靶向PD-1的多肽及其應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域。具體地說，本發明涉及靶向人pd-1蛋白的多肽及其應用。

背景技術：

免疫系統中存在著眾多的共刺激信號和共抑制信號精確調控t細胞反應的強度和質量，這些抑制信號被稱為免疫檢查點。腫瘤細胞通常會過表達這些免疫檢查點蛋白，從而抑制t細胞的激活，逃避免疫系統的殺傷。通過不同的策略增強t細胞的活性對腫瘤免疫治療具有重要意義，其中對免疫檢查點進行阻斷是增強t細胞活性的有效策略之一。t細胞表面存在著一系列的免疫抑制性分子，如pd-1、ctla-4、tim-3、slam等，這些免疫抑制性分子可以與其相應的配體結合從而激活免疫抑制調節通路，進而導致t細胞功能的衰竭，其中，pd-1/pd-l1通路是目前的研究熱點。

pd-1是t細胞表面一個重要的抑制性受體，因最初在凋亡的t細胞淋巴瘤中發現，并能促進程序性細胞死亡而得名。pd-1蛋白可誘導性地表達于活化的t細胞、b細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞以及單核細胞等。其配體有兩個，分別為pd-l1(cd274，b7-h1)和pd-l2(cd273，b7-dc)。pd-l1比pd-l2的分布更加廣泛，pd-l1可以在b細胞、dc、巨噬細胞、骨髓源肥大細胞、t細胞、成纖維細胞、上皮細胞等細胞中表達，而pd-l2僅在dc、巨噬細胞、記憶性b細胞等細胞中表達，因此，阻斷pd-1/pd-l1通路比阻斷pd-1/pd-l2通路更為有效。pd-1/pd-l1抑制免疫通路的機理如下：腫瘤細胞存在著大量的基因突變以及蛋白的異常表達，可以作為腫瘤抗原活化t細胞。腫瘤特異性細胞毒t細胞到達腫瘤部位后，通過t細胞抗原受體(tcr)識別腫瘤細胞，釋放干擾素γ(ifn-γ)以及t細胞顆粒，殺傷腫瘤細胞。但ifn-γ除具有抗腫瘤作用外，還能夠誘導腫瘤細胞表達pd-l1。這些pd-l1與活化的t細胞中的pd-1結合后，抑制t細胞的抗腫瘤作用。

雖然目前已經有很多阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物進入臨床試驗或者個別藥物已經獲得美國fda的審批，例如：靶向pd-1蛋白的nivolumab、pembrolizumab和pidilizumab，以及靶向與pd-l1的mpdl3280a、mdx1105、medi4736等，但是這些藥物大部分都是抗體類藥物，具有生產成本高、組織滲透性差、易產生免疫原性等缺點。

與抗體類藥物相比，多肽分子因具有較高的特異性和組織親和性、生產成本低、不易產生免疫原性及較好的組織滲透性等優點，而成為最有吸引力的抗體替代物。因而，研究并開發出一些低分子量的有機小分子或者多肽類藥物成為阻斷pd-1/pd-l1通路的重要研究方向。

綜上所述，本領域急需低分子量的有機小分子或者多肽作為阻斷pd-1/pd-l1通路的候選藥物。

技術實現要素：

本發明的目的是提供能夠阻斷pd-1/pd-l1通路的低分子量的有機小分子或者多肽類。

在第一方面，本發明提供一種式i表示的多肽：

[xaa0]-[xaa1]-asp-tyr-[xaa2]-arg-[xaa3]-tyr-[xaa4](i)

其中，

[xaa0]為glyasn、thrglu、或pheasn構成的肽段、或無；

[xaa1]為trp、lys或met；

[xaa2]為asnsergln、arghisglyasnile、serleuglugluleu、sertrplysserglu、glnasn、cysprocys、cyshisglyprocys、cysalagluproleu、sertrpcysprocys構成的肽段；

[xaa3]為alaglnleu、metlysleuala、glulysalalys、leulysgluala、或glulyscyslys構成的肽段；

[xaa4]為asngln、aspleu、lys、aspleu、或arg；

并且所述多肽具有pd-1結合活性，所述多肽的長度為15-18個氨基酸。

在具體的實施方式中，所述多肽選自下組：

(a)氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽；

(b)將(a)所述的多肽經過1-6個(較佳地1-4個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有pd-1結合活性的由(a)衍生的多肽。

在優選的實施方式中，所述多肽與pd-1的結合kd值為1-5μm，優選1-4μm、更優選1-3μm，最優選與天然pd-l1與pd-1的結合kd值近似。

在具體的實施方式中，所述多肽選自氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽。

在具體的實施方式中，所述多肽是氨基酸序列如seqidno:1或6所示的多肽。

在第二方面，本發明提供一種分離的核酸分子，所述核酸分子編碼本發明第一方面所述的多肽。

在第三方面，本發明提供一種宿主細胞，所述宿主細胞包含本發明第二方面所述的分離的核酸分子。

在優選的實施方式中，所述宿主細胞包括但不限于：細菌、酵母、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

在優選的實施方式中，所述細菌包括但不限于：大腸桿菌、枯草桿菌；所述酵母包括但不限于：畢赤酵母、釀酒酵母。

在第四方面，本發明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發明第一方面所述的多肽以及藥學上可接受的賦形劑。

在優選的實施方式中，所述的藥物組合物還包含：(c)藥學上可接受的其它阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物。

在另一優選的實施方式中，所述其它阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物包括但不限于：靶向pd-1蛋白的nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab，以及靶向pd-l1的mpdl3280a、mdx1105、medi4736等。

在優選的實施方式中，所述的藥物組合物還可包含其它抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括但不限于：ipilimumab、ramucirumab、trametinib、ceritini、dabrafenib等。

在另一優選的實施方式中，所述藥物組合物的劑型適用于以下給藥方式，包括但不限于：注射給藥、輸注給藥、腹膜內給藥、瘤內給藥、肌肉內給藥。

在第五方面，本發明提供本發明第一方面所述的多肽的用途，用于制備抑制pd-1與pd-l1結合或抑制腫瘤、或治療細菌、病毒或真菌引起的感染或治療炎性疾病的藥物。

在具體的實施方式中，所述腫瘤包括但不限于：黑色素瘤、肺癌(優選非小細胞肺癌)、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏病、非何杰金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、小兒實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(cns)腫瘤、原發性cns淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸瘤、腦干神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、t細胞淋巴瘤等；

所述病毒包括但不限于：肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、孢疹病毒、流感病毒、腺病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、登革熱病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒等；

所述細菌包括但不限于：衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄球菌、肺炎球菌、霍亂、破傷風等；

所述真菌包括但不限于：假絲酵母、曲霉、皮炎芽酵母等；或者

所述炎性疾病包括但不限于：強直性脊柱炎、自身免疫性溶血性貧血、關節炎、重癥肌無力、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、惡性貧血、多肌炎等。

在第六方面，本發明提供一種抑制pd-1與pd-l1結合的方法，包括步驟：利用本發明第一方面所述的多肽或本發明第四方面所述的藥物組合物抑制pd-1與pd-l1結合。

在優選的實施方式中，所述抑制pd-1與pd-l1結合的方法是體外非治療性的。

應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示實施例3構建的人pd-1重組質粒的pcr鑒定結果，其中marker代表dna分子量marker；泳道中出現的條帶為目的條帶(357bp)。

圖2顯示實施例4的經純化人pd-1蛋白的sds-page電泳結果，其中m代表蛋白分子量marker；泳道1代表人的pd-1蛋白，該目的條帶大小為13kda，與理論值大小一致。

圖3a顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:1的多肽結合的spr圖，測得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為1.38μm。

圖3b顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:2的多肽結合的spr圖，測得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.13μm。

圖3c顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:3的多肽結合的spr圖，測得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.14μm。

圖3d顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:4的多肽結合的spr圖，測得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.39μm。

圖3e顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:5的多肽結合的spr圖，測得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.32μm。

圖3f顯示人的pd-1蛋白與人pd-l1蛋白結合的spr圖，測得人pd-l1蛋白與pd-1蛋白的kd值為1.15μm。

圖4顯示人pd-l1蛋白與氨基酸序列為seqidno:1的多肽競爭結合人pd-1蛋白的spr圖。

圖5a顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:6的多肽結合的spr圖，測得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為2.08μm。

圖5b顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:7的多肽結合的spr圖，測得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.96μm。

圖5c顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:8的多肽結合的spr圖，測得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為3.11μm。

圖5d顯示人pd-1蛋白與氨基酸序列為seqidno:9的多肽結合的spr圖，測得的該條多肽與pd-1蛋白的kd值為4.81μm。

具體實施方式

發明人經過廣泛而深入的研究，出乎意料地發現了一組靶向人pd-1蛋白的多肽，該組多肽能夠競爭性地與人pd-1蛋白結合，從而成為研究pd-1/pd-l1免疫檢查點阻斷劑的多肽類先導藥物，進而為抗腫瘤藥物的發展提供基礎。在此基礎上完成了本發明。

除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與所公開的發明所屬領域的技術人員的普遍理解相同的含義。為便于理解本發明，對本發明涉及的相關術語作如下定義，但本發明的范圍并不限于這些具體的定義。

pd-1蛋白

本文所用的術語“pd-1蛋白”是指人體內t細胞表面的一個重要的抑制性受體。其有兩個配體，分別為pd-l1和pd-l2。pd-l1與活化的t細胞中的pd-1結合后，起到抑制t細胞的抗腫瘤作用。因此，阻斷pd-1/pd-l1通路對于抑制或殺傷腫瘤有著積極作用。

本領域技術人員熟知，人體內的蛋白有可能產生一定突變，而仍保留其活性。因此，本發明所述的pd-1蛋白包括包含一定突變的pd-1蛋白，只要該突變的pd-1蛋白在人體內行使與野生型pd-1相同的功能。例如，在具體的實施方式中，本發明所述的pd-1蛋白具有seqidno:14所示氨基酸序列(pptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterrae)，其相應的編碼核苷酸序列如seqidno:13所示。

pd-1蛋白具有與其特異性結合的配體(pd-l1)。例如，在具體的實施方式中，本發明所述的pd-l1具有seqidno:12所示氨基酸序列。

本發明的多肽

本發明提供能夠競爭性結合人pd-1蛋白的多肽，這些多肽具有結構上的相似性，即，在特定的位置具有特定的氨基酸殘基。

在具體的實施方式中，本發明提供式i表示的多肽：

[xaa0]-[xaa1]-asp-tyr-[xaa2]-arg-[xaa3]-tyr-[xaa4](i)

其中，[xaa0]為glyasn、thrglu、或pheasn構成的肽段、或無；[xaa1]為trp、lys或met；[xaa2]為asnsergln、arghisglyasnile、serleuglugluleu、sertrplysserglu、glnasn、cysprocys、cyshisglyprocys、cysalagluproleu、sertrpcysprocys構成的肽段；[xaa3]為alaglnleu、metlysleuala、glulysalalys、leulysgluala、或glulyscyslys構成的肽段；[xaa4]為asngln、aspleu、lys、aspleu、或arg；這些多肽的長度為15-18個氨基酸。

這些多肽與人pd-1蛋白具有良好的結合親和力，其中結合親和力最高的多肽與人pd-1蛋白的天然配體pd-l1相當。在優選的實施方式中，所述多肽為氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽；或者將氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽經過1-6個，(較佳地1-4個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有pd-1結合活性的衍生多肽。

在具體的實施方式中，本發明的多肽與pd-1的結合kd值為1-5μm，優選1-4μm、更優選1-3μm，最優選與天然pd-l1與pd-1的結合kd值近似。

在優選的實施方式中，本發明的多肽選自氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽；更優選氨基酸序列如seqidno:1或6所示的多肽。

在本發明的多肽的基礎上，本發明提供一種分離的核酸分子以及宿主細胞，所述核酸分子編碼本發明的多肽，所述宿主細胞包含所述的分離的核酸分子。

本領域技術人員知曉如何選取宿主細胞并在其中進行蛋白質的表達，例如，所述宿主細胞包括但不限于：細菌、酵母、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。在具體的實施方式中，所述細菌包括但不限于：大腸桿菌、枯草桿菌；所述酵母包括但不限于：畢赤酵母、釀酒酵母。

由于本發明的多肽與人pd-1蛋白具有良好的結合親和力，這些多肽能作為pd-1/pd-l1結合的抑制劑或調節pd-1/pd-l1結合程度的調節劑。因此，本發明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發明的多肽以及藥學上可接受的賦形劑。

本發明的多肽顯然還可以與其它機理的阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物以及其它抗腫瘤藥物聯用以增強彼此的作用。因此，上述藥物組合物中還可包含藥學上可接受的其它阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物。例如，所述其它阻斷pd-1/pd-l1通路的藥物包括但不限于：靶向pd-1蛋白的nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab，以及靶向pd-l1的mpdl3280a、mdx1105、medi4736等。在優選的實施方式中，所述的藥物組合物還可包含其它抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括但不限于：ipilimumab、ramucirumab、trametinib、ceritini、dabrafenib等。

本領域技術人員知熟知，本發明的藥物組合物的具體劑型取決于要采用的給藥方式。例如，本發明的藥物組合物可采用的給藥方式包括但不限于：注射給藥、輸注給藥、腹膜內給藥、瘤內給藥、肌肉內給藥，等等。而藥物組合物中活性成分的含量可由醫學領域的技術人員根據，例如患者的性別、年齡、總體健康狀況等實際情況自主決定。

基于本發明的多肽的活性，本領域技術人員不難想到可將其制備成抑制pd-1與pd-l1結合的藥物或抑制腫瘤的藥物。在具體的實施方式中，所述腫瘤包括但不限于：黑色素瘤、肺癌(優選非小細胞肺癌)、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、子宮癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏病、非何杰金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、小兒實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(cns)腫瘤、原發性cns淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸瘤、腦干神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、t細胞淋巴瘤。

在其它實施方式中，所述抑制pd-1與pd-l1結合的藥物還可用于治療細菌、病毒或真菌感染。例如，以下病毒引起的感染：肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、孢疹病毒、流感病毒、腺病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、登革熱病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒等；以下細菌引起的感染：衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄球菌、肺炎球菌、霍亂、破傷風等；或以下真菌引起的致病感染：假絲酵母、曲霉、皮炎芽酵母等。

在其它實施方式中，所述抑制pd-1與pd-l1結合的藥物還可用于治療炎性疾病，包括但不限于：強直性脊柱炎、自身免疫性溶血性貧血、關節炎、重癥肌無力、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、惡性貧血、多肌炎等。

在本發明的多肽或藥物組合物的基礎上，本發明進一步提供了一種抑制pd-1與pd-l1結合的方法，包括利用本發明的多肽或藥物組合物抑制pd-1與pd-l1結合的步驟。在具體的實施方式中，所述抑制pd-1與pd-l1結合的方法是體外非治療性的。

本發明的優點：

1.本發明提供了能夠競爭性結合人pd-1蛋白的多肽；

2.本發明的多肽能與人pd-1蛋白良好結合，其中，結合親和力最高的多肽與人pd-1蛋白的結合情況與天然pd-l1蛋白無異；

3.本發明的多肽具有較高的特異性、組織親和性、不易產生免疫原性以及較好的組織滲透性；和

4.本發明的多肽的生產成本低。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(coldspringharborlaboratorypress，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。

實施例

實施例1.本發明多肽的合成

(1)實驗儀器與材料

二甲基甲酰胺(dmf)、哌啶、樹脂、二氯甲烷(dcm)、茚三酮反應試劑、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)、三異丙基硅烷(tis)、乙二硫醇(edt)、無水乙醚、三氟乙酸(tfa)、n-甲基嗎啉(nmm)、甲醇、乙醇、20種氨基酸、多肽固相合成管、質譜儀器microtof-q11(brukerdaltonics)。

(2)實驗步驟

稱量樹脂并投入到多肽固相合成管中，加入適量的dmf溶脹半小時以上。抽掉dmf，用脫保護液(哌啶:dmf＝1:4)進行fmoc去保護反應，置于搖床上10分鐘。抽掉脫保護液，用dmf、dcm洗滌三次，從固相合成管中取出少量樹脂于試管中，用乙醇洗滌2次，茚三酮法檢測并記錄顏色，準備投料，進行氨基酸縮合反應。分別按照seqidno:1-9所示的氨基酸序列取相應氨基酸、hbtu，并用少量的dmf溶解，投入到固相合成管中，加入10倍的nmm，攪拌反應。1-2小時后，從固相合成管中取少量樹脂于試管中，用乙醇洗滌2次，茚三酮法檢測。抽掉固相合成管中的液體，用dmf、甲醇、dcm各洗滌2次，得到第一個氨基酸縮合后的肽樹脂。對所得肽樹脂重復進行以上“fmoc去保護、氨基酸縮合”反應步驟，至最后一個氨基酸反應完畢，得到氨基酸序列如seqidno:1-9所示的肽。反應完畢后，dmf、甲醇、dcm各洗滌2次，繼續抽干10-15分鐘。固相合成管中取出合成完的部分肽樹脂，于室溫下在裂解液(tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％)中裂解兩小時。將樹脂過濾后，于旋蒸儀中蒸干，用無水乙醚洗滌6次，然后常溫揮干。粗肽使用分析級hplc純化，使用hplc檢測純度>90％。所得的純肽使用質譜鑒定。最后將純化后的溶液凍干，即可得到純品。表1列出了本發明多肽的分子量的理論值和質譜測定的實際值。

實施例3.人的pd-1重組質粒的構建

目的基因為pd-1蛋白上34-150位氨基酸的編碼核酸。利用ncoi和ndei兩個酶切位點設計的特異性引物將目的片段克隆到pet-28a載體(novagen公司)上。正向引物為：5’-ttttccatgggtccccccaccttctccccag-3’(seqidno:10)；反向引物為：5’-gccgccgcatatgttattctgcccttctctctg-3’(seqidno:11)。以人的pd-1基因為模板，進行pcr擴增。pcr體系為：2μlpd-1質粒，2μl正向引物，2μl反向引物，5μl10×緩沖溶液，4μldntp，1μlpfu聚合酶，34μlddh2o。pcr擴增條件：94℃預變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸48s，30個循環；72℃10min。pcr擴增完畢后，進行核酸電泳，切下目的條帶，用pcr產物回收試劑盒回收pcr產物。將所得的pcr產物和質粒pet-28a載體分別用ncoi和ndei兩個限制性核酸內切酶進行雙酶切，然后在t4連接酶的作用下連接，轉化到大腸桿菌dh5α感受態細胞中。過夜培養后，挑取單克隆進行菌液pcr鑒定(結果見圖1)，然后取陽性重組子測序，保留菌株和甘油菌。通過重組質粒構建的人的pd-1具有如seqidno:13所示的核苷酸序列。

實施例4.人的pd-1蛋白的表達與純化

本發明所用到的人的pd-1蛋白是經原核生物表達、純化后獲得的。具體實驗步驟如下：將測序正確的重組質粒轉化到e.colibl21感受態細胞中進行誘導表達。挑取單個菌落接種于含有卡那霉素的tb培養基中，于37℃振蕩培養過夜。次日將小培產物擴培到1l的tb培養基中，培養至od600為0.5-0.6，加入誘導劑iptg至終濃度為0.5mm，37℃誘導5-7h。在4,000rpm下收菌，先用裂解緩沖溶液(50mmtris-hcl，ph8.0，50mmnacl,，1mmdtt，0.5mmedta，5％甘油)裂解細菌，然后再高壓破碎，在12,000rpm下離心取沉淀。用洗雜緩沖液(20mmtris-hcl，ph8.0，2m尿素，2.5％tritonx-100)洗雜兩次，取沉淀。然后再用溶解緩沖溶液(20mmtris-hcl，ph8.0，8m尿素)溶解蛋白，離心取上清。取3kda的蛋白超濾濃縮管濃縮蛋白至5ml左右，將其加入到1l的復性緩沖液(50mmtris-hcl，ph8.0，50mml-arg，24mmnacl，1mmkcl，1mmedta)中，用稀釋法在4℃下復性24h。用3kda的濃縮管濃縮蛋白，至20ml左右，將蛋白裝入透析袋中，在透析緩沖液(50mmtris-hcl，ph8.0，150mmnacl，1mmdtt)中透析過夜，濃縮。對獲得的蛋白過陽離子交換柱和分子篩進行純化。將過完分子篩后的蛋白進行14％sds-page凝膠電泳，鑒定純化后的蛋白純度。所得電泳圖如圖2所示，蛋白大小約為13kda，與人pd-1蛋白的理論值吻合，說明成功獲得了人pd-1蛋白。

實施例5.人pd-1蛋白與本發明多肽的spr結合實驗

本發明的多肽與人pd-1蛋白的結合通過biacoret200進行表面等離子體共振(surfaceplasmonresonances,spr)實驗測定。具體實驗步驟如下：用10mm醋酸鈉溶液將純化好的pd-1蛋白稀釋到50μg/ml，使用氨基偶聯試劑盒將pd-1蛋白偶聯到cm5芯片上，流速為10μl/min，結合時間為420s，最后的偶聯量約為5000ru。結合實驗是在含有0.05％的表面活性劑p20的pbs溶液(137mmnacl，2.7mmkcl，8mmna2hpo4，2mmkh2po4，ph7.4)中進行的。實驗溫度設定為25℃，流速為30μl/min，結合時間90s，解離時間120s。將多肽用運行溶液溶解后，成倍稀釋成不同濃度，隨著運行溶液結合到pd-1上。得到的結合數據用biaevaluation2.0軟件分析，利用穩態擬合得到親和力kd值。本發明的多肽與人pd-1蛋白的spr結合實驗的實驗結果如圖3a-3e以及圖5a-5d所示。表1列出了本發明的多肽的序列及spr實驗測得的kd值。

本發明人同時檢測了人pd-1蛋白與人pd-l1蛋白的結合親和力kd值，其為1.15μm(如圖3f所示)。

表1.本發明的多肽序列、分子量及它們與人pd-1蛋白結合的kd值

實施例6.人pd-l1蛋白與seqidno:1所示多肽競爭性結合人pd-1蛋白的spr實驗

根據實施例5中的spr實驗結果，seqidno:1所示多肽與人pd-1蛋白的結合親和力最高。因而，本發明人以seqidno:1所示多肽為例，探究了該肽阻斷人pd-1蛋白與人pd-l1蛋白結合的能力。人pd-l1蛋白購自北京義翹神州生物技術有限公司。

具體實驗步驟如下：首先將50μg/ml人pd-l1蛋白通過氨基偶聯的方法偶聯到cm5芯片表面；然后將不同濃度的seqidno:1所示多肽(125nm，62.5nm，31.25nm，15.60nm，0nm)分別與100nm的人pd-1蛋白在冰上孵育15min，隨運行緩沖溶液(10mm磷酸鹽緩沖液，2.7mmkcl，137mmnacl和0.05％表面活性劑p20，ph7.4)流經芯片表面，流速為30μl/min，結合時間為90s，解離時間為120s；最后用biaevaluation2.0軟件分析實驗結果。實驗結果如圖4所示，隨著多肽濃度的升高，溶液中未結合的pd-1蛋白濃度逐漸下降，從而使得pd-1與pd-l1的結合減弱，響應值隨之下降。spr實驗結果如圖4所示，該結果表明seqidno:1所示多肽能夠阻斷人pd-1與pd-l1的結合。

討論：本發明提供了靶向人pd-1蛋白，即，能夠競爭性結合人pd-1蛋白的多肽，各多肽在特定的位置具有特定的氨基酸殘基，從而能夠具備相似的結構。這些多肽均能與人pd-1蛋白發生良好的結合，其中，seqidno:1所示多肽與人pd-1蛋白的結合親和力最高，其kd值為1.38μm與pd-l1和pd-1的結合kd值相當。因此，這些多肽能作為pd-1/pd-l1結合的抑制劑或調節pd-1/pd-l1結合程度的調節劑，以及為研究pd-1/pd-l1免疫檢查點阻斷劑和設計、開發阻斷pd-1/pd-l1通路提供了多肽類先導藥物。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。