多工試片裝置及其操作方法與流程

本發明涉及一種多工試片裝置及其操作方法，以應用于分子生物檢測，尤其涉及一種用于聚合酶鏈反應(pcr)、可以預先充填聚合酶鏈反應試劑的多工試片裝置及其操作方法。

背景技術：

在分子生物檢測領域中，經常需要針對一個樣品進行多種項目標的的檢驗。例如，通過聚合酶鏈反應檢測，來檢驗一個樣品中數種單核苷酸多態性(snp)的基因型，或是檢驗一個樣品中多個基因表現程度。此時，就會需要由幾個dna或rna檢驗(assay)組成一個檢驗套組(panel)。pcr檢驗中每組檢驗試劑中至少包括兩個特定的dna引子分子(某些pcr檢驗中還額外包括目標特定的報導探針(reporterprobes))，這對引子(引子對)必須正確地與從要進行測試樣品(樣品)中所萃取的dna模板混合，方能檢驗出樣品中特定dna目標是否存在或存在的量是多少。

傳統上，引子對和樣品置放于相同的反應容器以進行pcr。一般的置放方式通常是通過吸量管將單瓶儲存的引子對、酶和dntp混合物和緩沖液試劑以及樣品一一以手動方式以吸量管移液到反應容器中。最常見的承載容器是96孔盤。利用前述置放方式，pcr檢測至少需要兩回合(兩回)的吸量管移液操作，其中一回添加樣品到反應容器中，而另一回添加引子對到反應容器中。例如，假設利用一個檢驗套組來檢查在一個樣品中的36個目標，則需要至少36回移液操作以添加各自引子對到36個不同的反應容器中，另外，需要36回移液操作以添加樣品至上述各反應容器。此種操作方式不僅復雜容易出錯，而且須耗用大量的人力。

若在個別反應容器預先填充引子對，則實驗操作者只需要添加樣品到已經預先填充好的容器內。以前述例子而言，測試一個樣品的36個目標，將只需要36回移液操作添加樣品至預先填充好的36個反應容器中。此外，可同 時降低反應容器體積至約納升(nano-liter)的范圍內，以節省檢測試劑使用量。在此改良下，常見作為承載容器的96孔盤，其樣式將改為類似試片的微滴定板。

然而，微滴定板的反應容器(也稱為微井或納米井孔)的尺寸和體積太小，難以手動填充所用的引子對或樣品并同時避免造成相鄰反應容器之間的交叉污染(即引子對從一井散逸至其他井)，因此，需要特殊的微流體配劑分裝技術。更詳細而言，預先提供引子對至各納米井并且固定引子于該納米井的表面。之后，使用者即可以單一移液操作或通過單一微流體通道來添加樣品到各反應容器中，而無須擔心引子從一井散逸到其他井，使井與井之間的交叉污染降至最低。

后續進行樣品檢測時，每個反應容器中必須填充預定量的樣品。傳統的方法是，用移液吸管或針狀分注器將樣品逐個添加到反應井中。然而，隨著反應容器體積變小，井間的距離越接近，設計特殊的機械機構的分注器或路徑，個別傳送至每個反應容器是復雜且耗時的。若藉由特殊的試片裝置設計來達到單一移液操作或通過單一微流體通道來添加樣品到各反應容器中，將可以大大簡化聚合酶鏈反應配制檢測試劑所需的人為操作，并增加填充樣品的便利性。

技術實現要素：

本發明提供了一種多工試片裝置及其操作方法，適用于分子生物檢測；特別是，用于聚合酶鏈反應；且更具體地，應用于實時聚合酶鏈反應。藉由本發明的多工試片裝置及其操作方法，樣品可以迅速且均勻地載入試片的每一反應容器中，以單一回移液操作在很短的時間內便能填充所有的反應容器。

本發明提供一種多工試片裝置，其包括試片及犧牲層。試片具有多個反應容器、第一注入孔與第一排氣孔。反應容器布置為陣列，每一反應容器具開口部和底部。犧牲層具有微流道，微流道具有相互連通的注入流道、主要流道及末端流道。犧牲層適于與試片組裝，其中主要流道面對開口部而組裝。從第一注入孔注入樣品溶液至注入流道，以使樣品溶液從注入流道流過主要流道至末端流道，其中樣品溶液在流過主要流道時，載入每一反應容器中。

在本發明的一實施例中，多工試片裝置還包括用以容置試片及犧牲層的 殼體，殼體具有第二注入孔與第二排氣孔，其中依序從第二注入孔及第一注入孔注入樣品溶液至注入流道，以使樣品溶液從注入流道流過主要流道至末端流道，其中樣品溶液在流過主要流道時，載入每一反應容器中。

在本發明的一實施例中，殼體的材料包括導熱材料。

在本發明的一實施例中，殼體包括上蓋及底板，上蓋適于與底板組裝，且上蓋具有用以容置試片及犧牲層的凹槽，第二注入孔及第二排氣孔位于上蓋中。

在本發明的一實施例中，試片的材料包括透光性材料。

在本發明的一實施例中，透光性材料包括聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。

在本發明的一實施例中，犧牲層的材料包括蠟。

本發明提供一種多工試片裝置，其包括試片及犧牲層。試片具有多個反應容器，且反應容器布置為陣列，每一反應容器具有開口部和底部。犧牲層具有微流道，微流道具有相互連通的注入流道、主要流道及末端流道。犧牲層適于與試片組裝，其中主要流道面對開口部而組裝。將樣品溶液注入至注入流道，以使樣品溶液從注入流道流過主要流道至末端流道，其中樣品溶液在流過主要流道時，載入每一反應容器中。

在本發明的一實施例中，還包括用以容置試片及犧牲層的殼體，殼體具有注入孔與排氣孔，其中從注入孔注入樣品溶液至注入流道，以使樣品溶液從注入流道流過主要流道至末端流道，其中樣品溶液在流過主要流道時，載入每一反應容器中。

在本發明的一實施例中，殼體的材料包括導熱材料。

在本發明的一實施例中，殼體包括上蓋及底板，上蓋適于與底板組裝，且上蓋具有用以容置試片及犧牲層的凹槽，注入孔及排氣孔位于上蓋中。

在本發明的一實施例中，試片的材料包括透光性材料。

在本發明的一實施例中，透光性材料包括聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。

在本發明的一實施例中，犧牲層的材料包括蠟。

本發明提供一種多工試片裝置的操作方法，包括組裝包含試片、犧牲層及用以容置試片及犧牲層的殼體的多工試片裝置。試片具有布置為陣列的多個反應容器，每一反應容器具開口部和底部，犧牲層具有微流道，微流道具有相互連通的注入流道、主要流道及末端流道，其中主要流道面對開口部而 組裝。接著，將樣品溶液經由殼體的注入孔注入至注入流道，以使樣品溶液從注入流道流過主要流道至末端流道，其中樣品溶液在流過主要流道時，載入每一反應容器中。之后，將油經由殼體的注入孔注入至注入流道，以使油從注入流道流過主要流道至末端流道，其中油在流過主要流道時，排除未裝載于反應容器中的樣品溶液。接下來，加熱以使犧牲層熔化，熔化后的犧牲層與油混合。

在本發明的一實施例中，油包括礦物油或硅油。

在本發明的一實施例中，殼體的材料包括導熱材料。

在本發明的一實施例中，試片的材料包括透光性材料。

在本發明的一實施例中，透光性材料包括聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。

在本發明的一實施例中，犧牲層的材料包括蠟。

基于上述，本發明提供了一種多工試片裝置及其操作方法，使樣品在流過犧牲層的主要流道時，迅速且均勻地載入試片的每一反應容器中，再藉由油排除未裝載于反應容器中的樣品溶液。如此一來，以單一回移液操作在很短的時間內便能填充所有的反應容器，因此，能夠簡化實驗操作并節省時間。

另一方面，試片與犧牲層之間間隔至少約10μm的距離，而犧牲層具有一定厚度。在聚合酶鏈反應的實驗過程中，加熱以使犧牲層熔化，熔化后的犧牲層與油混合，進而使試片與底板之間具有約600μm的距離，以使反應順利進行。由于不需添加過量樣品，即可使試片與底板之間維持特定距離，因此，具有節省樣品添加量的作用。

為讓本發明的上述特征和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，并配合附圖作詳細說明如下。

附圖說明

圖1是根據本發明第一實施例的多工試片裝置的結構示意圖；

圖2是根據本發明第一實施例的試片的結構示意圖；

圖3是根據本發明第一實施例的試片的反應容器的剖面示意圖；

圖4是根據本發明第一實施例的多工試片裝置應用于樣品溶液裝載的示意圖；

圖5是根據本發明第二實施例的多工試片裝置應用于樣品溶液裝載的示 意圖；

圖6a至圖6c是根據本發明多工試片裝置的操作方法的示意圖。

附圖標記：

10：試片

12、42：注入孔

14、44：排氣孔

16：雙階結構

20：犧牲層

22：注入流道

24：主要流道

26：末端流道

28：微流道

30：殼體

40：上蓋

50：底板

60：空間

70a、70b：樣品溶液

80：油

100：檢測區域

102、160a、160b、160c、160d、160e、160f：反應容器

102a：開口部

102b：底部

x：第一階

y：第二階

具體實施方式

本發明提供一種多工試片裝置及其操作方法，可以廣泛地應用于不同類型的反應檢驗。下文中，先針對說明書內文所使用的名詞加以定義說明。

“試劑”可指用于一個特定測試/檢驗的數種成分的配方或制劑。例如，在采用聚合酶鏈反應的試驗中，檢測試劑包括一對引子、酶、dntps、熒光 報導物與鹽類等。在應用程序中，不同的引子對和熒光報導物可能先被添加到反應容器中，再其次是樣品與酶、dntp和其它添加劑混合再加到反應容器中。

“樣品”是指被測試的核酸樣品。例如，樣品可以是從血液、組織、唾液等來源中提取的核酸片段(包括dna或rna等)。

“分析”或”試驗”可指對同一樣品進行的一或多個實驗或測試項目。例如，使用pcr來針對核酸樣品檢測300單核苷酸多態性(300snp)基因型，該檢測包括數種pcr檢測項目，通過檢查每個單核苷酸多態性(snp)的每個基因型(a、t、c、g)。例如，使用實時熒光定量pcr確定一個特定序列的核酸量。

“樣品溶液”指的是上述“樣品”與混合試劑(mastermix)的混合物或混合溶液。

“反應容器”可指管盤的各個管、各反應管、微滴定板的孔或井，或測試試片或陣列板的凹坑/孔。如本文所述，“試片”、“試片板”、“檢測陣列板”或“檢測板”均可指容納前述反應容器的同一基底或基板。

當在容器中的液體體積減小到一定程度時，在容器中的液體流動主要是由表面的附著力而非重力所控制。如果容器中的液體體積只有幾納升，該液體具有較高的表面黏附性會黏著到容器(納井)上，也就是說，此時液體可以被視為黏接劑般穩定附著至容器底部或容器壁上。

較佳的，反應容器可以是試驗試片或檢測陣列板的單個反應孔或井。正如前面所討論的，優選乃是使用更小的體積的反應容器，其尺寸例如從幾納升到幾百納升不等。

圖1是根據本發明第一實施例的多工試片裝置的結構示意圖。

請參照圖1，多工試片裝置包括試片10、犧牲層20以及殼體30，其中殼體30可用以容置試片10及犧牲層20。在下文中，將先參照圖2及圖3，針對試片10的結構進行詳細說明。

圖2是根據本發明第一實施例的試片的結構示意圖。

請參照圖2，試片10具有檢測區域100，且檢測區域100的面積例如是22.5毫米×22.5毫米。檢測區域100中包含多個反應容器102，且反應容器102布置為n×n陣列。此外，試片10更具有注入孔12與排氣孔14。在本實施例 中，試片10的尺寸例如是42毫米×36毫米×2毫米。更詳細而言，試片10的材料可包括透光性材料，且透光性材料例如是聚碳酸酯(pc)或聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)。

請再參照圖2，從試片10的剖視圖(圖2的右側部分)來看，每一反應容器102具有較寬的開口部102a和較窄的底部102b。在本實施例中，每個反應容器102的深度d1例如是100微米，其開口部102a的尺寸例如是200微米(l1)×185微米(w1)，底部102b的尺寸例如是106.74微米(l2)×91.74微米(w2)。反應容器102之間的間距p1范圍例如是25微米至40微米。反應容器102的傾斜側壁的角度θ例如是90度至140度，優選在100度至135度之間，更優選在110度至120度之間。每一反應容器102可以容納例如2.1納升的樣品溶液。

圖3是根據本發明第一實施例的試片的反應容器的剖面示意圖。

請參照圖3，試片10的反應容器可以設計成具有不同的形狀或配置方式。舉例而言，反應容器160a及160b乃是在試片10內形成的凹槽但沒有貫通試片10。反應容器160b、反應容器160d及反應容器160f具有傾斜側壁。反應容器160c、反應容器160d、反應容器160e及反應容器160f貫穿試片10而在試片10的頂面和底面上有兩個開口端。由于毛細作用，樣品液體能穩滯于反應容器160c、反應容器160d、反應容器160e及反應容器160f中。反應容器160d穿透試片10且在試片10的頂面和底面上具有兩個開口端，并有傾斜的側壁連接的兩個開口端。

然而，圖2及圖3中所示的結構圖僅用于例示說明本實施例，本發明反應容器的形狀、大小或數量并不以此為限，且反應容器的橫截面形狀亦可以是例如圓形，方形或多邊形。

一般情況下，引子是溶于水性溶劑或溶液，本發明的試片可設計為反應容器的內壁和底表面是親水性的，而各反應容器之間是疏水性的。試劑或探針將只附著至親水性區域，也就是說，只附著到反應容器的內壁和底部表面。每個反應容器的尺寸可以是小于1毫米。以此尺寸大小規模，少量的樣品液體可以在10秒內溢流填充大量的反應容器，顯著提高了樣品裝載效率。

圖4是根據本發明第一實施例的多工試片裝置應用于樣品溶液裝載的示意圖。接著，在下文中，將同時參照圖1、圖2及圖4對本發明第一實施例 的多工試片裝置的結構及其于樣品溶液裝載的應用進行說明。

請參照圖1，犧牲層20具有微流道28，且微流道28具有相互連通的注入流道22、主要流道24及末端流道26。在本實施例中，犧牲層20的材料可包括蠟，因此，在聚合酶鏈反應中加熱至約60℃時可熔化。然而，本發明并不以此為限，亦可使用任何可熔溫度范圍在高于室溫至60℃的材料，且較佳使用可熔溫度為約60℃的材料。更詳細而言，犧牲層20的尺寸例如是37.6毫米×39.6毫米×1.3毫米，微流道28的深度例如是0.12毫米，主要流道24的尺寸例如是22.5毫米×22.5毫米。

請同時參照圖1及圖2，犧牲層20適于與試片10組裝，其中主要流道24面對試片10中反應容器102的開口部102a而組裝。請同時參照圖1、圖2及圖4，可從試片10的注入孔12注入樣品溶液至注入流道22，以使樣品溶液從注入流道22流過主要流道24至末端流道26，其中樣品溶液在流過主要流道24時，載入試片10的每一反應容器102中(樣品溶液的流動方向如圖4中的虛線箭頭所示)。

在圖2中，試片10的注入孔12與排氣孔14以對角線形式配置，但本發明并不以此為限，注入孔12與排氣孔14的配置方式亦可依犧牲層20的注入流道22及末端流道26的配置方式而加以調整，只要能夠使樣品溶液在流動過程中充分延展即可。

如圖1所示，殼體30可包括上蓋40及底板50，其中上蓋40適于與底板50組裝。更詳細而言，上蓋40的尺寸例如是45mm×43mm×5mm，底板50的尺寸例如是42mm×40mm×2mm。在本實施例中，上蓋40可具有用以容置試片10及犧牲層20的凹槽，且注入孔42及排氣孔44可位于上蓋40中。然而，本發明中殼體30的結構并不以此為限，亦可使用任何其他能夠容置試片10及犧牲層20的結構。舉例而言，殼體30也可以是一體成型結構，其中具有卡榫而能夠開合以置入試片10及犧牲層20。此外，亦可以使用導槽推進結構使試片10及犧牲層20容置于殼體30中。

更詳細而言，殼體30在聚合酶鏈反應中具有導熱的作用，其材料可包括導熱材料，導熱材料例如是鋁或銅等金屬、石墨或晶圓，但本發明并不以此為限。此外，殼體30更具有使試片10及犧牲層20與外界隔絕，以避免反應受到影響的作用。

在本實施例中，殼體30可包括標示標簽(未顯示)，當本發明的多工試片裝置應用于設置有標簽讀取裝置的儀器(例如：熱循環儀)時，標簽讀取裝置可以讀取殼體30上的標示標簽，其中標示標簽例如是手寫標記、條形碼或其他標記，但本發明并不以此為限，亦可依需求及所搭配使用的標簽讀取裝置選擇適用的標示標簽。

請同時參照圖1、圖2及圖4，可依序從殼體30的注入孔42及試片10的注入孔12注入樣品溶液至注入流道22，以使樣品溶液從注入流道22流過主要流道24至末端流道26，其中樣品溶液在流過主要流道24時，載入試片10的每一反應容器102中(樣品溶液的流動方向如圖4中的虛線箭頭所示)。另外，如圖4所示，試片10可更具有位于其邊緣處的雙階結構16，雙階結構16與犧牲層20、上蓋40及底板50之間可形成空間60，空間60具有防止氣泡產生的作用。在本實施例中，雙階結構16可具有第一階x以及第二階y，其中第一階x與第二階y的厚度比例例如是1:1，且第一階x與第二階y的厚度例如分別是1mm，總厚度例如是2mm。

在圖1中，上蓋40的注入孔42及排氣孔44以對角線形式配置，但本發明并不以此為限。注入孔42及排氣孔44的配置方式是依據試片10的注入孔12與排氣孔14的配置方式而定。即，如上文所述，可依犧牲層20的注入流道22及末端流道26的配置方式而加以調整，只要能夠使樣品溶液在流動過程中充分延展即可。

圖5是根據本發明第二實施例的多工試片裝置應用于樣品溶液裝載的示意圖。圖5所示的第二實施例相似于圖1、圖2、圖3及圖4所示的第一實施例，故相同組件以相同標號表示且在此不予贅述。

本實施例與上述第一實施例不同之處在于，試片10不具有注入孔12及排氣孔14，且試片10不具有位于其邊緣處的雙階結構16。此外，犧牲層20的尺寸大于試片10的尺寸。舉例而言，試片10的尺寸可與上述第一實施例相同，而犧牲層20中主要流道24的尺寸例如是大于22.5毫米×22.5毫米。

請參照圖5，可從殼體30的注入孔42注入樣品溶液至注入流道22，以使樣品溶液從注入流道22流過主要流道24至末端流道26，其中樣品溶液在流過主要流道24時，載入試片10的每一反應容器102中(樣品溶液的流動方向如圖5中的虛線箭頭所示)。

本發明更提供一種上述第一實施例及第二實施例中所述多工試片裝置的操作方法。圖6a至圖6c是根據本發明的多工試片裝置的操作方法的示意圖。接著，在下文中，將參照圖6a至圖6c對本發明的多工試片裝置的操作方法進行說明。必須說明的是，有關多工試片裝置的結構及樣品溶液裝載的細節已于上文中詳細地描述，故在此不予贅述。

首先，組裝多工試片裝置，經組裝完成的多工試片裝置經例如點膠方式固定密封以維持氣密狀態，避免樣品溶液向外流動。

接著，藉由移液操作(pipetting)或其他適用的液體分裝器，將樣品溶液經由殼體的注入孔注入至注入流道，以使樣品溶液從注入流道流過主要流道至末端流道。如圖6a所示，樣品溶液70a及樣品溶液70b在流過主要流道24時，載入每一反應容器102中。更詳細而言，樣品溶液的添加總量例如是60μl。

之后，將油經由殼體的注入孔注入至注入流道，以使油從注入流道流過主要流道至末端流道。如圖6b至圖6c所示，油80在流過主要流道24時，排除未裝載于反應容器102中的樣品溶液70b。更詳細而言，油例如是礦物油或硅油。

接下來，在聚合酶鏈反應的實驗過程中，加熱以使犧牲層熔化，熔化后的犧牲層與油混合，其中犧牲層經加熱以融化的溫度例如是約60℃。必須說明的是，本發明的試片與犧牲層之間間隔至少約10μm(例如是10μm至50μm)的距離，而犧牲層具有一定厚度(例如是550μm至590μm的厚度)。因此，當熔化后的犧牲層與油混合時，能夠使試片與底板之間具有約600μm的距離，以使反應順利進行。由于不需添加過量樣品，即可使試片與底板之間維持特定距離，因此，具有節省樣品添加量的作用。

綜上所述，本發明提供了一種適用于分子生物檢測的多工試片裝置及其操作方法，使樣品溶液在流過犧牲層的主要流道時，迅速且均勻地載入試片的每一反應容器中，再藉由油排除未裝載于反應容器中的樣品溶液。如此一來，以單一回移液操作在很短的時間內便能填充所有的反應容器，因此，能夠簡化實驗操作并節省時間。此外，由于不需添加過量樣品，即可使試片與底板之間維持特定距離，因此，本發明更具有節省樣品添加量的作用。

雖然本發明已以實施例揭示如上，然其并非用以限定本發明，任何所屬 技術領域中普通技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可作些許的改動與潤飾，故本發明的保護范圍當視所附權利要求界定范圍為準。