5?氨基?2?氧代噻唑并[4，5?D]嘧啶?3(2H)?基?5?羥甲基四氫呋喃?3?基乙酸酯的共結晶及其制備和使用方法與流程

發明領域

本發明涉及5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯和有機酸的共結晶，該共結晶的合成，及其用于治療病理性疾病，尤其是乙型肝炎(hbv)感染的用途。

發明背景

核苷類似物是類似或模擬dna合成中的天然核苷發揮作用的分子。“核苷類似物”類別內的化合物是治療癌癥、病毒感染和免疫抑制疾病的重要治療劑。核苷類似物通過抑制dna合成發揮其治療效果。在進入細胞之后，核苷類似物被磷酸化成相應的單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。三磷酸酯核苷類似物通過終止dna轉錄抑制細胞分裂。

核苷類似物也具有成熟的調控史，美國食品和藥品監管局(fda)最近批準了幾種核苷類似物用于治療疾病，如人免疫缺陷病毒(hiv)感染、乙肝病毒(hbv)感染、丙肝病毒(hcv)感染和癌癥。

乙肝病毒(hbv)是僅次于煙草的人類癌癥的第二大病因。hbv誘導癌癥的機制未知。假定hbv感染可直接觸發腫瘤發展，或通過慢性炎癥、肝硬化和與感染相關的細胞再生間接觸發腫瘤發展。感染hbv的人受急性肝炎和肝損傷之苦，導致腹痛、黃疸和某些肝酶的升高血液水平。雖然患者一般會從急性hbv感染恢復，病毒可持續無限復制，導致慢性持續性肝炎，其是肝細胞癌，一種原發性肝癌的主要病因之一。

3tc(拉米夫定)、干擾素α-2b、聚乙二醇化干擾素α-2a、賀維力(阿德福韋二匹伏酯)、博路定(恩替卡韋)、和替澤卡(替比夫定)是最近fda-批準的用于治療hbv感染的藥物。然而，這些藥物中的許多有嚴重副作用并且在用這些藥物治療的患者中會迅速出現病毒耐藥性。市售的核苷類似物的其他缺陷包括但不限于，與其采用需要耗時且高成本的純化的多步驟合成方案制備相關的困難，以及與其儲存期間的穩定性和抑制病毒復制而不破壞宿主細胞相關的挑戰。

技術實現要素：

本發明提供了共結晶作為治療劑用于治療疾病和病癥，如癌癥、病毒感染和與不良的免疫功能相關的病癥。

在一個實施方式中，本發明提供了包含至少2種組分的共結晶：(a)式i的化合物或其藥學上可接受的立體異構體或互變異構體；和

(b)共結晶成形劑。

共結晶成形劑(former)是有機酸。可用作共結晶成形劑的有機酸的示例是富馬酸、馬來酸、戊二酸、己二酸、α-酮戊二酸和鄰氨基苯甲酸。根據一個實施方式，共結晶成形劑是戊二酸，而對于其他實施方式，共結晶前體可以是選自馬來酸、己二酸或富馬酸的有機酸。

本發明的共結晶可包括式i的化合物和馬來酸、式i的化合物和富馬酸、式i的化合物和戊二酸、式i的化合物和己二酸、式i的化合物和鄰氨基苯甲酸、或式i的化合物和α-酮戊二酸。本發明的共結晶的式i的化合物與共結晶成形劑之比可以是1∶1、1∶2或2∶1。

本發明的共結晶是晶體并且在2θ衍射角處具有特征性的x-射線粉末衍射峰，如表2中進一步顯示。本發明的共結晶進一步由ir吸收光譜表征。

在一個實施方式中，本發明提供了包含藥學上可接受的運載體或稀釋劑和包含以下至少兩種組分的共接近的藥物組合物：(a)式i的化合物或其藥學上可接受的立體異構體或互變異構體和(b)共結晶成形劑。根據一個實施方式，本發明的藥物組合物的共結晶包含式i的化合物和戊二酸作為共結晶成形劑。

根據另一個實施方式，本發明提供了一種通過向有此需要的對象給予治療有效量的權利要求1的共結晶治療疾病或病癥的方法。使用本發明的共結晶治療的疾病或病癥的示例是選自癌癥、炎癥或乙型肝炎感染的那些。

根據該方法的一個實施方式，與治療有效量的選自下組的第二治療劑組合給予共結晶：抗生素、止吐劑、抗炎藥、抗病毒劑、抗癌劑、免疫調節劑、α-干擾素、β-干擾素、peg化α-干擾素、peg化β-干擾素、利巴韋林、烷基化劑、激素、細胞因子、聚合酶抑制劑、和toll受體-樣調節劑。

通過將共結晶成形劑的懸液或溶液與式i的化合物或其藥學上可接受的立體異構體或互變異構體的懸液或溶液混合以得到共結晶溶液，之后使該共結晶溶液過飽和來開始形成共結晶來合成本發明的共結晶。

用于溶解式i的化合物的共結晶成形劑的溶劑包括有機溶劑、水、或水和有機溶劑的混合物。適于溶解共結晶成形劑的經典有機溶劑的示例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、乙酸異丙酯、己烷、庚烷、甲苯、丙酮、乙腈、二噁烷、四氫呋喃(thf)、乙酸乙酯、或其組合。

附圖說明

圖1-本發明的示例性戊二酸共結晶的體內藥代動力學。該圖顯示了在口服給予10mg/kg劑量的式i的化合物的戊二酸共結晶或甲苯磺酸鹽之后獼猴中的平均血漿濃度。

圖2-合成式i的化合物和示例性的共結晶的示例性方案。

圖3a-生物活性物質(r06871765)對hbv復制的影響。通過分別使用實時pcr和clia測定測量分泌的hbvdna(■)和hbsag(●)的水平監測的hbv復制。由celltiter-glo(▲)測定的細胞活力。

圖3b-peg化的干擾素-α-2a對hbv復制的影響。通過分別使用clia和實時pcr測定測量分泌的hbsag(白色柱)和hbvdna(灰色柱)的水平監測的hbv復制。由celltiter-glo(黑色柱)測定的細胞活力。

圖4-dmso或r06871765刺激的pbmc調節的介質對hbv復制的影響。dmso調節的介質-圖(a)、(c)和(e)。r06871765(100μm)刺激的pbmc調節的介質-圖(b)、(d)和(f)。通過分別使用實時pcr和clia測定測量分泌的hbvdna(■)和hbsag(●)的水平監測的hbv復制。由celltiter-glo(▲)測定的細胞活力。

圖5-ifn-α2a(roferon-a)，圖5a；il-6，圖5b；tnf-α，圖5c；和ip-10，圖5d；對hbv復制的影響。通過分別使用實時pcr和clia測定測量分泌的hbvdna(■)和hbsag(●)的水平監測的hbv復制。由celltiter-glo(▲)測定的細胞活力。

詳述

本發明提供了包含式i的化合物和作為共結晶成形劑的有機酸的共結晶。本發明的共結晶及其藥物組合物可用于治療或預防病毒感染、癌癥和與不良免疫功能相關的疾病或病癥。

應注意到使用術語“包括”(及其語法變體)包括“具有”和“包含”的包含性涵義，而不是“僅由……組成”的排他性涵義。本文所用的術語“一個”、“一種”和“該”理解為包括復數和單數。

術語“活性藥物成分”或“api”是指一種物質，例如，引發生物活性的藥物組合物中的化合物或生物試劑。

在本發明的內容中，術語“共結晶”是指包含2種或更多種化合物的晶體分子復合物。藥物共結晶含有藥物物質和在相同晶體中存在的一種或多種其他分子。在室溫下，共結晶的2種或更多種化合物可以是固體形式。各種化合物具有其自身的不同物理特性，如結構、熔點和熔解熱。術語“共結晶”也指包含2種或更多種化合物的晶體物質，該化合物在室溫下各自可能是液體形式但是在促進共結晶的條件下結合時形成結晶材料。本發明的共結晶還包括通過將在室溫下為固體的化合物與在室溫下為液體的化合物在適于促進共結晶的條件下合并獲得的晶體材料。在本發明的一些方面中，通過在適于促進共結晶的條件下合并式i的化合物與共結晶成形劑或通過合并式i的化合物與共結晶成形劑的溶劑合物來獲得本發明的共結晶。

術語“共結晶成形劑”是指在共結晶的相同晶體分子復合物內與藥物一起存在的其他化合物或客體化合物。可參與與藥物的供體-受體相互作用的任何分子可用作共結晶成形劑。“共結晶成形劑”類別的示例性化合物包括但不限于有機酸、有機堿、醇、苯酚酯和環糊精。例如，共結晶成形劑可以是糖、煙酰胺4-羥基苯甲酸、苯甲酸、戊二酸、富馬酸、馬來酸、己二酸、α-酮戊二酸、鄰氨基苯甲酸或羥苯甲酸甲酯。

在本發明的內容中，術語“免疫調節劑”是指能夠通過刺激或抑制來修飾正常或異常免疫系統的天然或合成產物。

術語“預防”指本發明化合物或組合物預防被診斷患有本文所述疾病的患者或有患上該疾病風險的患者內的所述疾病的能力。該術語也包括在已經患有這類疾病或具有這類病癥癥狀的患者中預防疾病的進一步發展。

術語“患者”或“對象”指動物(例如，牛、馬、綿羊、豬、雞、火雞、鶉、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)或哺乳動物，優選人，包括嵌合和轉基因動物和哺乳動物。

術語“治療有效量”指本發明化合物在治療或預防疾病中足以提供益處的量，所述量延遲或最小化與所預防的疾病相關的癥狀，或者治愈或使所述疾病或感染或其病因好轉。具體地，治療有效量指足以提供體內治療益處的量。在聯系本發明化合物的量使用時，所述術語優選涵蓋非毒性量，所述非毒性量改善全體治療，降低或避免疾病癥狀或病因，或者增強其它治療劑療效或增強與其它治療劑的協同作用。

術語“治療”、“處理”和“療法”指：減輕或根除疾病或與疾病相關的癥狀。在某些實施方式中，此類術語指：通過給予一種或多種預防或治療劑至患有疾病的患者，使該疾病的擴散或惡化最小化。

本文所述的一些化合物可具有不對稱中心，并因此可以對映異構體和非對映異構體存在。本發明的化合物可以是單一對映異構體(光學異構體)、非對映異構體、或對映異構體的混合物，包括外消旋混合物的形式。本發明化合物的光學異構體可通過已知技術獲得，例如不對稱合成、手性色譜法，或通過利用光學活性拆分劑對立體異構體進行化學分離。

除非另有指示，“立體異構體”指，化合物的一種立體異構體，其基本不含該化合物的另一種立體異構體。因此，具有手性中心的立體異構純化合物基本不含該化合物的相反對映異構體。具有兩個手性中心的立體異構純的化合物基本不含該化合物的其他非對映異構體。典型的立體異構純的化合物包含大于約80重量％的該化合物的一種立體異構體和小于約20重量％的該化合物的另一種立體異構體，例如，大于約90重量％的該化合物的一種立體異構體和小于約10重量％的該化合物的另一種立體異構體，或大于約95重量％的該化合物的一種立體異構體和小于約5重量％的該化合物的另一種立體異構體，或大于約97重量％的該化合物的一種立體異構體和小于約3重量％的該化合物的另一種立體異構體。

如果在描述的結構和對該結構給定的名稱之間存在差異，則以描述的結構為準。此外，若結構或結構的部分的立體化學未用例如粗或虛線指示，則該結構或結構的部分應被理解為涵蓋其全部立體異構體。有機合成領域的技術人員應知曉用制備所述化合物的單一對映異構體的方法制備它們的情況。

共結晶

下面式i中顯示的5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯是以游離堿形式的無定形粉末存在的3’-脫氧腺苷類似物。

然而，游離堿具有弱化學穩定性并且沒有合適的制備工藝來一致地合成藥物級物質，游離堿不適合作為藥劑。為了解決這些缺陷，如美國專利號7，928，085所述合成游離堿的對甲苯磺酸(甲苯磺酸)鹽。如本專利中公開的那樣，甲苯磺酸鹽的晶體形式相比游離堿具有某些優勢。例如，甲苯磺酸鹽具有比游離堿更大的穩定性和水溶性。因此，甲苯磺酸鹽被認為是比游離堿更合適的配制具有低殘留溶劑含量的藥物組合物的試劑。

雖然5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯的甲苯磺酸鹽形式相比游離堿有某些有利性質，但甲苯磺酸鹽的合成是挑戰性的。例如，合成需要使用對甲苯磺酸(tsoh)，一種已知的致癌劑。商業規模的甲苯磺酸合成被以下觀察結果進一步復雜化，其伴隨著形成遺傳毒性劑-4-甲基苯磺酸乙酯(甲苯磺酸乙酯)和4-甲基苯磺酸異丙酯(甲苯磺酸異丙酯)作為副產物。

由于甲苯磺酸乙酯和甲苯磺酸異丙酯的生物學毒性，在甲苯磺酸鹽的商業規模制備過程中必須采用耗時且昂貴的純化方法。即，需要能夠去除或降低遺傳毒性副產物的濃度至藥物制劑所要求的個位數部分/百萬分率(ppm)的純化方案來獲得適合用作治療劑的甲苯磺酸鹽。除了合成挑戰以外，含5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯的甲苯磺酸鹽的藥物組合物的制備是挑戰性的。

使用下述方案合成的本發明的共結晶解決了與用于治療hbv和hcv感染的治療劑的甲苯磺酸鹽的合成和藥物開發相關的幾個缺陷和挑戰。如下文進一步所述，通過使5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯(式i的化合物)與至少一種共結晶成形劑接觸來合成本發明的共結晶。

當與共結晶成形劑結合時，式i的化合物的溶劑合物和鹽也可形成共結晶。為此，已經評價了作為共結晶成形劑的幾種有機酸。示例性的共結晶成形劑包括但不限于草酸、l-天冬氨酸、馬來酸、糖精、2-氨基苯甲酸、l-谷氨酸、l-蘇氨酸、4-氨基苯甲酸、α-酮戊二酸、1-羥基-2-萘甲酸、丙二酸、龍膽酸、水楊酸、l-(+)-酒石酸、富馬酸、乳糖酸、檸檬酸、d-葡萄糖醛酸、β-環糊精，羥丙基-β-環糊精、4-氨基水楊酸、煙酰胺、l(-)-蘋果酸、馬尿酸、乙醇酸、l(-)焦谷氨酸、γ-環糊精、苯甲酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、4-羥基苯甲酸、(+)樟腦酸、山梨酸、煙酸、乳清酸、尿素、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、l(-)-乳酰胺、l-抗壞血酸、肉桂酸、d，l-扁桃酸、香草酸和4-羥基苯甲酸甲酯。

除了上述的有機酸以外，本發明還提供了共結晶，其中共結晶成形劑是第二藥物或第二活性藥物成分(api)。“第二藥物”或“第二api”類別的示例是包含抗生素、止吐劑、抗抑郁藥、和抗真菌劑、抗炎劑、抗病毒劑、抗癌劑、免疫調節劑、α-干擾素、β-干擾素、利巴韋林、烷化劑、激素、細胞因子、或toll受體樣調節劑的治療劑。

表1顯示了按照本發明包含式i的化合物和有機酸共結晶成形劑的示例性共結晶的物理特性。如表1和下文中進一步顯示，示例性的共結晶中的許多具有優良的溶解性，使得它們基于生物制藥法規系統(bcs)分類系統命名為i類藥物。

表1

使用x射線粉末衍射(xrpd)光譜、核磁共振(nmr)光譜、光學顯微鏡和紅外(ir)光譜進一步表征本發明的共結晶。因此，在石蠟油中的戊二酸共結晶的懸浮液的偏振光顯微鏡顯示結晶固體。固態nmr研究證實了式i戊二酸共結晶，而溶液相nmr研究證實了根據本發明技術的共結晶的2∶1的式i化合物比戊二酸(共結晶成形劑)的化學計量。對示例性戊二酸共結晶(0.27mg/ml)的乙醇溶液進行紫外分光光度學研究，顯示在222nm、248nm和316nm處的三個吸收峰。此外，進行x射線粉末衍射研究以進一步表征本發明的共結晶。來自根據本發明的幾個共結晶的x射線粉末衍射研究的2θ值列于表2中。

表2

令人驚奇的是，本發明的共結晶與式i化合物的甲苯磺酸鹽相比具有幾個優點。例如，使用下述合成方案進行的共結晶的合成耗時較少。本發明的合成方法很容易實現規模擴大化，允許共結晶的商業合成和分離。本發明共晶體的純化是經濟有效且快速的。簡單的過濾和洗滌足以獲得適合用作藥劑的共結晶。此外，根據本發明的共結晶的合成消除了伴隨著甲苯磺酸鹽的制備的遺傳毒性副產物的產生。

除了上述優點之外，本發明的共結晶具有增強的化學穩定性，并且對無定形游離堿或5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯的甲苯磺酸鹽的水解較不敏感。因此，本發明的共結晶可以在室溫下長時間儲存，但相應的對甲苯磺酸鹽是吸濕性的，并且需要在低溫下儲存以防止降解。

另一個優點是本發明的共結晶具有非常少量的殘留溶劑。這允許本發明制備的共結晶的藥物組合物含非常低量的殘留溶劑(如果有的話)。此外，溶解性研究表明本發明的共結晶高度可溶于水，這對于制備藥物組合物而言是希望的。由于它們的高水溶性，根據生物制藥法規系統(bcs)指南，該共結晶被歸類為i類藥物。

鹽分因素(s)是指以鹽或酯形式影響藥代動力學和生物分布的給予的藥物劑量的分數。例如，鹽分因素@@(s)影響藥物血漿濃度、達到血漿中api穩態濃度所需的劑量，api的生物利用度和藥物的生物分布的其他因素。令人驚奇的是，式i化合物的共結晶具有相對于式i化合物的相應甲苯磺酸鹽較低的“s”(藥物鹽分因素)值。例如，示例性的戊二酸共結晶的鹽分因素(s)是1.2。式i化合物(5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯)的甲苯磺酸鹽的鹽分因素(s)更大，約1.53。因此，與1克相應的甲苯磺酸鹽相比，每克戊二酸共結晶含有較大量的5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-33(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯游離堿。

換句話說，包含戊二酸共結晶的藥物組合物每單位劑量中將含有更大量的5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯游離堿。因此，每天需要向患者給予較少劑量的共結晶藥物組合物，這可有利于增加患者在治療期間的依從性。

僅為了說明的目的，5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯游離堿的日劑量為約1600mg/天。如果制造口服制劑(片劑)，使得每片的最大重量不能超過1000mg，并且可存在于每個片劑中的5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯游離堿的最大量不能超過片劑的70重量％，那么需要給予患者以達到1600mg游離堿的目標日劑量的片劑的總數取決于(a)制備片劑中使用的式i化合物的具體形式和(b)與式i化合物的具體形式相關的鹽分因素(s)。

如表3所示，式i化合物的具體形式的鹽分因素(s)能影響實現1600mg游離堿的目標日劑量所需的片劑數。當口服制劑包含式i化合物的游離堿或戊二酸酯共結晶時，達到目標日劑量所需的片劑更少。如果包含式i化合物的游離堿的片劑的總重量為770mg(游離堿的鹽分因素(s)為1.0)，則各片劑將含有539mg游離堿(0.7×770mg)。由于游離堿難以以商業規模合成和純化，如上所述，包含游離堿的片劑的穩定性差，保質期短，游離堿的片劑配制不適于商業化。

相比之下，需要四片甲苯磺酸鹽來達到1600mg的式i化合物的游離堿的目標日劑量。例如，如果每單位劑量的重量(mg)，即含有式i化合物的甲苯磺酸鹽的片劑的重量為875mg，并且鹽分因素(s)為1.53，則每個875mg片劑將含有612.5mg(片劑的總重量的70％)的甲苯磺酸鹽，其對應于400mg的相應游離堿/片劑(612.5/1.53)。因此，需要將四片甲苯磺酸鹽片劑給予患者以達到1600mg游離堿的目標日劑量。因此，如果使用甲苯磺酸鹽作為藥物，患者不僅需要口服攝取更多的片劑，而且這樣的患者將需要吞下可能對需要治療的兒童和老年患者具有挑戰性的大得多的片劑。

與甲苯磺酸鹽相比，本發明共晶體的鹽分因素的較低值減少了每天需要的含有共結晶的片劑的數量。例如，如果含戊二酸共結晶的片劑重量為930mg，則這種片劑將含有612.5mg(930mg的70％)(重量)的戊二酸共結晶。因此，每個片劑中游離堿的量為533.7mg(612.5/1.22)。從上述討論可以看出，含有戊二酸共結晶的片劑與含有相應的甲苯磺酸鹽的片劑相比，含有更大量的游離堿(即以/mg/單位劑量計的游離堿的重量)。因此，如表3所示，達到1600mg的目標日劑量所需的共結晶片劑較少。

表3

藥物組合物和劑量

本發明還涉及本發明的共結晶的藥物制劑以及這種藥物制劑治療疾病癥如癌癥、病毒感染或與不良的免疫功能相關的疾病的用途。因此，一方面，本發明涉及包含式i化合物或其藥學上可接受的立體異構體、互變異構體或溶劑合物和至少一種共結晶成形劑以及藥學上可接受的賦形劑的共結晶的藥物制劑。

本發明的組合物還可以根據藥物配制的普遍認可的實踐而含有一種或多種其他治療劑、藥學上可接受的稀釋劑、佐劑、穩定劑、乳化劑、防腐劑、著色劑、緩沖劑或調味劑。合適的賦形劑是藥學領域技術人員熟知的，并且本文提供合適賦形劑的非限制性示例。特定賦形劑是否適于摻入藥物組合物或劑型中取決于本領域眾所周知的各種因素，包括但不限于將劑型給予患者的方式。例如，經口劑型(例如片劑)可包含不適合用在腸胃外劑型中的賦形劑。特定賦形劑的適用性也可取決于劑型中的具體活性成分。

適用于包含本發明的共結晶和藥學上可接受的運載體的單一單位劑量的藥物組合物也包括在本公開的范圍內。根據本發明的藥物制劑以及單一單位劑型可適用于口服、粘膜(包括舌下、口腔、直腸、鼻或陰道)、胃腸外(包括皮下、肌內、推注、動脈內或靜脈內)、透皮或局部給藥。本發明共結晶的無菌制劑也是可以想到的。

藥物制劑以及單一單位劑型可以含有不同量的共結晶，其藥學上可接受的鹽或互變異構體。例如，藥物制劑以及單一單位劑型中共結晶的量可以在約0.1mg至約1000mg的范圍內。對于一些制劑和單一劑型，共結晶的量為約50mg至約750mg、約50mg至約500mg、約100mg至約250mg、約10mg至約100mg、或約1mg至約10mg。

包含本發明的共結晶的無水藥物組合物也包括在本公開的范圍內。由于在制造、儲存、處理、包裝、運輸和使用藥物制劑期間常規遇到濕氣和/或水氣，所以使用制劑領域技術人員已知的無水或低含水成分和低水分或低濕度條件制備本公開的無水藥物組合物的方法和劑型在本公開的范圍內。

為了保持共結晶的藥物組合物的無水性質，本發明的藥物制劑應在保持其無水性質的條件下包裝并儲存。因此，優選使用已知防止暴露于水的材料包裝無水組合物。合適的包裝的示例包括但不限于，氣密性密封的箔、塑料、單位劑量容器(例如，小瓶)、泡罩包裝和條狀包裝。

根據本發明的共結晶是用于治療與不良的細胞分裂，不良的免疫功能或治療病毒感染相關的疾病或病癥的治療劑。可以通過向需要治療的患者或對象給予一種或多種治療有效劑量的本發明共結晶來實現治療。

口服劑型

適于口服使用的本發明的組合物可按照藥物組合物生產領域的任何已知方法制備。一般參見remington'spharmaceuticalsciences(《雷明頓藥物科學》)，第18版，賓西馬尼亞州伊斯頓的馬克出版公司(mackpublishing)，(1990)。這類口服劑型含有與至少一種賦形劑密切混合的預定量的活性成分。液體制劑可以進一步含有甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑，以提供本發明的共結晶的藥學上極佳且可口的制劑。

本發明的合適的口服組合物包括但不限于片劑、含片、錠劑、水性或油性懸浮液、可分散的粉末或顆粒劑、乳劑、硬膠囊或軟膠囊劑、糖漿劑或酏劑。因為片劑和膠囊易于給予、儲存和包裝，所以它們代表了最有利的經口單位劑型，在這種情況下使用固體賦形劑。如果需要，片劑可以通過標準的水性或非水性技術進行包衣。一般而言，藥物組合物和劑型通過如下方式制備：將活性成分(即共結晶)和液體運載體、精細研磨的固體運載體或兩者均勻且密切混合，然后，必要時，使產物成型為所需形式。

對于片劑組合物，與無毒藥學上可接受的賦形劑混合的活性成分用于制備片劑。這些賦形劑的示例包括但不限于，惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑和崩解劑，如玉米淀粉或藻酸；粘合劑，如淀粉，明膠，樹膠如阿拉伯膠，和潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。用于本發明的藥物組合物的粘合劑或填料通常以藥物組合物或劑型的約50至約99重量％存在。

片劑可以通過壓縮或模塑制備，并且可以是未包衣的或包衣的，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而在期望的時間段內提供持續的治療作用。示例性的延遲材料包括但不限于單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

口服使用的制劑也可制備成其中混有活性成分與惰性固體稀釋劑，如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土的硬明膠膠囊，或其中混有活性成分與水或油性介質如花生油、液體石蠟或橄欖油的軟明膠膠囊。

除了片劑和膠囊之外，本發明的共結晶可以配制成適合于口服給藥的糖漿、懸浮液、可分散粉末和顆粒劑。當配制成口服懸浮液時，藥物組合物可以含有分散劑或潤濕劑，例如天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯化氧與脂肪酸，長鏈脂族醇或部分脂肪酸酯的縮合產物。這些產品的例子是聚氧乙烯硬脂酸酯、十七碳乙烯氧基鯨蠟醇、己糖醇如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯、或聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。口服混懸劑也可含有一種或多種防腐劑，如對羥基苯甲酸乙酯或者對羥基苯甲酸正丙酯，一種或多種著色劑，一種或多種調味劑以及一種或多種甜味劑，如蔗糖或糖精。糖漿劑和酏劑中可配有甜味劑，如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。這類制劑也可含有緩和劑、防腐劑、調味劑和著色劑。

緩釋劑型

也可通過本領域普通技術人員熟知的受控的緩釋方式或通過遞送裝置給予本發明的共結晶。示例包括但不限于美國專利號3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、和4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、和5,733,566中所述的那些，其各自通過引用納入本文。這樣的劑型可用于使用例如羥丙基甲基纖維素，其它聚合物基質，凝膠，滲透膜，滲透系統，多層涂層，微粒，脂質體，微球或其組合中的一種或多種活性成分以不同比例提供所需釋放曲線的緩釋或控釋。合適的控釋制劑是制劑領域的普通技術人員已知的。因此，本公開包括適于口服給予的單一單位劑型，諸如但不限于，片劑、膠囊、凝膠膠囊和適于控釋的囊片。

所有控釋藥物產品的共同目標是改善藥物治療，使其優于所述藥物的非控制對應物所獲得的治療。理想情況下，在藥物治療中使用控釋制劑的特征在于以預定的時間間隔施用已知量的活性劑，例如2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、或2-12個月、3-12個月、4-12個月、5-12個月、6-12個月、7-12個月、8-12個月、9-12個月、10-12個月、11-12個月、或1年。控制釋放制劑的優點包括藥物延長的活性，降低的給藥頻率和提高的患者依從性。此外，可使用控釋制劑來影響藥物作用的啟動時間或其它特性(例如藥物在血液中的水平)，因而能影響副作用(例如，反作用)的出現。

大多數控釋制劑被設計成在開始時釋放迅速產生所需療效的藥物(活性成分)量，然后逐漸并持續地釋放相同或其它藥物量以在更長的時間內維持相同治療或預防效果的水平。為了保持體內恒定的藥物水平，所述藥物必須以替代該藥物經代謝并排出身體的量的速度從所述劑型釋放。可以通過各種條件刺激活性成分的控釋，包括但不限于ph、溫度、酶、水或其它生理條件或化合物。

腸胃外劑型

腸胃外劑型可通過多種途徑給予患者，所述途徑包括但不限于皮下、靜脈內(包括推注)、肌肉內和動脈內注射。因為腸胃外劑型的給予通常繞過患者針對污染物的天然防御，所以腸胃外劑型優選是無菌的，或者能夠在給予患者前消毒。腸胃外劑型的實例包括但不限于準備注射的溶液、準備溶解或懸浮在藥學上可接受的注射用載劑中的干燥和/或凍干產品(可重建粉末)、準備注射的懸浮液，和乳液。

可用于提供本公開的腸胃外劑型的合適載劑是本領域技術人員公知的。示例包括但不限于：用于注射usp的水；水性載劑如但不限于氯化鈉注射液、林格注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化鈉注射液，以及乳酸林格注射液；水混溶性載劑如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性載劑如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯和苯酸芐酯。腸胃外制劑可以包括增加根據本發明的一種或多種活性藥物成分或本發明的共結晶的溶解度的化合物。

藥盒

本公開提供了包含含有本發明的共結晶的一個或多個容器的藥物包裝或藥盒，并且可任選地包括含有藥學上可接受的運載體的一個或多個容器。在其它實施方案中，本公開提供包含含有本發明的共結晶的一個或多個容器的藥物包裝或藥盒，包含其他治療劑的一個或多個容器和含有藥學上可接受的運載體的一個或多個容器。

根據本發明的藥盒或包裝可以包含含有將本發明的共結晶配制成適于給藥的藥物組合物所需的一種或多種藥物成分的一個或多個容器或藥物包裝，，以及裝置，如用于給予本發明的共結晶的藥物組合物的一種或多種注射器。

藥盒或包裝可以包括緩沖液，調節藥物運載體的張力的化合物和改變親水親油平衡(hlb)的化合物，以改善遞送和生物分布。藥盒或包裝中存在的容器可任選附有管理藥品或生物制品的生產、使用或銷售的政府機構規定的告知書，該告知書反映出生產、使用或銷售管理機構批準其用于人體。

聯合治療

在一個方面，本發明的共結晶的治療有效劑量可以與治療有效劑量的組合藥物(其他治療劑)一起給予需要治療的患者或對象。本領域技術人員將認識到，可以分開地，例如在給予組合藥物之前或之后的幾秒鐘、幾分鐘或幾小時內，給予一定劑量的共結晶，或者可將兩個劑量一起給予。其他治療劑包括但不限于抗生素、止吐劑、抗抑郁藥、和抗真菌劑、抗炎劑、抗病毒劑、抗癌劑、免疫調節劑、α-干擾素、β-干擾素、peg化α-干擾素、peg化β-干擾素、利巴韋林、烷化劑、激素、細胞因子、或toll受體樣調節劑。

除了上述治療劑之外，本發明還包括聯合治療方案，其包括與治療有效量的聚合酶抑制劑，例如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和替比夫定組合的共結晶。包含三種藥物組合的治療方案也包括在本發明的范圍內。例如，這種方案可以包括給予治療有效劑量的共結晶、聚合酶抑制劑和干擾素或peg化干擾素。

存在于組合物中的每種化合物或其藥學上可接受的鹽或互變異構體的百分比也可以變化。例如，在一些實施方式中，所述組合物可包括的共結晶或其藥學上可接受的鹽或互變異構體的量為約1％到約98％的范圍(重量/重量)。組合物可以含有本發明的共結晶或其藥學上可接受的鹽或互變異構體，其范圍為約5％至約80％，約10％至約70％，約15％至約60％，約20％至約50％和約30％至約40％(重量/重量)。

當使用抗生素作為第二種治療劑時，示例性化合物包括但不限于大環內酯類(例如，妥布霉素)、頭孢菌素(例如，頭孢氨芐頭孢拉定頭孢呋辛頭孢克肟頭孢克洛頭孢克肟或頭孢羥氨芐)、克拉霉素(例如，克拉霉素)、紅霉素(例如，紅霉素)、青霉素(例如，青霉素v(v-cillin或penvee))或喹諾酮(例如，氧氟沙星環丙沙星或諾氟沙星)、氨基糖苷類抗生素(例如，安普霉素、阿貝卡星、班貝霉素、丁酰苷菌毒素、地貝卡星、新霉素、新霉素、十一烯酸、奈替米星、巴龍霉素、核糖霉素、西蘇霉素和壯觀霉素)、苯丙醇抗生素(如疊氮霉酚、氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素)、安莎霉素抗生素(例如，利福酰胺和利福平)、碳頭孢烯類(例如，勞拉卡貝)、碳青霉烯類(例如，比阿培南和亞胺培南)、頭孢菌素類(例如，頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢曲嗪、頭孢西酮、頭孢唑蘭、頭孢咪唑、頭孢匹胺、和頭孢匹羅)、頭孢霉素類(例如，頭孢拉宗、頭孢美唑、和頭孢米諾)、單菌霉素類(例如，氨曲南、卡蘆莫南、和替吉莫南)、氧頭孢烯類(例如，氟氧頭孢和拉氧頭孢)、青霉素(例如，阿姆地諾西林、阿姆地諾西林雙酯、阿莫西林、巴卡西林、芐青霉素酸、芐青霉素鈉、表柔比星、芬貝西林、氟氯青霉素、盤納目西林、吡啶甲酸氫碘酸鹽、青霉素鄰苯三胺、青霉素0、青霉素v、青霉素v芐星青霉素、青霉素v哈胺、青哌環素、和芬絲西林鉀)、林可酰胺類(例如，克林霉素和林可霉素)、雙霉素、桿菌肽、卷曲霉素、多粘菌素、持久殺菌素、結核放射菌素、四環素類(例如，阿哌環素、金霉素、羥甲金霉素和去甲金霉素)、2，4-二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)、硝基呋喃類(例如，呋喃唑酮和呋唑氯銨)、喹諾酮類及其類似物(例如，西諾沙星、克林沙星、氟甲喹、和古來沙星)、磺胺類(例如，乙酰磺胺甲氧基吡嗪、芐磺胺、諾丙磺胺、酞磺醋胺、磺胺柯衣酸、和磺胺西汀)、砜類(例如，地百里砜、葡糖砜鈉、和苯丙砜)、環絲氨酸、莫匹羅星、和馬鈴薯球蛋白。

本發明的共結晶還可以與其它抗病毒劑組合給予或配制。有用的抗病毒劑包括但不限于蛋白酶抑制劑、核苷逆轉錄酶抑制劑、非核苷逆轉錄酶抑制劑和核苷類似物。抗病毒劑包括但不限于齊多夫定、去羥肌苷、司他夫定、可比韋、阿巴卡韋、阿德福韋、西多福韋、利托那韋、利巴韋林及其類似物、左旋利巴韋林、韋拉米啶、艾沙托立賓、吡非尼酮或其類似物、阿昔洛韋、更昔洛韋、阿糖腺苷、碘苷、曲氟尿苷以及膦甲酸、金剛烷胺、金剛乙胺、沙奎那韋、茚地那韋、安格那韋、洛匹那韋、利托那韋、α-干擾素、β干擾素、克立夫定、恩替卡韋、普來可那利。

另外的治療劑可包括腫瘤壞死因子拮抗劑，如依那西普、英夫利昔單抗和阿達木單抗)，胸腺素-α、(zadaxin.tm)、干擾素受體激動劑、α-葡糖苷酶抑制劑、tnf-α拮抗劑、ns3解旋酶抑制劑、ns5b聚合酶抑制劑(如gs-9190、mk-3281、vch-759(vx-759)、vch-916、abt-333、bms-791325、pf-00868554、idx-184、r1626、psi-7851、vch-222(vx-222)、abt-072和bi207127)和ns5a蛋白的抑制劑(如bms-790052、a-831和azd2836)。

本發明的共結晶可以聯合以下試劑給予或配制：抑制病毒ns3蛋白酶的試劑，例如vx-950和sch503034，toll樣受體(tlr)調節劑如imo-2125和pf-04878691；細胞色素p450單加氧酶抑制劑；核酶如heptazyme^tm和硫代磷酸酯寡核苷酸，其與hbv蛋白質序列互補并且抑制病毒核心蛋白的表達。

或者，本發明的共結晶可以與免疫調節劑組合給予或配制。免疫調節劑包括但不限于甲氨蝶呤、來氟米特、環磷酰胺、環孢霉素a，霉酚酸酯、雷帕霉素(西羅莫司)、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布喹那、丙二腈氨化物(例如來氟米特)、t細胞受體調節劑、和細胞因子受體調節劑、肽模擬物、和抗體(例如人、人源化、嵌合、單克隆、多克隆、fvs、scfv、fab或f(ab)2片段或表位結合片段)、核酸分子(例如反義核酸分子和三股螺旋)、小分子、有機化合物和無機化合物。t細胞受體調節劑的例子包括但不限于：抗-t細胞受體抗體(例如，抗-cd4抗體(如cm-t412(勃林格公司(boeringer))、idec-ce9.1(idec和skb)、mab4162w94、orthoclone和oktcdr4a(揚森齊拉格公司(janssen-cilag)))、抗-cd3抗體(如nuvion(產物設計實驗室(productdesignlabs))、okt3(強生公司)、或利妥昔(idec))、抗-cd5抗體(如抗-cd5蓖麻毒蛋白連接的免疫偶聯物)、抗-cd7抗體(如chh-380(諾華公司(novartis)))、抗-cd8抗體、抗cd40配體單克隆抗體(如idec-131(idec))、抗-cd52抗體(如campath1h(ilex))、抗-cd2抗體、抗-cd11a抗體(如xanelim(基因泰克公司(genentech))、抗-b7抗體(如idec-114(idec))、ctla4-免疫球蛋白、和toll受體樣(tlr)調節劑。細胞因子受體調節劑的例子包括但不限于：可溶性細胞因子受體(如tnfα受體胞外結構域或其片段、il-1β受體胞外結構域或其片段和il-6受體胞外結構域或其片段)、細胞因子或其片段(如白介素(il)-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-15、tnf-α、tnf-β、干擾素(ifn)-α、ifn-β、ifn-γ和gm-csf)、抗-細胞因子受體抗體(如抗-ifn受體抗體、抗-il-2受體抗體(如zenapax(蛋白質設計實驗室(proteindesignlabs))、抗-il-4受體抗體、抗-il-6受體抗體、抗-il-10受體抗體和抗-il-12受體抗體)、抗-細胞因子抗體(如抗-ifn受體抗體、抗-tnf-α抗體、抗-il-1β抗體、抗-il-6抗體、抗-il-8抗體(如abx-il-8(阿布吉尼公司(abgenix))，和抗-il-12抗體)。

當與另外的治療劑組合給予時，共結晶和其它治療劑可以疊加地或更優選協同地起作用。在一個實施方式中，包含本公開的共晶的組合物與另一種治療劑同時給予，所述另一種治療劑可以是與包含本公開的化合物的組合物相同組成或不同組成的一部分。在另一個實施方式中，可以在給予另一種治療劑之前或之后給予共結晶。在另一個實施方式中，對之前未經受過或目前未經受其它治療劑，尤其是抗病毒劑治療的患者給予本發明的共結晶。

實施例

i.相容性研究

通過典型的相容性測定法(compass)測定本發明共結晶與藥學上可接受的賦形劑的相容性。根據該方法，賦形劑相容性的研究通過如下方式進行：通過將本發明的戊二酸共結晶與單一藥物賦形劑物理混合，從而形成二元混合物，或通過將本發明的戊二酸共結晶與含有兩種或更多種賦形劑的混合物物理混合(三元混合物)。每個二元混合物含有5重量％的式i化合物，而三元混合物中式i化合物的重量百分比為50％。將測試混合物在50℃下儲存4周或在40℃的溫度和75％的相對濕度下儲存4周。

本發明的共結晶與通常用于制備藥物組合物的填料和/或賦形劑相容。表4說明了使用本發明式i化合物的戊二酸共結晶的三元混合物的相容性研究的結果。表5說明了使用式i化合物的甲苯磺酸鹽的三元混合物的類似研究的結果。

表4

表5

包含本發明的戊二酸共結晶或式i的化合物的甲苯磺酸鹽的三元混合物含有下表6中所示比例的以下賦形劑。

表6

相容性研究的結果，表4和表5清楚地顯示了本發明的戊二酸共結晶與藥學上可接受的制劑制造過程中通常使用的藥物賦形劑和填料更相容。然而，發現相應的甲苯磺酸鹽與常用的賦形劑和/或填料不穩定。

例如，將包含戊二酸共結晶的三元混合物和藥物填料或賦形劑在50℃下儲存4周或在40℃/75％相對濕度下儲存4周顯示式i化合物幾乎不降解。在50℃時降解百分比的一般范圍為約0.02％至0.098％。濕度的存在不會不利地影響本發明共結晶的三元混合物的相容性和/或穩定性，在40℃和75％相對濕度的存在下，式i化合物的降解百分比沒有增加。

相比之下，在包含式i化合物的甲苯磺酸鹽和兩種或更多種藥物填料或賦形劑的三元混合物中，式i化合物的降解百分比較大。很明顯，水分的存在損害了含有甲苯磺酸鹽的三元混合物的相容性。如表5所示，濕度的存在增加了三元混合物的降解。對于甲苯磺酸鹽，三元混合物2在濕度存在的情況下顯示出約10％的降解，相比之下，本發明的戊二酸共結晶的類似的三元混合物的降解為0.02％。

這些數據清楚地表明，本發明的戊二酸共結晶比甲磺酸鹽與藥物制劑制造中通常使用的賦形劑和填料更相容。

ii.穩定性研究

通過在不同溫度和不同相對濕度的條件下將共結晶的測試樣品儲存一至三個月的時間來進行固態穩定性研究。通過超高效液相色譜(uplc)分析測試共結晶來判斷穩定性。共結晶的試樣中api的降解百分比計算如下：

降解％＝100*(參照樣品的api的auc％-測試樣品的api的auc％)/參照樣品的api的auc％

根據本發明的共結晶在研究中使用的溫度范圍內是相當穩定的。在濕度(75％相對濕度(r.h.))存在下的儲存沒有增加本發明共晶體的降解百分比。不歸因于特定理論，結晶度可能有助于本發明共結晶的穩定性。表7顯示了在40℃下和75％相對濕度的存在下在一定范圍的溫度內，根據本發明的式i戊二酸共結晶的穩定性的數據。

表7

*用作1個月穩定性的參照；**用作2個月穩定性的參照。

如表7所示，式i化合物的戊二酸酯共結晶在寬儲存溫度范圍和濕度存在下顯示出優異的穩定性。通過將式i化合物的游離堿的無定形形式與式i化合物的結晶形式進行比較，進一步支持結晶度有助于提高穩定性的假設，如表8所示。

表8

上述結果表明，結晶度確實對穩定性具有重要影響，因為結晶形式比相應的無定形形式更穩定，特別是在水分存在下。因此，結晶度也可能有助于提高本發明共結晶的穩定性。

本發明共結晶的改進的穩定性具有某些優點。更大的穩定性可以允許更好地處理和易于使用共結晶，特別是在商業規模制備共結晶和商業規模制備共結晶藥物制劑期間。增強的穩定性還可有助于增加固體藥物組合物如含有共結晶的片劑的保質期。

由于結晶形式不在溶液中保留，即當共結晶溶于溶劑時，只有式i化合物和溶劑之間的相互作用才能影響溶液的穩定性。因此，在相同的實驗條件下，預計共結晶、甲苯磺酸鹽或游離堿的結晶形式的溶液顯示相當的溶液穩定性。

iii.用于對共結晶的藥代動力學和毒性研究的制劑的開發

研究表明，共結晶可溶于水和緩沖溶劑。這些研究表明溶劑的ph影響共結晶的溶解度。在低ph下溶解度最高，例如在ph為1.0或ph為2.0的緩沖液中，并且溶解度隨緩沖液ph增加而降低。戊二酸共結晶的ph1.0緩沖溶液的uplc分析表明，每毫升緩沖溶液中存在超過60mg的游離堿形式的式i化合物。然而，基于uplc分析，每毫升ph7.0緩沖溶液中存在約22mg的游離堿形式的式i化合物。有趣的是，ph4.0緩沖液中的溶解度最低，每毫升緩沖液中存在大約8毫克的游離堿形式，最有可能是由于形成式i化合物的兩性離子形式。

在室溫下孵育24小時后對緩沖的共結晶溶液的分析顯示沒有降解。與甲苯磺酸鹽不同，本發明共結晶的溶液中不會形成遺傳毒性副產物。多形體篩選進一步顯示了表征為固體形式a的示例性戊二酸共結晶的單一多晶型物。

藥代動力學

進行研究以比較戊二酸共結晶的藥代動力學(pk)與式i化合物的甲苯磺酸鹽的pk。使用不含防腐劑的blanose7lfpm的3％溶液配制戊二酸共結晶和甲苯磺酸鹽。食蟹猴藥代動力學研究結果表明，口服各化合物后，戊二酸共結晶的血漿濃度大于相應的甲苯磺酸鹽。

在本研究中，每種化合物以10mg/kg的劑量口服給予食蟹猴。給藥后，在0分鐘、60分鐘、120分鐘和180分鐘從每個測試對象中獲得血液。在將血漿從全血中分離后，通過加入70％乙醇使各血漿樣品的等分試樣變性。通過離心使變性蛋白質沉淀，收集上清液并用干燥氮氣流干燥。將由此獲得的沉淀在含有0.1％甲酸的水中重建，并通過使用hss-t3(高強度二氧化硅)柱或ymctriartc-18柱的uplc分析重建的混合物。使用含有0.1％hcooh(流動相a)的水和含有0.1％hcooh(流動相-b)的乙腈的混合物進行梯度洗脫，用于藥代動力學(pk)樣品的分析。

如圖1所示，口服給予戊二酸共結晶提供了循環血漿中較高濃度的共結晶。事實上，口服給予戊二酸共結晶后檢測到的式i化合物的脫乙酰化形式的血漿濃度比經口服給予甲苯磺酸鹽后檢測到的式i的脫乙酰化形式的血漿濃度高約兩倍。

口服給予共結晶后，式i化合物的脫乙酰化形式的較高濃度也導致較高水平的活性藥物物質，即式i化合物的脫乙酰化氧化形式。參見方案1。式i化合物是雙前藥，其經酶促轉化為生物活性藥物的5-氨基-3-((2r，3r，5s)-3-羥基-5-(羥甲基)四氫呋喃-2-基)-3a，7a-二氫噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(3h，6h)-二酮，如以下方案1中所示。

方案1

相反，從以10mg/kg的口服劑量給予相應的甲苯磺酸鹽的猴獲得的血漿中觀察到較低水平的脫乙酰化形式的式i化合物和生物活性物質。幾個因素可導致觀察到的血漿中前藥和活性物質濃度差異。不受特定理論的約束，一個假說是共結晶的更大的穩定性，相比相應的甲苯磺酸鹽，共結晶在生物介質中的更大的溶解度以及肝和腎對共結晶的較低的清除速率可能促成了在口服給予戊二酸共結晶制劑后觀察到的脫乙酰化和活性物質的較高血漿水平。

基于pk結果，本發明的共結晶被認為是用于開發靶向癌癥、病毒感染(包括hbv感染)的治療的更好的候選治療。

b.口服glp毒理學研究

作為本發明的共結晶的藥物運載體，測試了三種載劑，不含防腐劑的blanose7lfpm(羧甲基纖維素鈉)，pluronicf60和聚乙烯醇。由于共結晶表現出良好的水溶性，因此不將表面活性劑加入到含共結晶的藥物制劑中。

使用含有不同量(濃度)的本發明共結晶的制劑進行毒理學研究。簡言之，將已知量的戊二酸共結晶溶解在各運載體中，以提供含有100mg/ml，10mg/ml和1mg/ml游離堿(式i化合物)的制劑。將各測試制劑分成三份相等的部分并在室溫2-8℃和-20℃下儲存。儲存七天后，通過超高效液相色譜(uplc)分析各制劑的含量和純度，并通過光學顯微鏡分析顆粒尺寸。還測量了每種制劑的ph。

制劑的ph不受運載體的影響，并且在七天試驗期間保持不變。根據使用的運載體，在所有儲存溫度下，測試制劑的測量ph值范圍為4.0至5.6。雖然在所有測試制劑中觀察到一定量的降解，但降解百分比在藥學上可接受的范圍內。然而，與使用其他兩種運載體制備的制劑相比，含有blanose7lfpm的制劑顯示出最大的降解百分比。

如表9所示，在許多試驗制劑中觀察到雙前藥(式i化合物戊二酸共結晶)向式i化合物的單一前藥(未乙酰化)形式的脫乙酰化。

表9

脫乙酰化在blanose7lfpm制劑中最顯著，最少存在于pluronicf60制劑中。這些結果表明運載體的性質可以影響活性藥物的降解速率和程度、觀察到的沉淀程度以及儲存后固體餅狀物質的形成。

在pva和pluronicf60制劑中，沉淀和固體餅狀產物的形成最顯著。與pva配方中形成的沉淀物不同，pluronicf60配方中形成的沉淀物可以通過搖動容易地分散。blanose制劑中的沉積物形成相對較慢。然而，一旦在blanose制劑中形成固體餅狀物，則該固體不能通過攪拌或搖動而容易地懸浮。

在室溫下儲存1個月后，選擇10％pluronicf60制劑作為體外和/或體內功效研究的運載體，因為其即使在長時間儲存后也能易于處理且具有提高的穩定性。

iv.制備方法

可以通過將共晶成形劑的溶液與式i化合物的溶液組合而合成包含式i化合物和至少一種共結晶成形劑的共結晶。具體地說，將兩種溶液以促進共結晶的共結晶成形劑與式i化合物的摩爾比組合。

根據本發明方法的一個實施方式，共結晶成形劑和式i化合物以1∶2的摩爾比組合。由此獲得的共結晶溶液過飽和以引發共結晶的形成。可以利用冷卻、溶劑蒸發或添加反溶劑來使共結晶溶液過飽和并引發共結晶形成。包含式i化合物和至少一種共結晶成形劑的共結晶可以通過過濾或化學領域已知的其它合適的方法從共結晶溶液中分離。

由于共結晶的形成需要式i化合物和共結晶成形劑之間的接觸，因此在一個實施方式中，式i化合物和共晶體成形劑可以一起研磨，然后熔化所得固體混合物并冷卻以形成共結晶。或者，結晶成形劑可以在與式i接觸之前熔化，并使所得混合物共結晶。可通過在適于促進共結晶的條件下合并式i的化合物與共結晶成形劑或通過合并式i的化合物與共結晶成形劑的溶劑合物來獲得本發明的共結晶。

測定固體混合物存在共結晶可以通過本領域已知的常規方法進行。例如，使用粉末x射線衍射技術來測定結晶混合物中共晶體的存在是方便和常規的。以類似方式使用的其他技術包括差示掃描量熱法(dsc)、熱重分析(tga)和拉曼光譜。單晶x射線衍射和固態nmr方法在鑒定共結晶結構中特別有用。

圖2顯示了包含式i化合物和戊二酸作為示例性共結晶成形劑的共結晶的合成。為了比較的目的，圖2還顯示了制備5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯的對甲苯磺酸鹽的方法。如圖所示，合成方法在商業生產共結晶時操作簡單，穩健，高效，且可擴大規模。此外，該方法是成本有效的，并且允許以良好的產率制造共結晶。

簡言之，脫氧腺苷(2)在酸性條件下經脫嘌呤。在一個實施方式中，通過使化合物2與乙酸酐、乙酸鉀和冰醋酸接觸以形成(3r，5s)-5-(甲基乙酰氧基四氫呋喃)-2，3-二基二乙酸酯(3)來實現脫嘌呤。

然后在三氟甲烷磺酸四甲基甲硅烷基酯(tmsotf)存在下將化合物3偶聯至5-氨基-3h-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮(4)[根據wolfe等，j.org.chem.1997，62，1754-1759]的方法制備以形成化合物5。雖然tmsotf作為用于將化合物3與化合物4偶聯的酸催化劑的示例，其它酸催化劑如alcl3、sncl4和ticl4也可以與n，o-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(“bsa”)或三甲基甲硅烷基氯化物等的硅化試劑一起使用。通常，化學計量的化合物3和4用于偶聯反應。然而，稍過量的5-氨基-3h-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮(4)可以用于合成化合物5。根據一個方面，5-氨基-3h-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮(4)與化合物3的摩爾比的范圍是約1.2∶1至約10∶1，約1.2∶1至約9∶1，約1.2∶1至約8∶1，約1.2：1至約7∶1，約1.2∶1至約6∶1，約1.2∶1至約5∶1，約1.2∶1至約4∶1，約1.2∶1至約3∶1，或約1.2∶1至約2∶1。

通過將化合物5與脂肪酶435孵育來實現5-甲基乙酰氧基的選擇性脫乙酰化。

酶催化的脫乙酰化通過將酶的緩沖溶液加入到化合物5的有機溶液中來進行。或者，酶可以共價連接到固體支持物上，并且通過使固體支持的酶與化合物5的有機溶液接觸來實現。使用固體支持的酶是有利的，因為它允許酶的高效循環并且允許更短的反應時間。

化合物如5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯(6)難以處理。反應溶劑的蒸發或化合物6從反應混合物中沉淀是困難的，此外，提供了不合適于共結晶形成的次優產物。根據本公開的方法消除了分離化合物6的需要，因為反應混合物含有純化狀態的化合物6和適于引發共結晶的溶劑混合物。因此，根據本發明的共結晶可以通過使含有化合物6的反應混合物與共結晶成形劑(固體)或共晶體成形劑的溶液接觸而容易地獲得。

根據一個實施方式，通過在環境溫度下使包含化合物6和共晶體成形劑的反應混合物老化來引發共結晶的形成。例如，反應混合物可以在約-10℃至約35℃，約10℃至約25℃，或約10℃至約20℃的溫度下老化。

如果需要冷卻來引發共結晶形成，共結晶混合物的溫度可以以約1℃/分鐘、約0.5℃/分鐘或約0.25℃/分鐘的速率冷卻。對于一些實施方式，冷反應混合物的溫度在約-20℃至約20℃，例如約-20℃至約-10℃，約-10℃至約0℃，約0℃至約5℃，或約0℃至約10℃的范圍內。

用于制備根據本發明的共結晶的其它技術包括但不限于機械共結晶合成，溶劑熱共結晶合成，共結晶合成使用溶劑蒸發，共晶合成固相研磨方法和共結晶合成溶劑滴研磨方法。

通過溶劑蒸發法合成共結晶包括制備式i化合物和合適的共結晶成形劑的分離溶液，將化學計量的式i化合物溶液與化學計量量的共結晶成形劑混合，并通過將反應混合物儲存在適于引發共結晶形成的溫度下，使所得到的含有式i化合物和共結晶成形劑的反應混合物飽和。

根據一個實施方式，通過溶劑滴磨法獲得本發明的共結晶。簡言之，將式i化合物(化合物6)和共晶體成形劑在少量的合適的共結晶溶劑存在下一起研磨，其被認為起催化劑的作用。

適于共結晶形成的溶劑包括例如，乙醇、甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、乙酸乙酯、乙腈、乙酸異丙酯、thf及其混合物。在一個實施方式中，將戊二酸的乙醇溶液加入到化合物6的甲苯-乙醇溶液中。然后將所得的過飽和反應混合物冷卻以形成5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-5-羥甲基四氫呋喃-3-基乙酸酯戊二酸共結晶。

通常，使用等摩爾或更大摩爾量的共結晶成形劑來合成共結晶。根據反應化學計量，共結晶成形劑與式i化合物的摩爾比可以為約1∶1、2∶2、或約2∶1。化合物6的溶液和共結晶成形劑的溶液的濃度可在約50毫摩爾至約2.0摩爾，例如約250毫摩爾，約500毫摩爾，約600毫摩爾，約700毫摩爾，約800毫摩爾，大約900毫摩爾，約1摩爾，約1.2摩爾，約1.4摩爾，約1.6摩爾，約1.8摩爾或約2.0摩爾變化。

共結晶的形成取決于共結晶成形劑的溶液濃度，式i化合物的溶液濃度，反應物(共結晶成形劑和式i化合物)和產物(共結晶)在適于引發共結晶形成的溫度下在反應混合物中的溶解性。一般共結晶時間可以為約10分鐘至約48小時，約10分鐘至約24小時，約10分鐘至約12小時，約10分鐘至約10小時，約10分鐘至約8分鐘，約10分鐘至約6小時，約10分鐘至約4小時，約10分鐘至約2小時，或約10分鐘至約1小時。

如此形成的共結晶可以通過重力過濾，真空過濾分離，然后洗滌分離的共結晶并干燥。也可以通過從反應混合物中蒸發溶劑來分離共結晶。分離的共結晶通常在約30℃至約70℃或約40℃至約60℃的溫度下干燥。干燥方法可以在大氣壓或減壓(真空)下進行，例如約0.1至約10毫米汞柱的減壓范圍。

上述方法提供了純度至少為95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％或99.9％的本發明的共結晶。使用本發明的方法合成以下示例性共結晶。

實施例

下面的合成方案僅是為了闡述，而不是用來限制權利要求的范圍。

在下文所述的合成方案中，除非另有說明，所有溫度以攝氏度計，且所有份數和百分數以重量計。試劑從商業供應商處購買，除非另有說明，不經進一步純化使用。所有溶劑均購自商業供應商，并按原樣使用。

以下反應通常在氬氣或氮氣的正壓下于室溫(除非另有說明)在無水溶劑中進行，并且反應燒瓶裝有橡膠隔片以供通過注射器引入底物和試劑。將玻璃器皿烘干和/或加熱干燥。所述反應由tlc檢測和/或由lc-ms分析，并且根據起始物質的消耗判斷是否結束。使用高強度二氧化硅(hss)柱或ymc柱進行超高效液相色譜(uplc)的分析。一般流速為0.7ml至1.0ml/分鐘，注射體積約為2-5μl。

分析薄層色譜(tlc)可在預被覆硅膠60f2540.25mm板(emd化學公司)的玻璃板上進行，并采用紫外光(254nm)和/或硅膠上的碘和/或采用tlc染劑的加熱來觀測，所述染劑例如磷鉬酸乙醇、茚三酮溶液、高錳酸鉀溶液或硫酸高鈰溶液。

在以600mhz操作的brukeravance光譜儀上記錄¹h-nmr譜和¹³c-nmr。以cdcl3溶液(以ppm報告)，使用參比標準的氯仿(對質子7.27ppm，且對碳77.00ppm)、cd3od溶液(對質子3.4和4.8ppm的參照標準，且對碳49.3ppm的參照標準)、dmso-d6(對質子2.49ppm)或適時使用內部的四甲基硅烷(0.00ppm)獲得nmr譜。若需要，可使用其它nmr溶劑。當報告峰值多重性時，使用以下縮寫：s(單峰)，d(雙峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，br(加寬)，bs(寬單重峰)，dd(雙重雙峰)，dt(雙峰三重峰)。當給出時，偶聯常數以赫茲(hz)報告。

5-氨基-3-(2’-o-乙酰基-3’-脫氧-β-d-呋喃核糖基)-3h-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮)的戊二酸共結晶的合成

偶聯反應-(2s，4r，5r)-4-乙酰氧基-5-(5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2h)-基-四氫呋喃-2-基-甲基乙酸酯(5)的合成

根據pct公開號：wo2008140549中描述的方案合成化合物5。簡言之，向裝有溫度探針、冷凝器和氮氣入口的三口燒瓶中加入5-氨基-3h-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮(化合物4)和乙腈。將n，o-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(bsa)通過漏斗加入到化合物4的溶液中，然后在氮氣氣氛下在40℃下攪拌90分鐘。冷卻至5℃后，加入1，2，5-三-o-乙酰基-b-d-呋喃核糖(化合物3)的乙腈溶液，然后加入tmsotf。

然后將反應混合物加熱至75℃，并在該溫度下保持10小時。加熱后，將含有反應混合物的燒瓶逐漸冷卻至15℃。然后將水加入到1ml部分的冷反應混合物中，以淬滅反應同時維持反應混合物的溫度為15℃。淬滅的反應混合物與硅藻土合并并用氫氧化鈉中和。將去除硅藻土后得到的濾液與碳酸氫鈉水溶液和固體氯化鈉混合，然后轉移到分液漏斗中并用乙腈萃取。濃縮有機層得到期望的產物，化合物5。化合物5的特性及其純度通過hplc使用可靠物質作為標準物測定。

b.選擇性脫乙酰化-化合物6的合成

將化合物5在乙腈中的溶液加入到與固體支持物結合的南極假絲酵母b型(biocatalytics目錄號imb-111)脂肪酶的碳酸氫鹽水性溶液中。將反應混合物(懸浮液)攪拌36小時，然后過濾酶連接的支持物。用乙酸乙酯萃取該濾液。合并的乙酸乙酯層用無水硫酸鎂干燥，與norit211攪拌90分鐘，然后通過硅藻土濾器輔助物過濾得到所需的醇(6)。化合物6的特性及其純度通過hplc使用可靠物質作為標準物測定。

c.共結晶形成

將含有17.2g化合物(6)[52.7mmol]的乙酸乙酯溶液(47.4ml)在60℃，180毫巴的減壓下進行旋轉蒸發以除去溶劑。將所得殘留物溶于乙醇(110ml)中并減壓濃縮(60℃，180毫巴)。然后將新鮮乙醇(83ml)加入到圓底燒瓶中的反應混合物中，并將混合物在室溫下攪拌直到得到化合物(6)的透明黃色乙醇溶液。

通過將戊二酸溶解在15ml乙醇中制備戊二酸溶液(3.62g，27.4毫摩爾)。然后將澄清的無色溶液在15分鐘內逐滴加入到攪拌的乙醇溶液化合物(6)中，在加入戊二酸的過程中將其加熱并保持在溫度50℃。然后將共結晶混合物以0.25℃/分鐘的速率冷卻至30℃以引發共結晶形成。攪拌冷共結晶混合物后，沒有形成晶體。

將共結晶混合物在攪拌下再加熱至50℃。將10mg式i化合物的戊二酸共結晶加入共結晶混合物中作為晶種以引發共結晶形成，并將混合物以0.25℃/分鐘的速率冷卻。隨著溫度降低，形成了無法攪拌的濃懸浮液。將共結晶混合物再加熱至55℃并保持在該溫度，直到獲得容易攪拌的懸浮液。

然后通過以0.25℃/分鐘的速率降低溫度將熱的攪拌懸浮液逐漸冷卻至約0℃。將冷共結晶混合物攪拌過夜，同時保持共結晶混合物的溫度在0℃和5℃之間。通過抽濾收集共結晶的懸浮液，用冷乙醇(43ml)洗滌，并在真空烘箱(＜5毫巴)中在40℃的溫度下干燥。產率-得到18.24g(88.1％)白色固體的戊二酸共結晶。通過hplc測定共結晶的純度，發現純度為99.75％。

表10顯示了使用類似于實施例1中公開的方案合成的示例性共結晶和示例性共結晶的相應物理特性。

表10

如上所述，本發明共結晶的鹽分因素(s)低于式i化合物的甲苯磺酸鹽的鹽分因素(stos為1.53)。由于它們較低的s-值，含有共晶體的組合物在較低口服劑量下達到式i化合物的較高穩態血漿濃度。因此，接受治療的患者將需要比接受式i化合物的甲苯磺酸鹽的組合物的患者所接受的更少的口服劑量的共結晶組合物以達到治療上適合的式i化合物的血漿濃度。

v.對hbv病毒復制子復制活性的抑制

hbv感染是急性和慢性肝病的主要原因之一。雖然目前的hbv治療方法有效降低血清hbvdna水平，但是這些治療劑在降低病毒清除速率方面的效果有限，并且通常需要長時間使用，這會引起嚴重的毒副作用。本發明提供了作為toll樣受體7(tlr-7)激動劑的式i化合物的共結晶，其在未成熟樹突狀細胞上表達。

tlr是通過刺激宿主中細胞因子和趨化因子的釋放而激活免疫應答的病原體識別受體的家族。在宿主免疫系統激活時釋放的細胞因子和趨化因子是有效的抗病毒劑，主要是由于其識別和殺死病毒感染細胞的能力。因此，分別評估式i化合物(雙前藥)，單一前藥(脫乙酰化的式i化合物或式i化合物的氧化形式)和未乙酰化的氧化形式的式i化合物(生物活性物質)在體外抑制hbv復制的能力。方案1(上述)說明了雙前藥的結構，單一前藥和生物活性物質的結構。

通過監測含hbv感染的heparg細胞的培養物中分泌的hbvdna水平和hbv表面抗原(hbsag)水平，評價對病毒復制的直接抑制。通過將hbv感染的heparg細胞暴露于由未乙酰化的氧化形式的式i化合物(生物活性物質)(其是選擇性tlr-7激動劑)刺激的外周血單核細胞(pbmc)的條件培養基中間接評估培養物中的病毒復制。

heparg細胞系的生成

heparg細胞(cat#hpr101)、heparg生長培養基補充劑(cat#add710)和heparg分化培養基補充劑(cat#add720)購自biopredics國際公司(法國雷恩)。雖然生長培養基補充劑中沒有dmso，但分化培養基補充劑含有2％dmso。在含有生長培養基補充劑的william′se培養基(wem)(gibco))中，在含5％co2的加濕氣氛中于37℃培養細胞。為了起始分化，將生長培養基與分化培養基(含有分化培養基補充劑的wem)以1∶1比例組合，并加入到融合的heparg細胞中。

孵育三天后，將合并的培養基用分化培養基替換，并將細胞在分化培養基中再維持2至4周。分化培養基在整個孵育期間每2至3天更換一次。分化的heparg細胞(hepargd)顯示由單層膽汁樣細胞包圍的肝細胞樣細胞島。在hbv感染和化合物治療之前，將hepargd細胞以每孔50,000至60,000個細胞接種到膠原i包被的96孔板(吉布可公司，cat#a11428-03)中。允許細胞在hbv感染之前在接種至少1周后在96孔板中恢復其分化表型。

hbv感染

如sellm.a.等，pnas，84(4)：1005-1009所述，從hepg2.2.15培養細胞，一種支持hbv(基因型d，株系ayw)復制和病毒體分泌的細胞系收集hbv接種物。將hepg2.2.15細胞維持在含有預先包被膠原蛋白i的hyperflask(康寧公司)的含有1×pen/strep(英杰公司)、10％fbs和0.25mg/mlg-418(英杰公司)的dmem+glutamax-1(bdbiosciences)中。達到融合后，用含有1×pen-strep，2.5％fbs和1％dmso的dmem+glutamax-1替換hepg2.2.15培養基3天，然后用含有1×pen-strep和1％dmso的dmem+glutamax-1替換。在2周內每3至4天收集含1％dmso的培養基，并且通過在tvbeckman轉子中20％蔗糖墊的超速離心以45,000rpm離心4小時，在4℃下將hbv感染性病毒粒子和亞病毒顆粒沉淀3小時。將沉淀以10⁸-10⁹基因組當量(ge)/ml的濃度重懸于wem中，通過實時pcr測定，如下所述，使用含有基因型dhbv的質粒dna作為內標。為了評估接種物的感染性，將96孔板中的hepargd細胞在含有50-200ge/細胞和4％peg8000(聚乙二醇8000，西格瑪公司，cat#p5413-500g)的分化培養基中在37℃下感染16小時。在感染結束時，移除hbv接種物，細胞用分化培養基洗滌3次。每2-3天補充分化培養基，通過測定分泌的hbvdna、乙型肝炎表面(hbsag)和/或e(hbeag)抗原來監測hbv復制。

分泌的hbv抗原和hbvdna的檢測

按照由制造商(autobio診斷公司，鄭州，中國)推薦的說明書使用hbsag化學發光免疫試驗從50μl的hbv感染的heparg上清中檢測hbsag。使用magnapure96dna和病毒na小體積試劑盒(羅氏，cat#05467497001)，從50μlhbv感染的hepargd上清液中提取hbvdna。使用eagletaq主混合物試劑盒(羅氏，cat#05529026190)和以下加熱/冷卻循環條件用正向引物ctgtgccttgggtggcttt，反向引物aaggaaagaagtcagaaggcaaaa和探針56-fam-agctccaaa/zen/ttctttataagggtcgatgtccatg-3iabkfq(idtdna)擴增覆蓋核心區的99個核苷酸片段：50℃下2分鐘，95℃下10分鐘，和40個循環的95℃下15秒和60℃下1分鐘。使用viia7實時pcr系統(生命技術公司)進行所有pcr反應。

hbv病毒復制的抑制

本發明的式i化合物的共結晶是雙前藥，其在體內酶促轉化為生物活性藥物的5-氨基-3-((2r，3r，5s)-3-羥基-5-(羥甲基)四氫呋喃-2-基)-3a，7a-二氫噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(3h，6h)-二酮，如上述方案1中所示。據信這些化合物通過刺激toll樣受體，特別是tlr-7來釋放細胞因子和趨化因子，發揮抗病毒活性。為了確定病毒復制抑制活性，合成了戊二酸共結晶(雙前藥)、脫乙酰化形式的式i化合物(單一前藥)和生物活性物質(ro6871765)。

測量hbv復制的直接和間接抑制活性。在本研究中，使用roferon-a、il-6、tnf-α、ip-10或dmso作為無藥物對照。對于戊二酸共結晶的直接研究儲備溶液，在wem生長培養基中制備式i化合物的脫乙酰化形式和生物活性物質(ro6871765)以及對照劑，最終體積為120μl，dmso濃度為2％(v/v)。將這些試劑的等分試樣在感染后第4天加入含有hbv感染的hepargd細胞的96孔培養板的獨立孔中。每個孔中dmso的終濃度為2％。在抑制研究中使用的hepargd細胞保持在含有2％dmso的分化培養基中。為了評估hbv復制的間接抑制活性，將hbv感染的hepargd細胞與收集自dmso(對照)或ro6871765(100μm)刺激的pbmc的條件培養基一起孵育，在分化培養基中連續稀釋。

通過向培養中的hbv感染的細胞中加入含有測試化合物的分化培養基等分試樣或條件培養基的等分試樣來發揮hbv病毒復制抑制活性。每2至3天向培養中的hbv感染細胞中加入含有測試化合物或條件培養基的已知等分試樣的分化培養基，共7天。在治療的第7天(感染后11天)，如上所述，使用50μl上清液分別用于使用clia或實時pcr測定分泌的hbv抗原或hbvdna的水平。使用celltiter-glo(普洛麥格公司，cat#g7571)測定細胞活力。通過使用graphpad(加利福尼亞州拉由拉市)獲得劑量-反應曲線。根據劑量-反應曲線計算ec50(引起50％抑制的有效濃度)和cc50(未處理細胞對照)值作為測試化合物的濃度或條件培養基濃度(對數稀釋度)，其中與沒有藥物的對照相比，觀察到hbv病毒復制活性降低50％。ec50和cc50值來自2-4次獨立的hbv感染研究，每次一式兩份進行。

ro6871765對hbv復制的直接影響

先前的病毒抑制研究已經表明戊二酸共結晶(雙前藥)和脫乙酰化形式的式i化合物(單一前藥)不能抑制培養的heparg細胞中的病毒復制。為了評估ro6871765(生物活性物種)是否在heparg細胞中抑制hbv病毒復制，感染的細胞在感染后第4天與已知濃度的ro6871765一起孵育。使用ro6871765的200μm儲備液的系列稀釋液來制備測試溶液。在病毒抑制研究中測試的ro6871765的濃度分別為200μm、66.67μm、22.22μm、7.41μm、2.47μm和0.82μm。每3天用含有已知濃度的ro6871765或2％dmso(對照細胞)的新鮮培養基補充細胞培養基。作為陽性對照，使用以56pm，167pm和500pm三種不同濃度的聚乙二醇化干擾素-α2a處理的hbv感染的hepargd細胞。

在治療的第7天(細胞感染后11天)測量分泌的hbsag和hbvdna的水平。如圖3a所示，ro6871765沒有發揮任何直接的抗hbv作用。對于用最高濃度(200μm)的ro6871765孵育的細胞，檢測到hbvdna或hbsag水平無變化。因此，ro6871765的ec50大于200μm(圖3a，表11)。當用ro6871765處理hbv感染的hepargd細胞時，觀察不到明顯的細胞毒性(cc50＞200μm，最高濃度的ro6871765下，活力最大降低約17％)。

表11

相比之下，用聚乙二醇化干擾素-α2a處理的hbv感染的hepargd細胞顯示出hbv復制的顯著降低。在測試的最高濃度(500pm；見圖3b，表12)下，分泌的hbvdna和hbsag的水平分別降低了76.9％±14.8％和46.0％±6.3％。

表12

這些結果表明ro6871765具有弱抗病毒活性。然而，令本發明人驚奇的是，從ro6871765獲得的條件培養基刺激的pbmc顯著降低來自hbv感染的培養的heparg細胞的hbvdna和hbsag分泌物，從而為ro6871765間接抑制hbv病毒復制提供支持。

ro6871765對hbv復制的間接影響

tlr-7激動劑刺激來自人pbmc的細胞因子和趨化因子的生成。通過將培養的pbmc與dmso(對照)接觸或100μmro6871765(藥物)與hbv感染的hepargd細胞接觸獲得條件培養基。

將hbv感染的hepargd細胞與從健康供體-供體70615(圖a-d)和供體77726(圖e，f)分離的pbmc收集的各種稀釋的條件培養基孵育。來自每個供體的pbmc用dmso(圖a，c，e)或100μmro6871765(圖b，d，f)刺激。圖4a，4c和4e對應于使用dmso刺激的pbmc對hbv病毒復制的抑制，而圖4b，4d和4f對應于使用ro6871765刺激的pbmc的hbv病毒復制的抑制。進行三項實驗。在第一個實驗(圖4a，4b)中，首先使用分化培養基將來自pbmc(供體70615)的條件培養基稀釋10倍，然后以3倍增量連續稀釋，隨后將每種稀釋的條件培養基加入hbv感染的hepargd細胞。在第二個實驗(圖4c，4d)中，首先使用分化培養基將來自pbmc(供體70615)的條件培養基稀釋5倍，然后以5倍增量連續稀釋，隨后加入hbv感染的hepargd細胞。在第三個實驗(圖4e，4f)中，首先使用分化培養基將來自pbmc(供體77726)的條件培養基稀釋5倍，然后以5倍增量連續稀釋，隨后加入hbv感染的hepargd細胞。通過監測在培養基中分泌的hbvdna和hbsag的水平，測定對照和ro6871765處理的細胞的hbv復制抑制活性。

如圖4所示，用dmso處理的pbmc的條件培養基不誘導任何顯著的抗病毒作用(參見圖4a，4c和4e和表13)。相比之下，在用ro6871765處理的pbmc的條件培養基存在下，觀察到分泌的hbvdna和hbsag水平的劑量依賴性降低(參見圖4b，4d和4f，表13)。ro6871765對hbvdna的平均ec50值為-2.5±0.4log10，相當于ro6871765刺激條件培養基的1∶318稀釋度(表13)。ro6871765刺激條件培養基對hbv表面抗原(hbsag)分泌的平均ec50值為-1.2log10，相當于1∶16稀釋度(表13)。細胞活力測定顯示，來自dmso處理的pbmc的條件培養基沒有顯示出顯著的細胞毒性作用，而用來自ro6871765刺激的pbmc的稀釋的條件培養基(10倍和5倍稀釋)處理的hbv感染的hepargd細胞顯示細胞活力的分別輕微降低14％和19％(圖4，表13)。

表13

^asd-標準偏差

獲得的用ro6871765處理的培養的pbmc的條件培養基的抗病毒效果最有可能歸因于從pbmc釋放細胞因子和趨化因子。來自條件培養基的細胞因子分析研究表明，ro6871765誘導干擾素α(ifn-α)，白細胞介素6(il-6)，腫瘤壞死因子α(tnf-α)和ifnγ誘導的蛋白10(ip-10)，而當用dmso處理pbmc時，沒有觀察到這些細胞因子的釋放。

為了研究ifn-α2a(羅擾素(roferon-a))，il-6，tnf-α和ip-10對hbv復制的影響，使用hbv感染的heparg細胞測定進行這些細胞因子中的每一種的劑量依賴性滴定。測試的最高濃度為-對于羅擾素(roferon-a)為1000iu/ml，對于il-6、tnf-α和ip-10為1000ng/ml，隨后將其轉化為摩爾濃度進行比較。

如圖5所示，羅擾素(roferon-a)和il-6都顯示出對分泌的hbsag和hbvdna的劑量依賴性抑制。羅擾素(roferon-a)和il-6對hbvdna分泌的ec50值分別為1.0±0.3pm和0.027±0.0073nm。羅擾素(roferon-a)和il-6也分別以0.033±0.022nm和0.26±0.020nm的ec50值抑制hbsag分泌。雖然tnf-α似乎抑制hbv復制，但是即使在約1nm的濃度下，該細胞因子也是細胞毒性的。tnf-α對hbvdna和hbsag分泌的ec50值分別為0.085±0.046nm和0.32。即使在測試的最高濃度(ec/cc50＞115nm，參見圖5)，也未觀察到趨化因子ip-10的細胞毒性或hbv復制抑制作用。這些數據一起強烈地表明ro6871765刺激的pbmc條件培養基通過介導從人pbmc中釋放ifn和細胞因子的間接機制來抑制hbv復制。