一種新多肽PAP1及其應用的制作方法

本發明屬于藥物及日化領域，具體涉及一種新多肽pap1及其應用。

背景技術：

組織創傷后的愈合過程是各種修復細胞增殖、分化、遷移和凋亡的過程。炎癥、潰瘍、燙傷、創傷、手術以及先天性畸形等多種急慢性損傷可引起大面積皮膚缺損、難愈性潰瘍和疤痕，并引發許多局部與全身系統的反應，其危害十分嚴重。多肽藥物在促進創面愈合、預防疤痕及治療慢性潰瘍方面具有獨特的優勢。其中表皮生長因子(hegf)、堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)等多肽具有明顯的修復創傷、護膚、抗皺和防衰老作用，但它們的制備成本高、穩定性較差，限制了其應用。

技術實現要素：

為了克服現有技術的不足和缺點，本發明的首要目的在于提供一種新多肽pap1。

本發明的另一目的在于提供上述新多肽pap1的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種新多肽pap1，其結構如式i所示：

h-ser-ser-pro-tyr-thr-ser-gly-pro-his-pro-gly-val-val-tyr-oh式i；

所述的新多肽pap1的制備，可采用現有技術中的公知方法進行，既可以用多肽自動合成儀按常規固相合成方法進行化學合成，也可以通過將短肽序列推導出核苷酸序列，然后克隆到表達載體中進行生物合成；

所述的新多肽pap1在制備促進組織修復或改善皮膚美感的產品中的應用；

優選的，所述的新多肽pap1在制備治療創傷、燙傷、潰瘍或改善皮膚美感的產品中的應用；

所述的產品優選為藥品、化妝品或日化用品；

所述的藥品、化妝品或日化用品中含有有效劑量的多肽pap1，余量為輔料或其它可配伍的藥物；

所述的輔料是指常規的賦形劑，如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑和粘合劑等；

所述的其它可配伍的藥物，是指其它天然藥物、化學藥物或生物藥物；

所述的藥品、化妝品或日化用品可以采用片劑、膠囊劑、注射劑、脂質體納米粒、控釋劑、凝膠膏劑、軟膏劑、外用搽劑、貼劑(例如面膜)、霜劑(例如面霜)、洗滌劑(例如香波、香皂、泡沫浴或浴鹽)、乳液、凝膠、爽膚水等。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

(1)本發明合成了一種新多肽pap1，其結構如式i所示。

(2)本發明提供的新多肽pap1在較低濃度(1.56～3.13μg/ml)下即可促進小鼠胚胎成纖維細胞的增殖和人永生化表皮細胞的遷移，具有促進組織修復作用。

(3)本發明提供的新多肽pap1結構穩定，可用于治療消化道潰瘍、口腔潰瘍，并具有美白，去除皺紋、疤痕和色斑作用。

(4)本發明提供的新多肽pap1的毒性較低，在口服200mg/kg劑量下未觀察到明顯的毒副作用。

(5)本發明提供的新多肽pap1容易合成，易于大量制備。

附圖說明

圖1是新多肽pap1的¹hnmr譜圖。

圖2是新多肽pap1的¹³cnmr譜圖。

圖3是新多肽pap1的高分辨率質譜圖。

圖4是新多肽pap1對balb/c3t3細胞增殖影響的結果分析圖。

圖5是新多肽pap1對hacat細胞水平遷移影響的結果分析圖。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例1新多肽pap1的合成

采用全自動多肽合成儀常規固相合成方法，經過樹脂溶脹、脫保護、洗滌、氨基酸溶解、氨基酸活化、縮合過程，完成新多肽pap1的合成(委托合肥國肽生物科技有限公司合成)。

實施例2多肽pap1的結構鑒定

實施例1制得的新多肽pap1為白色粉末；uv(meoh)λmax(logε)205(3.85),224(1.61),279(0.12)nm；ir(kbr)νmax3300,2968,2889,1664,1537,1447,1205,1132,801,722cm^-1；hr-esi-msm/z1447.6919[m+h]⁺(c66h94n16o21,計算值1447.6852)。氫譜(¹hnmr)和碳譜(¹³cnmr)數據見表1(由2d-nmr歸屬)。氨基酸測序結果為：h-ser-ser-pro-tyr-thr-ser-gly-pro-his-pro-gly-val-val-tyr-oh。其¹h,¹³cnmr圖譜見圖1～2；高分辨率質譜見圖3。根據以上理化和光譜數據，鑒定出pap1的化學結構，如式i所示。

表1pap1的¹h(500mhz)和¹³c(125mhz)nmr數據

^a)measuredat500mhz.^b)measuredat125mhz.^c)overlappedsignalswerereportedwithoutdesignatingmultiplicity.

實施例3新多肽pap1對balb/c3t3細胞增殖的促進作用

將處于對數生長期的細胞(balb/c3t3細胞株，購自美國模式培養物集存庫americantypeculturecollection，atcc)用胰酶消化、離心、重懸后進行細胞計數，按3000個細胞/孔接種于96孔板中，輕拍至細胞分散均勻，pbs封閉。37℃、5％co2培養過夜。棄培養基，加入含體積分數0.5％fbs的饑餓培養基處理24h，使細胞同步化；棄饑餓培養基，加入完全培養基配置不同濃度的多肽pap1(實施例1制得)，37℃、5％co2培養箱孵育48h。按10μl/孔加入cck8試劑，37℃孵育3h，酶標儀450nm、630nm雙波長檢測。計算細胞存活率，重復實驗至少3次以上；

試驗結果如圖4所示，pap1在較低濃度(1.56～3.13μg/ml)下對balb/c3t3細胞具有顯著的促增殖作用，且其活性強于市售藥物康復新液。

實施例4新多肽pap1對hacat細胞遷移的促進作用

將對數生長期的hacat細胞(購自美國模式培養物集存庫americantypeculturecollection,atcc)，胰酶消化，重懸，按1×10⁶個/孔接種到12孔板，置37℃，5％co2培養箱內培養至細胞長滿培養孔。吸棄培養液，pbs洗滌，用無菌槍頭在每個試驗孔中央垂直于培養孔自上而下劃線。用pbs洗去劃痕產生的細胞團，使劃痕邊緣整齊。加入新鮮培養基以及pap1(0.80μg/ml)(實施例1制得)，顯微鏡下拍照，繼續置于細胞培養箱中培養。每隔12個小時觀察記錄，所得圖像數據用imageproplus6.0處理。在劃痕每側邊緣均勻選取30個點，取其中線代表劃痕邊緣，測量劃痕間距，并用以下公式計算劃痕修復率：劃痕修復率＝(0h劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度)/0h劃痕寬度。

試驗結果顯示，pap1組hacat細胞的遷移率高達93％(72小時)，明顯高于對照組59％(72小時)(圖5)，說明新多肽pap1能夠明顯促進hacat細胞的水平遷移。

實施例5新多肽pap1對小鼠皮膚創傷的修復作用

選取40只8～10周雄性昆明小鼠(購自廣東省動物中心)分籠飼養，自由取食，實驗前一天停止進食。用質量分數1％戊巴比妥鈉0.2ml腹腔注射麻醉小鼠，背部剪毛，脊柱表皮皮膚上下對稱開0.5cm×0.5cm正方形傷口，剪去全層皮膚，勿傷及肌肉層，傷口止血備用。次日，乙醚麻醉小鼠，傷口滴加不同溶度的pap1(0.1mg/ml或0.2mg/ml)、生理鹽水和康復新液各0.1ml，每日換藥一次。于3、5、10天觀察創面愈合情況。先將創面面積描繪在透明薄膜上，再以此為模板，將質地均勻的硬紙片剪成同樣大小，然后用分析天平稱質量。以硬紙片質量間接地表示創面面積大小。按公式計算創面愈合率：創面愈合率(％)＝(原始創面面積-未愈合創面面積)/原始創面面積。結果見表2。

表2小鼠創傷愈合率統計結果

注：與模型組相比，**p＜0.01有顯著性差異

試驗結果表明，新多肽pap1能夠明顯促進小鼠皮膚創傷的愈合，與對照組比較具有顯著性差異，且優于康復新液。

實施例6新多肽pap1對小鼠皮膚燙傷的修復作用

選取40只8～10周雄性昆明小鼠(購自廣東省動物中心)分籠飼養，自由取食，實驗前一天停止進食。用質量分數13％na2s溶液涂抹脫毛，將20g的砝碼置于水浴鍋內一同加熱至沸，維持10min，然后用鉗子夾住砝碼上端，迅速放在小鼠皮膚上5s，稍加壓力，形成燙傷面積為2cm×2cm的淺ⅱ度燙傷模型。次日，傷口滴加不同溶度的pap1(0.1mg/ml或0.2mg/ml)、生理鹽水和康復新液各0.1ml，每日換藥一次。于3、5、10天觀察創面愈合情況。按實施例5的方法計算創面愈合率。結果見表3。

表3小鼠燙傷愈合率統計結果

注：與模型組相比，**p＜0.01有顯著性差異

試驗結果表明，新多肽pap1能夠明顯促進小鼠皮膚燙傷的愈合，與對照組比較具有顯著性差異，且優于康復新液。

實施例7新多肽pap1對大鼠應激性胃潰瘍的保護作用

試驗方法：取體重180～210g雄性sd大鼠50只(購自廣東省動物中心)，隨機分為空白組、模型組、硫糖鋁組(1g/kg，陽性藥組)、低劑量組(pap11mg/kg)和高劑量組(pap12mg/kg)。給藥組灌胃給藥，連續7天。造模前24h禁食不禁水，除對照組外，采用束縛水浸法造模，將各組大鼠固定于鼠板，頭向上垂直浸泡在恒溫(20℃)水槽中8h，水面與大鼠劍突齊平。應激造模結束后，將大鼠頸椎脫臼處死，剖腹，結扎幽門。向胃內灌注體積分數10％甲醛溶液2ml，結扎賁門，取出胃體置于甲醛溶液中固定15min。沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗后展開，觀察胃黏膜損傷并計算胃潰瘍指數。按guth標準計算潰瘍指數(ui)：點狀出血計為1分，線狀出血長度<1mm為2分，1～2mm為3分，2～4mm為4分，>4mm為5分，寬度>1mm時分值×2。結果見表4。

表4大鼠潰瘍指數統計結果

注：與模型組相比，**p＜0.01有顯著性差異

試驗結果表明，新多肽pap1對大鼠應激性胃潰瘍具有明顯保護作用，與模型組比較具有顯著性差異，其保護效果優于陽性藥硫糖鋁。

實施例8新多肽pap1對大鼠口腔潰瘍的保護作用

試驗方法：取體重180～210g健康sd大鼠40只(購自廣東省動物中心)，隨機分為模型組、陽性藥組(康復新液)、低劑量組和高劑量組，采用化學灼燒法造模。向內徑0.4cm、長3cm的玻璃管中注滿體積分數80％冰醋酸，一端塞入棉花，將棉花端于大鼠下唇黏膜表面垂直固定5秒，使局部有紅暈和水腫，24小時后觀察，出現潰瘍并重度充血、水腫，潰瘍面直徑＞3mm者即造模成功。實驗組、模型組和陽性藥組的潰瘍面分別滴加不同溶度的pap1、生理鹽水和康復新液各0.1ml，每日給藥一次。于1、2、3天后觀察潰瘍面愈合情況。潰瘍積分標準如下：無充血、水腫潰瘍面直徑＜1mm記1分；輕度充血、水腫，潰瘍面直徑1～2mm記2分；中度充血、水腫，潰瘍面直徑2～3mm記3分；重度充血、水腫潰瘍面直徑＞3mm記4分。結果見表5。

表5大鼠口腔潰瘍愈合積分

注：與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01

試驗結果表明，新多肽pap1能夠明顯促進大鼠口腔潰瘍的愈合，與模型組比較具有顯著性差異，且優于康復新液。

實施例9新多肽pap1的急性毒性實驗

試驗方法：取體重18～22g的昆明種小鼠(購自廣東省動物中心)，隨機分組，每組10只，灌胃不同劑量的多肽pap1，根據小鼠存活情況，計算半數致死劑量ld50。半數致死量按如下公式計算：半數致死劑量(mg/kg)＝(小鼠一半死亡時的劑量/對應小鼠的體重)。

試驗結果：多肽pap1在200mg/kg的給藥劑量下，未觀察到小鼠死亡，說明它的毒性較低，ld50大于200mg/kg(表6)。

表6pap1對小鼠的急性毒性作用

實施例10新多肽pap1的皮膚安全性評價

受試人群：年齡18～50歲之間，女性18人，男性12人，總計30人。受試者皮膚健康，無皮膚病過敏史，符合受試者志愿入選標準。

試驗方法：選用合格的斑貼器，以封閉式斑貼試驗方法，將多肽pap1約0.020～0.025ml(2mg/ml)滴于斑貼器內，外用專用膠帶貼覆于受試者背部，24小時后去除試驗品，分別于去除后0.5、6、12、24、48小時觀察皮膚反應，按照《化妝品衛生規范》中皮膚反應分級標準記錄其結果。

試驗結果：本試驗30名受試者通過斑貼試驗，在0.5、6、12、24、48小時觀察皮膚反應，均未觀察到皮膚不良反應，說明本發明的新多肽pap1對皮膚使用安全。

實施例11片劑的制備

多肽pap10.1g，乳糖40g，淀粉漿60g，硬脂酸鎂0.2g，混合，過篩，干燥后壓片。每片含pap10.001g。

實施例12注射劑的制備

多肽pap10.1g，丙二醇50g，研磨，再加100ml注射用水稀釋，混勻，然后加入氯化鈉9g，溶解后再加入注射用水至1000ml，調ph值5.5～6.5，濾過，灌封，滅菌，即得1000支注射用針劑。

實施例13固體脂質納米顆粒的制備

多肽pap10.1g，大豆卵磷脂500mg，溶于25ml乙醇中，另取硬脂酸200mg和大豆卵磷脂500mg溶于25ml環己烷中，混合攪拌均勻；于37℃恒溫水浴中減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，使藥物及輔料在燒瓶壁形成均勻脂質薄膜，于真空干燥器中放置過夜，除盡有機溶劑；另取聚乙二醇單硬脂酸酯3750mg，攪拌溶解在175ml水中，加入上述薄膜中，超聲10min，定容至250ml，得淡黃色透明溶液；將此溶液冷凍干燥可得凍干粉。用球磨機研磨24小時，制得粒徑均勻的納米粒，混勻并分裝。每袋含pap10.001g。

實施例14控釋膠囊的制備

多肽pap10.1g，乳糖40g和淀粉漿10g，直接裝到旋轉制粒機/包衣器制備顆粒，將稀釋到質量分數為15％固體的塑化乙基纖維素包衣劑懸浮液噴霧到多肽顆粒的旋轉床上。在噴霧期間，用泊洛沙姆188制成的分散體載體膜包衣顆粒，形成平均顆粒度大約為450μm的持續釋放的顆粒。混勻裝入膠囊，每個膠囊含pap10.001g。

實施例15外用凝膠膏劑的制備

稱取甘油2g，依次加入聚丙烯酸0.75g和氫氧化鋁0.1g，充分混合，加入pap10.01g，在真空條件下充分攪拌混合得①；另外稱取純化水5g，將乳酸0.06g、羧甲基纖維素鈉0.1g溶解在水得②；將②加入到①中，在真空條件下充分攪拌，經交聯反應得到含藥膏體，將含藥膏體涂布(控制含藥膏體層厚度在1.0mm左右)，裁剪成常規貼膏劑的規格，每貼含藥物的量為0.001g，晾干，包裝。

實施例16軟膏劑的制備

硬脂醇20g與白凡士林21g在水浴中熔化，加熱至75℃，備用。十二烷基硫酸鈉1.46g，羥苯甲酯0.025g，羥苯丙酯0.015g，丙二醇10g，pap10.05g依次溶于水中，加熱至75℃，將75℃硬脂醇與白凡士林加入，攪拌至冷，制成含pap10.05％的軟膏劑。

實施例17外用搽劑的制備

取pap10.025g，溶解于45ml蒸餾水中，過濾，濾液加入甘油5ml，氮酮1ml，蒸餾水補足體積至50ml，制成含pap10.05％的外用搽劑。

實施例18面霜的制備

將26號白油1g，十六十八醇1g，硬脂酸1g，單甘脂0.5g，350硅油0.05g，gtcc0.5g，尼泊金甲酯0.03g混合，加熱到90℃，制成第一半成品；在第一半成品中加入去離子水4g、pap10.005g、平平加-200.3g、甘油0.5g，并加熱到80℃，形成第二半成品；將第二半成品在80℃下進行2次均質(轉速3000轉/分鐘，時間10分鐘)后繼續攪拌30分鐘，冷卻到45℃形成膏霜狀后加入0.005g卡松，混勻，得到含0.05％pap1的面霜。

實施例19面膜的制備

將pap10.01g溶解于10ml去離子水中，過濾，濾液與甘油潤濕的卡波姆0.3g混合，加入三乙醇胺，調節ph值為6～7，均勻涂布于面膜紙，制成每張含有pap10.001g的面膜。

實施例20爽膚水的制備

將0.01gpap1配置為0.02mg/ml的水溶液；將甘油5g加入透明質酸1g中分散，加水溶解，攪拌均勻，得透明質酸溶液；將海藻糖1g和尿囊素1g用水溶解后與上述透明質酸溶液混合，攪拌均勻，得混合溶液；將多肽溶液、d-泛醇1g、燕麥β-葡聚糖10g、1,2-戊二醇10g和防腐劑0.05g依次加入上述混合溶液，加水攪拌均勻，即得爽膚水。

實施例21乳液的制備

(1)將0.01gpap1配置為0.02mg/ml的水溶液；

(2)將0.05g透明質酸鈉加水溶解分散，攪拌均勻，得透明質酸溶液；

(3)將甘油5g、丁二醇3g、海藻糖2g、尿囊素0.2g、增稠劑0.1g，用水溶解，加熱至75℃；

(4)將霍霍巴籽油2g、氫化聚癸烯3g、聚二甲基硅氧烷2g、辛酸/癸酸三甘油酯3g、乳化劑3g加熱至75℃，攪拌均勻；

(5)將步驟(3)制得的產物快速倒入步驟(4)制得的產物中，恒溫均質3～5min，冷卻；

(6)冷卻至60℃以下，加入(1)、(2)，均質；冷卻至40℃以下，加入防腐劑和香精，即得乳液。

實施例22潔面啫喱的制備

將0.01gpap1配置為0.02mg/ml的水溶液；將上述多肽溶液、甘油2.5g、癸基葡糖苷3g、椰油酰蘋果氨基酸鈉3g、月桂醇聚醚硫酸酯鈉1.5g、增溶劑0.1g、香精0.05g依次加入水中攪拌，再加入增稠劑0.5g，攪拌至完全溶脹即可得潔面啫喱。

實施例23多肽pap1乳液的美容效果評價

1.1試驗品：本發明實施例21制備的多肽乳液

1.2受試人群：年齡18～55歲之間，女性20人，男性10人，總計30人。受試者皮膚有皺紋，色斑，色澤暗啞，以及皮膚上留有微創、手術后疤痕等不美觀因素。

1.3測試方法：受試者皮膚清潔后，將實施例21制備的乳液涂覆到皮膚上，觀察和感受使用效果。

1.4測試評估結果如表7：

表7多肽pap1乳液的試用(8周)反饋總結表

受試者表示，使用多肽pap1乳液產品，可提高肌膚含水量，增強肌膚保濕力和皮膚彈性，提高肌膚水嫩潤澤感。該產品具有美白，去皺紋、疤痕和色斑的效果。受試者未出現過敏現象。

實施例24多肽pap1面膜的美容效果評價

1.1試驗品：本發明實施例19制備的pap1多肽面膜

1.2受試人群：年齡18～55歲之間，女性22人，男性8人，總計30人。受試者臉部皮膚有皺紋，色斑，色澤暗啞，以及皮膚上留有微創、手術后疤痕等不美觀因素。

1.3測試方法：受試者臉部清潔后，將實施例19制備的pap1面膜涂覆于面部，每日一次，觀察和感受使用效果。

1.4測試評估結果如表8：

表8pap1多肽面膜的試用(8周)反饋總結表

受試者表示，使用pap1多肽面膜產品，可提高肌膚含水量，增強肌膚保濕力和皮膚彈性，提高肌膚水嫩潤澤感。產品具有美白，去皺紋、疤痕和色斑的效果。受試者未出現過敏現象。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。