本發(fā)明涉及茶葉深加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表兒茶素沒(méi)食子酸酯單體的制備方法。
背景技術(shù)：
茶多酚是從茶葉中提取的30多種多羥基酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，約占茶葉干重的10％～35％，包括黃烷醇類(lèi)(兒茶素)、花色苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)和酚酸類(lèi)等，其中兒茶素為茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的70％～80％。茶葉中的兒茶素類(lèi)可以分為三種游離型態(tài)：兒茶素(Catechin,C)、表兒茶素(Epicatechin,EC)、表沒(méi)食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)；兩種酯化的沒(méi)食子酸：表兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epicatechingallate,ECG)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechingallate,EGCG)，其中以EGCG與ECG的含量較多。大量研究表明酯型兒茶素在抗氧化、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、防癌、防輻射等藥理藥效中發(fā)揮有重要的作用，因此對(duì)兒茶素中起主要作用的酯型兒茶素EGCG和ECG更為關(guān)注，其分離成為深入研究與應(yīng)用的需要。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，ECG在抗氧化、清除脂質(zhì)自由基、抑制人體病毒侵染方面作用顯著；具有極強(qiáng)的抑菌活性，可望開(kāi)發(fā)成為一種天然的類(lèi)抗生素物質(zhì)；也可明顯改善創(chuàng)傷傷口愈合和瘢痕形成效果；同時(shí)，ECG還對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。目前對(duì)于ECG單體的需求主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)茶葉深加工生產(chǎn)企業(yè)及相關(guān)的研究單位均需要大量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，檢測(cè)產(chǎn)品中每種兒茶素的含量；(2)新藥開(kāi)發(fā)與功能性食品研發(fā)需要從化學(xué)成分角度來(lái)證明其劑量和效果，需要大量的高純度兒茶素單體；(3)茶食品、茶飲料最新研究證明，非酯型兒茶素苦味輕而酯型兒茶素苦味較重，可通過(guò)單體的混配比例調(diào)節(jié)改良配方；(4)人體代謝研究表明，復(fù)雜兒茶素(一般為酯型)經(jīng)代謝成簡(jiǎn)單兒茶素(一般為非酯型)后更容易消化吸收，因此在開(kāi)發(fā)針對(duì)不同目的用途的產(chǎn)品時(shí)需要不同的兒茶素配伍。然而，由于茶葉的成分復(fù)雜，兒茶素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)比較相似，從茶葉中有效地制備高純度的兒茶素單體具有相當(dāng)難度。目前國(guó)內(nèi)外兒茶素分離純化大都針對(duì)EGCG一種化合物進(jìn)行，比較成功的應(yīng)用于ECG單體制備的工藝主要包括：硅膠柱層析、凝膠柱層析、高速逆流色譜、制備液相、吸附柱層析以及多種方法聯(lián)用等。制備液相和高速逆流色譜制備純度高，但是制備量小，不適宜規(guī)模放大；柱層析制備量大但是產(chǎn)品純度低，需要后續(xù)進(jìn)一步的純化，且C18鍵合硅膠、凝膠和大孔吸附樹(shù)脂的價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本較高；上述工藝均需用到大量有毒有害有機(jī)溶劑，容易造成溶劑殘留，且能耗高。兒茶素單體的制備工藝流程中，首先，在以溶劑充分提取茶葉中兒茶素類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)，茶葉中的農(nóng)殘也被同時(shí)提取；同時(shí)，后續(xù)的制備工藝實(shí)際也是茶葉中痕量農(nóng)殘被濃縮與富集的過(guò)程。而兒茶素制品中的農(nóng)殘限量執(zhí)行的是茶葉的標(biāo)準(zhǔn)，合格的茶葉原料提制出的兒茶素卻往往成為農(nóng)殘嚴(yán)重超標(biāo)的產(chǎn)品，導(dǎo)致其出口貿(mào)易嚴(yán)重受阻，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)應(yīng)用受到限制。此外，ECG易溶于水，一般多用作水性飲料或功能性食品的添加物，其中所殘留的農(nóng)藥隨之溶解在飲料或食品中，并被消費(fèi)者直接攝入，構(gòu)成人類(lèi)健康的安全隱患。因此，適應(yīng)國(guó)內(nèi)外對(duì)ECG單體的大量市場(chǎng)需求，以及對(duì)其農(nóng)藥殘留限量的特殊要求，探尋一種簡(jiǎn)單易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的ECG單體制備方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在ECG單體制備方面存在的缺陷和不足，提供一種表兒茶素沒(méi)食子酸酯單體的制備方法，該制備方法借助于自制的高分子聚合物作為柱層析的填料，通過(guò)柱層析、結(jié)晶等簡(jiǎn)單步驟，即可得到高純度的表兒茶素沒(méi)食子酸酯單體。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是：一種特異識(shí)別ECG的高分子聚合物的制備方法，將ECG與多羥基功能單體反應(yīng)形成復(fù)合物，向反應(yīng)體系中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，聚合后即得。ECG分子與功能單體之間首先以氫鍵作用自組裝形成復(fù)合物，再通過(guò)交聯(lián)聚合反應(yīng)形成高分子聚合物，最后將ECG分子從聚合物中洗脫后形成特異識(shí)別空穴。采用此種方法制備得到的高分子聚合物不僅具有與ECG分子官能團(tuán)的類(lèi)型、位置、大小相匹配的空穴，且具有與ECG分子官能團(tuán)相互作用的功能基團(tuán)，能夠增強(qiáng)該聚合物空穴對(duì)于ECG分子的特異識(shí)別能力。由于ECG分子結(jié)構(gòu)中的A、C、D環(huán)上均帶有多個(gè)酚羥基，功能單體的選擇以能形成多個(gè)氫鍵作用的多羥基化合物更為適用。本發(fā)明優(yōu)選所述多羥基功能單體選自甲基丙烯酸、丙烯酸、亞甲基丁二酸、對(duì)乙烯基苯甲酸中的一種或幾種，優(yōu)選為甲基丙烯酸。為了確保高分子聚合物的性能，所述制備方法為：按照1：(3-5)摩爾比將ECG和多羥基功能單體溶于惰性溶劑中，于0-10℃反應(yīng)0.5-4h后形成復(fù)合物，向反應(yīng)體系中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，于30-70℃振蕩反應(yīng)1-48h，即得。優(yōu)選地，按照1：(3-5)(優(yōu)選1：4)摩爾比將ECG和多羥基功能單體溶于甲苯或氯仿中，于0-10℃反應(yīng)1-2h后形成復(fù)合物，向反應(yīng)體系中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，于50-60℃振蕩反應(yīng)20-24h，即得。所述振蕩可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明優(yōu)選交聯(lián)聚合反應(yīng)在恒溫?fù)u床中進(jìn)行。其中，交聯(lián)劑用量為ECG摩爾量的20-30倍，引發(fā)劑用量為多羥基功能單體摩爾量的10％-20％。所述交聯(lián)劑可采用本領(lǐng)域常用的物質(zhì)，本發(fā)明所述交聯(lián)劑優(yōu)選自乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、二乙烯基苯(DVB)中的一種或幾種，進(jìn)一步優(yōu)選為EGDMA。所述引發(fā)劑也可采用本領(lǐng)域常用的物質(zhì)，本發(fā)明所述引發(fā)劑優(yōu)選自偶氮二異丁腈、異丙苯過(guò)氧化氫、叔丁基過(guò)氧化氫中的一種或幾種，進(jìn)一步優(yōu)選為偶氮二異丁腈(AIBN)。為了確保高分子聚合物具有良好的分離效果，本發(fā)明所述制備方法還包括對(duì)所述高分子聚合物進(jìn)行后處理的步驟，所述后處理為：用體積比(6-10)：1的甲醇和冰醋酸混合溶劑索氏提取所述高分子聚合物2-8次，每次提取2-24h，水洗和/或甲醇洗滌提取后的高分子聚合物直至洗液為中性，干燥即得。優(yōu)選地，用體積比為(8-10):1的甲醇和冰醋酸混合溶劑索氏提取所述高分子聚合物4-6次，每次提取6-12h，水洗和/或甲醇洗滌提取后的高分子聚合物直至洗液為中性，40-70℃干燥固體成粉末即得。交聯(lián)聚合反應(yīng)后的產(chǎn)物為固體或絮凝狀沉淀物，后處理之前先對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾產(chǎn)物若為塊狀，則先對(duì)其進(jìn)行研磨，然后再進(jìn)行索氏提取。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是：一種特異識(shí)別ECG的高分子聚合物，該聚合物是通過(guò)上述任意一種制備方法得到的。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是：特異識(shí)別ECG分子的高分子聚合物作為吸附劑在ECG單體制備中的應(yīng)用。采用上述制備方法得到的高分子聚合物對(duì)ECG分子具有特異識(shí)別能力，適宜用于從茶葉中提取ECG。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是：一種表兒茶素沒(méi)食子酸酯單體的制備方法，包括如下步驟：(1)以特異識(shí)別ECG的高分子聚合物為填料裝填層析柱，備用；(2)茶葉經(jīng)沸水浸提、濃縮后，將濃縮液過(guò)所述層析柱，廢棄流出液；(3)以水洗滌層析柱后廢棄洗脫液，再以乙腈和冰醋酸混合溶劑洗脫層析柱，收集洗脫液，濃縮后復(fù)溶，加入ECG晶種結(jié)晶即得所述表兒茶素沒(méi)食子酸酯單體。優(yōu)選地，步驟(1)中，按照填料與茶葉的質(zhì)量比為1：(10-40)裝填層析柱，所述質(zhì)量比優(yōu)選為1:25。優(yōu)選地，步驟(2)中，按照1g茶葉加入10-30mL水的比例對(duì)茶葉進(jìn)行浸提。具體為：先用40％-60％的水煮沸提取5-15min，然后向茶渣中加入剩余部分水繼續(xù)煮沸提取5-15min，合并提取液，并于50-70℃濃縮，直至濃縮液的體積為加入水體積的1/20-1/30。優(yōu)選地，步驟(3)中，洗滌用的水與茶葉的體積質(zhì)量比為(1-4):1(mL：g)。優(yōu)選地，乙腈和冰醋酸的體積比為(90-100)：(3-8)，優(yōu)選為95:5。優(yōu)選地，混合溶劑與茶葉的體積質(zhì)量比為：(2-6)：1(mL：g)。優(yōu)選地，晶種加入量為茶葉重量的0.004％-0.02％。優(yōu)選地，結(jié)晶在0-4℃下進(jìn)行20-30h。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)施例。本發(fā)明涉及到的原料和試劑均可市購(gòu)獲得。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)是：1、自制的高分子聚合物填料對(duì)ECG具有特異識(shí)別能力，且可循環(huán)使用，以其為吸附劑從干茶或鮮茶中分離提取ECG穩(wěn)定性好，ECG單體提取率高，產(chǎn)品純度高；2、簡(jiǎn)化了現(xiàn)有的ECG單體提取工藝，制備周期短，制備量大，成本低；3、制備過(guò)程中使用水和甲醇，大大減少了有毒有害有機(jī)溶劑的使用，符合環(huán)保、安全的要求，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)價(jià)值。4、采用本發(fā)明方法分離得到的ECG單體農(nóng)藥殘留量大大降低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和歐盟標(biāo)準(zhǔn)的最大殘留限量。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1特異識(shí)別ECG的高分子聚合物的制備將8.80g的ECG和6.90g的甲基丙烯酸單體反應(yīng)物加入300mL氯仿中，于冰箱冷藏室4℃下反應(yīng)2小時(shí)后，加入100gEGDMA和2.40g偶氮二異丁腈，超聲10分鐘使EGDMA和偶氮二異丁腈完全溶解，得混合溶液；60℃下振蕩反應(yīng)48小時(shí)，過(guò)濾得到的聚合物，廢棄溶液，研磨聚合物沉淀，用500mL體積比為9:1的甲醇與冰醋酸的混合溶劑對(duì)聚合物進(jìn)行索氏提取，重復(fù)提取6次，每次12小時(shí)；提取結(jié)束后，再依次用200mL的去離子水、甲醇超聲20分鐘洗滌聚合物，重復(fù)5次直至溶液為中性，最后60℃真空干燥，即得。實(shí)施例2特異識(shí)別ECG的高分子聚合物的制備將8.80g的ECG和10.6g亞甲基丁二酸加入300mL甲苯中，于冰箱冷藏室4℃下反應(yīng)4小時(shí)后，加入80gEGDMA和2.60g偶氮二異丁腈，超聲10分鐘使EGDMA和偶氮二異丁腈完全溶解，得混合溶液；70℃下振蕩反應(yīng)20小時(shí)，過(guò)濾得到的聚合物，廢棄溶液，研磨聚合物沉淀，用500mL體積比為8:1的甲醇與冰醋酸的混合溶劑對(duì)聚合物進(jìn)行索氏提取，重復(fù)提取8次，每次8小時(shí)；提取結(jié)束后，再依次用200mL的去離子水、甲醇超聲20分鐘洗滌聚合物，重復(fù)5次直至溶液為中性，最后60℃真空干燥，即得。實(shí)施例3特異識(shí)別ECG的高分子聚合物的制備將8.80g的ECG和11.8g對(duì)乙烯基苯甲酸加入300mL氯仿中，于冰箱冷藏室6℃下反應(yīng)4小時(shí)后，加入100gEGDMA和2.60g偶氮二異丁腈，超聲10分鐘使MBAA和偶氮二異丁腈完全溶解，得混合溶液；70℃下振蕩反應(yīng)20小時(shí)，過(guò)濾得到的聚合物，廢棄溶液，研磨聚合物沉淀，用500mL體積比為10:1的甲醇與冰醋酸的混合溶劑對(duì)聚合物進(jìn)行索氏提取，重復(fù)提取6次，每次12小時(shí)；提取結(jié)束后，再依次用200mL的去離子水、甲醇超聲20分鐘洗滌聚合物，重復(fù)5次直至溶液為中性，最后60℃真空干燥，即得。實(shí)施例4特異識(shí)別ECG的高分子聚合物的制備該實(shí)施例的制備方法同實(shí)施例1，其區(qū)別僅在于：?jiǎn)误w反應(yīng)物為7.2g丙烯酸。實(shí)施例5ECG單體的制備方法稱(chēng)取2.0g實(shí)施例1制備得到的高分子材料，填入內(nèi)徑1cm的玻璃柱，以50mL蒸餾水洗滌后，保持液面高于柱填料，待用。準(zhǔn)確稱(chēng)取50g綠碎茶，加入500mL沸水煮10min，傾倒上層溶液于1000mL容量瓶中，將茶渣再以400mL沸水煮10min，過(guò)濾，濾液合并于同一個(gè)1000mL的容量瓶，定容，取樣檢測(cè)，綠碎茶中的ECG含量為2.492％，將剩余的溶液于60℃下減壓濃縮至50mL，過(guò)濾。濾液過(guò)上述玻璃柱，以100mL水洗滌后，廢棄流出液，再以200mL體積比為95:5的乙腈和冰醋酸混合溶劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于65℃下減壓濃縮至膏狀，加入適量水至剛好溶解為過(guò)飽和溶液，加入2mg純度為99.6％的ECG單體作為晶種，放入冰箱冷藏室4℃下靜置24小時(shí)，過(guò)濾，50mL純水洗滌，60℃下真空干燥，即得ECG單體1.078g，經(jīng)HPLC法測(cè)定，其純度為98.01％，提取率為86.52％。實(shí)施例6ECG單體的制備方法該實(shí)施例的制備方法同實(shí)施例5，其區(qū)別僅在于：柱層析填充物為實(shí)施例2制備得到的特異識(shí)別ECG的高分子聚合物，最終得0.9975gECG單體，純度92.30％，提取率80.06％。實(shí)施例7ECG單體的制備方法該實(shí)施例的制備方法同實(shí)施例5，其區(qū)別僅在于：柱層析填充物為實(shí)施例3制備得到的特異識(shí)別ECG的高分子聚合物，最終得0.9765gECG單體，純度90.77％，提取率78.37％。實(shí)施例8ECG單體的制備方法該實(shí)施例的制備方法同實(shí)施例5，其區(qū)別僅在于：柱層析填充物為實(shí)施例4制備得到的特異識(shí)別ECG的高分子聚合物，最終得1.050gECG單體，純度95.46％，提取率84.27％。效果實(shí)驗(yàn)例一農(nóng)藥殘留量檢測(cè)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23204-2008的樣品前處理方法，利用GC-ECD法分別測(cè)定實(shí)施例5中的碎綠茶和實(shí)施例5-8分離得到的ECG單體中的農(nóng)殘，測(cè)試的農(nóng)藥種類(lèi)有：三氯殺螨醇(Dicofol)，硫丹(Endosulfan)，聯(lián)苯菊酯(Bifenthrin)，氯氟氰菊酯(Lambda-cyhalothrin)氰戊菊酯(Fenvalerate)，溴氰菊酯(Deltamethrin)，其中，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和歐盟標(biāo)準(zhǔn)對(duì)上述六種農(nóng)藥最大殘留限量如表1所示，本發(fā)明測(cè)定的農(nóng)殘結(jié)果列于表2：表1國(guó)標(biāo)和歐盟標(biāo)準(zhǔn)對(duì)六種農(nóng)藥最大殘留限量的要求表2綠碎茶樣品與制備的ECG單體中的農(nóng)藥殘留量效果實(shí)驗(yàn)例二特異識(shí)別ECG的高分子聚合物循環(huán)使用重復(fù)實(shí)施例5的操作多次，對(duì)綠碎茶中ECG單體進(jìn)行分離提純，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示：表3填料重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)效果重復(fù)次數(shù)單體重量(g)純度(％)提取率(％)11.07898.0186.5221.04697.6083.9531.01096.8881.0640.98396.1778.8950.97495.4578.17從表3可以看出，隨著使用次數(shù)的增加，制備能力有所下降，獲得的ECG單體量略有減少，原因大概在于在重復(fù)識(shí)別的過(guò)程中，高分子聚合物空穴所作用的ECG分子不能夠完全洗脫，識(shí)別作用位點(diǎn)有所減少；但所制備的ECG單體純度依然很高，五次重復(fù)制備的ECG單體純度均在95.45％以上，充分說(shuō)明該高分子聚合物材料對(duì)ECG分子的特異識(shí)別能力強(qiáng)，性能穩(wěn)定。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。