基于CRISPR/Cas9技術的單子葉植物基因敲除載體及其應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域，具體涉及基于CRISPR/Cas9技術的單子葉植物基因敲除載體及其應用。

背景技術：

II型CRISPR/Cas9系統是來自鏈球菌屬的一種獲得性免疫系統，能夠抵御外源基因的入侵。經過人工修飾，這種系統在動植物中得到了廣泛應用。它主要由CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)和特異的Cas9蛋白組成。CRISPR是一成簇的規律間隔的短回文DNA重復序列，它由一系列短的高度保守的正向重復序列和長度相似的序列間隔排列組成。Cas9蛋白是一種由1409個氨基酸組成的多結構域蛋白，含有兩個核酸酶結構域RuvC-like和HNH。CRISPR/Cas9系統于2013年被Seung等人(Seung Woo Cho et al.,2013)首次成功運用于真核細胞的基因組編輯。基于CRISPR/Cas9的基因組編輯體系包括2部分：sgRNA及酶Cas9。這種系統能夠特異的識別毗鄰PAM(NGG)基序的靶序列，并在其上游3nt處進行切割，同時RuvC-like結構域在PAM區上游3～8nt處進行切割，形成DSB(double strains break),隨后機體通過自身的修復機制如同源重組、非同源重組來修復損傷的DNA,進而產生Indel(包括缺失和插入)的現象。

目前應用于植物上的CRISPR/Cas9載體構建體系并不多，有基于基因槍轉化的載體構建體系和基于農桿菌轉化的載體構建體系。在目前普遍使用的植物農桿菌轉化方面，基于CRISPR/Cas9技術的植物基因敲除載體體系構建過程比較繁瑣，需要多步才能將各個部分整合到雙元載體上。已報道的CRISPR/Cas9體系，有的體系是借助限制性內切酶BbsI先把sgRNA插入pATU6-26SK/pOsU6SK載體,再通過限制性內切酶KpnI和SalI酶切得到AtU6-sgRNA片段或通過KpnI和HindIII雙酶切獲得OsU6-sgRNA片段，同時將酶切過的SalI-Cas9-EcoRI或HindIII-Cas9-EcoRI片段與已用KpnI和EcoRI酶切的線性化的質粒pCAMBIA1300連接構建雙元載體，這種系統在構建過程中比較復雜而且周期長(ZY Feng,JK Zhu et al.,2013)；另外有利用合成的方法直接合成啟動子和sgRNA單元，再構建到雙元載體上，這種體系成本高，周期長(Wenzhi Jiang et al.,2013)。而在基因槍轉化方面中，已報道的體系都是將pU6-gRNA或pU3-gRNA載體與Cas9載體共同包裹在金粉中打入植物組織中，這種費用比較高。以上這些體系，要完成一個植物基因CRISPR/Cas9敲除載體的構建，要么成本高昂，要么過程繁瑣，且不能滿足高通量植物基因CRISPR/Cas9敲除載體構建的需求。

還有一種體系是將啟動子、sgRNA scaffold和Cas9片段整合到一個雙元載體，并選用BsaI作為插入位點，但是這種體系的缺陷在于，在兩個BsaI之間存在SpR(spectinomycin resistance gene壯觀霉素抗性基因)片段，在構建過程中需要Bsa I酶切回收線性化載體，再連接target site(HL Xing,L Dong et al.,2014)。

而本發明是將水稻OsU3啟動子及sgRNA元件與35S啟動子啟動的hSpCas9元件直接整合在已經突變掉兩個BspQ I識別位點的雙元載體pCAMBIA1300DM上，并在sgRAN scaffold元件中選用BspQ I作為靶序列的插入位點，且兩個BspQ I只間隔7bp堿基，只需要通過酶切純化獲取線性化載體，再一步連接的方法插入target oligos，實現簡便、快速和高效的構建CRISPR/Cas9基因敲除載體。

技術實現要素：

本發明的一個目的是提供一種基于CRISPR/Cas9技術的單子葉植物基因敲除載體pCambin1300DM-OsU3-Cas9，其具有以下特征：

(1)骨架載體為雙元載體pCAMBIA1300DM，所述雙元載體pCAMBIA1300DM是pCAMBIA1300中原有的2個BspQI酶切位點gaaGAgc和gcTcttc分別被突變成gaaCTgc和gcActtc的載體；

(2)在所述雙元載體pCAMBIA1300DM上，同時連入了sgRNA元件和Cas9元件；

(3)所述sgRNA元件由sgRNA啟動子、sgRNA-scaffold和靶點插入酶切位點組成；

(4)所述sgRNA啟動子為OsU3啟動子；

(5)所述靶點插入酶切位點為BspQ I，酶切位點信息為：

BspQ I:GGCAGAAGAGCAACACAAGCTCTTCA(SEQ ID NO：1)(6)所述Cas9元件為2x35S-Cas9-ter，其中2x35S為串聯的2個35S啟動子，ter為終止子(terminator)，Cas9為編碼基因Cas9的全長CDS序列并且兩端加有核定位的信號NLS(Nuclear localization signal)，N端加有Flag標簽。

本發明是將sgRNA結構單元與Cas9基因共同整合到骨架載體pCAMBIA1300DM上的敲除載體pCAMBIA1300DM-OsU3-Cas9，同時sgRNA結構單元中有BspQI的插入位點，其序列如下：

BspQ I:GGCAGAAGAGCAACACAAGCTCTTCA(SEQ ID NO：1)

本發明使用的啟動子是OsU3啟動子，在植物中啟動sgRNA scaffold結構的啟動子屬于Pol III promoters，包括U3和U6的啟動子，而OsU3是單子葉植物中啟動效率較高的啟動子；同時選用的限制性酶的插入位點也是一類特征的酶—Type IIs限制性內切酶，可選用的酶有AarI、BspQI、BbsI/Bpil、BsmBI/Esp3I、BfuAI/BveI和BsaI/Eco31I，而在本發明中選用BspQI的插入位點。

本發明使用pCAMBIA1300DM(原pCAMBIA1300的載體序列上有2處BspQ I酶切位點，為能使BspQ I作為靶位點插入使用的酶切位點，對傳統的pCAMBIA1300上原有的2處BspQ I酶切位點做了突變，使其成為本身沒有BspQ I酶切位點的雙元載體，命名為pCAMBIA1300DM)作為骨架載體，將2x35s-Cas9-ter(2x35s：2個串聯在一起的35s啟動子；Cas9:密碼子優化的Cas9酶的CDS序列；ter:終止子序列)及sgRNA元件(使用水稻的OsU3啟動子啟動)連入骨架載體；同時將BspQ I的酶切位點連入sgRNA元件的靶位點插入處(sgRNA啟動子與sgRNA scaffold之間)，構建出適用于單子葉植物基因的敲除載體pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I)-Cas9。

2x35s-Cas9-ter的序列(SEQ ID NO：2)：

CGGTATCGATAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTGATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACCTCGACCTCAACACAACATATACAAAACAAACGAATCTCAAGCAATCAAGCATTCTACTTCTATTGCAGCAATTTAAATCATTTCTTTTAAAGCAAAAGCAATTTTCTGAAAATTTTCACCATTTACGAACGATACTCGAGATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGTAAGGATCCTGATTGATCGATAGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGG

sgRNAscaffold的序列(SEQ ID NO：3)：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTT

本發明基于CRISPR/Cas9技術的植物基因敲除載體能夠應用于植物靶基因的敲除，同時也能夠以試劑盒的形式應用于植物基因編輯。

本發明的有益效果在于：

1、由BspQ I插入位點組成的sgRNA-OsU3結構序列與2x35s-hSpCas9-ter序列共同構建的CRISPR/Cas9植物敲除的雙元載體pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I)-Cas9，能夠通過一步酶切連接的方法來實現高效、快速構建單子葉植物基因敲除載體的目的。

2、本發明提供的CRISPR/Cas9敲除載體pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I)-Cas9，具有打靶效率高、脫靶效率低的特點，本發明載體的打靶效率高于10％，優選達到60％，特別適合應用于植物靶基因的敲除或者以試劑盒的形式運用到植物基因編輯中。

附圖說明

圖1為單子葉基因敲除載體結構圖—pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I)-Cas9。

圖2為載體pCAMBIA1300DM的結構圖。

圖3為Gn1a基因的測序結果與峰圖。

圖4為OsDEP1基因的測序結果與峰圖。

具體實施方案：

一.單子葉基因敲除載體構建：

1.將pOsU3-gRNA載體(中科院遺傳與發育研究所高彩霞實驗室饋贈)用Aar I酶切成線性化載體，并經CIP(堿性磷酸酶)反應后純化。

2.將合成的含有BspQ I的酶切位點的oligos序列進行退火磷酸化反應。

BspQ I-oligo1:GGCAGAAGAGCAACACAAGCTCTTCA(SEQ ID NO：5)

BspQ I-oligo2:AAACTGAAGAGCTTGTGTTGCTCTTCT(SEQ ID NO：6)

3.將退火磷酸化后的BspQ I插入序列與pOsU3-gRNA線性化載體進行T4連接，將BspQ I插入序列連入載體中。挑選陽性克隆的質粒(Aar I酶切不開的質粒)送測序，所測得正確的OsU3-sgRNA序列的載體標記為pOsU3-gRNA-B，其中OsU3(BspQ I)-sgRNAscaffold結構序列(畫下劃線的為BspQ I的識別序列)為(SEQ ID NO：4)：

AAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTCGGAAACCACGTGATGTGAAGAAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAGAAGAGCAACACAAGCTCTTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCCACATAATCTCTAGAGGATC.

4.設計含有AscI酶切序列的AscI-OsU3-F/R引物并從pOsU3-gRNA-B載體上擴增OsU3-sgRNAscaffold片段，

AscI-OsU3-F：5’-TTGGCGCGCCAGGAATCTTTAAACATACGAAC(SEQID NO：7)；

AscI-OsU3-R：5’-TTGGCGCCGATCCTCTAGAGATTATGTGG(SEQ ID NO：8)。

PCR反應條件為95℃，30s；65℃，30s；72℃，40s；35cycles。

5.膠回收OsU3-sgRNA scaffold的片段，連入T載體PMD19-T進行T/A克隆，并挑取陽性克隆送測序，獲得含有OsU3-sgRNA scaffold結構的PMD19-T載體。

6.酶切獲得AscI-OsU3-sgRNAscaffold片段：直接用AscI限制性內切酶從pMD19-T質粒上酶切獲得AscI-OsU3-sgRNAscaffold片段。并與已用AscI酶切線性化的pCAMBIA1300DM進行T4連接，構建pCAMBIA1300DM-OsU3質粒，構建成功后將質粒送去測序(測序引物OsU3-F:CCCAAGCTTAGGAATCTTTAAACATACGAAC(SEQ ID NO：9))。

7.從2X35s-hSpCas9質粒(中科院上海生命科學研究院朱健康實驗室饋贈)上用EcoRI和SalI酶酶切得到2x35s-hSpCas9-ter片段，并進行膠回收。同時用EcoRI和SalI酶切pCAMBIA1300DM-OsU3(BspQ I位點)質粒，獲得線性化質粒。

6.將2x35s-hSpCas9-ter片段連入pCAMBIA1300DM-OsU3線性化質粒中，經轉化、挑克隆、酶切檢測和測序，獲得正確的pCAMBIA1300DM-OsU3-Cas9質粒。

實施例：

一、水稻基因Gn1a敲除載體的構建

1.根據水稻基因Gn1a序列和sgRNA設計工具設計特意的靶序列，序列如下：

Gn1a-oligo1:GGCAGCAGTACCTGCCTTACTA(SEQ ID NO：10)

Gn1a-oligo2:AAACTAGTAAGGCAGGTACTGC(SEQ ID NO：11)

2.將設計的targetoligos按如下條件進行退火磷酸化過程：

在PCR管中配制反應體系：

在PCR儀上按以下程序完成反應過程：

①37℃30min

②95℃ 5min

③60個循環：

95℃—1.3℃/cycle 45s

④4℃保存

3.用BspQ I酶酶切pCAMBIA1300DM-OsU3-Cas9質粒，獲取線性化載體，并用CIP酶去做磷酸化處理，以免自連。

4.將退火磷酸化產物稀釋100倍，取2μl與線性化載體進行T4連接：

在PCR管中配制連接體系：

16℃連接0.5～1h，連接產物轉入大腸桿菌DH5a感受態細胞中并篩選陽性克隆2～4個送去測序。成功插入靶位點的測序結果為：

AGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAGCAGTACCTGCCTTACTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTT(SEQ ID NO：12)

表明水稻基因Gn1a的CRIPSR/Cas9敲除載體構建成功。

5.將其敲除載體轉至農桿菌中，并完成整個組培過程，獲得轉基因陽性幼苗，并做檢測驗證。

6.目的片段PCR產物的測序結果表明在53株轉基因水稻中有26株出現突變現象，這表明Gn1a基因的打靶效率為49％，見附圖3。

二、水稻DEP1基因的CRISPR/Cas9敲除載體的構建

1.根據水稻OsDEP1基因序列和sgRNA設計工具設計特意性的靶序列，序列如下：

OsDEP1-oligo1:GGCAGCTGCGGTTGCAACGGCTG(SEQ ID NO：13)

OsDEP1-oligo2:AAACCAGCCGTTGCAACCGCAGC(SEQ ID NO：14)

2.其他步驟與OsPDS基因的載體構建過程一樣。

3.OsDEP1轉基因陽性植株的檢測：利用OsDEP1-F/R引物

OsDEP1-F:5’-GCTGCTCATGCTGTAAACCT-3’(SEQ ID NO：15)

OsDEP1-R:5’-CGTGGGCATCGACAACCCTC-3’(SEQ ID NO：16)

進行目的片段PCR擴增，并將PCR產物進行測序，PCR反應條件為95℃，30s；55℃，30s；72℃，40s；35cycles。

4.分析測序結果:48株轉基因水稻中有19株發生了不同程度的突變，缺失最多的堿基數達30bp，突變頻率為39％，見附圖4。

從這些實施例可知，本發明所構建的單子葉敲除載體pCAMBIA1300DM(BspQ I)-OsU3-Cas9具有簡便、快速、高效的優點，特別是具有較高的打靶效率和極低的脫靶率。

所屬領域的普通技術人員應當理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權利要求)被限于這些例子；在本發明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術特征之間也可以進行組合，步驟可以以任意順序實現，并存在如上所述的本發明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細節中提供。因此，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。