一種以肉豆蔻酸為原料發酵生產十四碳二元酸的假絲酵母及其應用的制作方法

本發明屬于發酵生產技術領域，具體涉及一種假絲酵母及利用其以肉豆蔻酸為原料發酵生產十四碳二元酸的方法。

背景技術：

長鏈二元酸(LCDA)，又名長鏈二羧酸和長鏈二酸，化學式為HOOC(CH2)_nCOOH，其中n≥7，是重要的精細化工中間體，可以合成香料、工程塑料、耐寒增塑劑、高級潤滑油和聚酰胺熱熔膠、粉末涂料等一系列高附加值的特殊化學品。

長鏈二元酸可以用化學法合成，也可以通過生物法生產。但是化學合成法存在設備、技術要求，能耗高，污染大等缺點，而且一些特殊的長鏈二元酸用化學合成法也很難生產；隨著生物技術的發展，利用特殊微生物發酵生產長鏈二元酸得到了迅猛發展，因其具有生產能力大、設備投資少、環境污染少，便于工業化，越來越受到全世界的關注！

目前生產長鏈二元酸的方法是以烷烴為前體物，利用微生物發酵轉化而來。其前體物多為來源于石油的化工產品，存在安全風險，隨著人們健康意識的提升，勢必被更安全的，來源于植物的前體物——肉豆蔻酸所取代。

肉豆蔻酸，又稱為十四烷酸，是一種飽和脂肪酸，主要存在于自然界大量的植物中，是一種優良的前體物。因此，本領域迫切需要開發能夠利用新的前體物生產長鏈二元酸的菌種和方法。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種以肉豆蔻酸為原料發酵生產十四碳二元酸的假絲酵母。

本發明的另一目的在于提供上述假絲酵母的應用，即一種用其發酵生產十四碳二元酸的的方法。

本發明的原理如下：

本發明的具體技術方案如下：

一種以肉豆蔻酸為原料發酵生產十四碳二元酸的假絲酵母，其為Candida sp.OMK-3，已于2015年5月27日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地點為中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC NO：M 2015328。該菌細胞橢圓形或長條形，能形成假菌絲。菌落呈奶 油色，表面光滑，濕潤，邊緣整齊。可利用葡萄糖、蔗糖、核糖和阿拉伯糖，不能利用木糖醇，山梨糖和阿拉伯糖等。該菌株的18s rRNA和26s rRNA序列與假絲酵母標準株的18s rRNA和26s rRNA序列有99％的相似性，該菌鑒定為假絲酵母屬。

一種發酵生產十四碳二元酸的的方法，包括如下步驟：

(1)菌種活化：將未活化的權利要求1所述的假絲酵母的菌液均勻涂布在固體斜面培養基上，于28～30℃培養24～48h，得活化后的菌種，該固體斜面培養基的質量百分比配方如下：磷酸二氫鉀0.1～1.0％，氯化鈉0.05～0.3％，酵母浸粉0.1～1.0％，蛋白胨0.1～1.0％，余量為水和適量的瓊脂糖；

(2)將上述活化后的菌種接種于液體種子培養基中，于28～35℃和轉速150～500rpm的條件下培養至對數生長期，得種子液，上述液體種子培養基的初始pH為5～8，且具體質量百分比配方如下：葡萄糖1.0～3.5％，磷酸二氫鉀0.1～1.0％，尿素0.1～0.6％，硫酸鎂0.05～0.5％，氯化鈉0.05～0.3％，酵母浸粉0.1～1.0％，硫酸銨0.1～0.6％，余量為水；

(3)將上述種子液以8～15％的體積比無菌條件下轉移至于發酵培養基中，于30～40℃和轉速200～500rpm的條件下發酵培養70～120h，得發酵液，上述發酵培養基的初始pH為6.9～7.1，且具體質量百分比配方如下：葡萄糖2.0～5.0％，磷酸二氫鉀0.1～0.5％，尿素0.1～0.5％，硫酸鎂0.05～0.5％，氯化鈉0.05～3％，酵母浸粉0.1～0.8％，硫酸銨0.1～0.5％，肉豆蔻酸6.0～10.0％，余量為水；

(4)將上述發酵液滅活菌體，然后經陶瓷膜過濾除菌體和超濾膜脫色，得到清液；

(5)將上述清液經稀酸酸化結晶以分離提純相應的十四碳二元酸。

在本發明的一個優選實施方案中，所述液體種子培養基的配方如下：葡萄糖20，磷酸二氫鉀5，尿素4，硫酸鎂0.2，氯化鈉2.5，酵母浸粉5，硫酸銨6，酵母浸粉5.0，上述各組分的單位為g/L，溶劑為水。

在本發明的一個優選實施方案中，所述發酵培養基的配方如下：葡萄糖40，磷酸二氫鉀5，尿素5，硫酸鎂0.6，酵母浸粉8，硫酸銨3，肉豆蔻酸70～92，上述各組分的單位為g/L，溶劑為水。

在本發明的一個優選實施方案中，所述步驟(3)為：將上述種子液以10％的體積比在無菌條件下轉移至發酵培養基中，于30～40℃、200～500rpm攪拌速度和通氣比1:0.2的條件下發酵培養70～120h，得發酵液。

在本發明的一個優選實施方案中，所述步驟(4)為：將上述發酵液升溫至80℃，保溫30min，以滅活菌體，再調節pH至8～10，60℃進行陶瓷膜過濾以去除菌體，50℃進行 超濾膜脫色，得到清液。

在本發明的一個優選實施方案中，所述步驟(5)為：將上述清液用濃度為5～20％的稀酸調節pH至3～5，室溫下靜置結晶3～4h，經離心和干燥得到相應的十四碳二元酸。

本發明的有益效果是：

1、本發明的假絲酵母能以肉豆蔻酸為前體物生產十四碳二元酸，肉豆蔻酸來源于自然界中的植物，以其為發酵原料，安全性較來源于石油的前體物優良，提高了長鏈二元酸及其衍生物使用在食品中的安全系數；

2、本發明的方法所得的發酵液通過陶瓷膜和超濾膜處理后，再用稀酸酸化結晶，即可得到較高純度的十四碳二元酸，其工藝過程簡單，且無有害廢料排出，為實現工業化生產奠定了良好基礎。

附圖說明

圖1為本發明的十四碳二元酸二乙酯標品的GC檢測圖譜。

圖2為本發明的肉豆蔻酸乙酯標品的GC檢測圖譜。

圖3為本發明的發酵液中十四碳二元酸二乙酯的GC檢測圖譜。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。

實施例1：十四碳二元酸的生產(三角瓶震蕩發酵)

(1)菌種活化：將未活化的低溫甘油管Candida sp.OMK-3菌株的菌液在無菌條件下均勻涂布在固體斜面培養基上，于28℃培養48h，得活化后的菌種，該固體斜面培養基的配方如下(w/w)：磷酸二氫鉀0.1～1.0％，氯化鈉0.05～0.3％，酵母浸粉0.1～1.0％，蛋白胨0.1～1.0％，適量的瓊脂糖；

(2)挑取活化后的菌種接種于50mL液體種子培養基中(裝于500mL三角瓶中，121℃滅菌30min)，于30℃和轉速180rpm的條件下培養24h至對數生長期，得種子液，上述液體種子培養基的初始pH為6.8，且具體配方如下(g/L)：葡萄糖20，磷酸二氫鉀5，尿素4，硫酸鎂0.2，氯化鈉2.5，酵母浸粉5，硫酸銨6，酵母浸粉5.0；

(3)將上述種子液以15％(v/v)的接種量轉移至42.5mL發酵培養基中(裝于500mL三角瓶中，121℃滅菌30min)，于30℃、轉速200rpm和通氣比1:0.2的條件下發酵培養 100h，得發酵液，用GC法測定該發酵液中天然十四碳二元酸的濃度為71.6g/L，上述發酵培養基的初始pH為7.0，且具體配方如下(g/L)：葡萄糖40，磷酸二氫鉀5，尿素5，硫酸鎂0.6，酵母浸粉8，硫酸銨3，肉豆蔻酸70；

(4)取50mL上述發酵液，水浴升溫至80℃，保溫30min，滅活菌體。然后，將滅活發酵液離心(5000rpm)除去菌體，上清液用濃度為5～20％的稀酸調節pH值至3～5，靜止5min，加50mL乙酸乙酯萃取，分層，有機相用旋轉蒸發儀把乙酸乙酯懸干得十四碳二元酸2.9g。

實施例2：十四碳二元酸的生產(攪拌反應器發酵)

(1)菌種活化：將未活化的低溫甘油管Candida sp.OMK-3菌株的菌液在無菌條件下均勻涂布在固體斜面培養基上，于28℃培養48h，得活化后的菌種，該固體斜面培養基的配方如下(w/w)：磷酸二氫鉀0.1～1.0％，氯化鈉0.05～0.3％，酵母浸粉0.1～1.0％，蛋白胨0.1～1.0％，適量的瓊脂糖；

(2)挑取活化后的菌種接種于7.5L液體種子培養基中(裝于10L種子罐中，121℃滅菌30min)，于30℃和轉速300rpm并通風的條件下培養24h至對數生長期，得種子液，上述液體種子培養基的初始pH為6.8，且具體配方如下(g/L)：葡萄糖20，磷酸二氫鉀5，尿素4，硫酸鎂0.2，氯化鈉2.5，酵母浸粉5，硫酸銨6，酵母浸粉5.0；

(3)將上述種子液以15％(v/v)的接種量轉移至19.5L發酵培養基中(裝于30L發酵罐中，121℃滅菌30min)，于30℃、轉速400rpm和通氣比1:0.2的條件下發酵培養110h，得發酵液，用GC法測定該發酵液中天然十四碳二元酸的濃度為101.5g/L，上述發酵培養基的初始pH為7.0，且具體配方如下(g/L)：葡萄糖40，磷酸二氫鉀5，尿素5，硫酸鎂0.6，酵母浸粉8，硫酸銨3，肉豆蔻酸92；

(4)將24L上述發酵液升溫至80℃以滅活菌體，調節pH至8～10，60℃進行陶瓷膜過濾，50℃進行超濾膜脫色，收集清液46L；

(5)將上述清液用濃度為5～20％的稀酸調pH值至3～5，酸化后的清液室溫靜置結晶4h，離心，干燥，最終得到十四碳二元酸2154.5g。

實施例3：對實施例1和實施例2中的十四碳二元酸進行檢測

本實施例檢測的對照為十四碳二元酸二乙酯標品和肉豆蔻酸乙酯標品。

發酵液檢測：

(1)取發酵液2ml于離心管1中，12000rpm離心，5min，轉移上清液至離心管2中；

(2)上清液用稀酸調pH值3～5，12000rpm離心，移走上清液；

(3)向離心管2中(含沉淀物)加入適量乙醇，震蕩，將沉淀物完全溶解，80℃酯化1h，進氣相檢測十四碳二元酸含量。

氣相色譜檢測條件為：RTX-1701(30m*0.25mm*0.25μm)，FID檢測器，進樣口溫度240℃，空氣400mL/min，氫氣40mL/min，尾吹30mL/min，檢測器溫度250℃；程序升溫：50℃(3min)→5℃/min→230℃(21min)，具體檢測結果如圖1至圖3所示。

本領域普通技術人員可知，本發明的技術方案在下述范圍內變化時，仍然能夠得到與上述實施例相同或相近的技術效果，仍然屬于本發明的保護范圍：

一種發酵生產十四碳二元酸的的方法，包括如下步驟：

(1)菌種活化：將未活化的權利要求1所述的假絲酵母的菌液均勻涂布在固體斜面培養基上，于28～30℃培養24～48h，得活化后的菌種，該固體斜面培養基的質量百分比配方如下：磷酸二氫鉀0.1～1.0％，氯化鈉0.05～0.3％，酵母浸粉0.1～1.0％，蛋白胨0.1～1.0％，余量為水和適量的瓊脂糖；

(2)將上述活化后的菌種接種于液體種子培養基中，于28～35℃和轉速150～500rpm的條件下培養至對數生長期，得種子液，上述液體種子培養基的初始pH為5～8，且具體質量百分比配方如下：葡萄糖1.0～3.5％，磷酸二氫鉀0.1～1.0％，尿素0.1～0.6％，硫酸鎂0.05～0.5％，氯化鈉0.05～0.3％，酵母浸粉0.1～1.0％，硫酸銨0.1～0.6％，余量為水；

(3)將上述種子液以8～15％的體積比在無菌條件下轉移至發酵培養基中，于30～40℃和轉速200～500rpm的條件下發酵培養70～120h，得發酵液，上述發酵培養基的初始pH為6.9～7.1，且具體質量百分比配方如下：葡萄糖2.0～5.0％，磷酸二氫鉀0.1～0.5％，尿素0.1～0.5％，硫酸鎂0.05～0.5％，氯化鈉0.05～3％，酵母浸粉0.1～0.8％，硫酸銨0.1～0.5％，肉豆蔻酸6.0～10.0％，余量為水；

(4)將上述發酵液滅活菌體，然后經陶瓷膜過濾除菌體和超濾膜脫色，得到清液；

(5)將上述清液經稀酸酸化、結晶、分離提純得到相應的十四碳二元酸。

以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的范圍，即依本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。