應(yīng)用人脂肪衍生的干細胞增殖血清來源的丙肝病毒及其用途的制作方法

            文檔序號:11285345閱讀:749來源:國知局
            應(yīng)用人脂肪衍生的干細胞增殖血清來源的丙肝病毒及其用途的制造方法與工藝

            發(fā)明領(lǐng)域

            本發(fā)明涉及用于增殖丙肝病毒(hcv)的系統(tǒng)和方法以及其用途。

            發(fā)明背景

            hcv為黃病毒科(flaviviridae)的包膜正鏈rna病毒。它含有9.6kb基因組,其始于非翻譯區(qū)(5’-utr),接著是編碼結(jié)構(gòu)蛋白(核心、e1和e2)和包括p7、ns2、ns3、ns4和ns5在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)(ns)蛋白的序列(關(guān)于綜述,參見參考文獻1,2)。與乙肝病毒(hbv)的感染不一樣,hcv感染為具有肝內(nèi)表現(xiàn)和肝外表現(xiàn)兩者的多層面疾病3,并且hcv可駐留在非肝細胞4-6,其可在病毒持續(xù)性和再活化中起一定作用。然而,研究hcv的肝外復(fù)制的體外系統(tǒng)嚴重有限。就原代細胞而言,僅在人和黑猩猩肝細胞中證明血清攜帶的hcv(hcvser)的直接感染,人和黑猩猩肝細胞難以在培養(yǎng)物中維持,并且還具有在細胞特性上顯著的供體間的變化。此外,大多數(shù)體外細胞培養(yǎng)方法利用分子克隆,而不是天然病毒(關(guān)于綜述,參見參考文獻7)。這些模型還在非原代細胞中生長病毒,包括最近經(jīng)報道支持臨床hcv分離株的感染的hlz01肝癌細胞系8。因此,這些數(shù)據(jù)可外推至實際臨床病毒-宿主相互作用的程度仍是一個擔(dān)憂。

            因此,仍需要增殖血清攜帶的丙肝病毒(hcv)的備選系統(tǒng)和方法。

            發(fā)明概述

            提供本概述以呈現(xiàn)本發(fā)明的概述,從而簡要地指出本發(fā)明的性質(zhì)和實質(zhì)。在理解其不用于解釋或限制權(quán)利要求的范圍或含義的情況下提出該概述。

            在一方面,本公開內(nèi)容提供用于增殖丙肝病毒(hcv)的基于人脂肪衍生的干細胞(hadsc)的系統(tǒng),其包括hadsc、適于培養(yǎng)hadsc的培養(yǎng)基和hcv。在一些實施方案中,hadsc為原代細胞或傳代細胞,優(yōu)選第1-15代細胞,更優(yōu)選第1-6代細胞。在一些實施方案中,hadsc對特異性標記物dlk-1(即pref-1)呈陽性。在一些實施方案中,hcv來源于感染hcv的個體的血液、血清、血漿或體液,或為臨床hcv分離株。在一些實施方案中,hcv具有選自以下的基因型:1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a以及其任何組合,優(yōu)選基因型1a、1b、2a、2b或混合的2a+2b。在一些實施方案中,所述系統(tǒng)支持hcv的完全復(fù)制,包括感染病毒的產(chǎn)生。

            在另一方面,本公開內(nèi)容提供用于增殖丙肝病毒(hcv)的方法,其包括在適于培養(yǎng)hadsc的培養(yǎng)基中在適于hcv復(fù)制的條件下使用hadsc增殖hcv。在一些實施方案中,hadsc為原代細胞或傳代細胞,優(yōu)選第1-15代細胞,更優(yōu)選第1-6代細胞。在一些實施方案中,hadsc對特異性標記物dlk-1(即pref-1)呈陽性。在一些實施方案中,hcv來源于感染hcv的個體的血液、血清、血漿或體液,或為臨床hcv分離株。在一些實施方案中,hcv具有選自以下的基因型:1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a以及其任何組合,優(yōu)選基因型1a、1b、2a、2b或混合的2a+2b。在一些實施方案中,所述方法支持hcv的完全復(fù)制。

            在另一方面,本公開內(nèi)容提供hadsc用于增殖hcv或進行hcv生命周期分析或診斷hcv感染或篩選抗病毒化合物或表征感染hcv的受試者的這種hcv的用途。

            在另一方面,本公開內(nèi)容提供hadsc在制備用于診斷hcv感染或增殖hcv或進行hcv生命周期分析或篩選抗病毒化合物或表征感染hcv的受試者的這種hcv的試劑盒中的用途。

            在另一方面,本公開內(nèi)容提供用于診斷受試者中的hcv感染的方法,其包括以下步驟:

            a)提供hadsc,

            b)在適于培養(yǎng)hadsc的培養(yǎng)基中使hadsc與獲自受試者的生物樣品一起孵育,

            c)培養(yǎng)所述hadsc達足以允許hcv復(fù)制的時間,和

            d)檢測hcv復(fù)制的水平,

            其中檢測到hcv復(fù)制表明所述受試者感染hcv。

            在一些實施方案中,所述生物樣品來源于血液、血清、血漿或體液。

            在另一方面,本公開內(nèi)容提供用于篩選抗hcv化合物的方法,其包括以下步驟:

            a)使hadsc在第一容器的培養(yǎng)基中與hcv在不存在候選化合物的情況下接觸;

            b)確定在不存在候選化合物的情況下在第一容器的培養(yǎng)基中hcv的水平;

            c)使hadsc在第二容器的培養(yǎng)基中與hcv在存在候選化合物的情況下接觸;

            d)確定在存在候選化合物的情況下在第二容器的培養(yǎng)基中hcv的水平;

            e)比較在存在候選化合物的情況下的hcv水平與在不存在候選化合物的情況下的hcv水平;和

            f)當(dāng)在存在候選化合物的情況下的hcv水平低于在不存在候選化合物的情況下的hcv水平時將該候選化合物鑒定為抗hcv化合物。

            在一些實施方案中,hcv水平通過測量hcv滴度、hcv核酸水平或hcv多肽水平而確定。

            在一些實施方案中,候選化合物為選自以下的至少一種:化合物、蛋白、肽、肽模擬物、抗體、核酸、反義核酸、shrna、核酶和小分子化合物。

            在一些實施方案中,hcv為選自以下的hcv基因型中的至少一種:1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a以及其任何組合,優(yōu)選基因型1a、1b、2a、2b和混合的2a+2b。

            其它方面描述于下文。

            附圖簡述

            當(dāng)結(jié)合通過舉例而非限制的方式所包含的附圖閱讀時能更好地理解前述概述和下列詳述。

            圖1:hcv在體內(nèi)靶定人脂肪衍生的dlk-1+干細胞。(a)3名hcv(+)個體的脂肪組織(表1)收獲自手術(shù)傷口并且將rna提取出用于hcv特異性5’-utr(223bp)的rt-pcr。也對收獲自3名hcv(-)個體的脂肪組織進行平行研究用于比較,hcv(+)血清用作陽性對照。(b)將hcv(+)個體的脂肪組織切碎、勻漿并離心成漂浮物、緩沖液和細胞沉淀的層。將細胞沉淀的紅細胞進一步裂解以收獲svf。將rna從各細胞群中提取出并進行5’-utr的rt-pcr。在svf細胞中而未在漂浮物中檢測到病毒轉(zhuǎn)錄物(左圖)。svf細胞進一步免疫分離成dlk-1-和dlk-1+細胞,并將rna單獨提取出用于rt-pcr。病毒轉(zhuǎn)錄物存在于dlk-1+細胞中,而不存在于dlk-1-細胞(右圖)。數(shù)據(jù)代表利用來自3名hcv(+)供體的細胞的3個實驗。(c)將分離自3名hcv感染個體的dlk-1-和dlk-1+細胞的rna提取出用于hcv負鏈rna的rt-pcr。分離自hcv(+)個體的原代人干細胞(phh)用作陽性對照。(d)將分離自hcv(-)和hcv(+)個體的dlk-1-(圖b和e)和dlk-1+細胞(圖c和f)離心到細胞離心涂片器載玻片(cytospinslide)上用于病毒ns5的免疫細胞化學(xué)(c中的棕色標記)和蘇木精染色(核中的藍色標記)。用小鼠igg1對照抗體染色未分級分離的svf細胞(圖a和d)用作陰性對照。數(shù)據(jù)代表來自3名hcv(+)和3名hcv(-)供體的樣品。(e)將來自hcv(+)或hcv(-)個體的脂肪組織在同一切片上針對dlk-1(紅色標記,在圖b、c和h中的箭頭)和針對病毒ns5(棕色標記,在圖e和f中的箭頭)和蘇木精(藍色標記,圖d-f和i-j)進行序貫染色。在hcv(+)脂肪組織中dlk-1+細胞(紅色標記,箭頭,圖b和c)共表達ns5ag(棕色標記,箭頭,圖e和f)。在hcv(-)脂肪組織中dlk-1+細胞(圖h,箭頭)并不表達ns5(圖j,箭頭;h對比j)。用兔igg(圖a和g)或小鼠igg1(圖d和i)進行的染色用作陰性對照。圖b,e和c,f來自不同的供體。數(shù)據(jù)代表3名hcv(+)和3名hcv(-)供體。(f)分離自4名hcv(+)個體脂肪組織的dlk-1+細胞離體培養(yǎng)49天,并每7天將上清液收集用于5’-utr的qrt-pcr。數(shù)據(jù)表示為各時間點的一式三份的平均值±sd。

            圖2:幼稚dlk-1+hadsc在體外允許血清攜帶的hcv感染。(a)原代人肝細胞(phh)分離自hcv(-)供體,并置于皿中達3天,然后用hcvser(泳道“+”,左圖)或hcv(-)對照血清(泳道“-“,左邊)脈沖。在3h脈沖后,將phh培養(yǎng)額外5天,并將rna提取出用于5’-utr的rt-pcr(左圖)。平行地將分離自hcv(-)供體的p-3或p-4dlk-1+hadsc通過hcvser以0.2moi懸浮脈沖,每7天更換培養(yǎng)基。在所示時間點,將上清液和細胞分開收獲并將rna提取出用于5’-utr的rt-pcr。數(shù)據(jù)代表10個實驗。也將hcv(+)血清的rna提取出用于rt-pcr作為對照。(b)收集d14和d28hcvser-1b感染的hadsc的上清液和細胞,并提取rna用于hcv-特異性負鏈rna的rt-pcr。數(shù)據(jù)代表4個實驗。*:第0天培養(yǎng)上清液在用hcvser感染后的洗滌后1h收獲。(c)將hcvser-1b或hcv(-)對照血清脈沖的d14hadsc離心到細胞離心涂片器載玻片上用于在同一切片上的兔抗人dlk-1抗體(紅色標記,圖b和f),接著小鼠抗ns5抗體(圖d和h;在d中的棕色標記)和蘇木精(藍色標記,c,d,g和h)的三重染色。hcvser感染的dlk-1+hadsc包含ns5a(圖b對比d),而hcv(-)對照血清脈沖的細胞表達dlk-1而無ns5(圖f對比h)。兔igg和小鼠igg1的染色用作陰性對照(分別為圖a和e以及c和g)。結(jié)果代表4個實驗。(d)d14(圖b和c)和d21(圖e和f)hcvser-1b感染的hadsc的透射電子顯微照片。暴露于hcv(-)對照血清的d14和d21細胞顯示于圖a和d。圖b-f中的插圖為黃色正方形或黃色箭頭的放大圖。圖b、c、e和f的插圖中的白色箭頭指示病毒顆粒,圖d的插圖中的白色箭頭指示未感染hadsc的洋蔥形膜結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)代表來自hcvser-1b感染的2個實驗和來自hcvser-2a感染的1個實驗。(e)每7天收集的hcvser-1b感染的hadsc的細胞裂解物(左圖)和上清液(右圖)中的病毒5’-utr的qrt-pcr。數(shù)據(jù)表示為3個實驗的平均值±sd。(f)在連續(xù)培養(yǎng)1-4周的hcvser-1b感染hadsc的上清液中定量病毒5’-utr拷貝數(shù)(通過qrt-pcr)。數(shù)據(jù)表示為4個實驗的平均值±sd。

            圖3:hcvser感染對細胞為非供體特異性的且對于病毒為跨越基因型的,并且通過除mir-122外的各種宿主因子介導(dǎo)。(a)將“供體1”的p-2hadsc用hcvser-1b感染,并將21天的上清液(標記為“hcvadsc(1)”)過濾通過0.22-μm孔濾器和用于感染“供體2”的p-3hadsc,其21天的上清液(標記為“hcvadsc(2))用于感染“供體3”的p-6hadsc。21天的上清液的病毒拷貝數(shù)通過qrt-pcr定量。數(shù)據(jù)表示為各批次的感染hadsc的一式三份的平均值±sd。(b)p2、p6、p9和p15的hadsc由hcvser-1b感染,并將21天的上清液(左)和細胞裂解物(右)中的病毒轉(zhuǎn)錄物通過qrt-pcr確定。數(shù)據(jù)表示為3個獨立實驗的平均值±sd。(c)p0、p2、p6、p9和p15hadsc的dlk-1表達的rt-pcr。所有批次的細胞來自同一供體。n:作為陰性對照的無反轉(zhuǎn)錄酶。數(shù)據(jù)代表利用來自3個不同供體的細胞的實驗。(d)p5的hadsc用混合的基因型2a+2b的hcvser感染并連續(xù)培養(yǎng)。在d21和d56天,將細胞收集用于rt-pcr以檢測編碼基因型特異性核心抗原的mrna(對于基因型2a為174bp,左,和對于基因型2b為123bp,右)。n:hcv(-)對照血清脈沖的d21細胞,作為陰性對照。p:hcv(+)血清本身作為陽性對照(混合的基因型2a+2b)。m:標記物。數(shù)據(jù)代表利用來自兩個hcvser基因型2a+2b感染供體的血清的實驗。(e)p0、p2和p6hadsc的cd81、ldl-r、sr-b1和egfr的表面表達的流式細胞術(shù)。黑線:同種型對照ab。紅線:抗cd81,-ldl-r,-sr-b1或-egfrab。數(shù)據(jù)代表各代細胞的3個實驗。(f)p0、p2和p6hadsc的閉合蛋白(ocln)、緊蛋白-1(cldn1)、npc1l1和mir-122的表達的rt-pcr(左圖)。數(shù)據(jù)代表來自3個供體的hadsc。n:作為陰性對照的無反轉(zhuǎn)錄酶。p:分離自hcv(-)個體的原代人肝細胞,作為陽性對照。與huh7.5或hcv(-)原代人肝細胞(phh,右圖)相比較,也通過qrt-pcr在p0、p2、p6hadsc中確定mir-122表達。數(shù)據(jù)表示為分別使用來自3個不同供體的hadsc和phh的以平均值±sd計的相對于p0hadsc的表達水平。(g)將p2hadsc用所示濃度的封閉單克隆抗cd81(克隆js-81)、抗ldl-r(克隆c7)、抗egfrab(克隆la1)或多克隆抗sr-b1ab預(yù)處理1h,然后用hcvser-1b脈沖。對于封閉apo-e,將指示濃度的抗apoe抗體(克隆e6d10)添加至hcvser,隨后將其用于和hadsc進行3-小時孵育。定量確定21天的上清液的病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物。同種型:用同種型對照抗體(100μg/ml)處理。數(shù)據(jù)表示為3個實驗的抑制分數(shù)平均值±sd(與用同種型ab的處理相對比)。還通過錐蟲藍評估每次處理后的細胞成活力。(h)p2hadsc用對ocln、cldn1、npc1l1或dgat-1有特異性的sirna轉(zhuǎn)染。將用亂序rna轉(zhuǎn)染用作對照。轉(zhuǎn)染后48小時,洗滌細胞和通過hcvser-1b感染,并定量確定21天的上清液中的病毒5’-utr拷貝。在同一個實驗中進行ocln和cldn1的敲減,而在分開的實驗中進行npc1l1或dgat-1的敲減。每次轉(zhuǎn)染后通過錐蟲藍排除測定法測定細胞成活力,與通過亂序sirna的轉(zhuǎn)染相比,其未明顯改變。數(shù)據(jù)表示為3個獨立實驗的平均值±sd。(i)通過hcvser-1b感染附著的p4-p5hadsc,和連續(xù)21天在培養(yǎng)中添加分級劑量的利巴韋林、特拉匹韋和環(huán)孢菌素a。還將hadsc與分級濃度的ifnα一起孵育16h,然后暴露于hcvser-1b。每次處理后通過錐蟲藍評估細胞成活力。數(shù)據(jù)表示為3個獨立實驗的平均值±sd。

            圖4:hcvadsc在物理性質(zhì)上不同于jfh1/hcvcc和對原代人肝細胞具有感染性。(a)hcvadsc(基因型2a)自21天的hcvser-2a感染的hadsc上清液收獲,和通過在10-40%碘克沙醇中平衡離心進行密度梯度測定法。還平行進行hcvser(基因型2a)和jfh1/hcvcc的密度梯度測定法用于對比。數(shù)據(jù)代表5個實驗。(b)當(dāng)以重量(ng)/病毒拷貝表示時,hcvcc級分13具有最低量的hdl和ldl/vldl。數(shù)據(jù)代表3個供體的hcvser和它們的相應(yīng)hcvadsc。(c)apoe和b的測量證明,hcvser的主要級分具有最高的apoe含量,接著是hcvadsc,而hcvcc級分13幾乎沒有可檢測的apoe(左圖)。相比之下,apob僅在hcvser級分2中被檢出(右圖)。數(shù)據(jù)是使用hcvser(基因型2a)和其相應(yīng)hcvadsc的一個實驗(即,hcvadsc通過hcvser-感染的hadsc產(chǎn)生),和代表3個hcvser供體。(d)將在6-cm培養(yǎng)皿中的p2hadsc暴露于hcvser(基因型2a)或hcvcc。將感染的hadsc連續(xù)培養(yǎng)14或21天(無培養(yǎng)基更換),和在培養(yǎng)結(jié)束時通過qrt-pcr定量確定在上清液(左圖)和細胞裂解物(右圖)中的5’-utr拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,在hadsc中hcvcc未有效地感染/復(fù)制。數(shù)據(jù)表示為3個實驗的平均值±sd。(e)在hcvcc-感染的或未感染的huh7.5培養(yǎng)物的上清液中以及在hcvcc-或hcvser-感染的hadsc的21天的上清液中病毒5’-utr的rt-pcr。數(shù)據(jù)代表3個實驗。(f)將自hcv(-)患者分離的phh放置3天以允許附著,然后暴露于自被hcvser-1b或hcvser-2b感染的hadsc收集的21天的上清液中3h,或被對照血清脈沖。感染后5天,提取細胞rna用于5’-utr的rt-pcr。hcvser-1b本身用作陽性對照。數(shù)據(jù)代表3個實驗。(g)將自3個hcv(-)供體(供體1、2和3)分離的1x104/孔的phh置于6-孔板中3天以允許細胞附著,在第4天通過hcvser-1b的3個不同批次(自3個單獨的供體收集)之一分別感染phh。使用hcvser-1b以產(chǎn)生相應(yīng)的hcvadsc,其也用于平行感染phh。hcvser和其相應(yīng)hcvadsc成對感染同一批次的phh。感染后5天,收集phh上清液和定量確定5’-utr拷貝。將phh暴露于hcv(-)對照血清(亦來自3個不同的供體)用作陰性對照。數(shù)據(jù)表示為每次感染的一式三份的平均值±sd。

            圖5:通過離心分離人脂肪組織的勻漿物成不同層。按所述9,hcv(+)個體的脂肪組織經(jīng)離心并分成以下的層:漂浮物、緩沖液和細胞沉淀(左圖)。漂浮群體含有成熟的脂肪細胞。收集細胞沉淀,和用rbc裂解緩沖液處理以裂解紅細胞,收獲基質(zhì)血管級分(svf)細胞,和將svf細胞進行dlk-1+人脂肪形成的干細胞(hadsc)的免疫選擇,所述干細胞可被認為是原代(第0代)hadsc。

            圖6:所選級分的純度和針對dlk-1的rt-pcr。(a)通過使用mofloxdp流式細胞儀(bectoncoulter,ca,usa)測定在dlk-1+(左)和dlk-1-(右)級分中dlk-1+細胞的百分比,和用submit軟件進行分析。使用dlk-1+和dlk-1-級分的99.5%自體熒光的消除設(shè)置門控,以測定在各級分中陽性染色的細胞。使用與同種型對照抗體(兔igg)一起孵育的未分級分離的svf細胞,獲得類似的結(jié)果。數(shù)據(jù)代表6個實驗。(b)自未分級分離的svf細胞提取rna,選擇dlk-1-和dlk-1+細胞10和進行針對dlk-1的rt-pcr(引物按所述11)。相比于在dlk-1+細胞中的豐富表達,dlk-1-細胞幾乎不表達dlk-1mrna。數(shù)據(jù)代表4個實驗。

            圖7:hcv-感染的原代人肝細胞(phh)表達ns5抗原。自hcv(-)或hcv(+)供體(分別為圖a和b以及c和d)收獲phh并接種到膠原-i包被的孔中用于培養(yǎng)。作為對照實驗,我們檢測了ns5染色對新鮮分離自hcv(+)或hcv(-)供體和在無精氨酸williamse培養(yǎng)基(invitrogen,ca,usa)中培養(yǎng)的原代人肝細胞(phh;接種數(shù)1x104細胞/孔)的特異性。在第9天,洗滌細胞和使用與所述用于在細胞離心涂片器載玻片上染色細胞的類似方法(參見“方法”),在孔中進行免疫細胞化學(xué)。數(shù)據(jù)代表使用來自3個hcv(+)和3個hcv(-)供體的phh的3個實驗。

            注意:在過去在感染的肝組織中難以檢出hcv抗原。然而,染色分離的細胞未顯示與對肝組織染色一樣那么非特異性,只要適當(dāng)控制顯色時間(參見“方法”)。

            圖8:在hcv-感染的個體的脂肪組織中dlk-1+細胞共表達hcvns5抗原。自hcv-感染的個體收獲脂肪組織(表1),和按方法中所述,用抗dlk-1ab(紅色標記,白色箭頭,圖a和b),接著用抗ns5ab(棕色標記,白色箭頭,圖c和d)和蘇木精(在圖c和d中藍色標記)對同一切片進行免疫染色。在檢查的hcv(+)脂肪組織的所有切片中,在高倍視場(400x)中能檢出約0-4個dlk-1+ns5+細胞。圖a和c來自供體2和圖b和d來自供體3。用同種型對照抗體染色的圖片類似于在圖1e中顯示的那些。

            圖9:感染懸浮hadsc的方案。自hcv(-)個體制備hadsc,和按所述12,13進行傳代培養(yǎng)。以0.2moi將第2-6代hadsc暴露于hcvser(表2)(1x105hcv5’-utr拷貝數(shù)對比5x105hadsc細胞),通過用新鮮培養(yǎng)基稀釋hcv(+)血清進行調(diào)整。在3h后,用pbs洗滌細胞5次,之后在6-ml新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第7、14、21和28天收獲上清液和細胞裂解物,提取rna用于5’-utr的rt-pcr。

            圖10:用hcvser感染附著在塑料上的hadsc。將hadsc置于6-cm培養(yǎng)皿中1天以允許細胞附著。之后以2ml培養(yǎng)基的終體積添加hcvser以以0.5moi孵育細胞3h(1x1055’-utr拷貝對比2x105hadsc細胞)。在溫和洗滌后,在有或沒有每7天更換培養(yǎng)基的情況下(分別為途徑a或b),將hcvser-感染的hadsc在5ml新鮮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

            圖11:p2和p6hadsc的病毒復(fù)制效率優(yōu)于p9和p15細胞的病毒復(fù)制效率。將不同代的hadsc懸浮暴露于hcvser-1a或-2a。感染后,21天的上清液和細胞裂解物(連續(xù)培養(yǎng))的病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物通過qrt-pcr測定。結(jié)果顯示,與p2和p6細胞相對比,在細胞裂解物和上清液中p9和p15的細胞具有明顯更少的病毒拷貝。數(shù)據(jù)表示為3個實驗的平均值±sd。

            圖12:cd81、ldlr、sr-b1和egfr的阻斷以及apoe的中和減少在21天的hcvser-感染的hadsc培養(yǎng)物的細胞裂解物中的病毒拷貝。p-2hadsc用分級劑量的針對cd81(克隆js-81)、ldl-r(克隆c7)、egfr(克隆la1)的單克隆ab或針對sr-b1的多克隆ab預(yù)處理1h,然后在用hcvser-1b脈沖之前洗滌。對于apoe阻斷,按所述14在室溫下將各種濃度的抗apoe抗體(克隆e6d10)添加至hcv(+)血清1h,然后用于與hadsc一起孵育3h。與上清液中的測量(圖3g)一致,在hcv(+)血清中hadsc的cd81、ldl-r、sr-b1、egfr的阻斷和apoe的中和以劑量依賴方式顯著降低在細胞裂解物中的病毒轉(zhuǎn)錄物的量。同時,抗體本身的處理未顯著影響hadsc成活力。數(shù)據(jù)表示為每次處理的一式三份的平均值±sd。

            圖13:sirna轉(zhuǎn)染后的rt-pcr和在敲減閉合蛋白(ocln)、緊蛋白-1(cldn1)、npc1l1或dgat-1后在21天的細胞裂解物中的病毒拷貝數(shù)。(a)按所述15,16進行閉合蛋白、緊蛋白-1或npcll1的敲減,和按所述16,17進行rt-pcr。在同一實驗中進行ocln和cldn1的敲減,而在分開的實驗中進行npcll1的敲減。數(shù)據(jù)代表3個實驗。(b)dgat1的sirna探針是來自ambion的預(yù)設(shè)計的sirna(目錄號11782和11784)。按所述18進行亂序rna和對dgat1有特異性的sirna的轉(zhuǎn)染、qrt-pcr和蛋白質(zhì)印跡分析。數(shù)據(jù)表示為4個實驗的平均值±sd,并表示為標準化至18srrna的相對比率。(c)在敲減之后,將hadsc暴露于hcvser-1b,和通過qrt-pcr測定21天的細胞裂解物的5’-utr拷貝數(shù)。與用亂序sirna的轉(zhuǎn)染相比,sirna轉(zhuǎn)染本身未明顯影響細胞成活力,其在轉(zhuǎn)染后48h通過錐蟲藍排除試驗測定。顯然,在上清液中dgat1敲減具有比在細胞中更突出的抑制作用(圖c對比圖3h)。這與以下發(fā)現(xiàn)一致:dgat1敲減損害細胞內(nèi)復(fù)制和釋放兩者,但病毒釋放似乎更顯著受到影響19。數(shù)據(jù)表示為4個實驗的平均值±sd,表示為與亂序?qū)φ崭腥镜南鄬Ρ嚷省?/p>

            圖14:hadsc中親環(huán)蛋白a表達的rt-pcr。按所述20在p0-p6hadsc中進行親環(huán)蛋白a(cypa)的rt-pcr。幼稚huh7.5細胞用作陽性對照。數(shù)據(jù)代表4個實驗。

            圖15:hcvser、jfh1/hcvcc和hcvadsc的主要級分(通過密度梯度)的總脂質(zhì)含量。通過hdl和ldl/vldl膽固醇測定試劑盒(abcam)檢測hdl和ldl/vldl的水平。按照制造商的說明書,通過elisa人apob免疫測定試劑盒和elisa人apoe免疫測定試劑盒(r&d)測量apob和apoe的量。還將不同級分的hdl和ldl/vldl、apob和apoe的量標準化至重量/拷貝。(a)hcvser(特別是級分2)具有比hcvcc或hcvadsc更高的hdl和ldl/vldl“總”量。(b)和(c)另外2個批次的hcvser和hcvadsc的分析表明相同模式的脂質(zhì)和apoe/b含量。

            圖16:jfh1/hcvcc有效感染huh7.5。將4x105huh7.5細胞/孔置于6-孔板中過夜。1天后,將細胞洗滌并與hcvcc病毒接種物(0.5moi)一起孵育3h。洗滌后,將細胞在補充有10%胎牛血清(fbs)和1%非必需氨基酸的dmem中培養(yǎng)。在感染后第3天,收獲上清液和提取rna用于5’-utr轉(zhuǎn)錄物的qrt-pcr。將未暴露于病毒接種物的幼稚huh7.5細胞用作陰性對照。數(shù)據(jù)表示為3個實驗的平均值±sd。本實驗驗證用于感染hadsc的hcvcc接種物的感染性(圖4d)。

            本發(fā)明實施方案的詳細描述

            參照用于說明的示例性應(yīng)用,下文描述了本發(fā)明的幾個方面。應(yīng)理解,陳述了許多具體的細節(jié)、關(guān)系和方法以提供對本發(fā)明的充分理解。然而,相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地認識到,本發(fā)明可在沒有一個或多個特定細節(jié)的情況下或與其它方法一起實施。本發(fā)明不受行為或事件的順序限制,因為一些行為可以不同的順序發(fā)生和/或與其它行為或事件同時發(fā)生。此外,并非需要所有例舉的行為或事件以實現(xiàn)本發(fā)明的方法。

            定義

            除非另有定義,否則本文所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語以及命名法具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。一般而言,細胞培養(yǎng)、感染、分子生物學(xué)方法等的程序是本領(lǐng)域使用的常見方法。這樣的標準技術(shù)可見于參考手冊例如sambrook等(1989,molecularcloning-alaboratorymanual,coldspringharborlaboratories)和ausubel等(1994,currentprotocolsinmolecularbiology,wiley,newyork)。

            如本文所用的單數(shù)形式″一個″、″一種″和″所述″意欲也包括復(fù)數(shù)形式,除非上下文清楚另外指明。此外,在術(shù)語″包括″、″包含″、″具有″、″有″、″含有″或其變體用于詳細描述和/或權(quán)利要求的情況下,這樣的術(shù)語意欲以類似于術(shù)語″包含(comprising)″的方式包括在內(nèi)。

            如本文所用的術(shù)語“約”當(dāng)涉及可測量的值例如量、短暫持續(xù)時間等時,意指包括與指定值的±20%或±10%的變化,更優(yōu)選±5%,甚至更優(yōu)選±1%和還更優(yōu)選±0.1%的變化,因為這樣的變化適合進行所公開的方法。

            如本文所用的術(shù)語“脂肪組織”定義具有初級代謝重要性的彌散器官,其由白色脂肪、黃色脂肪或褐色脂肪構(gòu)成。脂肪組織具有脂肪細胞和基質(zhì)。脂肪組織存在于整個動物身體。例如,在哺乳動物中,脂肪組織存在于網(wǎng)膜、骨髓、皮下空間和包圍大部分器官。

            如本文所用的術(shù)語“干細胞”定義成體未分化細胞,其可產(chǎn)生自身和進一步分化的后代細胞。

            術(shù)語″人脂肪衍生的干細胞″、″hadsc″、″人脂肪衍生的dlk-1+干細胞″和″人脂肪形成的dlk-1+細胞″可互換使用,如本文所用,是人成體干細胞,其是或具有獲自含脂肪組織的組織來源的親本細胞。這些細胞表達特定的標記物dlk-1(即pref-1)——表皮生長因子樣家族的一個成員21,對于脂肪形成是關(guān)鍵的,并且所述表達在成熟脂肪細胞中被完全廢除22-24。

            如本文所用的術(shù)語“原代細胞”是指直接源自個體的細胞或組織的細胞。如本文所用的“傳代細胞”是指從原代細胞再次培養(yǎng)的細胞。如本文所用的“傳代數(shù)”是指細胞從原代細胞再次培養(yǎng)的次數(shù)。例如第1代細胞(p1細胞)是指通過直接再次培養(yǎng)原代細胞獲得的細胞,和第2代細胞(p2細胞)是指通過直接再次培養(yǎng)第1代細胞獲得的細胞,等等。

            如本文所用的術(shù)語″培養(yǎng)″、″培育″、″生長″、″增殖″和″繁殖″可互換使用,是指細胞在配制的培養(yǎng)基中體外生長。如本文所用的術(shù)語″培養(yǎng)系統(tǒng)″、″培育系統(tǒng)″、″增殖系統(tǒng)″和″繁殖系統(tǒng)″可互換使用,是指包括生成病毒顆粒的細胞的細胞培養(yǎng)物。具體而言,本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)中生成hcv的hadsc。所述系統(tǒng)支持hcv的完全復(fù)制(例如附著、進入細胞、復(fù)制、成熟等),包括產(chǎn)生有感染性的病毒,特別是病毒進入、包括(-)和(+)鏈合成的復(fù)制、病毒蛋白合成、病毒裝配、病毒運輸或病毒釋放。

            如本文所用的術(shù)語″樣品″或″生物樣品″意指自受試者分離的或自體外培養(yǎng)物分離的生物材料。生物樣品可包含適于檢測受試者或體外細胞培養(yǎng)物中的核酸、多肽或生物、生理或病理過程的其它標記物的任何生物材料,可包括獲自受試者或體外細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基、體液、組織和細胞和/或非細胞材料。

            如本文所用的術(shù)語″診斷″是指確定疾病或病癥的存在。在本發(fā)明的一些實施方案中,提供用于作出診斷的方法,其允許確定特定的疾病或病癥的存在。

            如本文所用的術(shù)語″患者″、″受試者″、″個體″等可互換使用,是指可適于本文所述方法的任何動物。在某些非限制性實施方案中,所述患者、受試者或個體是人。

            描述

            本發(fā)明涉及hadsc容許被hcv感染這一發(fā)現(xiàn)。

            hadsc

            人脂肪衍生的干細胞是中胚層來源的多能成體干細胞和可容易大量獲得9。這些細胞表達特定的標志物dlk-1(即pref-1)——表皮生長因子樣家族的一個成員21,對于脂肪形成是關(guān)鍵的,并且所述表達在成熟脂肪細胞中被完全廢除22-24。越來越多的證據(jù)表明,人脂肪形成的dlk-1+細胞(hadsc)可分化成多種細胞譜系(關(guān)于綜述,參見參考文獻25,26),這使hadsc成為用于設(shè)計再生療法的有前景的工具。還已報道,各種解剖腔室中的間充質(zhì)干細胞對病毒感染敏感27-32。然而,尚未探究hadsc在病毒疾病中的作用。

            一般而言,hadsc可獲自任何可得的來源。在一個實施方案中,hadsc自合適的組織來源分離。hadsc的合適的組織來源包括但不限于任何包含脂肪的組織,例如褐色或白色脂肪組織,例如皮下白色脂肪組織。通常,人脂肪組織使用手術(shù)切除或吸脂術(shù)從活的供體獲得。在一些實施方案中,脂肪組織從受試者的預(yù)選擇區(qū)域獲得,即腹部、臀部、腹股溝和腹膜,或其任何組合。

            在一個實施方案中,hadsc自腹部或臀部皮下脂肪組織分離。在一個實施方案中,hadsc是原代細胞,即直接源自個體的脂肪組織的細胞。在另一個實施方案中,hadsc是經(jīng)傳代的細胞,例如第1-15代細胞,優(yōu)選第1-6代細胞。

            分離、隔離和擴繁adsc例如hadsc的方法是本領(lǐng)域已知的,和描述于例如美國專利號6,391,2971b1;6,777,231b1;美國專利號5,786,207;美國專利申請公開號2005/0076396a1;burris等(1999)molendocrinol13:410-7;erickson等(2002)biochembiophysrescommun.jan.18,2002290(2):763-9;gronthos等(2001)journalofcellularphysiology,189:54-63;halvorsen等(2001)metabolism50:407-413;halvorsen等(2001)tissueeng.7(6):729-41;harp等(2001)biochembiophysrescommun281:907-912;saladin等(1999)cellgrowth&diff10:43-48;sen等(2001)journalofcellularbiochemistry81:312-319;zhou等(1999)biotechnol.techniques13:513-517;erickson等(2002)biochembiophysrescommun.1月18日,2002;290(2):763-9;gronthos等(2001)journalofcellularphysiology,189:54-63;halvorsen等(2001)metabolism50:407-413;halvorsen等(2001)tissueeng.12月7日,2001(6):729-41;harp等(2001)biochembiophysrescommun281:907-912;saladin等(1999)cellgrowth&diff10:43-48;sen等(2001)journalofcellularbiochemistry81:312-319;zhou等(1999)biotechnol.techniques13:513-517;zuic等(2001)tissueeng.7:211-228;hauner等(1987)j.clin.endocrinol.metabol.64:832-835;katz等(1999)clin.plast.surg.26:587-603。

            僅用于說明的目的,幾種基于形態(tài)學(xué)的、生物化學(xué)的或分子的方法可用于分離所述細胞。在一方面,基于細胞大小和粒度分離hadsc,因為hadsc小并且為顆粒?;蛘?,因為干細胞趨于具有比分化的細胞更長的端粒,因此hadsc可通過測定端粒的長度或通過測定端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性分離。

            或者,hadsc可在免疫組織化學(xué)上通過選擇hadsc-特異性細胞標記物與其它細胞分離。hadsc表達間充質(zhì)干細胞標記物cd10、cd13、cd29、cd34、cd44、cd54、cd71、cd90、cd105、cd106、cd117和stro-1。對于造血譜系標記物cd45、cd14、cd16、cd56、cd61、cd62e、cd104和cd106以及對于內(nèi)皮細胞(ec)標記物cd31、cd144和vonwillebrand因子而言,它們是陰性的(zuk等,molbiolcell13(12):4279-4295,2002;musina等,bullexpbiolmed139(4):504-509,2005;romanov等,bullexpbiolmed140(1):138-143,2005)。在形態(tài)學(xué)上,它們是成纖維細胞樣的,并且在體外擴繁后保持它們的形狀(zuk等,molbiolcell13(12):4279-4295,2002;arrigoni等,celltissueres338(3):401-411,2009;zannettino等,jcellphysiol214(2):413-421,2008)。在多個方面,hadsc通過dlk-1+的免疫選擇分離。

            在另一個實施方案中,hadsc自市售可得的來源或已建立的hadsc系獲得。這樣的hadsc的非限制性實例為例如poieticstm人脂肪衍生的干細胞(目錄號pt-5006,lonzagroupltd.)和pcs-500-011tm。

            細胞培養(yǎng)

            一般而言,hadsc可在本領(lǐng)域可得和眾所周知的培養(yǎng)基中維持和擴繁。這樣的培養(yǎng)基包括但不限于角質(zhì)形成細胞-sfm(k-培養(yǎng)基)、dulbecco′smodifiedeagle′s(dmem)、dmemf12eagle′sminimumessentialf-12kiscove′smodifieddulbecco′srpmi-1640間充質(zhì)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(pcs-500-030tm)和間充質(zhì)干細胞生長試劑盒-低血清(pcs-500-040tm)。

            本發(fā)明還考慮用哺乳動物血清補充細胞培養(yǎng)基,優(yōu)選胎牛血清。在本發(fā)明的一些實施方案中,這樣的哺乳動物血清濃度范圍為0vol%-20vol%,優(yōu)選5vol%-15vol%,更優(yōu)選10vol%。血清的實例包括胎牛血清(fbs)、牛血清(bs)、小牛血清(cs)、胎牛血清(fcs)、新生牛血清(ncs)、山羊血清(gs)、馬血清(hs)、人血清、小雞血清、豬血清、綿羊血清、兔血清、血清代替品和牛胚胎液。

            其它補充物例如生長因子、激素、氨基酸、脂質(zhì)、礦物質(zhì)等也可有利地使用以供給細胞最佳生長和擴繁所必需的痕量元素。這樣的補充物是市售可得的。確定這些補充物的合適濃度完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。

            hcv

            本發(fā)明的hcv可以是可感染hadsc的任何hcv或可自hcv感染的個體分離的任何hcv。在一個實施方案中,hcv是選自以下的hcv基因型的至少一種:基因型1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a,或其任何組合。在另一個實施方案中,hcv是選自以下的hcv基因型的至少一種:基因型1a、1b、2a、2b和混合的2a+2b。

            在一方面,本發(fā)明包括用于增殖hcv的基于hadsc的系統(tǒng),其包括hadsc。在另一方面,本發(fā)明包括以下方法:將hadsc或本發(fā)明的hcv培養(yǎng)系統(tǒng)用于增殖hcv、或進行hcv生命周期分析、或診斷hcv感染、或篩選抗病毒化合物、或表征被hcv感染的受試者的hcv。

            hcv的水平可通過本領(lǐng)域任何已知的技術(shù)來確定。這樣的技術(shù)可包括抗hcvelisa測定法(酶聯(lián)免疫吸附測定法),其檢測hcv蛋白??墒褂猛ㄟ^擴增所測定的rna來檢測hcv復(fù)制(例如聚合酶鏈反應(yīng)或pcr,分支dna測定法)。hcv的rna的合成實際上可通過在單一步驟中使用經(jīng)設(shè)計用于實時pcr的裝置的rt-pcr或通過在濾器上使用hcv-特異性放射性探針的rna雜交來分析。例如,可將分離的rna進行使用能夠擴增hcv基因組的特異性寡核苷酸引物的偶聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄和擴增,例如逆轉(zhuǎn)錄和通過聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)的擴增。然后,可進行直接測序以確定已經(jīng)感染所述受試者的hcv的基因型。

            在各種實施方案中,hcv的水平通過測量hcv滴度、hcv核酸的水平或hcv多肽的水平來確定。

            在各種實施方案中,在候選化合物存在時觀察到的hcv水平相對于在候選化合物不存在時觀察到的hcv水平降低,表示候選化合物的抑制活性。

            根據(jù)本發(fā)明,候選化合物包括而不限于化合物、蛋白、肽、肽模擬物、抗體、核酸、反義核酸、shrna、核酶和小分子化合物。

            如本文所公開,使用篩選方法鑒定的抗hcv化合物可進一步在敏感性動物模型中進行測試。

            試劑盒

            在一個相關(guān)方面,本發(fā)明還提供用于增殖hcv,或進行hcv生命周期分析,或診斷hcv感染,或篩選抗病毒化合物,或表征被hcv感染的受試者的hcv的試劑盒,其包括本文所述的hadsc和適于培養(yǎng)hadsc的培養(yǎng)基。

            本發(fā)明進一步通過以下實施例進行說明。這些實施例僅意欲說明本發(fā)明,而不是限制本發(fā)明的范圍。對于以下實施例中的實驗方法,它們在常規(guī)條件例如由sambrook等在moleculeclone:alaboratorymanual,newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989中描述的那些下或按制造商所指示那樣進行,除非另有說明。

            實施例

            材料和方法

            臨床樣品

            所有臨床脂肪組織和肝樣品在機構(gòu)研究委員會的批準下獲自kaohsiungmedicaluniversityhospital(kmuh-irb-960477、kmuh-irb-960343和kmuh-irb-20120404)。在該程序之前,書面的知情同意書獲自所有供體。

            新鮮脂肪組織的分級分離和dlk-1+細胞的培養(yǎng)

            hcv(+)脂肪組織獲自用于切除肝細胞癌的外科創(chuàng)傷(剖腹術(shù))。對于hcv(-)脂肪組織,如之前所述13,樣品獲自已在乳腺癌的乳房切除之后立即接受乳房再造術(shù)的女性的橫向腹直肌肌皮瓣。hcv(-)脂肪組織還獲自正接受吸脂術(shù)的肥胖人(表1)。無一患者已經(jīng)接受輔助化學(xué)療法或放射療法以在手術(shù)前治療乳腺癌。

            樣品收獲后,組織用無菌生理鹽水洗滌和將樣本置于無菌袋中并立即送出用于制備。如所述12,13,33,將新鮮脂肪組織固定用于免疫組織化學(xué)或通過離心(800g,10min)用于分級分離成在頂部的漂浮層(漂浮物)(其含有成熟的脂肪細胞和結(jié)締組織)、在中間的緩沖液層和在底部的沉降的細胞沉淀。簡言之,用剪刀將脂肪組織充分切碎成小塊,和用不含鈣和鎂的pbs洗滌,隨后通過在37℃在pbs中持續(xù)攪拌30min用0.075%膠原酶(37.5mg/ml;sigma-aldrich)消化。

            如所述12,34收集在底層的細胞沉淀(即svf細胞)和用rbc裂解溶液處理(以裂解紅細胞),和隨后通過100-μmsteriflip(millipore)濾器過濾。在用錐蟲藍染色后,svf細胞的數(shù)量和成活力使用countesscell計數(shù)器(invitrogen)確定。然后如所述10通過免疫磁珠,將svf細胞進行針對dlk-1+細胞的陽性選擇,提取細胞rna用于rt-pcr或qrt-pcr。還將dlk-1+細胞進行免疫細胞化學(xué)(針對病毒ns5抗原)。

            對于所有樣品,從脂肪取樣至細胞分離的間隔時間是3h或更少。對于培養(yǎng)dlk-1+細胞,按所述13將1x105個細胞置于6-cm培養(yǎng)皿中49天,每7天收獲上清液(與培養(yǎng)基更換同步)用于rna提取。

            dlk-1+細胞的免疫選擇

            將自hcv-感染的或未感染的個體制備的rbc-裂解的未分級分離svf細胞與多克隆兔抗dlk1抗體(abcam,usa)在4℃一起孵育30分鐘。按所述10,將細胞在含有0.8mmol/lmgcl2、20mmol/lhepes、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的hbss中洗滌兩次,和與磁性微珠結(jié)合的山羊抗兔igg(miltenyibiotecinc,auburn,ca)在4℃一起孵育30分鐘。將細胞懸浮液洗滌,并通過在midimacsseparator(miltenyibiotec)中的柱,結(jié)果dlk-1+細胞保留在柱中,而dlk-1-細胞通過柱。將兩種細胞級分在hbss中洗滌兩次。dlk-1+和dlk-1-級分的細胞成活力分別為>96%和>97%。提取rna用于rt-pcr或qrt-pcr。在單獨實驗中,將細胞固定至細胞離心涂片器載玻片上用于免疫細胞化學(xué)(5-7×103個細胞/載片)。在體外感染的實驗中,在暴露于hcv(+)血清(hcvser)之后,培養(yǎng)并傳代(再次培養(yǎng),按所述13)dlk-1+細胞指定的時間周期。然后提取rna用于病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物的rt-pcr或qrt-pcr。

            用hcvser的hadsc感染

            在本研究中采用兩種方案:

            (1)方案1,懸浮感染-我們使用第2代(p-2)至第6代的幼稚hadsc用于hcvser感染。以0.2的感染復(fù)數(shù)(moi),在eppendorf管中,添加總計200μl的hcv血清(含1x1055’-utr拷貝)至懸浮在800μl新鮮培養(yǎng)基中的5x105個hadsc,隨后在37℃孵育3小時。用pbs洗滌細胞3次和進一步培養(yǎng)7、14、21和28天,收獲上清液和細胞裂解物中的rna用于5’-utr的rt-pcr。還收集細胞用于免疫細胞化學(xué)和透射電子顯微術(shù)(tem)研究。

            (2)方案2,附著形式的感染-將p-2至p-6幼稚hadsc接板于6-cm培養(yǎng)皿中1天以允許細胞附著,在0.5moi(1x1055’-utr拷貝對比2x105hadsc細胞),以終體積2-ml培養(yǎng)基添加hcvset達3h。在溫和洗滌后,在有或沒有每7天更換培養(yǎng)基的情況下,將細胞在5ml新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

            5’-utr的rt-pcr和定量rt-pcr

            viralrnaminikit(qiagen,basle,switzerland),從140μlhcv(+)血清或hcvser-感染的hadsc培養(yǎng)物的上清液提取rna。按照制造商的說明書,使用rnaminikit(ambion,carlsbad,ca,usa)分離來自細胞裂解物的rna。然后用高容量cdna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna轉(zhuǎn)換成單鏈cdna,接著用gotaqmastermix(promega,wi,usa)進行pcr。對于定量病毒拷貝,使用appliedviiatm7real-timepcrsystem,用丙肝病毒高級試劑盒(primerdesignltd.,uk)進行pcr。hcv-特異性逆轉(zhuǎn)錄和擴增引物按照abiprimer3.0expresssoftword進行設(shè)計。引物5′-actcgcaagcaccctatcag-3′用于逆轉(zhuǎn)錄,用于pcr和實時pcr的引物與不同hcv基因型的高度保守的5’-非翻譯區(qū)(utr)匹配,如所述35。

            人脂肪組織的免疫組織化學(xué)(ihc)

            從外科創(chuàng)傷收獲新鮮脂肪組織,在福爾馬林中固定和在石蠟中包埋。將組織切成5μm切片和脫石蠟,然后浸入檸檬酸鹽緩沖液(10mm檸檬酸ph6.0)中和通過微波加熱用于抗原恢復(fù)。在用5%bsa在室溫下封閉30min后,在4℃施用多克隆兔抗dlk1抗體(1∶150;目錄號ab21682,abcam,usa)或兔iggab(1∶150;目錄號ab-105-c,r&d)過夜,接著在室溫下施用堿性磷酸酶綴合的抗兔igg第二抗體(1∶500;jasonimmunoresearch)達1h和隨后用固紅底物系統(tǒng)(sigma-aldrich)顯色。對于連續(xù)ns5染色,將樣品浸入pbs中10min以除去蓋玻片,和在室溫下將載玻片在0.3%h2o2中孵育30min以減少內(nèi)源過氧化物酶的非特異性背景。在用5%bsa在室溫下封閉30min后,在4℃添加小鼠抗ns5抗體(1∶200,克隆bgn/1246/5g7,目錄號0200-0423,abdserotec)或小鼠igg1同種型ab(1∶100,目錄號14-4714,ebioscience)過夜。在我們的經(jīng)驗中,對于脂肪組織的ns5染色而言,細胞浸透程序不是必需的,因為之前樣品已被包埋在石蠟中。然后在室溫下將切片與辣根過氧化物酶聚合物quanto試劑(抗小鼠,即用型;thermoscientific)一起孵育7min和用ultravisionquantodetectionsystem(含dab顯色底物;thermoscientific)顯色。之后,切片用蘇木精染色和放回蓋玻片,其導(dǎo)致細胞輪廓的輕微改變(如圖1e所示)。dlk1和ns5a染色的電子圖片通過高質(zhì)量顯微鏡(zeiss)、快速計算機硬件和高分辨率顯示屏以及tissuefaxs掃描軟件(tissuegnostics)捕獲。隨后選擇圖片中的相同視場和將其可視化用于共定位的對比和分析。

            在脂肪組織(圖1e)中,顯色所需的最佳時間在不同供體的組織間顯著不同(即供體和供體之間變化),不管hcv感染狀態(tài)如何。我們已改進所述方法多次,發(fā)現(xiàn)顯色時間是關(guān)鍵的。我們遵循的原理是,首先確定顯色的最大時間,對于同種型ab染色(兔igg或小鼠igg1)這得到最少的顏色信號;然后采用該時間用于抗dlk-1ab或抗ns5ab染色的顯色。這將確保幾乎沒有底物過度顯色引起的假陽性,和獲得同種型ab染色的低背景。

            在我們對hcv(+)供體1(表1)的脂肪組織的研究中,在顯著顏色信號出現(xiàn)之前,兔igg染色的顯色的最大時間是40-50秒,因此設(shè)置dlk-1染色的顯色為40-50秒。類似地,沒有明顯顏色信號的小鼠igg1染色的顯色的最大時間短至15秒,這被設(shè)置為抗ns5ab染色的顯色時間。相比之下,在供體2和供體3的脂肪組織上,兔igg染色的最佳顯色時間是30秒和小鼠igg1染色的最佳顯色時間為僅10秒,因此這些時間分別設(shè)置用于抗dlk-1和抗ns5ab染色的顯色。當(dāng)染色hcv(-)樣品時遵循類似的原理。

            免疫細胞化學(xué)(icc)

            對于未分級分離的svf細胞或dlk-1+hadsc或dlk-1-細胞的免疫細胞化學(xué),遵循與ihc類似的原理,和如上所述在每個對照實驗中預(yù)確定最佳顯色時間。在指定的時間點收集細胞和通過細胞離心涂片器附著至聚賴氨酸包被的玻璃載玻片上,隨后用4%福爾馬林固定20分鐘。對于dlk-1染色,在37℃通過0.05%胰蛋白酶溶液處理30min對細胞進行抗原恢復(fù),然后通過ddw漂洗3次。在用ultravblock緩沖液(在ultravisionquantodetectionsystem中的試劑,thermo,usa)封閉5min后,在4℃將細胞與兔抗dlk1抗體或兔igg一起孵育過夜,接著在室溫下與堿性磷酸酶綴合的抗兔igg第二抗體一起孵育1h和用固紅底物系統(tǒng)(sigma-aldrich)顯色5-6min(在大多數(shù)情況下)。對于hcv-特異性ns5(其在相同載玻片上進行染色,如圖2c所示)的單次或連續(xù)染色,將載玻片置于pbs中10min以除去蓋玻片和洗出封固介質(zhì),將細胞用含0.3%tritox-100和1%bsa的pbs滲透和封閉30min,然后應(yīng)用ultravisionquantodetectionsystem(thermoscientific,fremont,ca,usa)。然后將細胞在hydrogenperoxideblock(abcam,ma,usa)中孵育10分鐘以降低由于內(nèi)源過氧化物酶引起的非特異性背景染色。在洗滌后,將細胞用ultravblock(thermoscientific,ma,usa)孵育5分鐘以封閉非特異性背景染色,在4℃與含小鼠單克隆抗ns5抗體的稀釋緩沖液孵育過夜。將用小鼠igg1進行的染色用作陰性對照。下一天,將細胞與第一抗體amplifierquanto溶液一起孵育10分鐘,和與hrppolymerquanto一起孵育另外10分鐘,在每次試劑施用之間通過pbs洗滌。最終,將30μldabquanto色原添加至1mldabquanto底物,通過渦旋混合,并施用至細胞2-3分鐘(在大多數(shù)情況下)用于顯色。在洗滌后,用永久封固介質(zhì)固定載玻片,通過蓋玻片覆蓋,和使用tissuefaxs顯微術(shù)(zeiss)可視化和照相。

            血清hcv-感染的hadsc的透射電子顯微術(shù)

            對于tem研究,按所述36收集和制備hadsc,和通過透射電子顯微鏡(jem2000exii;jeol,tokyo,japan)檢查。

            編碼hcv2a和2b的核心抗原的mrna的rt-pcr

            按制造商的說明書,使用rnaminikit(ambion,carlsbad,ca,usa)分離hadsc的rna。用高容量cdna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(appliedbiosystems)將rna轉(zhuǎn)換成單鏈cdna。用于逆轉(zhuǎn)錄的特異性引物是5′-atgtaccccatgaggtcggc-3′。用于pcr的引物與不同hcv基因型的核心蛋白區(qū)相匹配。含(正向)5′-cgcgcgactaggaagacttc-3′和(反向)5′-cgcgcgacgcgtaaaacttc-3′的引物混合物用于第一次pcr,熱概況如下設(shè)置:94℃2分鐘,接著94℃45秒、55℃45秒和72℃90秒的35個循環(huán),然后72℃7分鐘用于最終延伸。在第二次pcr中用于基因型鑒定的類型特異性反義引物是5′-ccaagagggacgggaacctc-3′(類型2a)和5′-accctcgtttccgtacagag-3′(類型2b),熱概況如下設(shè)置:95℃2分鐘,接著95℃30秒、60℃30秒和72℃30秒的30個循環(huán),然后72℃7分鐘用于最終延伸37,38。

            流式細胞術(shù)和封閉實驗

            不同代的懸浮的0.5-1x105hadsc用小鼠抗人cd81單克隆ab(克隆js-81,bdbiosciences)、抗ldl-rab(克隆c7,millipore)、抗egfrab(克隆la1,millipore)或兔多克隆抗srb1ab(novusbiologicals)在4℃染色1h。各自的對照是小鼠igg1或多克隆兔igg。洗滌后,將細胞進一步與異硫氰酸熒光素(fitc)綴合的第二ab(jacksonimmunoresearchlaboratories,pa,usa)一起孵育和通過cellquantatmsc高分辨率流式細胞儀(beckmancoulterfullerton,ca,usa)分析。為封閉細胞表面分子,在37℃用1ml含指定劑量(1-100μg/ml)的抗體的無血清k-培養(yǎng)基預(yù)處理2x105hadsc(附著在孔中)。將用各自同種型抗體的處理用作對照。在1h后,將未稀釋的hcv(+)血清添加至eppendorf管中,使moi為0.2,以在抗體存在下孵育3h。之后,洗滌細胞和接板于6-cm培養(yǎng)皿中用于連續(xù)培養(yǎng)。對于apoe封閉,按所述14在室溫下添加各種濃度的抗apoe抗體(克隆e6d10)至hcv(+)血清達1h,然后與hadsc一起孵育3h。在21天的持續(xù)培養(yǎng)后收集上清液和細胞,提取rna以定量病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物。在單獨的實驗中,孔中的hadsc用指定劑量的ifnα(sigma-aldrich,mo,usa)在k培養(yǎng)基中一式三份預(yù)處理16h,然后暴露于基因型1a、1b、2a和2b的hcv(+)血清。21天后,在細胞裂解物中的5’-utr轉(zhuǎn)錄物通過qrt-pcr定量測定,結(jié)果計算為與用溶媒(pbs)對照處理的細胞相比的抑制分數(shù)。

            用于mir-122的rt-pcr的rna提取

            按所述39制備用于mir-122的rt-pcr的引物,并進行rt-pcr。細胞的總rna用rna提取試劑rezoltmc&t(protech,taipei,taiwan)分離。為確定mir-122水平,我們使用taqmanmicrornareversetranscriptionas試劑盒(appliedbiosystems)逆轉(zhuǎn)錄所提取的rna,和將cdna用作mir-122的taqmanmicrorna測定法的實時pcr分析的模板。

            合成的sirna和基因沉默

            按所述15,40,41,對閉合蛋白和緊蛋白-1具有特異性的sirna通過dharmacon合成。它們各自的靶序列為uaacauuaggaccuuagaa(緊蛋白-1)和gugaagaguacauggcugc(閉合蛋白)。按所述16制備npc1l1,和按所述19制備dgat-1的sirna。在6-孔細胞板的孔中使用xfect轉(zhuǎn)染試劑(clontech)將特異性sirna轉(zhuǎn)染至hadsc。hcv感染通過與hcvser一起在37℃孵育sirna-轉(zhuǎn)染的細胞3h進行,然后用pbs洗出hcvser。按所述15,19,40,41,在轉(zhuǎn)染后48小時,裂解細胞用于rt-pcr以確定基因沉默的程度。在21天的培養(yǎng)后收獲hcvser-感染的hadsc的細胞裂解物和上清液用于5’-utr的qrt-pcr。

            jfh1/hcvcc和huh7.5細胞

            將huh7.5細胞在含10%熱滅活的胎牛血清(invitrogen)和0.1mm非必需氨基酸(invitrogen)的dmem(invitrogen)中培養(yǎng)。按之前所述42,體外轉(zhuǎn)錄基因組jfh-1rna和通過電穿孔遞送至細胞。然后將轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)移至完全dmem中和每3-4天傳代。在通常的實踐中,來自用全長jfh1cdna轉(zhuǎn)染的細胞的條件培養(yǎng)基通過離心(3,000xg)10分鐘澄清,和在使用前無菌過濾(0.2μm乙酸纖維素,millipore)。對于較長期的貯存,將hcvcc等分和貯存在-80℃。通過添加1/4體積的在pbs中的無菌過濾的40%(w/v)聚乙二醇-8000在4℃過夜孵育來濃縮病毒。按所述43,通過離心(8,000xg,15min)收集病毒沉淀物和重懸浮于pbs中。

            藥物抑制測定法

            抗病毒藥物利巴韋林、環(huán)孢菌素a和ifnα全都來自sigma-aldrich。特拉匹韋來自selleckchemicals,ma,usa。在培養(yǎng)皿中在第0天,將分級劑量的利巴韋林、特拉匹韋或環(huán)孢菌素a添加至hcvser-感染的hadsc的培養(yǎng)基中和培養(yǎng)21天。對于ifnα處理,hadsc用指定劑量的ifnα預(yù)處理16h,然后與hcvser一起孵育。然后定量測定細胞裂解物的病毒5’-utr轉(zhuǎn)錄物和計算為與用溶媒對照處理的細胞相比的抑制分數(shù)。對于利巴韋林和ifnα,溶媒對照為pbs,對于環(huán)孢菌素a和特拉匹韋,溶媒對照為0.1%dmso。

            hcvser、hcvadsc和hcvcc的浮力密度

            按之前所述,hcvcc和hcvadsc的培養(yǎng)基通過peg-8000濃縮。將所有樣品重懸浮于500μl的無血清培養(yǎng)基中和在連續(xù)的碘克沙醇(optiprep,axis-shield,norway)密度梯度上分層,所述梯度為從10%至40%碘克沙醇(各0.5ml),其用含10mmhepes(ph7.55)、150mmnacl和0.02%bsa的溶液制備,如之前所述44。在4℃在sw-41轉(zhuǎn)子(beckmancoulter)中,將梯度在40,000rpm超速離心6小時。超速離心后,從梯度的頂部收集17個級分(各級分含有500u1)。最終,使用viralrnaminikit(qiagen,basle,switzerland)從各級分中分離總rna。將rna用于通過定量rt-pcr的hcvrna檢測。

            apob、apoe和膽固醇的測定

            根據(jù)制造商的說明書,將elisa人載脂蛋白b/apob免疫測定試劑盒和elisa人載脂蛋白e/apoe免疫測定試劑盒(r&dsystems)用于檢測apob和apoe表達。hdl和ldl/vldl的膽固醇通過hdl和ldl/vldl膽固醇測定試劑盒(abcam)檢測。在浮力密度的不同級分中apob、apoe和hdl和ldl/vldl的膽固醇的表達水平針對拷貝進行標準化。

            用hcvser或hcvadsc感染人原代肝細胞(phh)

            新鮮的非腫瘤性肝組織自針對hcv-相關(guān)或非相關(guān)的肝細胞癌手術(shù)切除的肝樣本獲取,和按所述45分離和培養(yǎng)phh。將phh接板于膠原i包被的6-孔板中3天以允許細胞附著至該板上。在第4天,溫和洗滌細胞,和在終體積0.5ml的與hcvser或其相應(yīng)的d21hadsc-增殖的hcv(+)上清液(其含有1x104hcv5’-utr拷貝)混合的無精氨酸williamse培養(yǎng)基(invitrogen,ca,usa)中培養(yǎng)3小時。感染后,洗滌細胞和進一步在1ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng),直到感染后第5天,其中每天更換新鮮培養(yǎng)基。然后將細胞裂解用于rna提取,用于5’-utr的rt-pcr。

            實施例1:hcv體內(nèi)靶向hadsc。

            在臨床上,hcv感染的有意義的特征是hcv(+)患者在慢性感染的肝中可具有過度的脂肪積聚,即肝脂肪變性46,47,肝脂肪變性的嚴重性似乎與肝纖維化的比率相關(guān)48。新近的研究還說明,hcvrna復(fù)制可通過增加飽和脂肪酸的可用性刺激,通過多不飽和脂肪酸或脂肪酸合成的抑制劑抑制49,50。這些發(fā)現(xiàn)表明,在hcv的生命周期中脂肪代謝起重要作用。因此我們猜測,脂肪組織的細胞組分可牽涉到體內(nèi)hcv感染。

            為測試我們的猜測,我們從hcv-感染或未感染的個體(表1)收獲皮下脂肪組織和提取rna用于hcv-特異性5’-utr轉(zhuǎn)錄物的rt-pct,其使用hcvser基因型1b(hcvser-1b)作為陽性對照。

            表1

            a.皮下脂肪組織和肝組織的hcv(+)供體。所有患者接受針對肝細胞癌的外科切除的剖腹術(shù)。從外科創(chuàng)傷(剖腹術(shù))收獲脂肪組織[~(2-2.5cm)3],和從切除的肝臟的非腫瘤性部分(遠離損傷)收獲肝組織?;颊呔幪柵c圖1f中指出的相同。

            注意:患者1-3的樣品用于圖1a-e,和患者1-4的樣品用于圖1f?;颊?的樣品大小比要求的小[~(0.6-1.3cm)3],因此該樣品的分離的附著svf細胞僅用于延長培養(yǎng)實驗(在圖1f中)。

            b.hcv(-)肝組織的供體。患者是hbv-相關(guān)的或非-b非-c的肝細胞癌的受害者并接受了肝切除。

            注意:在表1a和1b中肝炎病毒感染的診斷在診斷肝細胞癌時作出,在組織收獲后給予抗病毒治療。

            引人關(guān)注的是,hcv(+)個體(基因型1b或2a的患者編號1-3,表1)的脂肪組織含有病毒5’-utr(223bp,圖1a),與hcv(-)個體的那些相反。為排除可能的來自血液的污染和確定表達病毒轉(zhuǎn)錄物的細胞來源,我們按所述12,13,33通過離心分級分離脂肪組織成在頂部的含有成熟脂肪細胞的漂浮層(漂浮物)、在中間的緩沖液層和在底部的沉降的細胞沉淀(圖5)。收集細胞沉淀,和進一步用rbc裂解緩沖液處理,以裂解紅細胞,收獲基質(zhì)血管級分(svf)細胞。然后從漂浮物層和rbc-裂解的svf細胞分別提取rna,但幾乎沒有rna能從緩沖液層中提取(數(shù)據(jù)未顯示)。rt-pcr證實,盡管在漂浮物層中無病毒5’-utr檢出,但病毒轉(zhuǎn)錄物在svf細胞中檢出(左圖,圖1b)。

            接下來,我們按所述10通過免疫磁珠從svf細胞陽性選擇dlk-1+細胞,流式細胞術(shù)分析證實>99.7%的陽性選擇的細胞表達dlk-1(圖6)。隨后分別從dlk-1+和dlk-1-細胞提取rna用于rt-pcr,這證實病毒轉(zhuǎn)錄物存在于dlk-1+細胞中,但不存在于dlk-1-細胞中(右圖,圖1b)。我們還對hcv-特異性負鏈rna進行rt-pcr51,使用自hcv(+)原代人肝細胞(phh)提取的rna作為陽性對照。數(shù)據(jù)證實,hcv復(fù)制中間體存在于所有的3個hcv(+)供體的dlk-1+細胞中,但不存在于dlk-1-細胞中(375bp;圖1c)。dlk-1+和dlk-1-細胞還被分別離心到細胞離心涂片器載玻片上,用于用小鼠抗hcvns5抗體(克隆bgn/1246/5g7)和蘇木精(描繪細胞核)的免疫細胞化學(xué)。還染色自hcv(-)個體分離的細胞用于比較。與5’-utr的mrna表達一致,自hcv(+)供體分離的dlk-1+細胞表達ns5抗原(棕色標記,圖c,圖1e),而dlk-1-細胞的ns5表達接近背景,無論hcv感染狀態(tài)如何(圖b和e)。將用同種型抗體(小鼠igg1)染色的未分級分離的hcv(+)或hcv(-)svf細胞用作對照(圖a和d,圖1e)。蘇木精染色(藍色標記)證實,ns5+細胞是真正的有核細胞(圖c,圖1e),而不是細胞碎片??筺s5抗體的特異性在hcv(+)phh的染色中得到證實(圖7)。

            對于體內(nèi)驗證,我們對自hcv-感染和未感染的個體收獲的皮下脂肪組織進行免疫組織化學(xué)。首先用抗dlk-1ab染色組織切片。在用pbs浸漬和洗滌后,用抗ns5ab和蘇木精染色相同的切片。結(jié)果顯示,dlk-1在自hcv-感染和未感染的個體兩者收獲的脂肪組織中在類似于小鼠脂肪組織中描述的位置52中檢出(紅色標記,白色箭頭,分別為圖b和c,和h,圖1e)。此外,ns5+細胞在hcv(+)脂肪組織中可見(棕色標記,白色箭頭,圖e和f,圖1e),但在hcv(-)樣品中不可見(圖j)。值得注意的是,在hcv(+)樣品中病毒ns5與dlk-1表達共定位(圖b對比e和c對比f,圖1e;b和e以及c和g來自單獨的供體;亦見圖8)。在檢查的所有切片中,在hcv(+)脂肪組織的每個高倍放大視場(400x)中,發(fā)現(xiàn)約0-4個dlk-1+ns5+細胞。

            為了確定hcv(+)個體的hadsc是否產(chǎn)生病毒,我們培養(yǎng)自hcv(+)患者分離的dlk-1+細胞和每7天定量上清液中的病毒拷貝數(shù)。引人關(guān)注的是,盡管在前4周很少病毒轉(zhuǎn)錄物被檢出,但d28-d35之后它們變得在上清液中可檢出和拷貝數(shù)呈時間依賴性增加(至d49;圖1f)。此外,在延長培養(yǎng)時病毒轉(zhuǎn)錄物的量似乎與細胞從中分離的各個患者的血清病毒滴度相關(guān)(圖1f和表1)。

            總之,我們的數(shù)據(jù)提供hcv體內(nèi)靶向hadsc的證據(jù)。

            實施例2:幼稚hcv(-)hadsc在體外對hcvser感染和復(fù)制敏感

            為檢查幼稚hcv(-)hadsc在體外是否對hcvser感染和復(fù)制敏感,我們從hcv(-)個體制備hadsc和對其傳代培養(yǎng)。懸浮的第3代(p-3)或p-4細胞(在eppendorf管中)與hcvser(表2)在0.2moi以終體積1ml一起孵育(即1x1055’-utr拷貝數(shù)對比5x105hadsc細胞)。

            表2.用于本研究的hcv(+)血清的hcv基因型和5’-utr拷貝數(shù)。所有患者沒有感染hiv或乙肝病毒的證據(jù)。他們也沒有急性感染性疾病的征兆。從2011年9月至2014年2月收集血清并立即使用或貯存在-80℃直到使用?;颊呔幪?-5的血清用于圖2a-d,和剩余的血清用于圖2e-f、圖3和圖4。

            3h后,洗滌細胞和轉(zhuǎn)移至6-cm培養(yǎng)皿中用于培養(yǎng),每7天更換培養(yǎng)基,和在第7、14、21和28天收獲上清液和細胞裂解物用于rna提取(圖9中的方案)。作為hcvser感染性的對照,將自非腫瘤肝組織(按所述45和表1)分離的hcv(-)phh接板于孔中3天,以允許細胞附著,然后在第4天與hcvser或hcv(-)對照血清(血型ab)一起孵育3h;洗滌后,將phh進一步培養(yǎng)5天,然后進行細胞rna提取。結(jié)果顯示,暴露于hcvser的phh的確表達病毒5’utr(標記為“+”,左,圖2a),而暴露于hcv(-)對照血清的細胞不表達(標記為“-”)。

            在感染后的培養(yǎng)中,病毒轉(zhuǎn)錄物不能在d7-上清液或d7-細胞裂解物中檢出,但是在所有實驗的d14-細胞裂解物中變得可檢出,還在18個實驗的10個的上清液中可檢出(右,圖2a;總計18個實驗,使用來自8個供體的hadsc,表3)。同時,5’-utr在所有實驗的d21和d28上清液兩者中以及在細胞裂解物中始終被檢出(右,圖2a)。

            我們還檢查了hcv-特異性負鏈rna,結(jié)果證實d14和d28hcvser-1b感染的hadsc表達復(fù)制中間體,按所預(yù)期的,其不存在于上清液中(圖2b)。自hcv-感染的患者分離的phh用作陽性對照。

            為進一步證實,將感染的hadsc離心到玻璃載玻片上用于連續(xù)的免疫細胞化學(xué)研究。細胞首先用抗dlk-1抗體染色,接著在相同切片上用抗ns5抗體和蘇木精染色。結(jié)果顯示,d14hcvser-1b感染的hadsc的確表達dlk-1(紅色標記,圖b,圖2c),和與rt-pcr發(fā)現(xiàn)相一致,它們還表達ns5(棕色標記,圖d,圖2c),這與對照血清脈沖的表達dlk-1(圖f)但不表達ns5(圖h)的hadsc相反。用同種型抗體兔igg和小鼠igg1(分別為抗dlk-1和抗ns5抗體的對照)染色證實了背景顏色(分別為圖a和c以及e和g)。因為幾乎所有hcvser-感染的dlk-1+細胞表達ns5(圖b對比d),因此hadsc對臨床分離株的感染的許可似乎是一個普遍化的性質(zhì),而不是限制于僅一個或多個細胞子集。

            還通過透射電子顯微術(shù)研究了d14和d21hcvser-hadsc。與暴露于hcv(-)對照血清的hadsc(圖a和d,圖2d)相比,≈50-60nm直徑的病毒顆粒能夠在hadsc的外部(插圖中的白色箭頭,圖b和e,圖2d)和內(nèi)部(插圖中的白色箭頭,圖c和f,圖2d)可見。在細胞外部鑒定的病毒顆粒被包裹在由雙膜(黃色箭頭和在插圖中放大,圖b)或電子致密膜狀結(jié)構(gòu)(黃色箭頭和在插圖中放大,圖e)構(gòu)成的膜狀囊泡中。相比之下,細胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的病毒顆粒呈無膜狀包裹的游離形式(黃色正方形和在插圖中放大,圖c;病毒顆粒通過白色箭頭指出)或被多個環(huán)狀同心膜包圍(“洋蔥形的”,黃色正方形和在插圖中放大,圖f;病毒顆粒通過白色箭頭指出)。

            除了感染懸浮的hadsc之外(圖2,a-d),我們還感染附著的hadsc,即通過將它們接板于6-cm培養(yǎng)皿中1天,然后用hcvser以0.5moi(1x1055’-utr拷貝對比2x105hadsc細胞)在終體積2ml中脈沖細胞3h。在溫和洗滌后,將細胞在5ml的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng),每7天更換培養(yǎng)基(圖10)。在第7、14、21和28天提取上清液和細胞裂解物中的rna并進行qrt-pcr。結(jié)果顯示,在第7天病毒轉(zhuǎn)錄物始終在細胞裂解物中可檢出,盡管它們不存在于上清液中(左圖對比右圖,圖2e)。此外,在細胞裂解物中的病毒拷貝在第2周最顯著增加(左圖,圖2e),而在上清液中的增加以一周的滯后即第3周最明顯(右圖,圖2e)。

            為測量通過該系統(tǒng)生產(chǎn)的總病毒拷貝,我們持續(xù)培養(yǎng)hcvser-感染的hadsc而無培養(yǎng)基更換(圖10)和在指定的培養(yǎng)期結(jié)束時收集上清液。qrt-pcr證實,最多的病毒釋放(至上清液中)發(fā)生在第3周,在28天的培養(yǎng)后總拷貝數(shù)為~3x105/ml(圖2f)。

            表3.幼稚hadsc的供體的特征

            *tram瓣:橫向腹直肌肌皮瓣

            實施例3:hadsc產(chǎn)生的病毒體是顯示臨床分離株的生物學(xué)性質(zhì)的真正的“病毒體”

            為了檢查hadsc產(chǎn)生的病毒體(標記為“hcvadsc”)的感染性,我們用hcvser-1b感染了“供體1”的p2hadsc和在第21天收集上清液(標記為“hcvadsc(1)”)。通過0.22-μm孔濾器過濾后,使用hcvadsc(1)感染“供體2”的hadsc以制備hcvadsc(2),其隨后用于感染“供體3”的hadsc。結(jié)果證實,hcvadsc對不同供體的幼稚hadsc具有感染性,具有如hcvser初始感染中見到的相對一致的復(fù)制效率(圖3a)。還對源自初始被hcvser-1a、-2a和-2b感染的hadsc的上清液的hcvadsc獲得了類似的觀察結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

            接下來我們通過用hcvser-1b感染p2、p6、p9和p15hadsc研究了不同傳代數(shù)的hadsc的許可性和在21天的持續(xù)培養(yǎng)后測量了病毒拷貝。結(jié)果顯示,與p2和p6細胞相對比,在上清液和細胞裂解物兩者中p9和p15hadsc具有極低水平的病毒轉(zhuǎn)錄物(分別為左圖和右圖,圖3b)。對用hcvser-1a和-2a的感染獲得了類似的觀察結(jié)果(圖11)。在確定幼稚[hcv(-)]hadsc的dlk-1表達的實驗中,我們發(fā)現(xiàn),dlk-1表達可從p0至p6檢出,但在p9時降低和在p15時不可檢出(圖3c),遵循如對于hcv感染的許可性所注意到的類似的趨勢。

            此外,hadsc似乎對基因型1或2的感染沒有偏愛(圖3b和圖11)。為對其做進一步檢查,我們用混合的基因型2a+2b的hcvser感染了p5hadsc和收集細胞用于rt-pcr以檢測編碼基因型特異性核心抗原的mrna。事實上,混合的2a+2bhcvser本身(作為陽性對照)表達編碼基因型2a和2b兩者的核心抗原的mrna(174和123bp,泳道“p”,分別為左圖和右圖;圖3d),其也在基因型2a+2b感染的hadsc的d21和d56細胞裂解物中被檢出。在該實驗中,通過hcv(-)對照血清脈沖的細胞用作陰性對照(標記為“n”)。因此,hadsc對于被臨床分離株感染的許可性是跨越基因型的,至少對于基因型1a、1b、2a和2b是如此。

            宿主因子,包括四跨膜蛋白(tetraspanin)cd81、ldl-r、sr-b1、表皮生長因子受體(egfr)、載脂蛋白(apo)e、閉合蛋白、緊蛋白-1、niemann-pickc1-樣1(npc1l1)膽固醇吸收受體和二酰基甘油乙酰轉(zhuǎn)移酶-1(dgat-1),已顯示在病毒附著或附著后步驟中介導(dǎo)在人肝細胞或肝癌細胞系中的hcv感染/復(fù)制15,16,19,53-58。我們通過流式細胞術(shù)或rt-pcr檢查了這些分子在hadsc中的表達。

            流式細胞術(shù)顯示,p0(即附著的svf細胞)、p2和p6hadsc明顯表達cd81、ldl-r、sr-b1和egfr(圖3e)。rt-pcr也證實編碼閉合蛋白(ocln)、緊蛋白-1(cldn1)和npc1l1而非mir-122的mrna的表達(左,圖3f)。相比之下,mir-122在huh7.5肝癌細胞中大量表達(為hadsc的~60倍高)和在phh中甚至更高豐度(~2000倍高;右,圖3f)。

            為了確定這些分子的作用,我們用分級劑量的針對cd81(克隆js-81)、ldl-r(克隆c7)、egfr(克隆la-1)的單克隆ab或針對sr-b1的多克隆ab預(yù)處理p2hadsc達1h,然后通過hcvser-1b脈沖。對于apoe阻斷,按所述14在室溫下將各種濃度的抗apoe抗體(克隆e6d10)添加至hcv(+)血清達1h,然后用于感染。在21天的上清液中的病毒轉(zhuǎn)錄物的定量顯示,在hcv(+)血清中的cd81、ldl-r、sr-b1、egfr的阻斷和還有apoe的中和以劑量依賴方式顯著降低病毒拷貝的量;同時,處理本身未顯著影響細胞成活力(圖3g)。還注意到在細胞裂解物的病毒拷貝中的類似的劑量-響應(yīng)降低(圖12)。

            在通過hcvser-1b感染之前,我們還按所述15,16用對閉合蛋白或緊蛋白-1具有特異性的sirna或在單獨實驗中用對npc1l1具有特異性的sirna轉(zhuǎn)染p2hadsc。我們還檢查了dgat-1的作用,dgat-1是運輸hcv核衣殼核心至脂質(zhì)小滴所需要的分子,對于在肝癌細胞系中hcv的產(chǎn)生是重要的19。rt-pcr證實mrna敲減的影響(圖13),其隨后降低在21天的培養(yǎng)后的上清液(圖3h)和細胞裂解物(圖13)中的病毒拷貝。

            最后,我們檢查了抗病毒藥物的抑制作用。將p4-5的細胞接板于孔中,暴露于hcvser-1b,和將分級濃度的包括利巴韋林、特拉匹韋或環(huán)孢菌素a(親環(huán)蛋白a抑制劑)在內(nèi)的抗病毒藥物添加至培養(yǎng)基中。對于ifnα處理,hadsc用指定劑量的ifnα預(yù)處理16h,然后與hcvser一起孵育。然后測定21天的細胞裂解物中的病毒轉(zhuǎn)錄物,并計算為與用溶媒對照處理的細胞相比的抑制分數(shù)。結(jié)果證實,hcv復(fù)制以劑量-響應(yīng)方式受到利巴韋林、特拉匹韋、環(huán)孢菌素a和ifnα抑制(圖3i)。在我們的預(yù)備實驗中已經(jīng)證實了在p0、p2和p6hadsc中親環(huán)蛋白a的表達(圖14)。因此,hcvadsc是顯示臨床分離株的生物學(xué)性質(zhì)的真正的“病毒體”。

            實施例4:hadsc是允許完全的hcv復(fù)制的體內(nèi)hcv貯庫

            為了表征hcvadsc的物理性質(zhì),我們按所述43通過平衡離心比較了hcvser、hcvcc和hcvadsc的浮力密度特征。研究的所有病毒源自基因型2a。與之前報道43,59,60相一致,hcvser在較低密度1.039(級分2)和1.080(級分7)的級分中具有大量的rna,而hcvcc的rna在1.132(級分13;圖4a)達到峰值。hcvadsc的最大量的rna在密度1.080(級分7)中見到,接著是在較高密度1.124和1.156(級分12和15)中的兩個峰。引人關(guān)注的是,在hcvadsc的1.080處的峰與hcvser相同(圖4a)。因此,hcvadsc的物理性質(zhì)比hcvcc更類似于臨床分離株。

            我們還確定了各主要級分的脂質(zhì)和載脂蛋白(apo)特征,包括hdl、vldl/ldl和apoe和apob。與hcvcc和hcvadsc相比,hcvser似乎具有最高的總脂質(zhì)量(圖15),這不是意外的,因為病毒增殖的微環(huán)境不同(血清對比培養(yǎng)基)。此外,當(dāng)表示為重量(ng)/病毒拷貝時,hcvcc級分13具有最低的hdl和ldl/vldl含量(圖4b)。hcvser的主要級分還具有最高的apoe含量(按照pg/拷貝計),接著是hcvadsc,hcvcc級分13幾乎沒有可檢出的apoe水平(圖4c)。因此,在病毒顆粒相關(guān)的脂質(zhì)含量中,hcvadsc還顯示與hcvser比與hcvcc更多的相似性。引人關(guān)注的是,在hcvadsc的任何級分中未檢出apob,暗示apob可能對于hadsc中的感染不是必需的,這與apoe相反(圖3g)。

            我們還通過用jfh1/hcvcc的病毒接種物以及hcvser感染p2hadsc比較了各種病毒對hadsc的感染性。平行進行作為對照的在huh7.5細胞中的hcvcc復(fù)制。我們發(fā)現(xiàn),與在huh7.5細胞中的hcvcc的有效復(fù)制(圖16)相反,hcvcc-感染的hadsc在14天或21天的培養(yǎng)后在上清液或細胞裂解物中產(chǎn)生很少的5’-utr轉(zhuǎn)錄物(圖4d),hadsc的hcvser感染顯示與之前類似的復(fù)制動力學(xué)(圖4d對比3a)。還收集幼稚huh7.5和hcvcc-感染的huh7.5細胞的21天的上清液以及hcvcc或hcvser感染的hadsc的那些上清液用于rna提取和進行rt-pcr。結(jié)果證實,在hcvcc-感染的hadsc上清液中無病毒轉(zhuǎn)錄物被檢出(泳道3,體4e),這與huh7.5的hcvcc感染和hadsc的hcvser感染相反(分別為泳道2和4,圖4e)。

            接下來我們檢查了hcvadsc對幼稚phh的感染性。phh按所述45自hcv(-)個體分離,培養(yǎng)3天(1x104細胞/皿)以允許細胞附著,隨后暴露于自hcvser-1b感染的hadcs培養(yǎng)物的21天的上清液制備的hcvadsc。感染后5天提取細胞rna用于rt-pcr。結(jié)果顯示,與通過對照血清脈沖的hadsc的上清液的感染(作為陰性對照,泳道“1”,圖4f)相反,hcvadsc-感染的phh的確表達病毒5’-utr(標記為“2”和“3”,圖4f)。

            最后,按之前所述制備來自3個不同供體的phh,并接種到孔中。在第4天,通過hcv(-)對照血清(來自3個不同個體)、hcvser-1b(來自3個單獨的供體)和其相應(yīng)的hcvadsc感染細胞。hcvser和相應(yīng)的hcvadsc配對感染同一批次的phh。感染后5天收集上清液和定量5’-utr拷貝。phh暴露于hcv(-)對照血清用作陰性對照。結(jié)果顯示,hcvser的感染產(chǎn)生高度變化的復(fù)制動力學(xué),如之前在用臨床分離株對phh的感染中所報道61。被hcvadsc的感染還導(dǎo)致病毒滴度增加,在hcvser感染的情況下病毒滴度高度變化(圖4g)。這些發(fā)現(xiàn)證實了hcvadsc對肝細胞的感染性。

            總之,hadsc是體內(nèi)hcv貯庫,其允許完全的hcv復(fù)制和代表了之前未被認識的臨床hcv-宿主相互作用位點。此外,hadsc是第一類非肝原代細胞,其允許臨床hcv分離株的體外增殖,其可成為用于解釋hcv生命周期和促進抗病毒策略的發(fā)展的新工具。

            本說明書中提及的所有出版物和專利通過引用結(jié)合到本文中。在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下,本發(fā)明的所述方法和系統(tǒng)的各種改變和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。盡管已結(jié)合特定的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明,但應(yīng)理解,所要求保護的本發(fā)明不應(yīng)過度限制于這樣的特定實施方案。事實上,對細胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的用于實施本發(fā)明的所述方式的各種變化,意欲包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

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