一種嵌段聚合物、含有其的藥物載體及其制備方法和應用與流程

本發明涉及一種藥物載體，具體涉及一種嵌段聚合物、含有其的藥物載體及其制備方法和應用。

背景技術：

癌癥即惡性腫瘤，是由于人體細胞的正常增殖機制被破壞，導致細胞惡性增殖，人體代謝失衡，組織和器官的結構與功能受損，最終患者會因器官衰竭而死亡。而隨著經濟社會發展和人口的老齡化，癌癥成為發達國家和發展中國家人體健康的頭號殺手，其中乳腺癌、肺癌、直腸癌在發展中國家發病率最高。目前，對于癌癥的預防與治療主要通過早期的診斷和治療，煙草控制，以及疫苗的使用(肝癌、宮頸癌)等，同時向大眾不斷普及癌癥預防與控制知識也能很大程度的減輕癌癥帶來的經濟與社會負擔。

癌癥目前的治療方式主要是手術并配合放射治療與化學治療。在傳統的癌癥治療中，藥物治療是主要的治療方式之一，即化療。化療是通過對患者進行全身或者局部給藥，實現對惡性增殖細胞的抑制并殺死腫瘤細胞。化療藥物的種類主要有烷化劑(卡氮芥、環磷酰胺)，抗代謝藥物(吉西他濱、卡莫氟)，抗腫瘤抗生素(阿霉素、吡喃阿霉素)，抗腫瘤動植物成分藥物(紫杉醇、羥基喜樹堿)，抗腫瘤激素類藥物(他莫昔芬、阿他美坦)及一些雜類如順鉑、樂沙定等。但是，傳統抗癌藥物的作用機理是根據腫瘤細胞惡性增殖、代謝旺盛的特性對其生長進行抑制并達到殺死癌細胞的目的，這一性質導致此類藥物不僅抑制癌細胞增殖，對正常的組織細胞生長也會產生抑制作用。因此，針對這一問題，為了提高對癌細胞的抑制效果并降低對正常細胞的傷害，能夠靶向作用的藥物載體成為藥劑學研究的一個熱點。

靶向藥物轉運系統(targetdrugdeliverysystem，tdds)包括作為藥物載體的脂質體、乳劑、微囊和微球、納米囊、或納米球等，其功能是將藥物靶向運輸到作用部位并富集停留一段時間，從而實現藥效的提升，降低藥物的生物毒性。peg-plga嵌段共聚物作為制備納米粒子載體的原料應用前景廣闊，但由于peg主鏈上缺少易于功能化修飾的官能團，使得其作為藥物載體的應用受到了一定限制。聚[n-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺](phpma)作為水溶性高分子聚合物，生物毒性低且具有優良的生化性能和良好的可功能化性，通過自身的羥基 反應或者與其他功能性單體共聚合的方法可以制備含有不同功能基團的聚合物；大分子量的phpma具有epr(增強的滲透和滯留)效應，有利于其在腫瘤部位的聚集，可替代peg作為聚合物材料的親水嵌段。但是，由于目前phpma載體的制備普遍采用普通自由基聚合，制備所得的聚合物分子量不可控，且分子量分布很寬，會對載體的epr效應以及藥物的釋放產生嚴重影響，進一步則會影響到藥物對腫瘤的治療效果。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種嵌段聚合物、含有其的藥物載體及其制備方法和應用。

本發明提供一種嵌段聚合物，其聚合單體包括第一單體和第二單體，所述第一單體為交酯或內酯中的一種或多種，所述第二單體為(甲基)丙烯酸酯類化合物或(甲基)丙烯酰胺類化合物中的一種或多種，所述嵌段聚合物以r-oh作為引發劑引發第一單體開環聚合(rop)，然后以所得的端基為r基團的聚合物作為大分子引發劑引發第二單體的進一步聚合而得；其中，r為具有可逆加成斷裂轉移(raft)或原子轉移自由基(atrp)聚合活性的基團。

根據本發明，所述r-oh為下述式(i)～式(iii)所示化合物的一種：

其中，r1為具有raft聚合活性的烷基二硫代酯基、芳基二硫代酯基、烷基三硫代碳酸酯基、芳基三硫代碳酸酯基、烷基磺酸酯基、芳基磺酸酯基、烷基二硫代氨基甲酸酯基或芳基二硫代氨基甲酸酯基；

r2為r1、具有atrp引發活性的含氯原子(cl)或溴原子(br)的基團、或r4-co-nh-r3-；

r3為-gflg-、-gplgiagq-或-gplgiagqkkkkkkkk-等多肽；

r4為r1、或者具有atrp引發活性的含氯原子(cl)或溴原子(br)的基團。

優選地，r1中，烷基為c8-16烷基，優選為c12烷基；芳基為苯基或萘基，優選為苯基。

優選地，r1為苯基二硫代酯基或者十二烷基三硫代碳酸酯基。

優選地，所述含氯原子(cl)或溴原子(br)的基團例如為2-溴異丙基、2-氯異丙基、 2-氯乙基、2-溴乙基、2-氯丁基或2-溴丁基。

優選地，r2為苯基二硫代酯基、十二烷基三硫代碳酸酯基或2-溴異丙基。

優選地，所述交酯為丙交酯(la)或乙交酯(ga)；所述內酯為己內酯(cl)。

優選地，所述(甲基)丙烯酸酯類化合物或(甲基)丙烯酰胺類化合物為(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺或n-(羥基烷基)(甲基)丙烯酰胺。優選地，n-(羥基烷基)(甲基)丙烯酰胺中的烷基為c1-6烷基，進一步優選為c2-4烷基，例如為丙基。更優選地，n-(羥基烷基)(甲基)丙烯酰胺為n-(2’-羥基)丙基甲基丙烯酰胺(hpma)。

根據本發明，所述聚合物的通式如式(iv)所示：

式(iv)中，r’可為r1、氯原子(cl)或溴原子(br)；x可為-c(ch3)(cn)ch2ch2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)och2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)och2ch2-s-s-ch2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)och2ch2-s-s-ch2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)nh-gflg-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)nh-gflg-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)nh-gplgiagq-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)nhgplgiagqkkkkkkkk-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)nh-gplgiagq-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)nh-gplgiagqkkkkkkkk-c(o)och2ch2-等非響應性、還原響應性或酶響應性連接鍵；y可為-c(ch3)-、-ch2-、-(ch2)5-中的一種或多種(如前兩種)；m為5000-20000，n為1000-20000。

根據本發明，所述聚合物的通式如式(v)所示：

式(v)中，m為5000-20000，n為1000-20000。

根據本發明，其中第二單體部分的摩爾含量為20mol％-80mol％。

根據本發明，所述嵌段聚合物為兩親性嵌段共聚物，其數均分子量為6000～40000，分子量分布指數pdi＜1.2。其中疏水段分子量為1000-20000，例如分別為2000、5000、10000、20000，親水段(如phpma)分子量為5000-20000，例如分別為5000、10000、20000。

本發明提供一種制備上述嵌段聚合物的方法，其包括以下步驟：

(1)以r-oh作為引發劑引發第一單體開環聚合，然后

(2)以所得的端基為r基團的聚合物作為大分子鏈轉移劑引發第二單體的進一步聚合，得到所述嵌段聚合物；

其中，r為具有可逆加成斷裂轉移(raft)或原子轉移自由基(atrp)聚合活性的基團，所述第一單體為交酯或內酯中的一種或多種，所述第二單體為(甲基)丙烯酸酯類化合物或(甲基)丙烯酰胺類化合物中的一種或多種。

根據本發明，所述引發劑r-oh，以4-十二烷基三硫代碳酸酯基-4-氰基戊醇為例，合成步驟可細分為兩步，首先將十二烷基硫醇與二硫化碳以及對甲苯磺酰氯反應合成雙十二烷基雙三硫代碳酸酯，然后通過雙十二烷基雙三硫代碳酸酯與4，4’-偶氮雙(4-氰基戊醇)反應制備4-十二烷基三硫代碳酸酯基-4-氰基戊醇。

根據本發明，所述步驟(1)具體為：在惰性氣體(如氬氣)環境中，加入溶劑、r-oh引發劑、催化劑和第一單體，開環聚合，得到端基為r基團的聚合物，也即大分子鏈轉移劑。

優選地，步驟(1)中，所述溶劑選自三氯甲烷、四氫呋喃、n，n-二甲基甲酰胺、甲苯或二甲基亞砜等。所述催化劑為4-二甲氨基吡啶(dmap)、7-甲基-1，5，7-三氮雜二環[4.4.0]癸-5-烯(mtbd)、1，5-二氮雜二環[4.3.0]壬-5-烯(dbn)、1，8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)或1，5，7-三氮雜二環[4.4.0]癸-5-烯(tbd)等。

優選地，第一單體為交酯時，所述催化劑為dbu；第一單體為內酯時，所述催化劑為 tbd。

優選地，步驟(1)中，所述反應的反應溫度為30～60℃，優選40～50℃，更優選45℃；反應時間為30-70分鐘，優選40-60分鐘，更優選45分鐘。

優選地，步驟(1)中，所述第一單體與r-oh引發劑的摩爾比為50～150∶1，優選地80～120∶1，更優選100∶1。所述第一單體與催化劑的摩爾比為500～1500∶1，優選地800～1200∶1，更優選1000∶1。

根據本發明，所述步驟(2)具體為：在惰性氣體(如氬氣)環境中，加入溶劑、上述的大分子鏈轉移劑、第二引發劑和第二單體，進行可逆加成斷裂轉移(raft)或原子轉移自由基(atrp)聚合反應，得到本發明的兩親性嵌段聚合物。

優選地，步驟(2)中，所述溶劑為二甲基亞砜。所述第二引發劑為4，4’-偶氮二(4-氰基戊酸)(v501)

優選地，步驟(2)中，所述raft或atrp聚合反應的反應溫度為50～90℃，優選60～80℃，更優選70℃；反應時間為12～36小時，優選20～30小時，更優選24小時。

優選地，步驟(2)中，將raft或atrp聚合反應所得反應液濃縮后于沉淀劑(如異丙醇)中沉淀除去未反應的單體即可得到純化的兩親性嵌段共聚物。

本發明提供一種藥物載體，其含有上述聚合物。

根據本發明，所述聚合物制備成聚合物納米粒子，含有聚合物納米粒子的載體可以進行被動靶向給藥，具體的是長循環抗腫瘤靶向藥物載體。

本發明還提供一種藥物組合物，其含有上述藥物載體。

本領域技術人員可以理解，含有本發明聚合物的藥物載體能夠遞送的藥物并不受限制，各種藥物都可以使用本發明的藥物載體來遞送。根據本發明的一個方面，本發明的藥物載體可以用來遞送需要緩釋或者控釋的藥物，包括但不限于抗腫瘤藥、抗感染藥、激素類藥物等，所述抗腫瘤藥物包括但不限于抗腫瘤大分子，如具有抗腫瘤能力的蛋白質、多肽、質粒dna、sirna等，抗腫瘤小分子如7-乙基-10-羥基喜樹堿(sn38)、紫杉醇(ptx)或阿霉素(dox)等。

本發明進一步提供所述聚合物作為藥物載體(特別是抗腫瘤藥物被動靶向藥物載體)的應用或作為熒光指示劑載體的應用。

本發明的有益效果有：

本發明采用以r-oh作為引發劑的開環聚合(rop)以及可逆加成斷裂轉移(raft)或原子轉移自由基(atrp)聚合的方法，通過兩步簡單、高效的合成出本發明的兩親性嵌段共聚物；而且該反應催化效率極高，較傳統的辛酸亞錫催化所需時間大大縮短。另外，相較于傳統的普通自由基聚合所制備的聚合物分子量不可控且分子量分布較寬，通過本發明方法制備的兩親性嵌段聚合物分子量組成可調，分子量可控，分子量分布窄(＜1.2)。

本發明的嵌段聚合物制備的藥物載體，能夠有效延長藥物在血液中的循環時間，并還可以通過主動靶向或被動靶向作用定向富集至腫瘤病灶部位，此外，與傳統的聚乙二醇修飾的納米粒子相比較能夠減輕血液加速清除效應，減輕多次給藥過程中藥物的損失和對正常器官的毒副作用。

附圖說明

圖1為本發明提供的兩親性嵌段共聚物以pdlla-b-phpma為例的合成路線示意圖。

圖2是本發明方法制備的pdlla的反應動力學分析曲線。

圖3是本發明制備的pdlla的gpc曲線。

圖4是本發明制備的pdlla-b-phpma的gpc曲線。

圖5是本發明制備的pdlla-b-phpma的¹hnmr譜圖。

圖6是本發明制備的pdlla-b-phpma納米粒子隨時間在小鼠巨噬細胞raw264.7內吞噬量變化的clsm圖。

圖7是通過流式細胞儀檢測得到的本發明制備的pdlla-b-phpma納米粒子在小鼠巨噬細胞raw264.7內的吞噬量。

圖8是本發明制備的pdlla-b-phpma納米粒子與pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體第一次給藥后的血液清除實驗。

圖9是本發明制備的pdlla-b-phpma納米粒子與pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體第二次給藥后的血液清除實驗。

圖10是本發明制備的pdlla-b-phpma納米粒子與pdlla-b-peg納米粒子兩次給藥24小時后熒光強度之間的差異。

圖11是本發明制備的pdlla-b-phpma納米粒子在小鼠體內分布的活體成像圖片；其中，在活體或器官中黑色部分為熒光信號最強，白色部分熒光信號最弱。

具體實施方式

如上所述，本發明公開了一種嵌段聚合物和包含該聚合物的藥物載體。本發明的嵌段聚合物能夠有效延長藥物在血液中的循環時間，因而可以作為緩釋藥物的載體使用；其次，本發明的嵌段聚合物還可以通過主動靶向或被動靶向作用定向富集至腫瘤病灶部位，因而可以作為長循環抗腫瘤靶向藥物載體使用。根據應用要求，本發明的嵌段聚合物可通過物理包埋的方式作為抗腫瘤藥物載體包埋疏水性藥物，通過制備的嵌段聚合物納米粒子的尺寸效應以及腫瘤組織的增強滲透與滯留效應(enhancedpermeabilityandretention，epr效應)對腫瘤實現被動靶向給藥。

本發明中，為驗證phpma較peg的“隱身”性能差異，制備納米粒子包載尼羅紅作為熒光探針，通過共聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)觀察小鼠巨噬細胞raw264.7對聚合物納米粒子的吞噬量隨時間的變化，并使用流式細胞儀定量檢測各實驗組中聚合物的吞噬量。其次，由于peg作為藥物載體時具有加速血液清除(acceleratedbloodclearance，abc)效應，為了驗證phpma的引入對載藥體系abc效應的緩解，分別制備pdlla-b-peg和pdlla-b-phpma的納米粒子包載cy7.5，二次給藥后考察藥物載體在小鼠血液中的清除速率。再有，為驗證該嵌段聚合物的生物分布及腫瘤靶向效果，制備納米粒子過程中包載疏水性熒光染料cy7.5作為熒光探針，通過小動物活體成像系統觀察嵌段聚合物進入小鼠體內后的循環及富集情況。

下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

本發明所述數均分子量及分子量分布指數通過dmf相凝膠滲透色譜(gpc)以及¹h核磁共振光譜(¹hnmr)測量得到。

實施例1、4-十二烷基三硫代酯基-4-氰基戊醇(cta-oh)的合成

取1000ml圓底燒瓶，將14.6gkoh加入450ml水中，再緩慢加入40.4g(48ml)十二烷基硫醇得到乳濁液狀溶液，同時緩慢加入0.8g甲基三辛基氯化銨和14.4g(12.06ml)cs2的混合溶液，觀察到溶液由土黃色轉變為黃色最終為橙色。室溫反應1小時后于冰鹽浴(nacl) 中冷卻至-5℃，緩慢加入20g對甲苯磺酰氯，保持-5℃條件反應2小時后于45℃水浴中反應45分鐘生成橘色油狀產物，冰水浴冷卻1小時形成固體產物，抽濾并用冰水水洗數次除去水溶性雜質。再于丙酮中重結晶純化：于61℃水浴中逐漸加丙酮，不斷攪拌至溶解平衡即可，待冷卻至室溫后置于-20℃冰箱中過夜重結晶。將抽濾得到的晶體溶于150ml石油醚中，加無水naso4攪拌1小時除水，濃縮后通過柱層析分離純化，流動相為石油醚，所得產物為雙十二烷基雙三硫代碳酸酯。取所得純化產物5g與4.5g4，4`-偶氮雙(4-氰基戊醇)溶于150ml乙酸乙酯中冷凝回流避光反應24小時，反應溫度為95℃，得到的終產物再次通過柱層析分離純化回收，流動相為石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。

所述雙十二烷基雙三硫代碳酸酯的結構式如下：

實施例2、乙二醇單4-十二烷基三硫代酯基-4-氰基戊酸酯的合成

取實施例1中所制備雙十二烷基雙三硫代碳酸酯5g與5g4，4`-偶氮雙(4-氰基戊酸)溶于150ml乙酸乙酯中冷凝回流避光反應24小時，反應溫度為95℃，得到的終產物再次通過柱層析分離純化回收，流動相為石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。所得產物4.03g與3.1g乙二醇溶于50ml無水二氯甲烷，加入4.5g二環己基碳二亞胺(dcc)和0.2g4-二甲氨基吡啶(dmap)催化進行酯化反應，反應48小時后過濾除去產生的副產物二環己基脲，得到的終產物再次通過柱層析分離純化回收，流動相為石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1。

實施例3、乙二醇單2-溴異丁酸酯的合成

取9.3g乙二醇和2.02g三乙胺溶于100ml二氯甲烷中，采用冰水浴將體系溫度降到5℃，使用恒壓滴液漏斗緩慢滴加4.6g2-溴異丁酰溴，滴加完畢后反應24小時。待反應完畢后過濾除去產生的三乙胺氫溴酸鹽，濾液分別用1％碳酸氫鈉水溶液和純水洗三次。收集有機相加入無水硫酸鈉干燥后旋蒸濃縮除去有機溶劑得純凈產物。

實施例4、雙羥乙基二硫化物單2-溴異丁酸酯

取12g雙(2-羥乙基)二硫化物和2.02g三乙胺溶于100ml二氯甲烷中，采用冰水浴將體系溫度降到5℃，使用恒壓滴液漏斗緩慢滴加4.6g2-溴異丁酰溴，滴加完畢后反應24小時。待反應完畢后過濾除去產生的三乙胺氫溴酸鹽，濾液分別用1％碳酸氫鈉水溶液和純水洗三次。收集有機相加入無水硫酸鈉干燥后旋蒸濃縮除去有機溶劑得純凈產物。

實施例5、乙二醇單2-溴異丁酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸酯

取1.17ggflg四肽和0.33g三乙胺溶于10mln，n-二甲基甲酰胺(dmf)，冰浴條件下滴加0.3g二溴異丁酰溴，滴加完畢后室溫反應24小時。反應完畢后真空濃縮至2-3ml，逐滴加入二氯甲烷中，過濾收集沉淀。將沉淀溶于dmf并重復在二氯甲烷中沉淀以除去原料和所產生的鹽。取0.54g沉淀與0.12g乙二醇溶于10ml無水dmf中，加入0.56gdcc和0.1gdmap催化酯化反應的進行，反應24小時后過濾除去環己基脲(dcu)。加入50ml 二氯甲烷溶解產物，所得溶液用50ml純水洗4次。收集有機相并加入無水硫酸鈉干燥，過濾后旋蒸濃縮即得產物。其它基于多肽的r-oh的合成過程與本實施例相同。

實施例6、聚合物pdlla20000制備的反應動力學分析實驗

提前將實驗所需的反應瓶于120℃烘箱中烘干2小時除水，在45℃、氬氣保護條件下進行下列操作。將烘干的反應瓶抽真空15min以確保沒有空氣，在通氬氣的情況下取5gdlla單體加入反應瓶中。再于通氬氣情況下取提前蒸餾純化的三氯甲烷30ml于反應瓶中，攪拌溶解后加入2ml實施例1制備的cta-oh的chcl3溶液(25mg/ml)。在加入50mgdbu的同時開始計時，間隔2min取樣一次，連續取1小時，所取樣品于7ml異丙醇中沉淀，于冷凍離心機中8000r/min離心1分鐘。所得沉淀于60℃真空烘箱中干燥，烘干后測gpc曲線，結果如圖2所示，根據保留時間及產物分子量分布系數(pdi)的變化確定最佳反應時間為45分鐘。根據確定的反應條件，改變投料比分別制備pdlla5000、pdllam000、pdlla20000聚合物，其gpc曲線如圖3所示，分子量分布系數pdi分別為1.08，1.08和1.11，結果表明通過本發明的合成方法可以獲得具有很好的單分散性的聚酯。

由于dbu催化效率極高，為確定最佳反應時間及反應溫度，制備可控分子量且分子量分布較窄的聚合物，本實施例進行了反應動力學研究，確定在45分鐘時聚合物達到設計的分子量并且分子量分布最窄。

實施例7、兩親性嵌段聚合物pdlla-b-phpma的制備

不同分子量的聚合物制備方法相同，只需要改變原料的投料比即可，在此列舉兩親性嵌段聚合物pdlla10000-b-phpma5000的投料比例。取實施例6的pdlla10000聚合物2g，hpma單體1.2g，4，4’-偶氮二(4-氰基戊酸)(v501)7mg，共同溶于15mldmso中。將反應瓶置于液氮中，待液體凝固后抽真空15min，再將反應瓶置于70℃水浴中通氬氣磁力攪拌溶解，待完全溶解后再置于液氮中冷卻，如此通氬氣凍融三次以除去空氣。最后置于70℃水浴反應24小時，將反應后的溶液于去離子水中透析2天除去未反應的單體，凍干得到純化的產物，分別進行gpc和¹hnmr表征。

通過類似方法可以合成pdlla10000-b-phpma10000和pdlla10000-b-phpma20000，分別進行gpc和¹hnmr表征。

gpc和¹hnmr表征結果如圖4、圖5所示。圖4可見，分子量分布系數pdi分別為1.05，1.11和1.12，這些結果表明所得聚合物的分子量分布具有很好的單分散性。圖5為所制備的 聚合物的核磁譜圖，從中可計算得到聚合物的實際組成，其結果與設計分子量非常接近，進一步表明了聚合過程的活性特征。

實施例8、不同分子量組成的pdlla-b-phpma納米粒子的細胞吞噬實驗

在制備pdlla-b-phpma納米粒子的過程中加入尼羅紅作為熒光探針，指示raw264.7巨噬細胞對聚合物納米粒子的吞噬量隨時間的變化。

將細胞均勻培養在6孔板培養皿中，培養一定時間后分別加入各個實驗組尼羅紅標記的pdlla-b-phpma納米粒子溶液，計時分別于1小時及6小時將細胞固定并用dapi溶液(10μl，10μg/ml)染細胞核后通過聚焦激光掃描顯微鏡(clsm)來觀察熒光圖像，并使用流式細胞儀定量分析各實驗組細胞的吞噬量，結果如圖6、圖7所示。

圖6中，每欄圖片從左到右依次為明場、dapi(細胞核)、dii(納米粒子)、三個通道合并以及合并圖片的局部放大圖片。其中左側為共培養1h所得的照片，右側為共培養6h所得的照片。從圖中可以發現隨著時間延長，巨噬細胞對納米粒子的內吞量增加，但是pdlla-b-phpma和pdlla-b-peg納米粒子的內吞量要明顯低于pdlla納米粒子的細胞內吞量，證明phpma和peg能夠有效抑制巨噬細胞對納米粒子的攝取。與pdlla-b-peg相比，pdlla-b-phpma納米粒子的細胞內吞量更低，體現出phpma聚合物的優勢。另外，phpma的引入能夠明顯抑制巨噬細胞的攝取，其中phpma鏈段越長，巨噬細胞攝取量越低。與peg修飾的納米粒子相比，phpma修飾納米粒子的巨噬細胞攝取量更低，進一步證明了體系優異的“隱身”性能。

實施例9、包載cy7.5的pdlla-b-peg納米粒子和包載cy7.5的pdlla-b-phpma納米粒子的血液清除實驗

在制備pdlla-b-peg納米粒子和pdlla-b-phpma納米粒子的過程中加入cy7.5作為熒光指示劑，分別制備了50nm粒徑和100nm粒徑的四種不同納米粒子，設置每個實驗組使用三只balb/c雌鼠(20±2g，5-6周齡)小鼠，通過尾靜脈注射后，分別在0h，1h，3h，8h和24h通過眼部取血后，使用小動物活體成像系統(ivisspectrum，caliperlifesciences，usa)拍攝并進行數據處理，考察血液中熒光強度的改變情況。第一次給藥實驗結束后7天進行第二次給藥，并重復上述實驗，整理數據并作圖，實驗結果如圖8-10所示。

圖8為本發明制備的pdlla-b-phpma納米粒子及pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體，第一次給藥后，在小鼠體內的清除速率曲線。圖9為本發明制備的pdlla-b-phpma納 米粒子及pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體，第二次給藥后，在小鼠體內的清除速率曲線。圖10為本發明制備的pdlla-b-phpma納米粒子及pdlla-b-peg納米粒子作為藥物載體，第一次給藥24小時后，較第二次給藥24小時后，在小鼠血液中熒光強度的差值。從結果中可以發現，在第一次給藥之時，相同粒徑的pdlla-b-peg納米粒子和pdlla-b-phpma納米粒子擁有相似的血液清除行為，且小粒徑納米粒子擁有更長的血液循環時間。然而，在第二次給藥之后，我們可以發現pdlla-b-peg納米粒子由于abc效應的存在使得血液清除速率明顯加快。對于pdlla-b-phpma納米粒子而言，第二次給藥的血液清除速率與第一次相比也有一定程度的增加，但是從圖10中的該變量來看，血液清除速率的降低程度要小于pdlla-b-peg納米粒子，這也表明pdlla-b-phpma納米粒子優異的體內長循環性能。

實施例10、包載cy7.5的不同分子量組成的pdlla-b-phpma納米粒子的體內生物分布實驗

實驗所用小鼠為balb/c雌鼠(20±2g，5-6周齡)，并在實驗前一周在小鼠背部右下側構建4t1小鼠乳腺癌模型，每三只攜帶4t1乳腺癌模型的balb/c雌鼠作為一組進行pdlla-b-phpma納米粒子的生物分布實驗。cy7.5標記的各實驗組聚合物粒子溶液通過尾靜脈注射入小鼠體內并開始計時。分別在1，3，6，9，12，24，48小時通過小動物麻醉系統對小鼠進行麻醉，使用小動物活體成像系統(ivisspectrum，caliperlifesciences，usa)拍攝，根據熒光成像觀察藥物在小鼠體內的分布。48小時時間點的活體成像拍攝完成后，通過頸椎錯位處死小鼠，解剖取出心臟，肺，肝臟，脾臟，腎臟及腫瘤再次使用活體成像系統拍攝熒光圖像，根據所給出的熒光強度值，比較各實驗組在小鼠體內的生物分布及腫瘤富集情況，結果如圖11所示。

圖11為本發明制備的pdlla-b-phpma納米粒子包載cy7.5熒光探針后，通過尾靜脈注射入小鼠體內后，觀察隨時間變化納米粒子在小鼠體內分布的活體成像圖片。結果表明，pdlla-b-phpma納米粒子能夠通過epr效應有效地富集到腫瘤組織部位，與pdlla-b-peg納米粒子相比較，pdlla-b-phpma納米粒子擁有相似的腫瘤組織靶向能力，上述結果進一步證明了pdlla-b-phpma納米粒子良好的應用前景。