本發明屬于藥物化學技術領域，具體涉及一種含有氮烷基化、芳基化和酰基化亞砜亞胺和1,2,5-噁二唑結構的ido抑制劑及其制備方法。
背景技術：
吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,ido)是1967年hayaishi小組首次在細胞內發現的一種含有亞鐵血紅素的單體酶，cdna編碼蛋白由403氨基酸組成，分子量為45kda，它是延著色氨酸-犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶，并且在多種哺乳動物的組織中具有廣泛的表達(hayaishio.etalscience,1969,164,389-396)。在腫瘤患者的細胞中，ido常作為誘導腫瘤微環境免疫耐受產生重要的生理作用，其介導的色氨酸(tryptophan,trp)-犬尿氨酸(kynurenine,kyn)代謝途徑參與了腫瘤免疫逃逸，而ido作為誘導腫瘤微環境免疫耐受也產生重要的作用。
色氨酸為哺乳動物體內重要的必須氨基酸之一，需要從食物中大量攝取，維持細胞活化和增殖，以及蛋白質以及一些神經遞質的合成。因此，它的缺乏會導致一些重要的細胞的功能失常。ido在體內能夠催化色氨酸轉化為n-甲酰犬尿氨酸，降解色氨酸的含量而造成色氨酸體內的不足，導致腫瘤的發生。而免疫組織學研究顯示，犬尿氨酸途徑能夠導致興奮毒素喹啉酸的增多，還會導致阿茲海默等神經系統疾病等多種嚴重的人類疾病(guilleming.j.etalneuropathol.andappl.neurobiol.2005,31,395–404)。
哺乳動物體內色氨酸限速酶主要有兩種：色氨酸雙加氧酶(tdo)和ido。1937年，kotake等從兔子腸中純化出蛋白，并首次發現tdo主要在哺乳動物肝臟中表達，目前尚未發現他與免疫系統有密切聯系。tdo能夠催化犬尿氨酸途徑，使色氨酸轉變為n-甲酰犬尿氨酸[higuchik.etalj.biochem.1937,25,71-77；shimizut.etalj.biol.chem.1978,253,4700-4706]。1978年，從兔子腸道中純化的酶，被鑒定是含有亞鐵血紅素的雙加氧酶(ido)，ido是肝臟以外唯一可以催化色氨酸分子中的吲哚氧化裂解，并延犬尿氨酸途徑分解代謝的酶，ido通常在粘膜較多的器官中表達，如肺，小腸和大腸，直腸，脾，腎，胃和腦等，分布比較廣泛(hayaishio.etal,proceedingsofthetenthfebsmeeting,1975,131–144)。在某些特殊或病理條件下，如妊娠，慢性感染，器官移植和腫瘤等，ido表達會明顯增加，參與介導局部的免疫抑制。
研究表明，ido在腫瘤微環境中可以通過以下幾種方式來抑制局部t細胞免疫 反應：色氨酸耗竭、毒性代謝和誘導調節性t細胞增殖。很多情況是在腫瘤中過渡表達，從而消耗局部的色氨酸，產生大量的犬尿氨酸等代謝產物。事實上，在無色氨酸或犬尿氨酸的培養條件下，t細胞會發生增殖抑制、活性降低甚至凋亡。而t細胞中存在一個對色氨酸水平非常敏感的調節點，ido的作用下，能夠使色氨酸消耗，從而導致t細胞停滯于g1期中期，從而抑制了t細胞的增殖，也抑制了t細胞的免疫應答。而t細胞一旦停止增殖，可能就不會再被刺激作用，這是ido在體內免疫作用機制(mellora.etalbiochem.biophys.res.commun.2005,338(1):20-24)(leronds.etalj.exp.med.2002,196(4):447-457)。
本領域尚需研發高活性的新型ido抑制劑，本發明發現一類新型含有氮烷基化和芳基化亞砜亞胺和1,2,5-噁二唑結構的化合物具有出乎意料的高ido抑制活性。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種新型的含有氮烷基化和芳基化亞砜亞胺和1,2,5-噁二唑結構的化合物作為高效的ido酶抑制劑。
本發明的另一目的在于提供該化合物的制備方法。
本發明的第一方面，提供一種通式(i)化合物或其藥學上可以接受的鹽、其立體異構體或其互變異構體、或前藥：
式中，
r7和r8各自獨立為氫、取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c3-c10環烷基、取代或未取代的c2-c10烯基、取代或未取代的c3-c10炔基、取代或未取代的c6-c20芳基、或取代或未取代的c3-c14雜芳基；r7和r8可以一起可以形成三至八元環或三至八元雜環，其中雜原子可以是硫、氧、nh或nrf；
r9為c6-c20芳基、c5-c20雜芳基；r9可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羥基、氨基、硝基、醛基、-cf3、-cn、-sf5、nrarb、羧基、-cora、-co2c1-c6烷基、-conrarb、-so2re、-so2nrarb、-p(o)me2、-p(o)(ome)2；其中各ra和各rb各自獨立為氫、取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c3-c10環烷基、取代或未取代的c2-c10烯基、取代或未取代的c6-c20芳基、或取代或未取代的c3-c14雜芳基；ra和rb可以一起可以形成三至八元環或四至八元雜環，其中雜原子可以是硫、氧、nh或nrg；
r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、c1-c4烷基-苯基、c1-c4烷基-c5雜環、-c(o)ore；-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
x為一個單鍵、o，s、nh或nrd；
環a為5元或6元含雜環；
r3和r4各自獨立為氫、取代或未取代的c1-c10烷基；r3和r4可以一起可以形成三至八元環或三至八元雜環，其中雜原子可以是硫、氧、nh或nrh；
r1、rd、re、rf、rg、rh獨立地為c1-c10烷基、c3-c10環烷基、c6-c20芳基、或c3-c14雜芳基；r1可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、羥基、氨基、硝基、氰基、醛基、羧基、烷氧基、-cf3、-sf5；
r1和2可以被一個或多個鹵素、烷氧基和氰基取代；
r1和rd可以連接形成六至八元環；
r1和r3可以連接形成五至八元環；
n為2至8的整數；
m為0、1或2。
在另一優選例中，所述的“取代”指具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、羥基、-nh2、硝基、-cn、c1-c4烷基、c1-c4鹵代烷基、c1-c4烷氧基、c3-c6環烷基、c2-c4鏈烯基、c2-c4炔基、苯基、芐基。
在另一優選例中，r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、-so2re、或-c(o)nrarb；
在另一優選例中，r3和r4各自獨立為氫、
在另一優選例中，n為2至6。
在另一優選例中，x為nh。
在另一優選例中，m為0。
在另一優選例中，所述化合物如通式(ii)所示，
式中，
r9為c6-c20芳基、c5-c20雜芳基；r9可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羥基、氨基、硝基、醛基、-cf3、-cn、-sf5、nrarb、羧基、-cora、-co2c1-c6烷基、-conrarb、-so2re、-so2nrarb；
其中，ra、rb、r3、r4、r1的定義如上所述；
r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、-c(o)ore；-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
n為2-6。
在另一優先選例中，所述化合物如通式(iii)所示，
式中，
其中，r3、r4、r1的定義如上所述；
r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、-c(o)ore；-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
r1和2可以被一個或多個鹵素、烷氧基和氰基取代
ar為c6-c10芳基、五元或六元雜芳基；ar可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羥基、-cf3、-cn、-sf5。
n為2-6。
在另一優選例中，r1為c1-c10烷基；
r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
r3和r4各自獨立為氫；
ar為c6-c10芳基、五元或六元雜芳基；ar可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羥基、氨基、硝基、醛基、-cf3、-cn、-sf5。
在另一優選例中，r1為c1-c4烷基；
ar為c6-c10芳基、五元或六元雜芳基；ar可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羥基、-cf3、-cn、-sf5。
在另一優選例中，所述的通式i化合物的前藥，如通式(iv)所示，
式中，
r1、r2、r3、r4和r9的定義如上所述；
r10a為取代或未取代的c6-c20芳基、取代或未取代的五元或六元雜芳基、取代或未取代的c1-c12烷基、取代或未取代的c1-c12烷氧基，取代或未取代的c3-c12環烷基，c3-c12環烷氧基、nrarb；其中，ra、rb的定義如上所述；
其中，所述的“取代”指具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、羥基、-nh2、硝基、-cn、c1-c4烷基、c1-c4鹵代烷基、c1-c4烷氧基、c3-c6環烷基、c2-c4鏈烯基、c2-c4炔基、苯基、芐基。
在另一優選例中，x、r1、r2、r3、r4、r7、r8、r9、r10a等各基團分別獨立地為實施例中制備的式(i)、(ii)、(ii)和(iv)的各具體化合物中的相應基團。
在另一優選例中，所述化合物為：
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(氮，硫-二甲基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮乙基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮異丙基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮環丙基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮(2,2,2-三氟乙基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮(2-氟乙基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(1-氧-3,4,5,6-四氫-1λ6,2-噻嗪-1-基)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮環丙基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮環丁基基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(4-氟苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(4-氯苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(苯胺基甲酰)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲基胺基甲酰)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(異丙基胺基甲酰)亞砜 亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰甲酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰乙酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰異丙酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲磺酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(苯磺酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(氮-苯氨基磺酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(氨甲酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(氮，硫-二甲基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮乙基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-三氟甲基苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮異丙基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-三氟甲基苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮環丙基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮環丁基基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-三氟甲基苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(4-氟苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(4-氯苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(苯胺基甲酰)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲基胺基甲酰)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-三氟甲基苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(異丙基胺基甲酰)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰甲酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-三氟甲基苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰乙酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰異丙酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲磺酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-三氟甲基苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(苯磺酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(氮-苯氨基磺酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
(±)(z)-氮-(3-氯-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(氨甲酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
在另一優選例中，所述的化合物是實施例中所制備的化合物1-9。
在另一優選例中，所述的化合物是外消旋體。
在另一優選例中，所述的化合物是對映異構體。
在另一優選例中，所述藥學上可接受的鹽選自下組：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽(甲苯磺酸鹽)、1-萘磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、苯乙酸鹽、扁桃酸鹽。
本發明的第二方面，提供第一方面所述的通式(i)化合物的制備方法，包括以下步驟：
(a)化合物p1與r3obf4反應，得到化合物p2；
(b)化合物p1與arb(oh)2和cu(oac)2反應，得到化合物p3；
(c)化合物p2或p3在氫氧化鈉存在下(如氫氧化鈉水溶液)開環，得到終產物p4或p5,即通式(i)化合物。
本發明的通式(i)化合物也可由以下的制備方法獲得，包括以下步驟：
(a)化合物p1與r-n＝c＝o或clso2r2反應，得到化合物p6或p7；
(b)化合物p6或p7在氫氧化鈉存在下(如氫氧化鈉水溶液)開環，得到終產物p8或p9,即通式(i)化合物。
本發明也提供了第三種通式(i)化合物的制備方法，包括以下步驟：
(a)化合物d在酸的催化下與化合物e和一個還原劑反應，得到化合物f；
(b)化合物f在堿水解條件下(如氫氧化鈉水溶液)開環，得到終產物通式(i)化合物。
本發明也提供了第四種通式(i)化合物的制備方法，包括以下步驟：
各式中，r1、r3、r4、r7、r8、r9、n、m、x及環a的定義如上所示。
本發明中以丙二氰為起始原料，經過一系列的氧化，加成，環合、重氮化、取代等反應得到化合物p1。
本發明的第三方面，提供第一方面所述的通式(i)化合物的用途，用于：
(i)制備吲哚胺-2,3-雙加氧酶抑制劑；
(ii)制備預防和/或治療吲哚胺-2,3-雙加氧酶介導的疾病的藥物；或
(iii)制備抗炎藥物。
在另一優選例中，所述吲哚胺-2,3-雙加氧酶介導的疾病為ido介導的色氨酸代謝途徑的病理學特征的疾病。
在另一優選例中，所述吲哚胺-2,3-雙加氧酶介導的疾病為癌癥、眼疾、心里障礙、抑郁癥、焦慮癥、老年癡呆癥和/或自身免疫性疾病。
在另一優選例中，所述癌癥包括但不限于：結腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、大腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、腦癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、慢性粒細胞性白血病、血液腫瘤、淋巴腫瘤，包括在其他遠離腫瘤原發部位的組織或器官的轉移病變。
本發明的第四方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：
第一方面的通式(i)化合物或其藥學上可以接受的鹽、其立體異構體或其互變異構體、或其前藥；以及
藥學上可接受的載體。
本發明的第五方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：
第一方面所述的通式(i)化合物或其藥學上可以接受的鹽、其立體異構體或其互變異構體、或其前藥；以及
抗腫瘤藥物。
在另一優選例中，所述抗腫瘤藥物包括但不限于癌癥的免疫治療藥物：pd-1抗體，ctla-4抗體，pd-l1抗體，pd-l2抗體，任何一種其它化療藥物或靶向治療藥物，例如hdac抑制劑和ep4拮抗劑。
本發明的第六方面，提供一種預防和/或治療吲哚胺-2,3-雙加氧酶介導的疾病的方法，包括對患者給予第一方面所述的通式(i)化合物或第四或第五方面所述的藥物組合物的步驟。
在另一優選例中，所述吲哚胺-2,3-雙加氧酶介導的疾病為癌癥，所述方法進一步包含對患者施用額外的抗癌劑(也稱為抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物如上所述)的步驟。
本發明的通式(i)化合物，具有抗腫瘤、治療神經退行疾病(阿爾茨海默病)、抗炎等多種藥理活性。
應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一贅述。
具體實施方案
本發明人經過廣泛而深入地研究，首次意外研發出一種新型的包含亞砜亞胺和1,2,5-噁二唑結構的化合物，該化合物可作為高效的ido酶抑制劑，用于預防和/或治療吲哚胺-2,3-雙加氧酶介導的疾病，也可作為抗炎藥物使用。在此基礎上，完成了本發明。
定義
術語“烷基”是指一價飽和脂族烴基，具有1至10個碳原子，包括直鏈和支鏈烴基，如甲基(即ch3-)、乙基(即ch3ch2-)、正丙基(即ch3ch2ch2-)、異丙基(即(ch3)2ch-)、正丁基(即ch3ch2ch2ch2-)、異丁基(即(ch3)2chch2-)、仲丁基(即 (ch3)(ch3ch2)ch-)、叔丁基(即(ch3)3c-)、正戊基(即ch3ch2ch2ch2ch2-)、新戊基(即(ch3)3cch2-)。在本發明中，該術語包括取代或未取代的烷基。
如本文所用，術語“取代或未取代的”指所述基團可以是未取代的，或者所述基團中的h被一個或多個(較佳地1-6個，更佳地1-3個)取代基所取代。
如本文所用，所述的“取代”或“取代的”指所述基團具有一個或多個(較佳地1-6個，更佳地1-3個)選自下組的取代基：鹵素、羥基、-nh2、硝基、-cn、c1-c4烷基、c1-c4鹵代烷基、c1-c4烷氧基、c3-c6環烷基、c2-c4鏈烯基、c2-c4炔基、苯基、芐基。
如本文所用，術語“環烷基”指取代或未取代的c3-c12環烷基。
如本文所用，術語“烷氧基”指-o-烷基，其中所述烷基可以是飽和或不飽和的、可以是支鏈、直鏈的、或環狀的。優選地，烷氧基具有1-10個碳原子，較佳地1-6個碳原子。代表性的例子包括(但并不限于)：甲氧基、乙氧基、丙氧基。
如本文所用，術語“芳基”是指6至20個(較佳6-14個)碳原子的單價芳香族碳環基團，它具有單環(如苯基)或稠環(如萘基或蒽基)，如果連接點在芳香碳原上，稠環可能是非芳香性的(如2-苯并噁唑酮，2h-1,4-苯并噁嗪-3(4h)-酮-7-基等)。優選的芳基包括苯基和萘基。該術語包括取代或未取代的形式，其中取代基的定義如上。
如本文所用，術語“烯基”是指具有2至10(如2至6或2至4)個碳原子的烯基，且具有至少1(如1至2)個不飽和烯鍵(＞c＝c＜)。這類基團的例如有乙烯基、烯丙基、丁-3-烯基。如本文所用，術語“環烷基”是指具有3至10個碳原子的、具有單環或多環(包括稠合體系，橋環體系和螺環體系)的環狀烷基。在稠環體系中，一個或多個環可以是環烷基、雜環的、芳基或雜芳基，只要連接位點是通過環烷基的環。合適的環烷基的例子包括：例如，金剛烷基、環丙基、環丁基、環戊基和環辛基。
如本文所用，術語“鹵代”或“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。
如本文所用，術語“雜芳基”是指環內具有1至10個碳原子和1至4個選自氧、氮和硫的雜原子的芳香基團，這樣的雜芳基可以是單環的(如吡啶基或呋喃基)或稠環(如吲嗪基(indolizinyl)或苯并噻吩基)，其中，所述稠環可以是非芳香性的和/或含有一個雜原子，只要連接點是通過芳香性雜芳基的原子。在一實施例中，雜芳基的環原子氮和/或硫任選地被氧化為n-氧化物(n-o)，亞磺酰基或磺酰基。優選地雜芳基包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基和呋喃基。該術語包括取代或未取代的雜芳基。
如本文所用，術語“取代的雜芳基”是指被1至5個、優選1至3個、更優選1至2個的取代基所取代的雜芳基，所述取代基選自與取代的芳基所定義的相同取代基。
如本文所用，術語“雜環”或“雜環的”或“雜環烷基”或“雜環基”是指飽和的、部分飽和的或不飽和的基團(但不是芳香性的)，具有單環或稠環(包括橋環體系和螺環體系，環內具有1至10個碳原子和1至4個選自氮、硫或氧的雜原子，在稠環體 系中，一個或多個環可以是環烷基、芳基或雜芳基，只要連接點通過非芳香性環。在一實施例中，雜環基團的氮原子和/或硫原子任選地被氧化，以提供n-氧化物、亞磺酰基和磺酰基部分。
如本文所用，術語“取代的雜環的”或“取代的雜環烷基”或“取代的雜環基”是指被1到5(如1至3)個取代基所取代的雜環基團，所述取代基與取代的環烷基所定義的取代基相同。
如本文所用，術語“立體異構體”是指一個或多個立體中心的手性不同的化合物。立體異構體包括對映異構體和非對映異構體。
如本文所用，術語“互變異構體”是指質子位置不同的化合物的替代形式，如烯醇-酮和亞胺-烯胺互變異構體，或雜芳基的互變異構形式，所述雜芳基包含與環的-nh-部分和環的＝n-部分連接的環原子，如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑和四唑。
“前藥”是指實施例化合物的任何衍生物，當被施用于受試者時，其能夠直接或間接地提供實施例的化合物或其活性代謝物或殘余物。特別優選的衍生物和前藥是那些，當被施用于受試者時，提高實施例化合物的生物利用度(如口服給藥的化合物更容易被吸收進入血液)或相對于母體種類提高母體化合物到生物區室(如腦或淋巴系統)的運送的衍生物和前藥。前藥包括本發明化合物的酯類形式。
本發明化合物
如本文所用，術語“本發明化合物”指具有本發明通式結構的化合物，包括通式(i)或通式(ii)化合物、其外消旋體、其立體異構體或其互變異構體、或前藥、或其藥學上可以接受的鹽。應理解，該術語還包括式(iii)及本發明說明書和權利要求中其它通式所示的化合物、其外消旋體、其立體異構體或其互變異構體、或其藥學,上可以接受的鹽。
本發明涉及：這些化合物的外消旋混合物，富集任一種對映體的混合物，以及任一種分離的對映體。對于本發明的范圍，應當理解為，所述外消旋混合物指兩種r和s對映體50％:50％的混合物。所述分離的對映體應理解為純的對映體(即100％)或者高度富集某種對映體(純度≥98％、≥95％、≥93％、≥90％、≥88％、≥85％、≥80％)的混合物。
典型地，本發明提供通式(i)化合物或其藥學上可以接受的鹽、其立體異構體或其互變異構體、或前藥，
式中，
r7和r8各自獨立為氫、取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c3-c10 環烷基、取代或未取代的c2-c10烯基、取代或未取代的c3-c10炔基、取代或未取代的c6-c20芳基、或取代或未取代的c3-c14雜芳基；r7和r8可以一起可以形成三至八元環或三至八元雜環，其中雜原子可以是硫、氧、nh或nrf；
r9為c6-c20芳基、五元或六元雜芳基；r9可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羥基、氨基、硝基、醛基、-cf3、-cn、-sf5、nrarb、羧基、-cora、-co2c1-c6烷基、-conrarb、-so2ra、-so2nrarb、-p(o)me2、-p(o)(ome)2；其中各ra和各rb各自獨立為氫、取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c3-c10環烷基、取代或未取代的c2-c10烯基、取代或未取代的c6-c20芳基、或取代或未取代的c3-c14雜芳基；ra和rb可以一起可以形成三至八元環或四至八元雜環，其中雜原子可以是硫、氧、nh或nrg；
r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
x為一個單鍵、o，s、nh或nrd；
r3和r4各自獨立為氫、取代或未取代的c1-c10烷基；r3和r4可以一起可以形成三至八元環或三至八元雜環，其中雜原子可以是硫、氧、nh或nrh；
r1、rd、re、rf、rg、rh獨立地為c1-c10烷基、c3-c10環烷基、c6-c20芳基、或c3-c14雜芳基；r1可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、羥基、氨基、硝基、氰基、醛基、羧基、烷氧基、-cf3、-sf5；
r1和rd可以連接形成六至八元環；
r1和r3可以連接形成五至八元環；
n為2至8；
環a為1,2,5-噁二唑環；
m為0至2。
在另一優選例中，所述通式(a)化合物為：
其中r1為c1-c10烷基、c3-c10環烷基、c1-c10烯基、芳基、或雜芳基，r1可以被一個或多個鹵素取代；
r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
r10和r11分別獨立為氫、鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c2-c6炔基、羥基、氨基、硝基、氰基、醛基、-cf3、-cn、-sf5、nrarb、羧基、-co2c1-c6烷基、-conrarb、-so2ra、so2nrarb取代；ra和rb的定義如前所述；
n為1至8。
在另一優選例中，本發明還提供了式(a)的前藥：
式中，各基團的定義如上所述。
在本發明的一個優選地實施方式中，本發明提供了一種通式(i)化合物或其藥學上可以接受的鹽、其立體異構體或其互變異構體、或前藥：
式中，
r7和r8各自獨立為氫、取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c3-c10環烷基、取代或未取代的c2-c10烯基、取代或未取代的c3-c10炔基、取代或未取代的c6-c20芳基、或取代或未取代的c3-c14雜芳基；r7和r8可以一起可以形成三至八元環或三至八元雜環，其中雜原子可以是硫、氧、nh或nrf；
r9為c6-c20芳基、c5-c20雜芳基；r9可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羥基、氨基、硝基、醛基、-cf3、-cn、-sf5、nrarb、羧基、-cora、-co2c1-c6烷基、-conrarb、-so2re、-so2nrarb、-p(o)me2、-p(o)(ome)2；其中各ra和各rb各自獨立為氫、取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c3-c10環烷基、取代或未取代的c2-c10烯基、取代或未取代的c6-c20芳基、或取代或未取代的c3-c14雜芳基；ra和rb可以一起可以形成三至八元環或四至八元雜環，其中雜原子可以是硫、氧、nh或nrg；
r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、c1-c4烷基-苯基、c1-c4烷基-c5雜環、-c(o)ore；-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
x為一個單鍵、o，s、nh或nrd；
r3和r4各自獨立為氫、取代或未取代的c1-c10烷基；r3和r4可以一起可以形成三至八元環或三至八元雜環，其中雜原子可以是硫、氧、nh或nrh；
r1、rd、re、rf、rg、rh獨立地為c1-c10烷基、c3-c10環烷基、c6-c20芳基、或c3-c14雜芳基；r1和r2可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、羥基、氨基、硝基、氰基、醛基、羧基、烷氧基、-cf3、-sf5；
r1和r2可以被一個或多個鹵素、烷氧基和氰基取代；
r1和r2可以連接形成四至八元環；
r1和rd可以連接形成六至八元環；
r1和r3可以連接形成五至八元環；
n為2至8的整數；
m為0、1或2。
在另一個優選地實施方式中，本發明提供的所述化合物如通式(ii)所示，
式中，
r9為c6-c20芳基、c5-c20雜芳基；r9可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羥基、氨基、硝基、醛基、-cf3、-cn、-sf5、nrarb、羧基、-cora、-co2c1-c6烷基、-conrarb、-so2re、-so2nrarb；
其中，ra、rb、r3、r4、r1的定義如權利要求1所述；
r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、c1-c4烷基-苯基、c1-c4烷基-c5雜環、-c(o)ore；-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
r1和r2可以被一個或多個鹵素、烷氧基和氰基取代；
r1和r2可以連接形成四至八元環；
n為2-6的整數。
在本發明另一個優選地實施方式中，本發明提供的所述化合物如通式(iii)所示，
式中，
ar為苯環，五元或六元雜芳基，ar可以被一個或多個選自下組的基團取代：鹵素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羥基、氨基、硝基、醛基、-cf3、-cn、-sf5、nrarb、羧基、-cora、-co2c1-c6烷基、-conrarb、-so2re、-so2nrarb；
r2為c1-c12烷基、c6-c20芳基、c5-c20雜芳基、c1-c4烷基-苯基、c1-c4烷基-c5雜環、-c(o)ore；-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
ra、rb、r3、r4、r1的定義如權利要求1所述；
r1和r2可以被一個或多個鹵素、烷氧基和氰基取代；
r1和r2可以連接形成四至八元環；
n為2-6的整數。
在本發明另一個優選地實施方式中，r1為c1-c4烷基；
r2為c1-c6烷基、苯基、c5-c20雜芳基、-c(o)ore；-so2re、-so2nrarb或-c(o)nrarb；
ra、rb的定義如權利要求1所述；
r1和r2可以連接形成四至八元環；
r3和r4各自獨立為氫；
n為2-6的整數。
在本發明另一個優選地實施方式中，本發明提供了所述的通式(i)化合物的前藥，如通式(iv)所示，
式中，
r1、r2、r3、r4和r9的定義如權利要求1所述；
r10a為取代或未取代的c6-c20芳基、取代或未取代的五元或六元雜芳基、取代或未取代的c1-c12烷基、取代或未取代的c1-c12烷氧基，取代或未取代的c3-c12環烷基，c3-c12環烷氧基、nrarb；其中，ra、rb的定義如權利要求1所述，
其中，所述的“取代”指具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、羥基、-nh2、硝基、-cn、c1-c4烷基、c1-c4鹵代烷基、c1-c4烷氧基、c3-c6環烷基、c2-c4鏈烯基、c2-c4炔基、苯基、芐基。
在本發明所述的化合物有立體異構體存在的情況下，本發明包括化合物的所有立體異構體。
在本發明所述的化合物有互變異構體存在的情況下，本發明包括化合物的所有互變異構體。
本發明還包括所述化合物中的任何一個或多個氫原子被其穩定同位素氘取代而產生的氘代化合物。
藥物組合物
本發明還提供了一種藥物組合物，它包含安全有效量范圍內的活性成分，以及藥學上可接受的載體。
本發明所述的“活性成分”是指本發明所述的通式(i)化合物或其藥學上可以接 受的鹽、其立體異構體或其互變異構體、或其前藥。
本發明所述的“活性成分”和藥物組合物可用作ido抑制劑。在另一優選例中，用于制備預防和/或治療腫瘤的藥物。在另一優選例中，用于制備預防和/或治療ido介導的疾病的藥物。
“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明顯改善病情，而不至于產生嚴重的副作用。通常，藥物組合物含有1-2000mg活性成分/劑，更佳地，含有10-200mg活性成分/劑。較佳地，所述的“一劑”為一個藥片。
“藥學上可接受的載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”在此指的是組合物中各組份能和本發明的活性成分以及它們之間相互摻和，而不明顯降低活性成分的藥效。
本發明優選實施例的化合物可以作為單獨活性藥劑給藥，也可以與一個或多個其它用于治療癌癥的試劑組合使用。本發明優選實施例的化合物與已知的治療劑和抗癌劑組合使用也是有效的，目前已知的化合物和其它抗癌劑或化療劑的組合在優選實施例范圍之內。這類藥劑的例子可參見《癌癥原理和實踐腫瘤學》(cancerprinciplesandpracticeofoncology)，v.t.devita和s.hellman(編者)，第6版(2001年2月15日)，lippincottwilliams&wilkins出版社。基于藥物的特殊性質和所涉及的癌癥，本領域普通技術人員能夠辨別有效的藥劑組合。這種抗癌劑包括(但不限于)如下：雌激素受體調節劑、雄激素受體調節劑、視黃醇類受體調節劑、細胞毒性/細胞生長抑制劑、抗增殖劑、異戊烯基蛋白轉移酶抑制劑、取乙酰酶(hdac)抑制劑、hmg-coa還原酶抑制劑和其他血管生成抑制劑、細胞增殖和生存信號抑制劑、凋亡誘導劑和干擾細胞周期檢查點(cellcyclecheckpoint)的試劑、ctla4抗體、pd-1抗體、pd-l1抗體等。優選實施例的化合物與放射治療同時施用時也有效。
通常，優選實施例的化合物將以治療有效量、通過具有類似作用的藥劑的任意一種可接受的模式施用。優選實施例的化合物(即活性成分)的實際用量根據多個因素確定，如待治療疾病的嚴重程度、患者的年齡和相對健康程度、被使用化合物的效力、施用的路徑和形式，以及其他因素。該藥物可一天施用多次，優選地，每天一次或兩次。所有這些因素都在主治醫生的考慮范圍內。
優選實施例的目的，治療有效劑量通常可以是對患者一次性施用或分次施用的每日總劑量，例如，每日約0.001至約1000毫克/公斤體重，優選地，每日約1.0至約30毫克/千克體重。單位劑量組合物(dosageunitcomposition)可包含其劑量因數以形成每日劑量。劑型的選擇取決于各種因素，例如給藥模式和藥物物質的生物利用度。通常，優選實施例的化合物可作為藥物組合物通過以下任意一種路線給藥：口服、全身給藥(如透皮、鼻內或通過栓劑)、或腸外給藥(如肌內、靜脈內或皮下)。優選的給藥方式為口服，可根據苦的程度調節方便的日劑量。組合物可采取的形式為片劑、丸劑、膠囊、半固體、粉劑、緩釋制劑、溶液、懸浮液、酏劑、氣霧劑或任 何其他適當的組合物。另一種優選的施用優選實施例化合物的方式為吸入。這是一種將治療劑直接運送給呼吸道的有效方法(參見，如美國專利號5,607,915)。
合適的藥學上可接受的載體或賦形劑包括：如處理劑和藥物運送改性劑和促進劑，諸如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、單糖、二糖、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、葡萄糖、羥丙基-b-環糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔點蠟、離子交換樹脂等，及其任意兩種或多種的組合。液體和半固體的賦形劑可以選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油，包括石油、動物油、植物油或合成來源，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。優選的液體載體，特別是用于可注射溶液的載體，包括水、鹽水、葡萄糖水性溶液和乙二醇。其它適宜的藥學上可接受的賦形劑在《雷明頓藥物科學》(remington’spharmaceuticalsciences),mackpub.co.,新澤西(1991)有描述，通過引用納入本文。
如本文所用，術語“藥學上可接受的鹽”是指通式i化合物的非毒性酸或堿土金屬鹽。這些鹽可在最終分離和純化通式i化合物時原位制得、或分別將合適的有機或無機酸或堿與堿性或酸性官能團反應制得。代表性的鹽包括，但不限于：乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、環戊烷丙酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、葡萄糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘基磺酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、硫氰酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。此外，含氮的堿性基團可被如下試劑季銨鹽化：烷基鹵化物，如甲基、乙基、丙基、丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸鹽，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯；長鏈鹵化物如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基鹵化物如芐基和苯乙基溴化物等。由此得到水溶性或油溶性或可分散產品。可被用于形成藥學上可接受的酸加成鹽的酸的例子包括如鹽酸、硫酸、磷酸的無機酸，和如草酸、馬來酸、甲磺酸、琥珀酸、檸檬酸的有機酸。堿加成鹽可在最終分離和純化通式i的化合物時原位制得、或使羧酸部分分別與合適的堿(如藥學上可接受的金屬陽離子的氫氧化物，碳酸鹽或碳酸氫鹽)或氨、或有機伯、仲或叔胺反應制得。藥學上可接受的鹽包括，但不限于，基于堿金屬和堿土金屬的陽離子，如鈉、鋰、鉀、鈣、鎂、鋁的鹽等，以及無毒的銨、季銨和胺陽離子，包括，但不限于：銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。其它代表性的用于形成堿加成鹽的有機胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
如本文所用，術語“藥學上可接受的前藥”是指那些優選實施例的化合物的前藥，在體內迅速轉化為上述通式所示的母體化合物的化合物，例如在血液中水解。在“t.higuchi和v.stella，作為新型運送系統的前藥(pro-drugsasnoveldelivery systems)，a.c.s.15symposiumseries的14卷”和“edwardb.roche編，藥物設計中的生物可逆載體(bioreversiblecarriersindrugdesign)，美國藥學協會和pergamon出版社，1987年”中提供了完整的討論，這兩者都引入本文作為參考。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
本發明的有益之處在于：
(1)提供一種結構新穎的通式(i)化合物；
(2)本發明的化合物可以作為高效的ido酶抑制劑；
(3)合成方法溫和，操作簡單易行，收率較高，易于衍生化，適合工業放大量生產；
(4)具有抗腫瘤、神經退行性疾病(阿爾茨海默病)、抗炎等多種藥理活性。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮’-羥基-4-((2-(氮，硫-二甲基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
第一步：4-氨基-氮’-羥基-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
將丙二氰(3.2g,48.5mmol)溶于70ml水中，加熱至完全溶解。冰水浴冷卻下，加入亞硝酸鈉(3.8g,55mmol)和6n鹽酸(0.6ml)。在冰浴下反應0.5小時后，升溫 至室溫反應2小時。將反應液繼續冰浴冷卻，將50％的鹽酸羥胺水溶液(9.9g,150mmol)滴加入反應液，攪拌半小時后，升至室溫反應1小時。加熱回流反應2小時，反應完全后，冰浴下，用8ml6n鹽酸調節ph至7.0。過濾沉淀，用水和乙酸乙酯各洗一次，干燥，得到白色化合物6.0g,收率93％。
13cnmr(75mhz,dmso-d6):δ154.4,144.0,140.0。
msesi:m/z＝144.0,[m+h]+.
第二步：4-氨基-氮-羥基-1,2,5-噁二唑-3-甲脒氯
將第一步產物(4.2g,29.4mmol)溶于30ml乙酸，分別加入水60ml，鹽酸15ml和氯化鈉(5.2g,88.2mmol)。冰浴下，滴加入溶于7ml水的亞硝酸鈉(2.0g,29.4mmol)，保持零度反應1小時，后升溫至室溫反應5小時。反應結束后，過濾沉淀，水洗一次，干燥，得白色固體化合物2.6g，收率55％。
13cnmr(75mhz,dmso-d6):δ154.4,142.3,126.9。
msesi：m/z＝160.9,[m+h]-.
第三步：4-氨基-氮’-(3-溴-4-氟苯基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
在60℃下,向第二步產物(41.99g，259.2mmol)的純水(800ml)溶液中批量加入3-溴-4-氟苯胺(54.179g，285.12mmol)。反應混合液在60℃下攪拌10min，往該混合液中加入na2co3(41.2g,388.8mmol)的水(500ml)溶液。攪拌反應20min后lcms顯示反應完全。反應混合液冷卻后過濾，用水洗，烘干得到灰色固體(70g，85％)。
1hnmr(400mhz,acetone-d6)：δ8.10(dd,1h),7.78(m,1h),7.56(t,1h),6.15(s,1h)。
第四步：4-氨基-氮’-(3-溴-4-氟苯基)-1,2,5-噁二唑--3-基)-1,2-4-噁二唑酮
在室溫下，將第三部產物(70g，221.5mmol)和cdi(39.8g，332.173mmol) 溶解于乙酸乙酯(600ml)中并升溫至60℃，攪拌反應20分鐘；tlc監測反應完全，將反應混合液冷卻至室溫，濃反應液，將殘余物用pe:ea＝4:1打漿，得到灰白色固體(55g，收率為72％)。
1hnmr(400mhz,acetone-d6)：δ8.09(dd,1h),7.83(m,1h),6.79(t,1h)。
第五步：4-(3-溴-4-氟苯基)-3-4-(((2-甲基硫)乙基)氨基)-1,2,5-惡二唑-3-基)-1,2-4-惡二唑酮的制備
室溫下，將4-氨基-氮’-(3-溴-4-氟苯基)-1,2,5-噁二唑--3-基)-1,2-4-噁二唑酮(3.0g，8.8mmol)溶解在dcm(20ml)中加入三乙基硅烷(3.1g，26.3mmol)和甲磺酸(2.4g,26.3mmol)，冰浴降溫至0℃，滴加2，2-二甲氧基甲硫基乙烷(2.4g，17.5mmol)。滴畢，在室溫下反應2小時反應完畢，用飽和碳酸氫鈉水溶液調到ph＝7，有機相用水洗(20ml×3)，飽和食鹽水洗(20ml×3)，分離有機項，干燥濃縮，得棕色固體(3.5g,96％)。
1hnmr(300mhz,acetone-d6):δ8.08(d,1h),7.80(dd,1h),7.57(t,1h),6.14(s,1h),3.66(m,2h),2.80(m,2h),2.13(s,3h)。
第六步：4-(3-溴-4-氟苯基)-3-4-(((2-甲基硫)乙基)叔丁氧羰基氨基)-1,2,5-惡二唑-3-基)-1,2-4-惡二唑酮
將第五步產物(50mg,0.120mmol)溶于thf(2ml)中，加入二碳酸二叔丁酯(131mg,0.601mmol)，加入催化量4-二甲氨基吡啶(2mg),冰浴下攪拌，直到反應完全，加入水(10ml)用乙酸乙酯萃取(10mlx3)萃取，用水洗(5ml)飽和食鹽水洗(5ml)硫酸鈉干燥，柱層析分離純化得到白色固體(60mg,100％收率)。
1hnmr:(400mhz，cdcl3):δ7.71-7.69(m,1h),7.39-7.35(m,1h),7.22-7.14(m,1h),3.97-3.94(m,2h),2.83-2.80(m,2h),2.12(s,3h),1.53(s,9h)
第七步：(±)4-(3-溴-4-氟苯基)-3-4-(((2-(甲基亞砜)乙基)叔丁氧羰基氨基)-1,2,5-惡二唑-3-基)-1,2,4-惡二唑酮
將第六步產物(2.0g,3.9mmol)溶于20ml二氯甲烷和2ml甲醇，冰浴下加入mmpp(1.06g,2.15mmol)，室溫反應1小時。反應結束后，加入20ml水，用 乙酸乙酯萃取3次，合并有機層，水(10ml)洗三次，飽和氯化鈉(10ml)洗一次，旋干溶劑，干燥，得黃色固體1.6g,收率77％。
1hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.71(dd,1h),7.38(m,1h),7.22(t,1h),3.95(t,2h),2.82(t,2h),2.12(s,3h),1.50(s,9h).
第八步：(±)4-(3-溴-4-氟苯基)3-4-(((2-(甲基三氟乙酰基亞砜亞胺)乙基)叔丁氧羰基氨基)-1,2,5-惡二唑-3-基)-1,2,4-惡二唑酮
將第七步產物(330mg,0.620mmol)加入反應瓶中，加入cf3c(o)nh2(140mg,1.240mmol),mgo(99mg,2.479mmol)和rh(oac)2(10mg),在室溫下攪拌一分鐘，加入phi(oac)2(309mg,0.930mol)，室溫攪拌直到tlc監測反應完全。反應中加入水(10ml)，用乙酸乙酯萃取(10mlx3)，用水洗(10ml)和飽和食鹽水洗(10ml),無水硫酸鈉干燥。柱層析分離純化，得到目標化合物(300mg,75％收率)。
第九步：(±)4-(3-溴-4-氟苯基)3-4-(((2-(甲基亞砜亞胺)乙基)叔丁氧羰基氨基)-1,2,5-惡二唑-3-基)-1,2,4-惡二唑酮
將第八步產物(330mg,0.513mmol)溶于甲醇中(5ml),冰浴下，加入碳酸鉀(142mg,1.026mmol),攪拌15分鐘。tlc顯示反應完全，正己烷：乙酸乙酯＝1:1。反應液過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌(10ml*2),濾液濃縮后得到白色(280mg,99％收率)。
1hnmr:(400mhz,dmso-d6):δ8.00(s,1h),7.64-7.60(m,2h),4.03-3.99(m,2h),3.88(s,1h),3.42-3.40(m,2h),2.96(s,3h),1.48(s,9h)
第十步：(±)4-(3-溴-4-氟苯基)3-4-(((2-(甲基亞砜甲基亞胺)乙基)叔丁氧羰基氨基)-1,2,5-惡二唑-3-基)-1,2,4-惡二唑酮
將第九步產物(20mg,0.037mmol)溶于二氯甲烷中(2ml)，加入三甲基氧鎓四氟硼酸鹽(8mg,0.055mmol)，室溫下攪拌2小時，tlc顯示反應完全，反應液中加入水(10ml),乙酸乙酯(10ml)，然后用乙酸乙酯萃取(10mlx2)合并有機相，然后用水洗(10ml)，飽和食鹽水洗(10ml),硫酸鈉干燥。濃縮后柱 層析分離純化，得到目標化合物(10mg,48％收率)。
1hnmr:(400mhz,acetone-d6):δ7.96-7.94(m,1h),7.66-7.62(m,1h),7.53-7.49(m,1h),4.17(s,2h),3.64-3.57(m,1h),3.50-3.42(s,1h),2.97(s,3h),2.64(s,3h),1.54(s,9h)
第十一步：((±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮’-羥基-4-((2-(氮，硫-二甲基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
將第十步產物(20mg,0.037mmol)溶于二氯甲烷中(1ml)，加入10n的氯化氫/乙醇溶液(2ml)，室溫下攪拌2小時，反應完全后，直接濃縮干，所得殘留物溶于四氫呋喃中(2ml),加入2m氫氧化鈉水溶液(0.2ml)，室溫攪拌30分鐘。tlc顯示反應完全(二氯甲烷：甲醇＝20:1)，加入2m鹽酸調節ph＝5，反應液中加入水(10ml),乙酸乙酯(10ml)，然后用乙酸乙酯萃取(10mlx2)合并有機相，然后用水洗(10ml)，飽和食鹽水洗(10ml),硫酸鈉干燥。濃縮后柱層析分離純化，得到目標化合物(10mg,52％收率)。
1hnmr:(400mhz,acetone-d6):δ10.78(s,1h),8.10(s,1h),7.31-7.29(m,1h),7.17-7.13(m,1h),7.02-6.98(m,1h),4.28-4.27(m,2h),4.02-4.04(m,2h),3.84(s,3h),2.92(s,3h)
ms(esi):[m+h]+m/z＝435.0
實施例2
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮’-羥基-4-((3-(硫-甲基-氮乙基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
根據實施例1制備方法，將第十步的試劑用三乙基氧鎓四氟硼酸鹽取代，再運用第十一步的條件得到目標化合物。
1hnmr:(400mhz,acetone-d6):δ10.85(s,1h),8.12(s,1h),7.28-7.26(m,1h),7.17-7.13(m,1h),7.02-6.98(m,1h),6.64(s,1h),3.81(s,2h),3.57(s,1h),3.43-3.40(m,1h),3.31-3.06(m,5h),1.11-1.05(m,3h).
ms(esi):[m+h]+m/z＝449.0
實施例3
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-(2-(硫-甲基-氮-苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
第一步：(±)4-(3-溴-4-氟苯基)3-4-(((2-(甲基亞砜苯基亞胺)乙基)叔丁氧羰基氨基)-1,2,5-惡二唑-3-基)-1,2,4-惡二唑酮
將實施例1第九步的產物(20mg,0.037mmol)溶于二氯甲烷中(2ml)，加入苯硼酸(8mg,0.055mmol)，醋酸銅(5mg)室溫下攪拌2小時，tlc顯示反應完全，反應液中加入水(10ml),乙酸乙酯(10ml)，然后用乙酸乙酯萃取(2x10ml)合并有機相，然后用水洗(10ml)，飽和食鹽水洗(10ml),硫酸鈉干燥。濃縮后柱層析分離純化，得到目標化合物(15mg,66％收率)
1hnmr(400mhz，acetone-d6):δ7.93-7.91(m,1h),7.62-7.58(m,1h),7.51-7.47(m,1h),7.23-7.12(m,2h),6.96(d,2h),6.92-6.89(m,1h),4.29(s,2h),3.87-3.80(m,1h),3.76-3.68(m,1h),3.21(s,3h),1.51(s,9h)
第二步：(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-氮-苯基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
將第一步產物(10mg,0.016mmol)溶于二氯甲烷中(1ml)，加入10m的氯化氫/乙醇溶液(2ml)，室溫下攪拌2小時，反應完全后，直接濃縮干，所得殘留物溶于四氫呋喃中(2ml),加入2m氫氧化鈉水溶液(0.2ml)，室溫攪拌30分鐘。tlc顯示反應完全，加入2m鹽酸調節ph＝5，反應液中加入水(10ml),乙酸乙酯(10ml)，然后用乙酸乙酯萃取(2x10ml)合并有機相，然后用水洗(10ml)，飽和食鹽水洗(10ml),硫酸鈉干燥。濃縮后柱層析分離純化，得到目標化合物(5mg,63％收率)
1hnmr(400mhz,acetone-d6):δ10.80(s,1h),8.13(s,1h),7.29-7.27(m,1h), 7.19-7.13(m,3h),7.04-7.01(m,3h),6.89-6.85(m,1h),6.55(s,1h),3.91-3.87(m,2h),3.72-3.61(m,2h),3.20(s,3h)
ms(esi):[m+h]+m/z＝497.0
實施例4
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(苯胺基甲酰)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
第一步：(±)4-(3-溴-4-氟苯基)3-4-(((2-硫-甲基-氮-(苯胺基甲酰)亞砜亞胺)乙基)叔丁氧羰基氨基)-1,2,5-惡二唑-3-基)-1,2,4-惡二唑酮
將實施例1第九步的產物(20mg,0.037mmol)溶于四氫呋喃中(2ml)，加入苯基異氰酸酯(9mg,0.073mmol)室溫攪拌過夜，加入碳酸氫鈉水溶液(10ml)乙酸乙酯(10ml)，用乙酸乙酯萃取(10mlx2),合并有機相，用水洗(10ml)，飽和食鹽水洗(10ml)，濃縮有機相。柱層析分離純化得到目標化合物(20mg,82％收率)
1hnmr(400mhz,acetone-d6):δ8.24(s,1h),7.96-7.95(m,1h),7.66-7.58(m,3h),7.50-7.46(m,1h),7.26-7.22(m,2h),6.97-6.93(m,1h),4.36(s,2h),4.09-4.02(m,1h),3.96-3.86(m,1h),3.41(s,3h),1.51(s,9h)
第二步:(±)4-(3-溴-4-氟苯基)3-4-(((2-硫-甲基-氮-(苯胺基甲酰)亞砜亞胺)乙基)叔丁氧羰基氨基)-1,2,5-惡二唑-3-基)-1,2,4-惡二唑酮
將第一步產物(20mg,0.030mmol)加入10nhcl/etoh(3ml)，室溫攪拌3小時。反應完全后，直接濃縮干，得到目標化合物(20mg,100％收率)
1hnmr(400mhz，acetone-d6):δ8.10(s,1h),7.98-7.97(m,1h),7.72-7.68(m,1h),7.60(d,2h),7.54-7.50(m,1h),6.61(s,1h),4.03-4.00(m,2h),3.94-3.88(m,2h),3.64-3.60(m,1h),3.46(s,3h)
第三步:(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(苯胺基甲酰)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
將第二步產物(20mg,0.035mmol)溶于四氫呋喃(2ml)，加入2m氫氧化鈉水溶液(0.2ml)，室溫攪拌30分鐘。tlc顯示反應完全，加入2mol/l鹽酸調節ph＝5，反應液中加入水(10ml),乙酸乙酯(10ml)，然后用乙酸乙酯萃取(2x10ml)合并有機相，然后用水洗(10ml)，飽和食鹽水洗(10ml),硫酸鈉干燥。濃縮后柱層析分離純化，得到目標化合物(10mg,52％收率)
1hnmr(400mhz,acetone-d6):δ10.70(s,1h),8.19(s,1h),8.14(s,1h),7.61(d,2h),7.30-7.28(m,4h),7.26-7.22(m,2h),7.16-7.12(m,1h),7.02-6.98(m,1h),6.96-6.93(m,1h),6.57(s,1h),3.95-3.85(m,3h),3.81-3.74(m,1h),3.44(s,3h)
ms(esi):[m+h]+m/z＝540.1
實施例5
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰甲酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
第一步：(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(羰基咪唑)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒(化合物r)的制備：
室溫下，將(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-惡二唑-3-甲脒(500mg,1.19mol)溶于20ml乙酸乙酯，加入羰基二咪唑 (579mg,3.57mmol)，然后60°攪拌5小時，將溶劑蒸干，加入20ml水，用乙酸乙酯萃取(3x30ml)，合并有機層，飽和食鹽水系，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，過柱(二氯甲烷:甲醇＝100:5)，濃縮，干燥，得白色固體。
1hnmr(400mhz,acetone-d6):δ8.09(m,2h),7.78(m,1h),7.55(t,1h),7.46(s,1h),6.93(s,1h),6.46(t,1h),4.20(m,2h),4.10(m,2h),3.65(s,3h)。
第二步：(±)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰甲酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1，2，5-噁二唑-3-甲脒
將第一步產物(30mg,0.055mmol)溶于3ml甲醇，冰浴下，加入2n氫氧化鈉溶液1ml。室溫攪拌1h,用6n鹽酸溶液調節ph＝7.加入20ml水，用乙酸乙酯萃取(3x20ml)，有機層合并，水，飽和食鹽水各洗一次，濃縮溶劑，制備柱色譜分離(dcm:meoh＝20:1),得目標化合物(10mg,38％).
1hnmr(400mhz,acetone-d6):δ10.76(s,1h),8.10(s,1h),7.30(m,1h),7.16(t,1h),7.02(m,1h),3.93(m,2h),3.89(s,1h),3.79(s,1h),3.64(s,3h),3.47(s,3h),3.65(s,3h)。
ms(esi):[m+h]+m/z＝480.7
實施例6
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰乙酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
根據實施例5制備方法，將實施例5第一步產物(30mg,0.055mmol)溶于3ml乙醇，冰浴下，加入2n氫氧化鈉溶液1ml。室溫攪拌1h,用6n鹽酸溶液調節ph＝7.加入20ml水，用乙酸乙酯萃取(3x20ml)，有機層合并，水，飽和食鹽水各洗一次，濃縮溶劑，制備柱色譜分離(dcm:meoh＝20:1),得目標化合物(14mg,51％).
1hnmr(400mhz,cdcl3):δ9.96(s,1h),7.82(t,1h),7.26(dd,1h),7.05(t,1h), 6.94(m,1h),6.84(s,1h),4.29(m,2h),4.00(m,1h),3.90(m,1h),3.64(m,1h),3.52(m,1h),3.41(s,3h)。
ms(esi):[m+h]+m/z＝494.7
實施例7
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲酰異丙酯)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
根據實施例5制備方法，將實施例5第一步產物(30mg,0.055mmol)溶于3ml異丙醇，冰浴下，加入2n氫氧化鈉溶液1ml。室溫攪拌1h,用6n鹽酸溶液調節ph＝7.加入20ml水，用乙酸乙酯萃取(3x20ml)，有機層合并，水，飽和食鹽水各洗一次，濃縮溶劑，制備柱色譜分離(dcm:meoh＝20:1),得化合物tm(10mg,37％).
1hnmr(400mhz,cdcl3):δ10.07(s,1h),7.96(s,1h),7.24(m,1h),7.05(t,1h),6.93(m,1h),6.81(s,1h),5.03(m,1h),4.04(m,1h),3.89(m,1h),3.62(m,1h),3.58(m,1h),3.42(s,3h),1.34(d,3h),1.26(m,3h)。
ms(esi):[m+h]+m/z＝506.7
實施例8
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(甲磺酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
將化合物實施例1第九步的產物(30mg,0.055mmol)和三乙胺(15ul)溶于3ml二氯甲烷中，冰浴下，加入甲基磺酰氯(6.4ul)，反應十分鐘后，加入20ml水淬滅，用二氯甲烷萃取(3x20ml)，合并有機層，鹽水洗一次，干燥，過濾，旋干溶劑，過柱(dcm:meoh＝100:5)，得到粗產物35mg。將粗產物(35mg,0.056 mmol溶于1ml二氯甲烷和1ml三氟乙酸中，室溫反應三小時。旋干溶劑，加入水20ml，用二氯甲烷萃取(3x20ml)，合并有機層，鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，的粗產物(25mg)。將上一步粗產物溶于2ml四氫呋喃溶液中，加入0.5ml2n氫氧化鈉水溶液，室溫攪拌0.5小時，用2nhcl調節至ph＝7,加水20ml，乙酸乙酯萃取(3x20ml)，和并有機層，鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，過柱(dcm:meoh＝100:5)，得到白色固體(20mg,84％)
1hnmr(400mhz,cdcl3):δ9.28(s,1h),8.34(s,1h),7.52(,1h),7.01(t,1h),6.95(m,1h),6.87(s,1h),3.98(m,2h),3.95(m,1h),3.92(m,1h),3.54(m,1h),3.23(s,3h)。
ms(esi):[m+h]+m/z＝499.0
實施例9
(±)(z)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-(氨甲酰基)亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒
冰浴下，將(±)-氮-(3-溴-4-氟苯基)-氮'-羥基-4-((2-(硫-甲基-氮-氰基亞砜亞胺)乙基)氨基)-1,2,5-噁二唑-3-甲脒(20mg,0.045mmol)溶于2mldmso溶液中，然后加入無水碳酸鉀(63mg,0.45mmol)，緩慢滴加入0.5ml雙氧水，室溫反應0.5小時。加入硫代硫酸鈉水溶液20ml,淬滅后，用二氯甲烷萃取(3x20ml)，合并有機層，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，過柱(dcm:meoh＝100:5)，旋干，得到白色固體(14mg,67％)
1hnmr(400mhz,cdcl3):δ9.45(s,1h),7.52(,1h),7.01(t,1h),6.92(m,1h),5.00(s，2h),3.96(m,2h),3.75(m,1h),3.66(m,1h),3.32(s,3h)。
ms(esi):[m+h]+m/z＝466.0
實施例10手性異構體的拆分
使用安捷倫1260半制備液相色譜儀進行手性拆分：
實施例1的拆分：
手性柱：大賽璐chiralcelic4.6*250mm,填料粒徑5μm；流速1ml/min；檢測波長254nm；收集單一對映體；
條件1：將實施例1樣品1mg溶于1ml正己烷和異丙醇混合溶液中 (hexane:iproh＝8:2)，進樣量10μl，洗脫液hexane:etoh＝88:12(體積比)；兩個光學異構體出峰時間分別為14.251分鐘和16.905分鐘；
條件2：將將實施例1樣品1mg溶于1ml正己烷和異丙醇混合溶液中(hexane:iproh＝8:2)，進樣量10μl，洗脫液hexane:iproh＝75:25(體積比)；兩個光學異構體出峰時間分別為11.180分鐘和13.978分鐘。
實施例2的拆分：
手性柱：大賽璐chiralcelic4.6*250mm,填料粒徑5μm；流速1ml/min；檢測波長254nm；收集單一對映體；
條件1：將200微升實施例2的dmso溶液(10mmol/l)用異丙醇稀釋至1ml，進樣量10μl，洗脫液hexane:etoh＝88:12(體積比)；兩個光學異構體出峰時間分別為11.188分鐘和13.786分鐘；
條件2：將200微升實施例2的dmso溶液(10mmol/l)用異丙醇稀釋至1ml，進樣量10μl，洗脫液hexane:iproh＝80:20(體積比)；兩個光學異構體出峰時間分別為11.655分鐘和15.261分鐘。
實施例3的拆分：
手性柱：大賽璐chiralcelod-h4.6*250mm,填料粒徑5μm；流速1ml/min；檢測波長254nm；收集單一對映體；
條件：將實施例3樣品1mg溶于1ml正己烷和異丙醇混合溶液中(hexane:iproh＝8:2)，進樣量5μl，洗脫液hexane:etoh＝60:40(體積比)；兩個光學異構體出峰時間分別為9.842分鐘和16.879分鐘。
實施例11
活性測試
(1)ido蛋白的誘導表達及純化方法
首先pcr擴增ido基因，擴增的pcr產物回收，然后將pet28a質粒(購自上海寶曼生物科技有限公司)和ido膠回收產物用ecori和xhoi兩種限制性內切酶進行酶切(37℃，酶切2h)，跑膠，回收，t4連接酶鏈接過夜連接產物加入到dh5α感受態，冰上放置30min，42℃熱擊90s，搖菌涂板，挑取單克隆，pcr鑒定，測序鑒定，全部正確，即pet28a-ido質粒構建成功。
將構建好的含有pet28a-ido質粒的bl21，37℃大搖至od600為0.6-0.8，加入至終濃度為7μm的氯高鐵血紅素和1mm的iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，28℃誘導4h；誘導后，4℃，6000rpm離心收集菌體，收集的菌體用20mmpbs(ph6.5)清洗一次，再離心收集菌體。
將收集的菌體用裂解液(20mmpbsph6.5)重新懸起，超聲裂解(功率40％裂解 20min，冰上放置)，將裂解后的細菌，13000rpm離心15min，棄去沉淀，保留上清；將鎳柱用裂解液(20mmpbsph6.5)平衡3個柱體積，然后將裂解上清上樣到鎳柱上，上樣之后，用漂洗液(20mmpbsph6.5，20mm咪唑)清洗4個柱體積，最后用洗脫液(20mmpbsph6.5，250mm咪唑)洗脫蛋白；將洗脫的蛋白溶液進行透析4h，透析溶液為20mmpbsph6.5，透析之后蛋白樣品濃縮，分裝，液氮速凍，放入-80℃保存備用。
(2)ido酶抑制活性測試方法
首先將化合物進行3倍梯度稀釋，各個濃度取1μl加入到96孔板中；加入50μl配好的ido酶溶液(終濃度600ng/100μl)：加入25μl底物1混合溶液，加入25μl的底物2混合溶液起始反應。最后od321nm讀數60min。
(3)細胞活性測試方法
hela細胞(100μl)接種在96孔板上，接種量為每個孔5×103，生長過夜。第二天，化合物稀釋后，取1μl加入到96孔板中，然后將含有人的干擾素γ(終濃度50ng/ml)的培養基100μl加入到96孔板中，使最終體積為200μl。48小時孵化后，每個孔取140μl上清液轉移到一個新的96孔板上。10μl6.1n三氯乙酸加入每個孔混合，50℃孵化30分鐘，ido催化n甲酰犬尿素為犬尿素。反應混合物2500轉離心10分鐘去掉沉淀物。每個孔100μl上清液轉移到一個新的96孔板與100μl2％二甲氨基苯甲醛乙酸溶液混合。犬尿素分離后，用spectramaxi3reader在480nm測定數值。
各化合物的ido酶抑制活性和細胞抑制活性的測試結果如表1所示。
表1ido酶和細胞抑制活性測試結果
上述結果表明，本發明化合物(包括外消旋體和對映異構體)均具有優異的針對ido酶和細胞的抑制活性，特別是化合物2在ido細胞抑制活性中有出意料的高活性。