本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的一種超聲波輔助酶法提取腸激酶工藝。
背景技術(shù)：
外源蛋白的表達(dá)方式可分為直接表達(dá)和融合表達(dá)兩種，其中利用融合表達(dá)方式往往能實(shí)現(xiàn)外源目的蛋白的高效表達(dá)，且利于分離純化。但有時(shí)目的蛋白不能以融合蛋白的形式被使用，因此需要在目的蛋白和標(biāo)簽蛋白之間設(shè)計(jì)特異的蛋白酶酶切位點(diǎn)，利用獨(dú)特的蛋白酶切割，才能得到完整的目的蛋白。目前常見(jiàn)的工具蛋白酶有腸激酶，xa因子或凝血酶等，其中腸激酶由于其能完全去除目的蛋白的n端序列，而最常被使用。（gasparian,m.etal.expression,purification,andcharacterizationofhumanenteropeptidasecatalyticsubunitinescherichiacoli.proteinexprpurif.2003,31(1),133-9）。
腸激酶（enteropeptidase，ep或enterokinase，ek，ec3.4.21.9）是存在于脊椎動(dòng)物十二指腸內(nèi)的一種異源二聚體（heterodimeric）絲氨酸蛋白酶。分子量為150kda，由1條115kda的重鏈和1條35kda的輕鏈組成，在ph值4.5-9.5，溫度4-45℃范圍內(nèi)特異性水解蛋白底物（lavallie,e.r..etal.cloningandfunctionalexpressionofacdnaencodingthecatalyticsubunitofbovineenterokinase.jbiolchem.1993,268(31),23311-7）。由于ep裂解融合蛋白所釋放出的多肽具有和野生型完全一致的n-末端氨基酸序列，因而可以作為蛋白表達(dá)體系中融合蛋白的切割試劑（schmidt,f.r.recombinantexpressionsystemsinthepharmaceuticalindustry.applmicrobiolbiotechnol.2004,65(4),363-72）。但是天然的腸激酶來(lái)源有限，并且提取分離的成本高，加之天然提取的腸激酶易被其它蛋白酶污染，易造成切割融合蛋白同時(shí)又降解了目的產(chǎn)物。而基因工程技術(shù)正可以彌補(bǔ)這些不足，因而運(yùn)用基因工程的方法生產(chǎn)腸激酶已成趨勢(shì)。
目前已經(jīng)采用了原核或真核表達(dá)系統(tǒng)成功得到了有生物活性的重組豬、牛、小鼠等腸激酶輕鏈蛋白，但很少關(guān)于鳉魚腸激酶輕鏈基因工程方面的研究。（kitamoto,y.etal.cdnasequenceandchromosomallocalizationofhumanenterokinase,theproteolyticactivatoroftrypsinogen.biochemistry.1995,34(14),4562-8；matsushima,m.etal.structuralcharacterizationofporcineenteropeptidase.jbiolchem.1994,269(31),19976-82；yahagi,n.etal.complementarydnacloningandsequencingofratenteropeptidaseandtissuedistributionofitsmrna.biochembiophysrescomm/lun.1996,219(3),806-12）
國(guó)外已有大量關(guān)于牛腸激酶研究的報(bào)道，但有關(guān)鳉魚腸激酶研究很少。有研究表明，鳉魚腸激酶的特異性要遠(yuǎn)高于目前常見(jiàn)的牛腸激酶、豬腸激酶和人腸激酶（ogiwara,k.specificityofthemedakaenteropeptidaseserineproteaseanditsusefulnessas
abiotechnologicaltoolforfusion-proteincleavage.procnatlacadsciusa.2007,104(17),7021-6）。其對(duì)非特異多肽底物的酶切活性不到牛腸激酶的1/100，因此，如果能利用基因工程方法得到重組鳉魚腸激酶，其應(yīng)用價(jià)值將比重組牛腸激酶更高。目前，重組鳉魚腸激酶輕鏈尚無(wú)商業(yè)化產(chǎn)品。
由于鳉魚腸激酶輕鏈中含有9個(gè)半胱氨酸（cys）殘基，其中形成4對(duì)二硫鍵，有一個(gè)游離的cys殘基不參加配對(duì)，因此在重組表達(dá)時(shí)，極易形成二硫鍵錯(cuò)配，導(dǎo)致異構(gòu)體出現(xiàn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，將游離的cys殘基突變可能會(huì)有助于蛋白質(zhì)的復(fù)性折疊（ivanenkov,v.bacterialexpression,characterization,anddisulfidebonddeterminationofsolublehumanntpdase6(cd39l2)nucleotidase:implicationsforstructureandfunction.biochemistry.2003,42(40),11726-35）。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的重組鳉魚腸激酶輕鏈突變體，并提供其在大腸桿菌中高效表達(dá)、復(fù)性、層析純化的方法，該方法適用于鳉魚腸激酶輕鏈的大規(guī)模制備。
本發(fā)明在已報(bào)道的鳉魚腸激酶輕鏈的核苷酸序列和大腸桿菌偏愛(ài)密碼子的使用原則的基礎(chǔ)上（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），設(shè)計(jì)編碼新型鳉魚腸激酶輕鏈氨基酸的核苷酸序列，進(jìn)行體外合成，在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，并利用變復(fù)性與純化技術(shù)得到高活力的mepl融合蛋白。這一新型鳉魚腸激酶輕鏈帶有c112s突變。
本發(fā)明是通過(guò)一下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種超聲波輔助酶法提取腸激酶工藝，其特征在于：用超聲波輔助酶法提取腸激酶，具有seqidno：2所示的氨基酸序列；所述seqidno：1的氨基酸序列含有核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，其中載體為含有t7啟動(dòng)子的載體；所述的載體為pet32；所述的載體為一種宿主細(xì)胞，為原核細(xì)胞；所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
超聲波輔助酶法提取腸激酶工藝的方法包括：
a）根據(jù)蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)，將鳉魚腸激酶輕鏈野生型基因易形成二硫鍵錯(cuò)配的半胱氨酸進(jìn)行突變，全基因合成mepl核苷酸序列；
b）構(gòu)建含有人工合成的mepl基因的重組質(zhì)粒ptrx-d-mepl；
c）將重組質(zhì)粒ptrx-d-mepl轉(zhuǎn)化至權(quán)利要求5、6任一所述的宿主細(xì)胞中，得到含有重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞；
d）在表達(dá)條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，表達(dá)新型重組鳉魚重組腸激酶輕鏈；
e）層析純化得到目標(biāo)蛋白mepl。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：
本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了新型鳉魚腸激酶輕鏈的重組表達(dá)，經(jīng)復(fù)性純化后每升發(fā)酵液可獲得
100mg純度在95%以上的mepl蛋白，活性檢測(cè)其活性為ekmaxtm的2倍，特異性為ekmaxtm的80倍以上，無(wú)論表達(dá)量還是特異性，都是目前已有報(bào)告中最高的（ostapchenko,v.g.etal.dissectingstructuralbasisoftheuniquesubstrateselectivityofhumanenteropeptidasecatalyticsubunit.jbiomolstructdyn.2012,30(1),62-73）。
本發(fā)明提供的一種高特異性重組鳉魚腸激酶輕鏈，以及一種高效生產(chǎn)重組鳉魚腸激酶輕鏈的生產(chǎn)方法，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)簡(jiǎn)單的復(fù)性和純化，獲得快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、高活性、高特異性的重組鳉魚腸激酶輕鏈蛋白。該酶適用于生物制藥工程、基因工程、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的而研究和應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的說(shuō)明：
實(shí)施例：
鳉魚腸激酶突變體的構(gòu)建通過(guò)查找genbank中鳉魚腸激酶序列(mn_001104898)，利用大腸桿菌的密碼子偏愛(ài)性對(duì)其序列進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)編碼新型鳉魚腸激酶輕鏈(c112s)的核苷酸序列，將鳉魚腸激酶輕鏈的第112位cys被置換為絲氨酸(ser)，其核苷酸序列見(jiàn)序列表seqidno:1，其核苷酸與鳉魚體內(nèi)野生型序列，黑底區(qū)為根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性來(lái)優(yōu)化后改變的基因，選擇性突變位點(diǎn)用黑色三角形標(biāo)出。該人工合成鳉魚腸激酶輕鏈基因長(zhǎng)度。