本發明涉及一種發酵制備檸檬酸的方法。
背景技術：
：目前檸檬酸生產廠家生產檸檬酸主要采用間歇式檸檬酸發酵的方式，該方式控制粗放，簡易，生產波動大，發酵轉化率低，設備利用率低。申請號201010255961.9的發明專利中介紹了根據rq值不同的變化趨勢對間歇式發酵過程進行分段控制的工藝方式，該工藝方式只是針對不同階段進行溫度的不同控制，從而達到提高發酵水平的目的。申請號201110421212.3的發明專利介紹了一種連續性發酵生產檸檬酸的方法，該方法主要是控制不同時期對不同階段發酵罐的培養基糖濃度、酸度和營養物，例如，氮源濃度進行控制，達到提高發酵水平的目的。該兩種工藝解決了原有工藝上的部分缺陷，但沒有達到更精細化的控制。發酵酸度以及糖酸轉化率仍有待進一步提高。技術實現要素：本發明的目的是為了克服上述缺陷，提供一種發酵酸度以及糖酸轉化率均較高的發酵制備檸檬酸的方法。為了實現上述目的，本發明提供了一種發酵制備檸檬酸的方法，該方法包括：在發酵條件下，將檸檬酸發酵菌種接入檸檬酸發酵培養基中，其中，所述發酵包括如下4個連續階段：第一發酵階段：向一級發酵罐中流加檸檬酸發酵培養基、發酵種子液以及堿性氮源，所述堿性氮源的流加量使得第一發酵階段的ph值為3.5-5.5， 得到第一發酵液；在第一發酵階段，物料的停留時間為2-4小時；第二發酵階段：向二級發酵罐中流加第一發酵液以及酸性氮源，該階段的通氣量為0.22-0.25體積:體積·分鐘(立方米空氣/立方米的發酵液/分鐘)，且高于第一發酵階段、第三發酵階段和第四發酵階段的通氣量，得到第二發酵液；在第二發酵階段，物料的停留時間為4-6小時；第三發酵階段：向三級發酵罐中流加第二發酵液，該階段的罐壓為0.07-0.1mps，且高于第一發酵階段、第二發酵階段和第四發酵階段的罐壓，得到第三發酵液；在第三發酵階段，物料的停留時間為40-48小時；第四發酵階段：向四級發酵罐中流加第三發酵液，該階段的溫度為38-40℃，且高于第一發酵階段、第二發酵階段和第三發酵階段的溫度，得到第四發酵液；在第四發酵階段，物料的停留時間為5-7小時。優選地，第三發酵階段的通氣量均高于第一發酵階段和第四發酵階段的通氣量。優選地，第一發酵階段的溫度均高于第二發酵階段和第三發酵階段的溫度。優選地，該方法還包括：當第四發酵階段的還原糖濃度高于0.2重量％時，向四級發酵罐中流加第二發酵液；優選的，第二發酵液流向四級發酵罐中的流量使得四級發酵罐中的還原糖濃度為不高于0.2重量％。通過上述技術方案，通過不同級發酵罐采取不同的控制工藝，有效地提高了發酵終點的酸度以及糖酸轉化率，并且還有效地提高了設備的利用率，消除了發酵罐因投入培養基、滅菌、降溫以及發酵停止后，排出發酵液的時間，使間歇式發酵總周期72小時降低到本發明的65小時以內。此外，由于根據不同級發酵罐采取不同的控制工藝，使發酵成本降低了10-20％。本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。具體實施方式以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。本發明提供了一種發酵制備檸檬酸的方法，該方法包括：在發酵條件下，將檸檬酸發酵菌種接入檸檬酸發酵培養基中，其中，所述發酵包括如下4個連續階段：第一發酵階段：向一級發酵罐中流加檸檬酸發酵培養基、發酵種子液以及堿性氮源，所述堿性氮源的流加量使得第一發酵階段的ph值為3.5-5.5，得到第一發酵液；在第一發酵階段，物料的停留時間為2-4小時；第二發酵階段：向二級發酵罐中流加第一發酵液以及酸性氮源，該階段的通氣量為0.22-0.25體積:體積·分鐘，均高于第一發酵階段、第三發酵階段和第四發酵階段的通氣量，得到第二發酵液；在第二發酵階段，物料的停留時間為4-6小時；第三發酵階段：向三級發酵罐中流加第二發酵液，該階段的罐壓為0.07-0.1mps，均高于第一發酵階段、第二發酵階段和第四發酵階段的罐壓，得到第三發酵液；在第三發酵階段，物料的停留時間為40-48小時；第四發酵階段：向四級發酵罐中流加第三發酵液，該階段的溫度為38-40℃，均高于第一發酵階段、第二發酵階段和第三發酵階段的溫度，得到第四發酵液；在第四發酵階段，物料的停留時間為5-7小時。根據本發明，在檸檬酸的連續化發酵過程中，在第一發酵階段，通過使用堿性氮源將ph控制在3.5-5.5，使菌體生長和糖化作用更有利地進行。在第二發酵階段，通過加大通氣量和酸性氮源的添加，促進ph的下降，加快菌體由生長型向產酸型的轉型(在正常工藝中，黑曲霉在生長到一定的階段后，其代謝將自動從生長型向產酸型轉變，本專利利用加大通風和加速ph下降，促進這個轉變的加快進行，轉變的時間縮短，使菌體更快的進入高速 產酸時期)。在第三發酵階段，通過加大罐壓，促進二氧化碳的溶解，加強菌體的二氧化碳固定，提高轉化率。在第四發酵階段，通過提高溫度和降低罐壓，使菌體更快的釋放菌內代謝產物，并加快殘糖的消耗，使后續工段的檸檬酸提取工作更有利地進行。通過如上的四個階段的協調配合以對檸檬酸的發酵工藝進行精細調控，有效地提高了發酵終點的酸度以及糖酸轉化率，并且縮短了發酵周期，降低了生產成本。本發明需要說明的是，在以上的四個發酵階段中，每個階段除限定的發酵條件外的其他發酵條件均可以為本領域常規的發酵條件，只要滿足如上的各個發酵階段的關系的限定即可。盡管將本發明的發酵條件進行如上的控制即可實現本發明的目的，但本發明的發明人發現，在第三發酵階段的通氣量均高于第一發酵階段和第四發酵階段的通氣量時，發酵效率能夠得到進一步提高，發酵成本得到進一步降低。優選地，第三發酵階段的通氣量分別比第一發酵階段和第四發酵階段的通氣量高0.02-0.07體積:體積·分鐘；進一步優選地，第二發酵階段的通氣量分別比第一發酵階段和第四發酵階段的通氣量高0.06-0.12體積:體積·分鐘，比第三發酵階段的通氣量高0.02-0.07體積:體積·分鐘。本發明的發明人還發現，當第三發酵階段的罐壓均比第一發酵階段、第二發酵階段和第四發酵階段的罐壓高0.01-0.07mpa時，發酵效率也會得到進一步提高。本發明的發明人進一步發現，當第一發酵階段的溫度高于第二發酵階段和第三發酵階段的溫度時，發酵效率也會得到進一步提高。優選地，第一發酵階段的溫度分別比第二發酵階段和第三發酵階段的溫度高0.5-3.5℃；進一步優選地，四發酵階段的溫度比第二發酵階段和第三發酵階段的溫度高2-4℃，比第一發酵階段的溫度高0.5-2℃。根據本發明進一步優選的實施方式，在滿足上述各階段發酵條件的情況 下，第一發酵階段的溫度為37.5-39.5℃，通氣量為0.14-0.16體積:體積·分鐘，罐壓為0.03-0.05mpa；第二發酵階段的溫度為36-38℃，罐壓為0.04-0.06mpa；第三發酵階段的溫度為36-38℃，通氣量為0.18-0.2體積:體積·分鐘；第四發酵階段的通氣量為0.13-0.15體積:體積·分鐘，罐壓為0.04-0.06mpa。根據本發明，優選地，在第一發酵階段，所述堿性氮源的流加量使得該階段的ph值為3.5-4.5。其中，本發明對所述堿性氮源的種類沒有特別的限制，可以為本領域常規的用于檸檬酸發酵的堿性氮源，例如，可以為液氨和/或氨水。另外，本發明第二發酵階段的酸性氮源的種類也可以為本領域常規的用于檸檬酸發酵的酸性氮源，例如，可以為硫酸銨、硝酸銨和氯化銨中的一種或多種。根據本發明一種優選的實施方式，當進行如下的罐容控制時，發酵效率會進一步提高：第一發酵階段的罐容可以為發酵罐總罐容的80-90體積％；第二發酵階段的罐容可以為發酵罐總罐容的75-85體積％；第三發酵階段和第三發酵階段的罐容均可以為發酵罐總罐容的85-95體積％。根據本發明另一種優選的實施方式，當第四發酵階段的還原糖濃度高于0.2重量％時，還可以向四級發酵罐中流加第二發酵液。優選的，第二發酵液流向四級發酵罐中的流量使得四級發酵罐中的還原糖濃度為不高于0.2重量％。根據本發明，對發酵培養基的成分沒有特別的要求，只要可以用于檸檬酸發酵的發酵培養基即可。優選地，所述發酵培養基含有淀粉質原料酶解產物，碳源含量為13-21重量％，氮源含量為0.06-0.14重量％，磷源含量為0.005-0.07重量％，無機鹽含量0.1-2.6重量％，水含量為77-86重量％。一般地，淀粉質原料酶解得到淀粉質原料液化液，淀粉質原料液化液經固液分離得到淀粉質原料酶解殘渣和淀粉質原料液化清液，所述固液分離的條件使淀 粉質原料酶解殘渣的固含量為5-60重量％，更優選為30-50重量％。通常可以將淀粉質原料酶解液化清液用于制備發酵培養基，也可以將淀粉質原料酶解液化清液與淀粉質原料液化液混合后用于制備發酵培養基。本發明所述淀粉質原料酶解產物優選包括淀粉質原料液化液和淀粉質原料酶解液化清液。根據本發明，向各級發酵罐中流加物料的速度沒有特別的限制，只要保證各級罐中的物料能夠在其相應級別的發酵罐中停留如上的時間即可。優選的情況下，向一級發酵罐中流加種子液的速度為4-6m3/h，淀粉質原料液化液的速度為4-6m3/h，淀粉質原料液化清液的速度為18-22m3/h；向二級發酵罐中流加第一發酵液的速度為28-32m3/h，淀粉質原料液化清液的速度為18-22m3/h，硫酸銨的速度為0.4-0.5m3/h；向三級發酵罐中流加第二發酵液的速度為45-55m3/h；向四級發酵罐中流加第三發酵液的速度為45-55m3/h，優選的情況下，在四級罐發酵的發酵時間內，當第四發酵階段的還原糖濃度高于0.2重量％時，還可以向四級發酵罐中流加第二發酵液；優選的，第二發酵液流向四級發酵罐中的流量使得四級發酵罐中的還原糖濃度為0-0.2重量％。根據本發明，三級發酵罐可以包括一個或多個串聯的發酵罐，優選為1-5個。向三級發酵罐中的流加物料的順序可以為：向三級發酵罐的1號罐中流加第二發酵液，向2號罐中流加1號罐的發酵液，并依此類推，直至最后一號發酵罐。四級發酵罐的物料來自三級發酵罐的最后一號發酵罐，或選擇的還來自二級發酵罐。其中，物料在三級發酵罐的各個發酵罐中停留的時間可以相同也可以不同，只要保證物料在各個發酵罐中停留的時間之和為三級發酵罐的總時間即可。根據本發明，所述淀粉質原料可以為本領公知的各種可以用于酶解、發酵制備檸檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和 小麥中的一種或幾種，優選情況下，所述淀粉質原料為玉米。所述酶解步驟可以通過本領域常用的方法完成，比如向粉碎產物中添加產酶微生物和/或酶，在產酶微生物的生長溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產酶微生物為能夠分泌淀粉酶的產酶微生物。所述酶包括淀粉酶。由于微生物生長會產生副產物，因此優選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考慮，優選以每克粉碎后的粉碎產物的干重計，所述淀粉酶的用量為15-50個酶活力單位。本發明所述酶的酶活力單位的定義為：在ph值為6.0、溫度為70℃的條件下，1分鐘將1毫克淀粉轉化為還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。所述酶解的溫度可以在很大范圍內改變，優選為70-105℃，更優選為80-95℃。所述酶解的時間理論上越長越好，考慮到設備利用率，優選所述酶解的時間為90-150分鐘，更優選為100-120分鐘。所述酶解的ph值可以在很大范圍內改變，優選為5.0-7.0，更優選ph值為5.4-5.7。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。根據本發明，優選使用α-淀粉酶和/或異淀粉酶。根據本發明，所述固液分離的方法與裝置為本領域技術人員所公知，例如，壓濾機或離心機。根據本發明，所述發酵種子的獲得可以通過將黑曲霉種子接種到種子培養基中進行培養獲得，黑曲霉種子培養的程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和ph測定對黑曲霉的生長進行觀察，當ph在2.0-2.5、酸度0.5-2.0％、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時停止培養。優選情況下，所述種子培養處理的方法包括：將黑曲霉接種在黑曲霉培養液中進行培養，所述黑曲霉培養液中含有10-17重量％的玉米粉，接種后黑曲霉培養液中黑曲霉的濃度為3×105-4×105個/毫升。根據本發明，所述黑曲霉培養液的制備方法沒有特別的限制，只要得到的培養液能夠適用于黑曲霉的培養即可。按照本發明的方法制備得到的發酵產物檸檬酸可以用常規的方法，根據不同工業產品的要求分離并精制，比如中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝。以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。以下述發酵系統為例闡述本發明：發酵罐包括：一級發酵罐1個，罐容150m3；二級發酵罐1個，罐容300m3；三級發酵罐5個，單罐罐容500m3；四級發酵罐1個，罐容300m3。總共發酵罐容為3250m3；淀粉質原料液化清液罐1個、淀粉質原料液化液罐1個、種子罐1個，5m3的硫酸銨配料罐1個。50重量％濃度的硫酸銨溶液4.5m3，在配料罐中121℃滅菌備用。制備例本制備例用于說明發酵原料的制備。(1)將收獲的56千克玉米在熱水槽潤燜，直至玉米的含水量為15重量％，然后進行粉碎，得到平均粒子直徑為400微米的粉碎后產物。(2)將粉碎后的產物按25重量％的濃度調漿，相對于每克粉碎后的產物，加入20個酶活力單位的淀粉酶(諾維信公司，α-淀粉酶，本發明實施例中均為此淀粉酶)，進入噴射器，在85℃、ph為5.5的條件下酶解100分鐘，得到淀粉質原料液化液。(3)將淀粉質原料液化液通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出淀粉質原料液化清液和酶解濾渣，其中，酶解殘渣的含水量為50％。(4)將步驟(2)中的部分淀粉質原料液化液，加水稀釋至總糖的10 重量％，得到培養液，將培養液投入種子罐，加熱到121℃消毒，維持30分鐘后快速降溫至36℃，接入黑曲霉菌種(黑曲霉t01，天津工業微生物所，本發明實施例中均為此黑曲霉菌種，接種量為：每克酶解液化液3×105個菌落形成單位)，在36℃、0.4體積:體積·分鐘的通氣條件下進行菌種培養；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和ph測定對黑曲霉的生長進行觀察，當ph在2.0、酸度1％、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養，得到種子液。(5)將得到的淀粉質原料液化液和液化清液分別對應的加入至液化液罐內和液化清液罐內，兩罐內的糖液糖度為17.5％。實施例1-3用于說明本發明的檸檬酸的制備方法。按照表1-表4的條件進行檸檬酸的發酵。種子液為步驟(4)得到的黑曲霉種子液。液化液和液化清液分別為來自制備例步驟(5)的液化液罐和液化清液罐。表1：1-4級別罐的控制條件為：表2：第一培養階段的物料流加速度表3：第二培養階段的物料流加速度實施例編號一級罐物料m3/h液化清液m3/h硫酸銨m3/h實施例130200.45實施例228220.4實施例332180.5表4從三級罐5號向四級罐流加物料，流加速度為50m3/h，當第四發酵階段的還原糖濃度高于0.2重量％時，向四級發酵罐中流加第二發酵液；流加 的流量使得四級發酵罐中的還原糖濃度為低于0.2重量％。從四級發酵罐中，向體系外(分離提取工序)供給物料，供給速率為50m3/h。物料還原糖低于0.2％。根據gb1987-2007標準檢測最終所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉化率、單次產量以及每小時供酸量，轉化率(％)＝檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)×檸檬酸溶液的體積/總糖的重量×100％，檸檬酸的單次產量＝檸檬酸溶液的濃度×檸檬酸溶液的體積，每小時供酸量(t/h)＝檸檬酸的單次產量/時間。結果如表5所示。實施例4本實施例用于說明本發明的檸檬酸的制備方法。按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，不同的是，將第三發酵階段的通氣量設置為0.15體積:體積·分鐘。發酵結束后的酸度、轉化率、單次產量以及每小時供酸量見表5。實施例5本實施例用于說明本發明的檸檬酸的制備方法。按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，不同的是，第一發酵階段的溫度設置為37℃。發酵結束后的酸度、轉化率、單次產量以及每小時供酸量見表5。實施例6本實施例用于說明本發明的檸檬酸的制備方法。按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，不同的是，當第四發酵階段的還原糖濃度高于0.2重量％時，不向四級發酵罐中流加第二發酵液。發酵結 束后的酸度、轉化率、單次產量以及每小時供酸量見表5。對比例1本實施例用于說明本發明的檸檬酸的制備方法。按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，不同的是，第一發酵階段和第二發酵階段流加的氮源為硫酸銨。發酵結束后的酸度、轉化率、單次產量以及每小時供酸量見表5。對比例2本對比例用于說明現有技術的檸檬酸的制備方法。將制備例中得到的液化清液和液化液按照體積比為8:1的比例加入到300m3的發酵罐中，不添加氮源，加入量為205m3。滅菌降到37℃后，接入制備例中培養好的種子液25m3，在0.18體積:體積·分鐘的通氣量，37℃和0.05mpa的條件下培養60小時。發酵結束后的酸度、轉化率、單次產量以及每小時供酸量見表5。表5實施例/對比例編號酸度(％)轉化率(％)單次產量(t)每小時供酸量(t/h)實施例117.3102.92112.08.8實施例217.31032112.08.8實施例317.4102.52256.09.4實施例417.0101.82102.08.5實施例517.01012040.07.65實施例617.0100.91920.08.2對比例117.01011836.08.0對比例2151001351.25.63由以上實施例和對比例可以看出，采用本發明的技術方案進行檸檬酸的 發酵能夠顯著的提高發酵水平。通過實施例1與實施例4-6相比可以看出，將第三發酵階段的通氣量設置為高于第一發酵階段或第四發酵階段的通氣量，第一發酵階段的溫度設置為高于第二發酵階段和第三發酵階段的溫度，當第四發酵階段的還原糖濃度高于0.2重量％時，向四級發酵罐中流加第二發酵液，能夠進一步提高發酵水平。另外，采用本發明的技術方案，使得設備的利用率提高了26.5％，并且消除了間歇式發酵中培養基投入、排出發酵液等10小時的時間，使得發酵時間大大縮短。并且，由于根據不同級別的發酵罐采取不同的發酵工藝，使發酵的電耗和空氣消耗等成本下降了10-20％。以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。當前第1頁12