點。生物標記技術是該領域不可或缺的研究手段。通用的生物標記方法可以分為放射性標記、顯色標記、酶標記和熒光標記等。其中，熒光標記備受科研人員關注，而其檢測靈敏度很大程度上取決于熒光標記探針的發光強度和光化學穩定性。

熒光半導體納米材料量子點具有發光效率高、光化學穩定性好、發射光顏色與粒徑大小關聯等優點，作為一種新型熒光標記物可廣泛應用于蛋白質及dna檢測、細胞標記成像、活細胞生命動態過程示蹤、活體動物體內腫瘤細胞靶向示蹤等生物醫學領域。

現有的生物標記技術主要基于生物素與親和素之間的非共價相互作用，雖然具有簡便、快捷的優點，但是標記產物不穩定。另一種采用基于羧基與氨基的縮合反應的標記方法往往需要添加催化劑，并且由于生物體本身存在大量氨基與羧基，因此反應效率不高，特異性也不好。

目前點擊化學應用最為廣泛的是銅離子催化的端基炔和疊氮化物huisgen偶極環加成反應。而新型的基于環炔基-疊氮連接的不含銅的新型點擊化學方法更為其生物醫學應用奠定了良好基礎，將點擊化學與熒光納米量子點結合起來可以構建一種穩定的納米標記探針。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法，解決了現有技術中采用生物標記方法，無論是熒光半導體標記還是基于羧基與氨基的縮合反應標記都普遍存在標記不穩定、標記效率低、影響被標記物的活性，或者標記成本高的問題。

為解決上述的技術問題，本發明采用以下技術方案：

一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法，包括以下步驟：

步驟一，制備細胞-點擊化學修飾連接劑復合培養液：通過在細胞的培養液中，以1:1的比例添加帶有環炔基的點擊化學修飾連接劑，在室溫下反應30-60分鐘得到細胞-點擊化學修飾連接劑復合培養液，其中點擊化學修飾連接劑的量為細胞摩爾量的10-100倍；

步驟二，使用疊氮-熒光量子點復合物對細胞進行熒光標記：將疊氮-熒光量子點復合物以1:1的比例加入制備完成的細胞-點擊化學修飾連接劑復合培養液中，室溫孵育30-60分鐘，得到熒光量子點標記的生物體培養液，其中疊氮-熒光量子點復合物的量為細胞摩爾量的10-100倍。

進一步的，所述疊氮-熒光量子點復合物為cdse、cdte、cds、zns、cuinse、cuins、inp、cdse/zns、cdte/cds、cdte/cdse中的一種或多種。

進一步的，所述細胞-點擊化學修飾連接劑復合培養液制備完成后，加入ph為7.2-7.6的緩沖液對其洗滌，將多余的點擊化學修飾連接劑去除。

進一步的，所述熒光量子點標記的生物體培養液制備完成后，加入ph為7.2-7.6的緩沖液對其洗滌，將多余的疊氮-熒光量子點復合物去除，并采用離心的方式收集熒光量子點標記的細胞。

進一步的，所述緩沖液為pbs緩沖液或者hepes緩沖液。

進一步的，所述培養液為dmem培養液。

進一步的，所述疊氮-熒光量子點復合物中，量子點內核為cdse/zns核殼型量子點，外面包裹修飾有疊氮基團聚馬來酸酐聚合物n3-pmah。

進一步的，所述疊氮-量子點復合物溶液的制備方法是：

將cdse/zns核殼量子點溶解于氯仿中，然后將聚合物n3-pmah溶解于二甲基亞砜，緩慢加入cdse/zns核殼量子點的氯仿溶液，形成透明溶液；

50℃加熱2h，用旋轉蒸發除去氯仿，再在90℃加熱4h；

降溫后，加入氯仿/正己烷=1：1沉淀，6000g離心10min。丙酮洗3次；

重新溶解于ph為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，即得到疊氮-量子點復合物溶液。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：將熒光量子點以共價的方式結合到細胞上，熒光標記穩定、高效，并且能夠保持被標記物的活性；并且本發明的方法操作簡便，快速易行，為細胞等生物體的長時間觀察研究提供了適宜的實驗方法。

基于活體細胞的熒光標記，或活體熒光成像技術不需要殺死動物，可以對同一個動物進行長時間反復跟蹤成像，既可以提高數據的可比性，避免個體差異對試驗結果的影響。更重要的是，該技術可以得到直觀的成像圖片，了解標記物在動物體內的分布和代謝情況，避免了傳統的體外實驗方法的諸多缺點，特別是在在癌癥細胞轉移及干細胞相關研究、藥物制劑學、藥物臨床前研究中有不可估量的應用前景。

附圖說明

圖1為根據本發明對細胞進行熒光量子點標記的原理示意圖。

圖2為本發明實施例中所用疊氮-量子點復合物的結構示意圖。

圖3為用于修飾量子點的疊氮聚合物n3-pmah的1hnmr圖譜。

圖4示出本發明實施例中所用疊氮-量子點復合物的吸收和發射光譜。

圖5示出本發明實施例中所用疊氮-量子點復合物的透射電鏡圖像。

圖6a和6b分別為根據本發明對a549細胞和ramos淋巴瘤細胞進行熒光量子點標記后的熒光成像圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

圖1示出了本發明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例：一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法，包括以下步驟：

步驟一，制備細胞-點擊化學修飾連接劑復合培養液：通過在細胞的培養液中，以1:1的比例添加帶有環炔基的點擊化學修飾連接劑，在室溫下反應30-60分鐘得到細胞-點擊化學修飾連接劑復合培養液，其中點擊化學修飾連接劑的量為細胞摩爾量的10-100倍；

步驟二，使用疊氮-熒光量子點復合物對細胞進行熒光標記：將疊氮-熒光量子點復合物以1:1的比例加入制備完成的細胞-點擊化學修飾連接劑復合培養液中，室溫孵育30-60分鐘，得到熒光量子點標記的生物體培養液，其中疊氮-熒光量子點復合物的量為細胞摩爾量的10-100倍。。

根據本發明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述疊氮-熒光量子點復合物為cdse、cdte、cds、zns、cuinse、cuins、inp、cdse/zns、cdte/cds、cdte/cdse中的一種或多種。由于本發明的方法是在量子點表面修飾疊氮基，并利用疊氮基與環炔基發生點擊化學反應，而點擊化學反應與量子點本身并無直接關系。因此，本領域技術人員應理解，本發明的方法理論上適用于所有熒光量子點，其中核殼型的量子點具有更加穩定的光學性質。

根據本發明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述細胞-點擊化學修飾連接劑復合培養液制備完成后，加入ph為7.2-7.6的緩沖液對其洗滌，將多余的點擊化學修飾連接劑去除。

根據本發明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述熒光量子點標記的生物體培養液制備完成后，加入ph為7.2-7.6的緩沖液對其洗滌，將多余的疊氮-熒光量子點復合物去除，并采用離心的方式收集熒光量子點標記的細胞。

根據本發明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述緩沖液為pbs緩沖液或者hepes緩沖液。

根據本發明一種納米量子點對動物細胞的熒光標記方法的一個實施例，所述培養液為dmem培養液。

圖2為本發明的疊氮-量子點復合物結構示意圖。從圖中可見，本發明所用的量子點內核為cdse/zns核殼型量子點，經疊氮基修飾后，量子點表面包覆一層帶疊氮基的聚合物，疊氮基暴露于外，可以與環炔基化合物發生點擊化學反應。

實際操作中，細胞可以經一段時間的培養。例如，使用含10%小牛血清的dmem培養基，在37℃、5%co2/95%空氣、飽和濕度的培養條件下培養。隔天更換培養液，每4~6天傳代一次。使用前，首先用緩沖液將細胞洗3次，并換新鮮的不含小牛血清的dmem培養基。

細胞表面雖然有多個氨基，但是通過與點擊化學修飾連接劑分子連接后，轉變為環炔基，轉變的數量和加入的修飾試劑分子有關系，環炔基可以與量子點表面的疊氮基團發生連接反應。每個量子點表面有多個疊氮基，原理上每個疊氮基團都可以連接一個點擊化學修飾連接劑分子，由于量子點只有10nm左右大小，可以通過控制點擊化學修飾連接劑分子與細胞的比例，來保證細胞表面量子點能接觸到的范圍內，僅有一個環炔基能夠與量子點表面的疊氮基反應。生物體系中通常不含有環炔基和疊氮基，如此，整個反應體系只有含有環炔基的細胞能和帶有疊氮基的量子點反應，從而，本發明的標記方法具有明顯的特異性。

對于相對復雜的生物體系如血液、人體組織等體系中，采用這種標記方法可以大大避免傳統基于氨基和羧基反應的非特異性標記帶來的偽信號。同時相對生物素-親和素方法由于是化學鍵合，因此標記產物更加穩定。

由于本發明的生物體熒光標記是基于對細胞進行的熒光標記，因此，本發明的方法可以對細胞、干細胞、病毒、細菌等生物體進行熒光量子點標記。

下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細說明。

原料與試劑

n3-pmah聚合物修飾劑：參照文獻

journaloftheamericanchemicalsociety2012134(20),8388-8391中所公開的方法合成。具體地，將聚馬來酸酐（分子量1000，購自polysciences,inc）、組胺（購自西格瑪奧德里奇公司）、疊氮基團末端的氨基化聚乙二醇n3-peg8-ch2ch2nh2（購自嘉興博美生物技術有限公司）在二甲基亞砜（購自西格瑪奧德里奇公司）中反應12小時得到。其1hnmr圖譜示于圖3。

cdse/zns核殼量子點：購自武漢珈源量子點技術開發有限責任公司。

a549肺癌細胞、ramos淋巴瘤細胞：均從中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心獲得。

疊氮-量子點復合物

本發明所用的量子點內核為cdse/zns核殼型量子點，外面包裹修飾有疊氮基團聚馬來酸酐聚合物n3-pmah。其制備方法如下：

將cdse/zns核殼量子點溶解于氯仿中，然后將聚合物n3-pmah溶解于二甲基亞砜，緩慢加入cdse/zns核殼量子點的氯仿溶液。形成透明溶液。50℃加熱2h，用旋轉蒸發除去氯仿，再在90℃加熱4h。降溫后，加入氯仿/正己烷=1：1沉淀，6000g離心10min。丙酮洗3次。重新溶解于ph為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，即得到疊氮-量子點復合物溶液。

圖4為本發明所用疊氮-量子點復合物的吸收和發射光譜。從圖中可見，本發明的疊氮-量子點復合物在300nm到590nm有連續的吸收光譜，而發射波長在600nm附近。也就是說用300nm到590nm之間任何波長的光源激發都可以將其激發而發射出600nm的紅色熒光。這對于細胞的熒光標記而言，為熒光成像激發光的選擇帶來極大的方便。

圖5示出本發明實施例中所用疊氮-量子點復合物的透射電鏡圖像。從圖中可見，本發明的量子點粒徑小于5nm，和一般的生物分子如蛋白質大小基本差異不大，不會影響細胞的自身功能。同時也能確保細胞表面只有1個環炔基能與量子點結合。

盡管本發明并未窮舉，而僅使用了cdse/zns量子點作為疊氮-量子點復合物的內核，應理解，本發明的方法適用于所有的熒光量子點，包括cdse、cdte、cds、zns、cuinse、cuins、inp等量子點，或是cdse/zns、cdte/cds、cdte/cdse等的核殼型量子點，以及它們的任意組合。

實驗1：a549肺癌細胞標記

a549肺癌細胞培養：培養液為含10%小牛血清的dmem培養基，培養條件：37℃，5%co2/95%空氣，飽和濕度，隔天更換培養液，每4~6天傳代一次。

a549肺癌細胞培養：培養液為含10%小牛血清的dmem培養基，培養條件：37℃，5%co2/95%空氣，飽和濕度，隔天更換培養液，每4~6天傳代一次。

a549肺癌細胞與點擊化學修飾連接劑的結合：首先用pbs緩沖液將細胞洗3次，換新鮮的不含小牛血清的dmem培養基，然后將摩爾量為細胞摩爾量10倍的點擊化學修飾連接劑dbco-peg4-nhsester加入細胞培養液，在室溫下振蕩反應30分鐘，然后用pbs緩沖液洗去多余的修飾試劑，加入新鮮的培養基，備用。

用疊氮-量子點復合物對a549肺癌細胞進行熒光標記：將摩爾量為細胞摩爾量10倍的疊氮-量子點復合物加入以上步驟得到的細胞培養液中，孵育30分鐘，用pbs緩沖液洗去多余的疊氮-量子點，得到量子點標記的細胞溶液。

這樣的用量是為了保證修飾試劑和量子點在一定范圍內過量，以提高標記效率。

用熒光顯微鏡可以觀察到細胞上有明顯的熒光信號，如圖6a所示。細胞采用明場模式觀察，得到的細胞圖象為黑白；而量子點發出的熒光信號采用488nm的激光激發，收集590nm到630nm波長范圍的紅色熒光信號。可以看到量子點的紅色熒光信號和細胞得到很好的重疊。說明細胞已經成功得到標記。

實驗2：ramos淋巴瘤細胞標記

ramos淋巴瘤細胞培養：培養液為含12%胎牛血清的dmem培養基，培養條件：37℃，5%co2/95%空氣，飽和濕度，隔天更換培養液，每4~6天傳代一次。

ramos淋巴瘤細胞與點擊化學修飾連接劑的結合：首先用pbs緩沖液將細胞洗3次，離心收集細胞，換新鮮的不含小牛血清的dmem培養基，然后將摩爾量為細胞摩爾量30倍的點擊化學修飾連接劑加入細胞培養液，反應30分鐘，然后用pbs緩沖液洗去多余的修飾試劑，加入新鮮的培養基，備用。

用疊氮-量子點復合物對ramos淋巴瘤細胞進行熒光標記：將摩爾量為細胞摩爾量30倍的疊氮-量子點復合物加入第二步得到的細胞培養液中，孵育30分鐘，用pbs洗去多余的疊氮-量子點，離心收集得到量子點標記的細胞溶液。

這樣的用量是為了保證修飾試劑和量子點在一定范圍內過量，以提高起標記效率。由于ramos淋巴瘤細胞是懸浮細胞，為保證其標記效率，修飾劑和量子點的用量會比前面的細胞用量多。

應理解，根據本發明的方法，針對不同的細胞，或為適應不同的情況，點擊化學修飾連接劑及疊氮-量子點復合物的用量可以在細胞摩爾量10-100倍范圍內變化，并可由本領域技術人員根據實際情況進行選擇和調整。

用熒光顯微鏡可以觀察到細胞上有明顯的熒光信號，如圖6b所示。細胞采用明場模式觀察，得到的細胞圖象為黑白；而量子點發出的熒光信號采用488nm的激光激發，收集590nm到630nm波長范圍的紅色熒光信號。可以看到量子點的紅色熒光信號和細胞得到很好的重疊。說明細胞已經成功得到標記。

盡管這里參照本發明的多個解釋性實施例對本發明進行了描述，但是，應該理解，本領域技術人員可以設計出很多其他的修改和實施方式，這些修改和實施方式將落在本申請公開的原則范圍和精神之內。更具體地說，在本申請公開、附圖和權利要求的范圍內，可以對主題組合布局的組成部件和/或布局進行多種變型和改進。除了對組成部件和/或布局進行的變形和改進外，對于本領域技術人員來說，其他的用途也將是明顯的。