本發明屬于生物發酵技術領域，具體涉及一種利用木質纖維素原料發酵生產丁醇的方法。
背景技術：
丁醇是一種重要的有機化工原料，在化工、醫藥和石油等工業部門有廣泛的用途。而且由于比乙醇多兩個亞甲基，丁醇具有更高的疏水性，較低的揮發性，可與汽油以任意比例混合，并具有與汽油相當的熱值。作為一種有潛力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越來越受到世界各國的關注。
隨著石油資源的日益枯竭，降低礦物能源的使用比重，加強可再生能源開發已成為人類今后能源利用的重要趨勢。而且采用以石油為原料的丙烯羰基合成法生產丁醇由于技術落后，裝置偏小導致產能不夠，致使中國丁醇市場長期供應不足，不能滿足國內市場的需求。生物發酵法制備丁醇有其獨到的優勢，發展生物丁醇將極大地緩解丁醇供應不足的現狀。
由于我國人口眾多，用傳統的原料（玉米和甘蔗）發酵生產丁醇勢必會造成與人爭糧的問題，造成糧食短缺，因此開展以可再生的生物質材料為原料生物轉化生產生物丁醇是符合國情的研究方向。木質纖維素類農業副產物，蘊含大量的纖維素和半纖維素，例如玉米秸稈干物質中纖維素占34-42%，半纖維素占22-28%（岳國君，纖維素乙醇工程概論[m].北京：化學工業出版社，2014）。纖維素的水解產物為葡萄糖，而半纖維素的水解產物主要為木糖，還有少量甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，木質纖維素原料水解產生的混合糖中，半纖維素糖（主要為木糖）占30%-40%，因此半纖維素糖的發酵顯得至關重要。
菌株和原料問題一直是困擾丁醇發酵的瓶頸。近年來，國內外對纖維原料發酵產丁醇的研究很多，主要圍繞菌種誘變選育，尋找合適的纖維原料及其糖液制備、發酵工藝條件優化和溶劑提取等方面進行。目前工業上用于丁醇生產的菌株主要是丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌，具有相似的代謝路徑，其發酵產物主要分為3類：1)溶劑（丙酮、乙醇和丁醇）；2)有機酸（乙酸、乳酸和丁酸）；3)氣體（包括二氧化碳、氫氣等）。他們有的能夠利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，有的可以利用木糖、半乳糖和甘露糖，因此可以利用該菌對木質纖維素水解的混合糖進行丁醇丙酮發酵。但是，傳統丙酮丁醇發酵普遍存在以下問題：（1）傳統的丙酮丁醇發酵菌株需在嚴格厭氧條件下培養發酵，稍有操作不慎，很容易進入空氣，造成菌體不能正常生長，因此在發酵過程中通常需要通入惰性氣體如n2來保證無氧環境，能耗較高；（2）丁醇產率低，僅20%左右（質量分數），使得丁醇發酵過程原料成本偏高，制約了丁醇發酵產業的發展；（3）發酵產物除了丁醇外還有40%的丙酮和乙醇等副產物，消耗了有限的碳代謝流，降低了產物中丁醇所占的比例，增加了回收丁醇的難度，提高了能耗。
cn201110047422.0提供了一種利用丙酮丁醇羧菌厭氧發酵產丁醇的方法，以葡萄糖為底物，初始葡萄糖濃度為60g/l，在通入n2保持發酵罐嚴格厭氧環境的情況下，對丙酮丁醇羧菌產酸期和產醇期的ph進行調控，總溶劑和丁醇的產量分別為19.20-19.65g/l和11.43-12.30g/l，丁醇選擇性為58.2%-63.1%，溶劑產率為32.0%-32.8%，丁醇產率為19.1%-20.5%。
cn201210089406.2公開了一株產丁醇的拜氏梭菌（clostridiumbeijerinckii）y-3，該菌是通過對出發菌株clostridiumbeijerinckiincimb8052采用甲基磺酸乙酯（ems）誘變獲得的突變株，可以木糖渣為原料制備生物丁醇，在以木糖渣酶解液為碳源時，總溶劑產量為16g/l，丁醇產量為8.2g/l，解決了傳統生物發酵生產丁醇菌種能力和原料不足的問題。
cn201210163123.8通過基因工程手段抑制丙酮丁醇梭菌中葡萄糖轉運蛋白基因（glcg）的表達，增加木糖轉運蛋白、木糖異構酶和木糖糖激酶的表達或活力，提高了丙酮丁醇梭菌對木糖的利用率，以丙酮丁醇梭菌atcc824為出發菌株，獲得一株基因工程菌株824glcg-tba，使得對木糖的利用率從48.7%增加到93.6%。初始菌株atcc824的溶劑產量為12.99g/l，其中丁醇7.85g/l，溶劑和丁醇產率分別為22.5%和13.6%。工程菌株824glcg-tba的溶劑產量為16.06g/l，其中丁醇9.11g/l，溶劑和丁醇產率分別為28.2%和16.0%。
但是，丙酮丁醇發酵菌株存在糖代謝的阻遏效應，即在葡萄糖存在時會優先利用葡萄糖，木糖等其他糖類幾乎不消耗。同時丙酮丁醇梭菌本身利用木糖代謝的效率也較低，利用木糖發酵的速率遠低于葡萄糖發酵速率。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明提供了一種利用木質纖維素原料發酵生產丁醇的方法。本發明利用黑曲霉t2酶解纖維素和半纖維素，并利用水解產物中的木糖和葡萄糖作為發酵底物生產丁醇，具有酶解效果好、發酵產率高等特點。
本發明利用木質纖維素原料發酵生產丁醇的方法，包括如下內容：
（1）將木質纖維素原料進行預處理；
（2）采用黑曲霉（aspergillusniger）t2的產酶發酵液對預處理后原料進行酶解，得到纖維素和半纖維素水解混合糖液；所述黑曲霉為專利cn200910011768.8所述的黑曲霉t2；
（3）利用氫氧化鈣對水解混合糖液進行脫毒處理；
（4）以脫毒后糖液為碳源，補加營養元素制備發酵培養基；
（5）將拜氏梭菌xh0906接種至發酵培養基中，發酵生產丁醇；所述拜氏梭菌xh0906，其分類命名為拜氏梭菌（clostridiumbeijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.9124，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。
本發明步驟（1）所述的木質纖維素原料含有纖維素、半纖維素和木質素，可以采用秸稈、木屑、能源植物等，優選采用玉米秸稈。所述預處理方式可以采用一切可提高木質纖維素酶解性能的物理、化學和熱化學技術，包括機械粉碎、輻射、微波、酸處理、堿處理、蒸汽爆破預處理和溶劑預處理，或采用上述方法的組合預處理等，優選采用蒸汽爆破預處理。具體過程如下：將切碎的玉米秸稈進入到蒸汽爆破裝置的滯留器，在160-210℃下維持5-10分鐘，瞬間泄壓釋放，即得到蒸汽爆破預處理的玉米秸稈。預處理后的原料用水配制成固液比為2%-10%（w/v）的料液，調節ph為4.5-5.5進行酶解。
本發明步驟（2）中所述黑曲霉（aspergillusniger）t2為專利cn200910011768.8所述黑曲霉t2，已于2008年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.2715。黑曲霉（aspergillusniger）t2是一株產β-葡萄糖苷酶活高的菌株，除了能分泌β-葡萄糖苷酶外，還能夠分泌內切酶、外切酶和木聚糖酶，具有酶活高，生產方法簡單等特點。
本發明步驟（2）按照cn200910011768.8制得黑曲霉（aspergillusniger）t2的產酶發酵液，加入量5-20ml/g纖維素。酶解條件為：酶解ph值為4.5-5.5，溫度為45-55℃，攪拌速率為50-300r/min，酶解時間為24-72h。
本發明步驟（3）利用氫氧化鈣對水解混合糖液進行脫毒處理，直接加入氫氧化鈣固體顆粒調節酶解液的ph至9-12，于40-60℃，50-300r/min攪拌1h，采用常規方法進行固液分離，液體即為脫毒后的糖液。
本發明步驟（4）以脫毒后的糖液為碳源，配制用于丁醇發酵菌株發酵用的培養基，其中還原糖濃度為25-50g/l，補加營養元素配成發酵培養基。
本發明步驟（5）所述的發酵條件為厭氧發酵或兼氧發酵，接種量為（體積分數，v/v）1%-10%，發酵溫度為28-42℃，發酵時間24-72小時，即得到含有丁醇的發酵液。采用拜氏梭菌xh0906作為發酵菌株，無需通入空氣和氮氣。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
（1）采用黑曲霉（aspergillusniger）t2的產酶發酵液對預處理后木質纖維素原料進行酶解，可以耐受多種抑制物，纖維素酶成分全，可以同時高效酶解纖維素和半纖維素，具有酶解適應性強、酶解效果好、還原糖得率高等特點。
（2）利用拜氏梭菌（clostridiumbeijerinckii）xh0906為發酵菌株，發酵培養基中無需加入保險粉脫氧，發酵過程中不需要通入n2保持無氧環境，丁醇的選擇性達到100%，幾乎無丙酮和乙醇副產物產生，木糖和葡萄糖混合為碳源時無選擇性，丁醇產量為7-10g/l，丁醇產率為20%-40%。
（3）本發明發酵生產丁醇的過程操作簡單，原料單耗低，產品更容易提純，對利用木質纖維素原料生產丁醇的大規模工業應用具有重要意義。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明方法和效果做進一步詳細說明。實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。本發明中，wt%為質量分數。
本發明實施例使用的木質纖維素原料為玉米干秸稈，其中纖維素38.2wt%，半纖維素22.1wt%，木質素20.2wt%，灰分3.9wt%，用粉碎機粉碎至顆粒大小為1-5mm。
實施例1黑曲霉t2產酶發酵液的制備
配制發酵培養基：500ml三角瓶中裝玉米芯4.95g，酵母粉3.5g，kh2po40.4g,mgso40.06g，cacl20.06g，微量元素：feso41mg，mnso40.32mg，znso40.2mg，加水至200ml，ph5.0。
制備種子液：將上述培養基置于500ml三角瓶中，121℃滅菌30分鐘，冷卻后按10％接種量接種黑曲霉t2，28-33℃恒溫培養24小時。
液態發酵：將上述培養基在121℃滅菌30分鐘，冷卻后按10%（v/v）接種量將制備的種子液接種到培養基中，30℃，轉速200rpm，培養72小時。發酵液中濾紙酶活達到5.6u/ml，β-糖苷酶平均酶活達到2.46u/ml。
實施例2拜氏梭菌xh0906種子液的制備
種子培養基成分：蛋白胨10g/l、牛肉膏6g/l、木糖30g/l、氯化鈉0.5g/l、硫酸銨0.9g/l、硫酸鐵0.1g/l、硫酸鎂0.3g/l、氯化鈣0.1g/l，ph7.0，在121℃下滅菌15min。
以拜氏梭菌（clostridiumbeijerinckii）xh0906為發酵菌株，將保藏的拜氏梭菌從斜面上刮下1-2環接入搖瓶種子培養基中，不需要通入n2，30℃靜置培養36h，制備得到發酵種子液。
實施例3以玉米秸稈為原料發酵生產丁醇
（1）將玉米秸稈進行預處理：取粉碎的玉米秸稈利用2.0wt%的稀硫酸浸漬，固液比為1g:2ml，進入到蒸汽爆破裝置的滯留器中，在溫度170℃，壓力0.7mpa下維持5分鐘，瞬間泄壓爆破，得到稀酸蒸汽爆破預處理的玉米秸稈，主要由木糖、纖維素和木質素組成，干物質濃度為32%，木糖含量為21.2%（相對于干物質），纖維素含量為38.6%。
（2）對預處理后玉米秸稈進行酶解：把經過稀酸蒸汽爆破預處理的玉米秸稈物料利用naoh調節ph到5.0。加入自來水調節干物質濃度為5%，加入黑曲霉t2產酶發酵液，加入量為15ml/g纖維素，于50℃、150r/min酶解24h，酶解的ph值為5.0，酶解液利用液相色譜檢測，木糖濃度為10.1g/l，葡萄糖濃度為19.8g/l，纖維素的葡萄糖酶解得率為92.3%。
（3）利用氫氧化鈣對水解混合糖液進行脫毒處理：直接加入氫氧化鈣固體調節酶解液的ph至10.5，于50℃，120r/min攪拌保溫1h，固液分離后，液體即為脫毒后的糖液。
（4）以脫毒后糖液為碳源，補加以下營養元素配成發酵培養基：酵母粉1g/l，磷酸氫二鉀0.5g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，乙酸銨2.2g/l，七水合硫酸鎂0.2g/l，一水合硫酸錳0.01g/l，七水合硫酸亞鐵0.01g/l，氯化鈉0.01g/l，對氨基苯甲酸0.001g/l，維生素b10.001g/l，生物素0.0001g/l，調節ph至6-7。
（5）將拜氏梭菌xh0906種子液按照5%的接種量接種至發酵培養基中，發酵制備生物丁醇：發酵條件為兼氧發酵，培養基無需加入保險粉脫氧，發酵溫度為37℃，發酵過程不用通入n2保持無氧環境，自然ph，發酵48小時，即得到含有丁醇的發酵液，發酵液中的丁醇濃度為7.2g/l，葡萄糖和木糖全部利用，葡萄糖和木糖到丁醇的產率為24.1%。
實施例4
（1）將玉米秸稈進行預處理：取粉碎的玉米秸稈利用2.0wt%的稀硫酸浸漬，固液比為1g:2ml，進入到蒸汽爆破裝置的滯留器中，在溫度170℃，壓力0.7mpa下維持5分鐘，瞬間泄壓爆破，得到稀酸蒸汽爆破預處理的玉米秸稈，主要由木糖、纖維素和木質素組成，干物質濃度為32%，木糖含量為21.2%（相對于干物質），纖維素含量為38.6%。
（2）對預處理后玉米秸稈進行酶解：把經過稀酸蒸汽爆破預處理的玉米秸稈物料利用naoh調節ph到5.0。加入自來水調節干物質濃度為8%，加入黑曲霉t2產酶發酵液，加入量為10ml/g纖維素，于50℃、150r/min酶解24h，酶解的ph值為5.0，酶解液利用液相色譜檢測，木糖濃度為16.3g/l，葡萄糖濃度為32.7g/l，纖維素的葡萄糖酶解得率為95.3%。
（3）利用氫氧化鈣對水解混合糖液進行脫毒處理：直接加入氫氧化鈣固體調節酶解液的ph至11，于50℃，120r/min攪拌保溫1h，固液分離后，液體即為脫毒后的糖液。
（4）以脫毒后糖液為碳源，補加以下營養元素配成發酵培養基：酵母粉1g/l，磷酸氫二鉀0.5g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，乙酸銨2.2g/l，七水合硫酸鎂0.2g/l，一水合硫酸錳0.01g/l，七水合硫酸亞鐵0.01g/l，氯化鈉0.01g/l，對氨基苯甲酸0.001g/l，維生素b10.001g/l，生物素0.0001g/l，調節ph至6-7。
（5）將拜氏梭菌xh0906種子液按照5%的接種量接種至發酵培養基中，發酵制備生物丁醇：發酵條件為兼氧發酵，培養基無需加入保險粉脫氧，發酵溫度為37℃，發酵過程不用通入n2保持無氧環境，自然ph，發酵48小時，即得到含有丁醇的發酵液，發酵液中的丁醇濃度為8.3g/l，殘余葡萄糖6.2g/l，殘余木糖濃度6.5g/l，葡萄糖和木糖到丁醇的產率為22.9%。
比較例1
處理流程和操作條件同實施例4，不同之處在于：采用拜氏梭菌（clostridiumbeijerinckii)ncimb8052，購于英國國家工業、海洋和食品菌種保藏中心。發酵72小時，即得到含有丁醇的發酵液，發酵液中的總溶劑濃度8.9g/l，其中丁醇濃度為4.9g/l，丙酮濃度為2.6g/l和乙醇濃度1.4g/l。殘余葡萄糖濃度8.9g/l，殘余木糖6.4g/l，葡萄糖和木糖到丁醇的產率為14.5%。
比較例2
處理流程和操作條件同實施例4，不同之處在于：酶解采用諾維信的ctec2纖維素酶，加入量為10iu/g纖維素。酶解液中的木糖濃度為16.6g/l，葡萄糖濃度為33.8g/l，纖維素的葡萄糖酶解得率為98.5%。酶解液經過丁醇發酵后，發酵液中的丁醇濃度為8.9g/l，葡萄糖和木糖到丁醇的產率為22.9%，殘余木糖4.3g/l，殘余葡萄糖7.3g/l。由此可見，采用本發明提供的產酶菌株進行酶解，酶解效果接近商品酶；而且對上述酶解液發酵后，丁醇產率更高。