本發明屬于生物技術和植物學領域，更具體地，本發明涉及一種提高大豆的轉基因頻率的方法。
背景技術：
大豆(glycinemax(l.)merrill)起源于中國，是我國重要糧食作物之一，已有五千年栽培歷史，現知有1000個栽培品種。大豆含脂肪約20％，蛋白質約40％，還含有豐富的維生素，富含營養，除供直接食用外，可作醬、醬油和各種豆制食品；莖、葉、豆粕及粗豆粉作肥料和優良的牲畜飼料。豆粕經加工制成的組織蛋白、濃縮蛋白、分離蛋白和纖維蛋白等是多種產品，如人造肉、干酪素、味精及造紙、塑膠工業、人造纖維、火藥等的原料。豆油除主要供食用外，并為潤滑劑、油漆、肥皂、瓷釉、人造橡膠、防腐劑等重要原料。此外藥用有滋補養心、祛風明目、清熱利水、活血解毒等功效(韋直，1995。中國植物志，北京：科學出版社，234-236)，因此大豆具有重要的研究價值。
1952年，中國大豆總產量為952×104t，人均占有量約25kg，2003年大豆總產量超過1.539×107t，但因人口增加，人均占有量下降到11.8kg。隨著國民經濟的發展和人民生活水平的提高，加工業、食品業和畜牧業的發展，對大豆的需求急劇增加，大豆供求矛盾日益突出。目前擴大大豆種植的潛力是有限的，而提高單產還有很大的空間和潛力(趙團結，蓋鈞鎰，李海旺，邢邯，邱家馴，2006。超高產大豆育種研究的進展與討論，中國農業科學，39(1)：29-37)。
目前大多數基因型的大豆都來源于同一祖先，因此常規育種方法對擴大大豆產量的幫助是很有限的，需要通過先進的離體培養技術和基因技術可以為優化大豆種質資源，提高抗病蟲害能力提供關鍵性的技術幫助。
目前，盡管大豆的胚尖和子葉節兩個受體系統的再生頻率很高，但大豆的轉基因頻率偏低，一般低于2％。主要原因是：(1)不定芽伸長困難；(2)轉基因大豆抗性芽經過長時間篩選壓后長勢弱化，離體生根能力下降，不定根的長勢相對弱化。因此，本領域需要找到合適的手段來進一步提高大豆的轉基因頻率。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種提高大豆的轉基因頻率的方法。
在本發明的第一方面，提供一種培育轉基因大豆的方法，所述方法包括：
(a)將大豆種子滅菌處理，浸泡使大豆種子吸漲，獲得大豆種子的胚尖，進行預培養；
(b)將步驟(a)的胚尖在經活化的農桿菌中浸染；所述的農桿菌攜帶重組質粒，所述的重組質粒包含有外源基因；
(c)將步驟(b)浸染后的胚尖培養3-6天(較佳地4-5天)后，篩選培養攜帶外源基因的胚尖；篩選培養，獲得帶有不定芽的胚尖，該不定芽攜帶外源基因；抹除部分芽，保留2-3個健壯的不定芽；
(d)步驟(c)的帶有不定芽的胚尖培養(較佳地，在ms基礎培養基上培養)12-18天(較佳地14-16天，如15天)后，在赤霉素和多效唑溶液中浸泡，再轉接到含6-芐氨基腺嘌呤和赤霉素的ms基本培養基中培養，從而不定芽生長，出現主莖；
(e)將步驟(d)的小植株進行生根培養，使不定芽隨同胚軸生根；和
(f)將步驟(e)的小植株的一個胚軸上的多個大豆轉基因株系移栽到土壤，繼續培養，獲得轉基因大豆植株。
在本發明的一個優選例中，步驟(a)中，所述的滅菌處理包括：分別以酒精、升汞、次氯酸鈉進行滅菌。
在本發明的另一優選例中，所述的酒精為70％(v/v)濃度的酒精；所述的升汞是0.1％(v/v)升汞；或所述的次氯酸鈉是10％(w/v)次氯酸鈉。
在本發明的另一優選例中，酒精滅菌與升汞滅菌之間，還包括以無菌水沖洗，較佳地沖洗5-8次；升汞滅菌與次氯酸鈉滅菌之間，還包括以無菌水沖洗，較佳地沖洗5-8次。
在本發明的另一優選例中，所述的預培養的時間為3-5天。
在本發明的另一優選例中，步驟(a)中，浸泡使大豆種子吸漲時，以無菌水浸泡，浸泡溫度4±2℃。
在本發明的另一優選例中，步驟(a)中，預培養時，在包含2-5mg.l-16-芐氨基腺嘌呤(較佳地3-4mg.l-16-芐氨基腺嘌呤)的ms基本培養基中培養，培養條件16±2小時/天光照，25±2℃。
在本發明的另一優選例中，步驟(b)中，將農桿菌懸于包含2-5mg.l-16-芐氨基腺嘌呤(較佳地3-4mg.l-16-芐氨基腺嘌呤)和100-300um(較佳地150-250um)乙酰丁香酮的ms基本培養基中，將胚尖在其中浸染。
在本發明的另一優選例中，浸染條件為28±2℃搖床，250±50rpm。
在本發明的另一優選例中，浸染時間為30±10分鐘，更佳地30±5分鐘。
在本發明的另一優選例中，步驟(c)中，所述的浸染后的胚尖培養3-6天包括：在含有2-5mg.l-16-芐氨基腺嘌呤(較佳地3-4mg.l-16-芐氨基腺嘌呤)和100-300um(較佳地150-250um)乙酰丁香酮的ms基本培養基中暗培養，培養溫度25±2℃。
在本發明的另一優選例中，步驟(c)中，所述的篩選培養包括：將胚尖在含有0.3±0.1mg.l-1赤霉素，200±50mg.l-1替卡西林以及與重組質粒所攜帶的抗性基因相應的抗生素的ms基本培養基中培養，培養條件16±2小時/天光照，25±2℃。
在本發明的另一優選例中，篩選培養7-10天。
在本發明的另一優選例中，所述的重組質粒含有卡那霉素抗性基因，且所述的與重組質粒所攜帶的抗性基因相應的抗生素是卡那霉素；較佳地培養基中含有100±30mg.l-1卡那霉素。
在本發明的另一優選例中，步驟(d)中，在5-10mg/l赤霉素和1-3mg/l多效唑溶液中浸泡。
在本發明的另一優選例中，在赤霉素和多效唑中的浸泡時間為10-60分鐘；較佳地20-40分鐘。
在本發明的另一優選例中，步驟(d)中，在含0.3±0.1mg.l-16-芐氨基腺嘌呤，0.3±0.1mg.l-1赤霉素的ms基本培養基中培養。
在本發明的另一優選例中，步驟(e)中，將小植株進行生根培養包括：將小植株分別在1/8ms基本培養基、1/4ms基本培養基、1/2ms基本培養基中抗性篩選，具有抗性的芽隨同胚軸生根。
在本發明的另一優選例中，所述的1/8ms基本培養基包含100±20mg.l-1替卡西林，50±10mg.l-1卡那霉素；較佳地，篩選壓減半；較佳地，在該培養基中培養6-10天；較佳地7-9天；或
所述的1/4ms基本培養基包含1±0.2mg.l-1iba，100±20mg.l-1替卡西林，50±10mg.l-1卡那霉素；較佳地，篩選壓減半；或
所述的1/2ms基本培養基包含1±0.2mg.l-1iba，100±20mg.l-1替卡西林，50±10mg.l-1卡那霉素；較佳地，在該培養基中培養10±2天。
在本發明的另一優選例中，步驟(e)中，培養條件：16±2小時/天光照，25±2℃。
在本發明的另一優選例中，步驟(f)中，所述的土壤是泥炭、珍珠巖和蛭石按照重量比6∶3∶1的土壤。
在本發明的另一優選例中，在步驟(f)之后，還包括：收獲轉基因大豆植株的種子，得到t0代；較佳地，還進行進一步的傳代培養。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
附圖說明
圖1、大豆高頻轉基因植株獲得的關鍵步驟。
a：大豆胚尖長出的抗性芽，bar＝1cm。
b：大豆伸長復壯后的抗性芽，bar＝1cm。
c：大豆生根的轉基因植株，bar＝2cm。
d：大豆結莢的轉基因植株，兩個抗性芽形成兩個株系：line1和line2，bar＝5cm。
具體實施方式
為了進一步提高大豆轉基因頻率，本發明人使用根癌農桿菌轉化方法，結合不定芽伸長復壯劑的使用，獲得大量大豆抗性芽，并改進傳統的大豆轉基因抗性芽的離體生根方法，提出了一種全新的高效離體生根方法——帶胚軸生根法，獲得了大量的大豆轉基因植株苗并開花結莢。從而，形成了大幅提高大豆遺傳轉化頻率的技術體系。
胚尖的培育
胚尖的培育包括：將大豆種子滅菌處理，浸泡使大豆種子吸漲，獲得大豆種子的胚尖，預培養3-5天。
作為本發明的優選方式，所述的滅菌處理包括：分別以酒精、升汞、次氯酸鈉進行滅菌。較佳地，所述的酒精為70％(v/v)濃度的酒精；所述的升汞是0.1％(v/v)升汞；所述的次氯酸鈉是10％(w/v)次氯酸鈉。較佳地，酒精滅菌與升汞滅菌之間，還包括以無菌水沖洗，較佳地沖洗5-8次；升汞滅菌與次氯酸鈉滅菌之間，還包括以無菌水沖洗，較佳地沖洗5-8次。
大豆轉基因的受體材料通常采用成熟胚。目前為止本領域一般使用的均是氯氣消毒法。該法在環境友好性，然而安全性等方面均有待改善和提高。本發明中采用簡單易行的復合消毒方法來制備大豆無菌的受體材料，不需要采用化學反應方法發生氯氣；消毒效果良好，無菌率達100％；所制備的成熟胚受體材料活力很強，無菌萌發率達100％。
浸泡在水中的步驟可以使大豆種子充分吸漲，獲得胚尖。浸泡所用的水一般以無菌水為宜。較佳地，浸泡溫度4±2℃。
作為本發明的優選方式，在預培養時，在包含2-5mg.l-16-芐氨基腺嘌呤(6-ba)、較佳地3-4mg.l-16-ba的ms基本培養基中培養，培養條件16±2小時/天光照，25±2℃。
外源基因的轉化
外源基因的轉化是制備轉基因的必需步驟。可采用本領域常用于大豆轉基因的多種轉化方法來進行外源基因的轉化，較佳地如采用根癌農桿菌轉化法，包括：將前述方法獲得的胚尖在經活化的農桿菌中浸染；所述的農桿菌攜帶重組質粒，所述的重組質粒包含有外源基因。本發明的方法對于外源基因沒有特別的限制，可以是本領域希望進行大豆轉化以觀測轉基因效果的任何外源基因。
為了實現外源基因的轉化，可將外源基因插入到重組表達載體中。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含外源基因的核苷酸序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。所述的核苷酸序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mrna合成。表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀。包含上述的適當外源基因序列的載體，可以用于轉化農桿菌，以進行轉基因植物的制備。
作為本發明的優選方式，將包含有外源基因的農桿菌懸于包含2-5mg.l-16-ba、較佳地3-4mg.l-16-ba和100-300um、較佳地150-250um乙酰丁香酮的ms基本培養基中，將胚尖在其中浸染。更佳地，浸染條件為28±2℃搖床，250±50rpm；浸染時間為30±10分鐘，更佳地30±5分鐘。
在浸染之后，將胚尖培養3-6天，作為本發明的優選方式，該步驟培養包括：在含有2-5mg.l-16-ba、較佳地3-4mg.l-16-ba和100-300um、較佳地150-250um乙酰丁香酮的ms基本培養基中暗培養，培養溫度25±2℃。
將胚尖經上述培養3-6天后，篩選培養攜帶外源基因的胚尖。作為本發明的優選方式，所述的篩選培養包括：將胚尖在含有0.3±0.1mg.l-1赤霉素(ga3)，200±50mg.l-1替卡西林(較佳地還包括100±30mg.l-1卡那霉素)的ms基本培養基中培養，培養條件16±2小時/天光照，25±2℃。
篩選培養的時間可以根據本領域技術人員的經驗而定。較佳地，可以篩選培養7-10天；當然可以根據篩選情況選擇其它的時間。
經過篩選培養，可以選擇出已經轉入了外源基因的胚尖，從而應用于后續的步驟。
不定芽的誘導和伸長
篩選培養后，獲得了帶有抗性芽的胚尖。由于前述的方法優化，胚尖上可以獲得較多的不定芽。為了充分保證不定芽的質量，從胚尖上抹除部分小芽，保留2-3個健壯的抗性芽。
大豆遺傳轉化中，起始受體材料的平均不定芽數是較為關鍵的指標，直接關系到遺傳轉化頻率的高低。現有技術中常用的大豆胚尖遺傳轉化系統最早出自本發明人的實驗室，然而這個系統尚存在一些問題，主要表現在胚尖平均不定芽數偏少(1-3個/胚尖)，頂芽導致的假陽性率相對偏高。而采用本發明優化的方法先誘導大量的不定芽，再抹除大部分不定芽，既降低了假陽性率，又保證了抗性不定芽的質量。
抗性芽(即該芽攜帶了外源基因)的伸長包括：將帶有抗性芽的胚尖在培養12-18天、較佳地14-16天后，在ga3和多效唑溶液(較佳地，含有5-10mg/lga3和1-3mg/l多效唑)中浸泡。更佳地，在ga3和多效唑中的浸泡時間為10-60分鐘，較佳地20-40分鐘)。
經過上述浸泡的帶有抗性芽的胚尖再轉接到含有6-ba和ga3(較佳地，含有0.3±0.1mg.l-16-ba，0.3±0.1mg.l-1ga3)的ms基本培養基中培養，從而不定芽生長，出現主莖。
大豆轉基因抗性芽伸長困難為業界普遍公認的難題。本發明采用ga3和多效唑協同處理的方法，既解決了不定芽伸長的難題，又控制住了不定芽的徒長問題。
帶胚軸混合生根和移栽
經過前述培養步驟，帶有抗性芽的胚尖已經生長出主莖，之后，將小植株分別在1/8ms基本培養基、1/4ms基本培養基、1/2ms基本培養基中抗性篩選，抗性芽隨同胚軸生根。較佳地，該過程中的培養條件為：16±2小時/天光照，25±2℃。
作為本發明的優選方式，所述的1/8ms基本培養基包含100±20mg.l-1替卡西林，50±10mg.l-1卡那霉素；較佳地，篩選壓減半；較佳地，在該培養基中培養6-10天。
作為本發明的優選方式，所述的1/4ms基本培養基包含1±0.2mg.l-1iba，100±20mg.l-1替卡西林，50±10mg.l-1卡那霉素；較佳地，篩選壓減半。
作為本發明的優選方式，所述的1/2ms基本培養基包含1±0.2mg.l-1iba，100±20mg.l-1替卡西林，50±10mg.l-1卡那霉素；較佳地，在該培養基中培養10±2天。
應用本發明所述的抗性芽生根方法，可以使得每個抗性芽得以順利成苗，進一步提高大豆轉基因頻率。
生根后，將小植株的一個胚軸上的多個大豆轉基因株系移栽到土壤，繼續培養，獲得轉基因大豆植株。對于所應用的土壤沒有特別的限制，可以是本領域技術人員了解的適用于大豆發育生長的土壤，優選地，所述的土壤可以是泥炭、珍珠巖和蛭石按照重量比6∶3∶1的土壤。
轉基因植株的傳代培養
上述步驟可獲得轉基因大豆植株的種子，即得到t0代；較佳地，還進行進一步的傳代培養，獲得后代植株。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
基本培養基(murashigeandskoog，簡稱ms培養基)的制備
ms基本培養基內含0.5％(w/v)b5有機溶液，3％(w/v)的蔗糖，0.1mg.l-1肌醇，0.7％(w/v)瓊脂，調節ph至5.8，121℃滅菌15-25分鐘。
重組質粒pcambia2301
在pcambia2301的多克隆位點中插入了gus基因，并且包含卡那霉素抗性基因以用于抗性篩選，獲得重組質粒pcambia2301(liuh-k,yangc,weiz-m*.efficientagrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofsoybeansusinganembryonictipregenerationsystem.planta,2004,219:1042-1049)。
農桿菌
將重組質粒pcambia2301轉化農桿菌，獲得帶有該重組質粒的農桿菌。
實施例1、大豆轉基因1
1、轉基因植株的制備
(1)選取粒大、飽滿的成熟大豆種子備用，將所得的種子用70％(v/v)酒精做表面消毒，然后將種子倒入無菌三角瓶中用0.1％(v/v)升汞搖洗7分鐘，無菌水沖洗6次，再用10％次氯酸鈉(naclo)搖洗5分鐘，無菌水沖洗6次后用無菌水浸泡于4℃冰箱。
(2)待到步驟(1)中種子充分吸脹后，在無菌條件下將種子從三角瓶中取出，剝出胚尖，放入ms基本培養基(內含3mg.l-16-ba)中預培養4天。培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(3)制備工程菌(gmsot)：從yep培養平板(含卡那霉素(kanamycin))上挑取含有重組質粒pcambia2301的農桿菌單菌落接種于含有50mg.l-1利福平和50mg.l-1卡那霉素的50mlyep液體培養基中28℃搖床，250rpm震蕩過夜，然后進行第二次活化，4500rpm，4℃離心10分鐘，收集菌體，重懸于液體ms基本培養基(內含3mg.l-16-ba，200um乙酰丁香酮(as))備用。
(4)取出步驟(2)中預培養后的大豆胚尖在步驟(3)中制備完成的根癌農桿菌工程菌(gmsot)中浸染30分鐘；浸染條件：28℃搖床，250rpm。
(5)無菌條件下將步驟(4)所得浸染后的胚尖取出，置于無菌濾紙上吸干菌液，然后放置于鋪有濾紙的ms(含3mg.l-16-ba，200umas)基本培養基中(胚尖置于濾紙上)共培養4天；培養條件：暗中，25±1℃。
(6)將步驟(5)所得胚尖用400mg.l-1替卡西林(ticarcilin)無菌溶液抑菌，用無菌濾紙吸干水分后置于ms基本培養基(含0.3mg.l-1ga3，200mg.l-1替卡西林，100mg.l-1卡那霉素)中篩選培養；培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(7)8天后，抹除部分小芽，獲得攜帶了外源基因的抗性胚尖，其帶有2-3個生長健壯的抗性芽(圖1a)。
(8)15天以后，將步驟(7)所得的抗性芽用不定芽伸長復壯劑(5mg.l-1ga3，3mg.l-1多效唑(met：multi-effecttriazole))浸泡30min，再轉接到ms基本培養基(內含0.3mg.l-16-ba，0.3mg.l-1ga3)中培養，促進不定芽長長、長粗，并出現明顯主莖(胚軸)(圖1b)。
(9)將步驟(8)中的小植株先置于1/8ms基本培養基(100mg.l-1替卡西林，50mg.l-1卡那霉素)中，篩選壓減半(預處理8天，最長不超過10天，否則植株葉片容易褪綠變黃)；培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(10)將步驟(9)中預處理后的小植株置于1/4ms(含1mg.l-1iba，100mg.l-1替卡西林，50mg.l-1卡那霉素)培養基中生根培養5天，篩選壓減半，胚軸下端出現發根跡象；培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(11)將步驟(10)中的小植株轉接到1/2ms基本培養基(含1mg.l-1iba，100mg.l-1替卡西林，50mg.l-1卡那霉素)中培養10天左右，所有的抗性芽隨同胚軸生根，平均每個胚軸10-15cm長的根系(圖1c)；培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(12)將步驟(11)中已生根的在一個胚軸上的多個大豆轉基因株系移栽到土壤(擬南芥種植基質(泥炭6份：珍珠巖3份：蛭石1份)事先121℃滅菌60分鐘)；在人工氣候室中，約20天后多個轉基因植株苗開花結莢(圖1d)。
2、轉基因植株的檢測
將步驟(12)中的來源于同一胚軸的不同轉基因株系分別標注為line1、line2等(圖1d)，取不同株系的幼嫩葉片做gus染色，再取gus染色陽性的株系進行pcr檢測。gus、pcr陽性植株進一步進行southernblot檢測。
保留上述三種檢測結果為陽性的轉基因植株
3、轉基因植株的傳代
收獲轉基因植株，保存轉基因大豆種子(t0代種子)。
播種t0代種子，苗期(t1代)進行gus和pcr檢測，收獲其中陽性株系，并收獲t1代種子；播種t1代種子，苗期(t2代)進行gus和pcr檢測，保留其中陽性株系，收獲t2代轉基因株系中的純系，并保種。
4、轉基因頻率的計算
將獲得的轉基因植株數除以起始外植體數，計算轉基因頻率。
經統計，采用上述方法，轉基因頻率可以達到65％；而現有技術中目前的轉基因頻率約為1-2％。
實施例2、大豆轉基因2
(1)選取粒大、飽滿的成熟大豆種子備用，將所得的種子用70％酒精做表面消毒，然后將種子倒入無菌三角瓶中用0.1％升汞搖洗8分鐘，無菌水沖洗8次，再用10％次氯酸鈉(naclo)搖洗6分鐘，無菌水沖洗7次后用無菌水浸泡于4℃冰箱。
(2)待到步驟(1)中種子充分吸脹后，在無菌條件下將種子從三角瓶中取出，剝出胚尖，放入ms基本培養基(內含3mg.l-16-ba)中預培養5天。培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(3)制備工程菌(gmsot)：從yep培養平板(含卡那霉素(kanamycin))上挑取含有重組質粒pcambia2301的農桿菌單菌落接種于含有50mg.l-1利福平和50mg.l-1卡那霉素的50mlyep液體培養基中28℃搖床，250rpm震蕩過夜，然后進行第二次活化，4500rpm，4℃離心10分鐘，收集菌體，重懸于液體ms基本培養基(內含3mg.l-16-ba，200um乙酰丁香酮(as))備用。
(4)取出步驟(2)中預培養后的大豆胚尖在步驟(3)中制備完成的根癌農桿菌工程菌(gmsot)中浸染30分鐘；浸染條件：28℃搖床，250rpm。
(5)無菌條件下將步驟(4)所得浸染后的胚尖取出，置于無菌濾紙上吸干菌液，然后放置于鋪有濾紙的ms(含3mg.l-16-ba，200umas)基本培養基中(胚尖置于濾紙上)共培養5天；培養條件：暗中，25±1℃。
(6)將步驟(5)所得胚尖用400mg.l-1替卡西林(ticarcilin)無菌溶液抑菌，用無菌濾紙吸干水分后置于ms(含0.3mg.l-1ga3，200mg.l-1替卡西林，100mg.l-1卡那霉素)基本培養基中篩選培養；培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(7)9天后，抹除部分小芽，獲得攜帶了外源基因的抗性胚尖，其帶有2-3個生長健壯的抗性芽(圖1a)。
(8)15天以后，將步驟(7)所得的抗性芽用不定芽伸長復壯劑(10mg.l-1ga3，2mg.l-1多效唑)浸泡60min，再轉接到ms基本培養基(內含0.3mg.l-16-ba，0.3mg.l-1ga3)中培養，促進不定芽長長、長粗，并出現明顯主莖(胚軸)(圖1b)。
(9)將步驟(8)中的小植株先置于1/8ms基本培養基(100mg.l-1替卡西林，50mg.l-1卡那霉素)中，篩選壓減半(預處理9天，最長不超過10天，否則植株葉片容易褪綠變黃)；培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(10)將步驟(9)中預處理后的小植株置于1/4ms(含1mg.l-1iba，100mg.l-1替卡西林，50mg.l-1卡那霉素)培養基中生根培養6天，篩選壓減半，胚軸下端出現發根跡象；培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(11)將步驟(10)中的小植株轉接到1/2ms基本培養基(含1mg.l-1iba，100mg.l-1替卡西林，50mg.l-1卡那霉素)中培養10天左右，所有的抗性芽隨同胚軸生根，平均每個胚軸10-15cm長的根系(圖1c)；培養條件：16小時/天光照，25±1℃。
(12)將步驟(11)中已生根的在一個胚軸上的多個大豆轉基因株系移栽到土壤(基質：擬南芥種植基質(泥炭6份：珍珠巖3份：蛭石1份)事先121℃滅菌120分鐘)；在人工氣候室中，約25天后多個轉基因植株苗開花結莢(圖1d)。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。