新的肽化合物、其制備方法及其用途與流程

本發明涉及新的肽化合物、其制備方法，和所述新的肽化合物的用途。
背景技術：
：衍生自微生物的生理活性物質已經成為抗生素、抗真菌劑和抗癌藥物的來源，并已被開發為用于治療各種疾病的新藥或者成為新藥開發的模板。衍生自微生物的抗生素的實例是兩性霉素、紅霉素、鏈霉素、四環素和萬古霉素。此外，從鏈霉菌屬(其為放線菌屬)分離的達托霉素(deptomycin)在2013年被(fda)批準為下一代抗生素。來自微生物的抗癌藥物的實例是多柔比星、博來霉素、光輝霉素、新制癌菌素、噴司他丁和埃博霉素。因此，從細菌衍生的生理活性物質的研究在抗菌劑、抗真菌劑和抗癌藥的開發中是非常重要的。為了篩選與現有物質結構不同的生理活性物質，最近研究的一個策略是在地理和系統發育的特定環境中研究天然產物。雖然容易得到的土壤微生物和陸地植物在長時間內已被廣泛地研究用于天然產物，但是對微生物或海洋來源的研究相對不積極。海洋覆蓋了地球表面的約70％，而海洋本身則被視為大部分未被探索的充滿機遇的空間。雖然海洋微生物的多樣性尚未得到充分的確定，但到目前為止，這一領域的研究很少，據信只有1％的海洋微生物被培養或識別出來。因此，考慮到新結構的抗生素和抗癌藥物的發展，有必要選擇產生有用的生理活性物質的海洋微生物，并探索和開發生產新化合物的這種海洋微生物。因此，在選擇和研究新的海洋真菌時發現了新的菌株。此外，在研究新菌株的同時，發現新菌株能夠生產新的肽化合物，其也因此被發現具有抗癌活性，從而完成了本發明。本發明的詳細描述技術問題提供了新的肽化合物及其異構體、衍生物或藥學上可接受的鹽。此外，提供了產生所述肽化合物的曲霉屬的菌株f452。此外，提供了產生所述肽化合物的方法。此外，提供了用于預防或者治療癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含肽化合物。此外，提供了預防或者治療癌癥的方法。技術方案根據一個方面，提供了包含脂肽和苯甲酮的新的肽化合物或者所述肽化合物的異構體、衍生物或者藥學上可接受的鹽。根據另一方面，提供了產生所述肽化合物的曲霉屬的菌株f452。根據另一方面，提供了產生所述肽化合物的方法。根據另一方面，提供了藥物組合物，其包含肽化合物或者所述肽化合物的異構體、衍生物或者藥學上可接受的鹽。根據另一方面，提供了預防或者治療癌癥的方法，所述方法使用所述肽化合物或者所述肽化合物的衍生物或者藥學上可接受的鹽。本發明的有利效果包含脂肽和苯甲酮的新肽具有抗癌活性，并因此可用于預防或者治療各種類型的癌癥。此外，可使用低價格的大量培養基提供高收率的肽化合物。附圖說明圖1a和1b分別顯示了asperphenina和asperpheninb的結構式；圖2為顯示了培養曲霉菌屬菌株f452的培養基的圖像；圖3a為顯示了根據asperpheninb濃度的各細胞周期的rko細胞比率(％)的圖，以及圖3b和3c為各自顯示在2.5μm和5μm的濃度時根據asperpheninb培育時間的細胞周期的rko細胞比率(％)的圖；圖4為顯示了根據asperpheninb濃度，活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡或者壞死的細胞、或者壞死細胞的比率(％)的圖；圖5a和5b各自為根據asperpheninb濃度和asperpheninb在5μm濃度時的培育時間(以小時計)的細胞周期相關蛋白的免疫印跡圖像；圖6a和6b各自為根據asperpheninb濃度和asperpheninb在5μm濃度時的培育時間(以小時計)的細胞凋亡相關蛋白的免疫印跡圖像；圖7a至7c各自為顯示了asperpheninb和其它抗癌藥物的組合或者僅其它抗癌藥物的細胞生存力(％)的圖；和圖8為顯示了在將4mg/kg或者8mg/kgasperpheninb給藥至小鼠之后根據天數的小鼠的腫瘤體積的圖。最佳實施方式本發明的一個方面提供了包含脂肽和苯甲酮的肽化合物或者所述肽化合物的異構體、衍生物或者藥學上可接受的鹽。本發明中使用的術語"肽化合物"是指包含肽的化合物。肽是這樣的化合物：其中兩個或者更多個氨基酸通過一個氨基酸的羧基和另一氨基酸的氨基之間的肽鍵連接。根據構成肽的氨基酸的數目，所述肽可為二肽、三肽、四肽等。具有約10個以下肽鍵的肽被稱為寡肽，以及具有多個肽鍵的肽被稱為多肽。本發明所用的術語“異構體”是指與另一分子具有相同分子式但具有分子中的組成原子的連接或空間排列不同的化合物。異構體可以包括例如結構異構體和立體異體體。本發明所用的術語“衍生物”是指通過將化合物的一部分結構取代為另一結構或原子基團而獲得的化合物。本發明所用的術語“藥學上可接受的鹽”是指化合物的無機鹽和有機加成鹽。本發明所用的術語“脂肽”是指包括與肽連接的脂質的物質。脂肽可以包括通過酰胺鍵連接到肽的脂質。酰胺鍵也稱為肽鍵，并且是一個分子的氨基和另一個分子的羧基連接的共價鍵。所述脂質可為取代的或者未取代的c12-c20烷基、取代的或者未取代的c2-c20烯基或者取代的或者未取代的c2-c20炔基。所述烷基可為c2-c20烷基、c5-c20烷基或者c10-c15烷基。所述烷基可包括12個碳。所述烯基可為c2-c20烯基、c5-c20烯基、c10-c20烯基或者c10-c15烯基。所述炔基可為c2-c20炔基、c5-c20炔基、c10-c20炔基或者c10-c15炔基。本發明中使用的表達"取代的"是指有機化合物中的氫原子被另一原子團取代以形成衍生物。在這里，“取代基”為被引入的原子基團。所述取代基可為例如羥基、鹵素原子、c1-c20烷基、c2-c20烯基、c2-c20炔基、c1-c20雜烷基、c6-c20芳基、c6-c20芳基烷基、c6-c20雜芳基或者c6-c20雜芳基烷基、硝基、氰基、氨基、脒基、肼基、腙基、羧基或者其鹽、磺酸或者其鹽或者磷酸或者其鹽。所述肽可包含兩個、三個或者四個或者更多個氨基酸。所述肽可為例如包含三個氨基酸的三肽。所述肽可包括例如n末端-天冬酰胺(asp)-谷氨酰胺(gln)-亮氨酸(leu)-c末端。所述肽可包括一個或者多個β-氨基酸。氨基酸可包含氨基、羧基和該氨基酸特有的側鏈。20種類型的標準生物氨基酸具有連接至羧基的α碳的氨基，而β-氨基酸具有連接至羧基的β碳的氨基。其中的側鏈連接至與胺相鄰的碳的β-氨基酸為β3-氨基酸，以及其中的側鏈連接至與羧基相鄰的碳的β-氨基酸為β2-氨基酸。所述β-氨基酸可為β-亮氨酸。所述β-氨基酸可為β3-亮氨酸。所述苯甲酮可為二苯基甲酮，其為具有式(c6h5)2co的有機化合物。所述苯甲酮可為例如被1個、2個或者3個或者更多個羥基取代的化合物。例如，所述苯甲酮可為這樣的化合物：其中至少一個選自第5號碳、第9號碳和第13號碳的碳被羥基取代。所述脂肽和所述苯甲酮可經酮連接基連接。例如，所述苯甲酮可連接至所述脂肽的c-末端。所述肽化合物可由式1表示，[式1]在式1中，r1可為取代的或者未取代的c1-c20烷基、取代的或者未取代的c1-c20烯基或者取代的或者未取代的c1-c20炔基，其中r1可選擇性地為未取代的或者被羥基取代，r2、r3和r4可各自獨立地選自氫、羥基、鹵素基團、氰基、-c(＝o)ra、-c(＝o)ora、-oco(ora)、-c＝n(ra)、-sra、-s(＝o)ra、-s(＝o)2ra、-pra、取代的或者未取代的c1-c20烷基、取代的或者未取代的c1-c20烷氧基、取代的或者未取代的c2-c20烯基、取代的或者未取代的c2-c20炔基、c2-c20烯烴氧化物基團、取代的或者未取代的c3-c30環烷基、取代的或者未取代的c6-c30芳基、取代的或者未取代的c6-c30芳基氧基、取代的或者未取代的c6-c30雜芳基或者其組合，以及r5可為取代的或者未取代的苯甲酮。烷基、烯基、炔基和所述取代以及所述苯甲酮與上述相同。所述肽化合物可為由式2表示的化合物，[式2]由該式表示的化合物可為由式3或者4表示的化合物或者其異構體、衍生物或藥學上可接受的鹽，[式3][式4]本發明的一個方面提供了曲霉屬的菌株f452(登記號：kctc12688bp)，所述菌株產生包含脂肽和苯甲酮的肽化合物。所述脂肽、所述苯甲酮和所述肽化合物與上述相同。所述菌株可包括其突變株。所述突變株可例如通過天然突變株或者人工突變株所產生。所述人工突變株可通過物理誘變原(如紫外線)或者化學誘變原(如堿化合物)所導致。所述菌株可包括其孢子、菌體或者培養物。所述菌株可從海洋沉積物分離或者衍生。本發明的一個方面提供了產生包含脂肽和苯甲酮的肽化合物的方法，所述方法包括培養曲霉屬的菌株f452(登記號：kctc12688bp)以制備培養基；和從所述培養基分離包含脂肽和苯甲酮的肽化合物。所述方法可包括培養曲霉屬的菌株f452(登記號：kctc12688bp)以制備培養基。所述曲霉屬的菌株f452與上述相同。所述培養可為在液體培養基或固體培養基中培養菌株。所述培養基可包含instantocean。所述培養基可包含碳源，例如葡萄糖、大米、淀粉糖漿、糊精、淀粉、糖蜜、動物油或植物油。所述培養基可以包含氮源，諸如酵母提取物、胨、麥麩、大豆油粉、小麥、麥芽、棉籽粉、魚粉、玉米漿、肉汁、硫酸銨、硝酸鈉或尿素。如果需要，所述培養基可包含食鹽、鉀、鎂、鈷、氯、磷酸、硫酸或者刺激其它離子的產生的無機鹽。所述培養基可包含例如instantocean、酵母提取物、胨和大米。所述培養可以是在有氧條件下進行的搖動培養或者靜置培養。進行培養的溫度可為例如約20℃至約37℃或者約25℃至約30℃或者可為27℃。培養所需的時間可為例如1天至2個月、1周至2個月、2周至2個月、1個月至2個月或者6周。所述方法可包括從培養基分離肽化合物，所述肽化合物包含脂肽和苯甲酮。所述脂肽、所述苯甲酮，和所述肽化合物與上述相同。從培養基分離所述肽化合物可包括對培養基實施濃縮、離心、過濾或者色譜法。例如，可將培養基用乙酸乙酯、水或者其組合萃取。根據極性，可將得到的濃縮物通過色譜法分離成8個級分。所述色譜法可為例如反相快速色譜法，其使用例如水、乙腈或其組合作為移動相。所述級分可通過使用反相快速色譜法拆分，由此得到8個級分。在得到的級分中，用水/乙腈混合溶液(其以50:50的體積比混合)洗脫的級分能夠通過使用高效液相色譜(hplc)分離所述肽化合物。所述hplc使用水/甲醇混合溶液(其以70:30的體積比率混合)作為移動相，并且可通過使用反相半制備性hplc實施。分離的肽化合物可具有約80％、約90％或者約99％或者更多的純度。本發明的一個方面提供了用于預防或者治療癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含肽化合物或者所述肽化合物的異構體、衍生物或者藥學上可接受的鹽，所述肽化合物包含脂肽和苯甲酮。所述脂肽、所述苯甲酮、所述肽化合物、所述異構體、所述衍生物，和所述藥學上可接受的鹽與上述相同。所述癌癥可包括例如肝內膽管癌、肝癌、甲狀腺癌、結腸癌、睪丸癌、骨髓增生異常綜合征、膠質母細胞瘤、口腔癌、蕈樣真菌病、急性髓細胞樣白血病、慢性髓細胞樣白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴母細胞性白血病、基底細胞癌、卵巢上皮癌、卵巢胚細胞瘤、男性乳腺癌、腦瘤、垂體腺瘤、多發性骨髓瘤、膽囊癌、膽道癌、結腸癌、視網膜母細胞瘤、脈絡膜黑色素瘤、vater壺腹癌、膀胱癌、腹膜癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、非小細胞肺癌、舌癌、星形細胞瘤、小細胞肺癌、小兒腦瘤、小兒淋巴瘤、小兒白血病、小腸腫瘤、腦膜瘤、食管癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、腎盂和輸尿管癌、腎癌、惡性軟組織腫瘤、惡性骨瘤、惡性淋巴瘤、惡性間皮瘤、惡性黑色素瘤、眼瘤、陰部癌癥、尿道腫瘤、原發來源不明癌、胃淋巴瘤、胃癌、胃良性腫瘤、胃腸道間質瘤、willms腫瘤、乳腺癌、肉瘤、陰莖癌、咽癌、妊娠滋養細胞疾病、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、轉移性腦瘤、直腸癌、直腸良性腫瘤、陰道癌、脊髓腫瘤、前庭神經鞘瘤、胰腺癌、涎腺瘤、扁桃體癌、鱗狀細胞癌、肺腺癌、肺癌、肺鱗狀細胞癌、皮膚癌、肛門癌、喉癌或其組合。所述癌癥可為例如肺癌、結腸癌、胃癌、肝癌或者乳腺癌。本發明所用的術語“預防”是指通過施用組合物抑制疾病或延遲發作的任何行動。本發明所用的術語“治療”是指通過施用組合物來改善或減輕疾病癥狀的任何行動。藥物組合物可以進一步包括具有抗癌活性的已知活性成分。這種已知的活性成分可以是抗癌藥物。所述抗癌藥物可為依立替康、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、依托泊甙、紫杉醇或其組合。當還包含所述抗癌藥物時，所述藥物組合物可為單一組合物或者獨立組合物。所述藥物組合物還可包含載體、賦形劑或者稀釋劑。這種載體、賦形劑或者稀釋劑可為例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、甲基羥基苯甲酸酯、丙基羥基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂或者礦物油。根據常規方法，藥物組合物可以以口服制劑(如粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、混懸劑、乳劑和糖漿劑)、氣霧劑、外用制劑、栓劑或無菌注射溶液劑的形式配制。在制劑中，可使用常用的稀釋劑或者賦形劑，如填料、膨脹劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑和表面活性劑。關于藥物組合物，用于口服的固體制劑可以是片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑或膠囊劑。固體制劑可以進一步包括賦形劑。這種賦形劑可為例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或者明膠。此外，所述固體制劑還可包括潤滑劑，例如硬脂酸鎂或者滑石。關于藥物組合物，用于口服的液體制劑可為混懸劑、溶液劑、乳劑或者糖漿劑。所述液體制劑可包含水或者液體石蠟。所述液體制劑可包含賦形劑，例如濕潤劑、增甜劑、空氣清新劑或者防腐劑。關于藥物組合物，用于腸胃外給藥的制劑可以是無菌水溶液、非水溶液、混懸劑、乳劑、凍干劑或栓劑。非水溶液或者混懸劑可包含植物油或者酯。植物油可包括例如丙二醇、聚乙二醇或者橄欖油。酯可包括例如油酸乙酯。栓劑的基質可為witepsol、macrogol、tween61、可可紙(cacaopaper)、月桂精或者甘油明膠。本發明的一個方面提供了預防或者治療癌癥的方法，所述方法包括將用于預防或者治療癌癥的藥物組合物給藥于個體，所述藥物組合物包含肽化合物或者所述肽化合物的異構體、衍生物或者藥學上可接受的鹽，所述肽化合物包含脂肽和苯甲酮。所述脂肽、所述苯甲酮、所述肽化合物、所述異構體、所述衍生物、所述藥學上可接受的鹽、癌癥、預防、治療和藥物組合物與上述相同。個體可以是哺乳動物，包括大鼠、小鼠、狗、牛、猴和人。所述肽化合物的優選劑量根據患者的狀況和體重、疾病程度、藥物形式和給藥途徑及時間而變化，但可以由本領域普通技術人員進行適當選擇。然而，所述肽化合物的給藥量例如可為約0.0001mg/kg至約100mg/kg或者約0.001mg/kg至約100mg/kg，每天一次或者數次。基于總組合物的總重量，所述肽化合物在藥物組合物中的含量可為約0.0001wt％至約10wt％或者約0.001wt％至約1wt％。所述肽化合物的藥物劑型可為所述肽化合物的藥學上可接受的鹽的形式。所述肽化合物可單獨使用或者與其它藥物活性化合物組合使用。藥物組合物可以以各種途徑給予哺乳動物，所述哺乳動物包括大鼠、小鼠、狗、牛、馬、猴和人。給藥方法可以是例如口服、直腸或靜脈內、肌內、皮下、宮內或腦室內注射。所述方法還可包括將抗癌藥物給藥于個體。所述肽化合物、其異構體、衍生物或者藥學上可接受的鹽可與所述抗癌藥物同時、單獨或者順序給藥。例如，可以在將肽化合物或肽化合物的異構體，衍生物或藥學上可接受的鹽給予個體后，再向個體施用抗癌藥。以下，參照所附的實施例，對本發明進行更全面的說明。然而，這些實施例僅用于說明的目的，并且不應被解釋為以任何方式限制本發明構思的范圍。實施例1.asperphenina和asperpheninb的分離和鑒別1-1.分離曲霉屬(曲霉屬)的菌株f452為了篩選產生具有抗癌活性的物質的菌株，從熱帶海洋沉積物中分離菌株f452。分離菌株f452的全基因組，并使用聚合酶鏈反應(pcr)克隆18s核糖體dna序列。分析18s核糖體dna的核酸序列(seqidno:1)。作為核酸序列分析的結果，所述菌株f452被鑒定為與花斑曲霉(aspergillusversicolor)系統性相似的新菌株。所述菌株f452被命名為曲霉屬的菌株f452，然后于2014年10月13日(登記號：kctc12688bp)存放在保藏機構。1-2.培養曲霉屬的菌株f452將所述曲霉屬的菌株f452在無菌的ypg固體培養基(每1l蒸餾水含5g酵母提取物、5g胨、10g葡萄糖、16g瓊脂，和24.8ginstant(aquariumsystems))中培養，然后在27℃的溫度進行數天的原代培養。將在原代培養的固體培養基中培養的菌株f452在無菌的ypg液體培養基(每1l蒸餾水含5g酵母提取物、5g胨、10g葡萄糖，和24.8ginstant(aquariumsystems))中培養，然后在27℃的溫度進行7天的次級培養，同時以150rpm搖晃。將10ml次級培養物在固體大米培養基(每500ml蒸餾水含200g大米(organicaco.,ltd.,icheonrice,gyeonggi-do)、2.5g酵母提取物、2.5g胨、12.4ginstant(aquariumsystems))中培養，然后在27℃的溫度進行6周的三代培養。1-3.asperphenina和asperpheninb的分離和純化得到三代培養的固體培養基(在實施例1-2中在其中培養了菌株f452)，然后將每100g得到的固體培養基在1l乙酸乙酯(daejungchemicals&metalsco.,ltd.)浸漬1天。將該操作一共重復三次。將由此得到的乙酸乙酯通過濾紙(advantec)過濾，將濾液減壓，由此除去作為溶劑的乙酸乙酯。重復這種操作，得到25g粗萃取物。向粗萃取物添加200ml甲醇(daejungchemicals&metalsco.,ltd.)，然后將甲醇層減壓，由此得到11.4g甲醇萃取物。根據反相色譜法(merck,c18,700g,反相)，將由此得到的甲醇萃取物分成8個級分。在5個級分中使用的洗脫劑通過以下方法使用：從以60:40的體積比混合的水/乙腈(burdick&jackson)溶液每次減少5％的水。使用100％甲醇(daejungchemicals&metalsco.,ltd.)、丙酮(daejungchemicals&metalsco.,ltd.)和乙酸乙酯(daejungchemicals&metalsco.,ltd.)拆分最終級分，由此得到各級分。根據液體色譜(lc)-質譜(ms)并基于氫核磁共振譜，對使用以50:50的體積比混合的水/乙腈溶液拆分的級分3進行分析。使用了agilent1200serieslc(agilenttechnologies)和6130seriesms的lc/ms被用來鑒別級分的組成。在這里，使用由thermo-finnigancompany制造的ltq-orbitrapesi-ms質譜儀得到質譜，其以質荷比(m/z)形式表示。根據對lc-ms和氫核磁共振譜的分析，已經證實，所述菌株的培養基含有新的次級代謝產物，其被命名為asperphenin。使用具有折射率(ri)檢測器(shodex)的c18反相半制備性hplc(粒子直徑為5μm，250mmx10mm(長度x粒子內徑)，洗脫速率為2ml/min)將級分3分離。用于分離的移動相為以70:30的體積比混合的水/甲醇溶液，且進行反相半制備性hplc達約一個半小時。因此，得到50.0mgasperphenina和46.0mgasperpheninb。1-4.asperphenina和asperpheninb的物理化學表征分析asperphenina和asperpheninb呈淡黃色，在室溫穩定，并且良好地溶解在溫和有機溶劑(moderateorganicsolvent)如甲醇和丙酮中。基于核磁共振譜、紅外和紫外光譜數據、旋光粉末和高分辨質譜數據測定asperphenina和asperpheninb的結構。使用由brukercompany制造的500mhznmr并以dmso-d6作為溶劑得到核磁共振譜(1hnmr,13cnmr)。使用由thermo-finnigancompany制造的ltq-orbitrapesi-ms質譜儀得到質譜，并且以質荷比(m/z)形式表示。使用由jascocompany制造的ft-ir-4200光譜儀得到紅外光譜。使用由hitachicompany制造的u-3010uv/vis光譜儀得到紫外光譜。使用由jascocompany制造的p-1020旋光計得到旋光粉末。通過核磁共振譜確定的asperphenina和asperpheninb中每個的結構定位如下面在表1和2中所示。[asperphenina](1)分子式：c42h61n5o11(2)分子量：811(3)顏色：淡黃色(4)旋光粉末：-24.7(c1.0,甲醇,25℃)(5)紅外吸收帶(純)：3309,1671波數(6)1h-nmr(dmso-d6,600mhz)：見表1(7)13c-nmr(dmso-d6,150mhz)：見表1[表1]asperphenina的核磁共振譜的化學位移值[asperpheninb](1)分子式：c42h61n5o11(2)分子量：811(3)顏色：淡黃色(4)旋光粉末：-18.4(c1.0,甲醇,25℃)(5)紅外吸收帶(純)：3309,1671波數(6)1h-nmr(dmso-d6,600mhz)：見表2(7)13c-nmr(dmso-d6,150mhz)：見表2[表2]asperpheninb的核磁共振譜的化學位移值根據核磁共振譜分析的asperphenina和asperpheninb各自的結構通過下面的化學式表示。asperphenina:asperpheninb:實施例2.asperphenina和asperpheninb的抗癌活性2-1.鑒別asperphenina和asperpheninb的抗癌活性關于肺癌細胞系a549(koreancelllinebank)、結腸癌細胞系hct116(atcc)、胃癌細胞系snu638(koreancelllinebank)、肝癌細胞系sk-hep-1(koreancelllinebank)，和乳腺癌細胞系mda-mb-231(koreancelllinebank)，使用硫氰酸胺b(srb)測定(其為測量細胞生存的方法)測量asperphenin的細胞凋亡效果。具體地，在96孔微量培養板的每一孔中培育濃度為3.5x104個細胞/ml的190μl細胞懸浮液。將0.8μm、4μm、20μm或者100μmasperphenin添加至細胞培養基，并在37℃的溫度在5％co2的條件下培養72小時。在培育之后，將50μl50％(v/v)三氯乙酸溶液(sigmaaldrich)添加至每一孔，然后在4℃的溫度培育30分鐘，由此將細胞固定至三氯乙酸。將固定的細胞用水洗滌五次，然后在空氣中干燥。接下來，將含有1％(v/v)乙酸(duksan)的80μl0.4％(w/v)srb水溶液(sigmaaldrich)添加至每一孔中，在室溫培育1小時以使其中的細胞染色，并將染色的細胞用水洗滌并干燥。通過將200μl10mmtris(ph10.0)(sigmaaldrich)添加至每一孔，將細胞溶解，然后通過在515nm測量其吸光度來計算活細胞的數目。基于活細胞的數目計算將細胞生長抑制至50％的化合物濃度，即，50％抑制濃度(ic50)，并將結果在表3中示出。在這里，使用依托泊甙(sigmaaldrich)作為陽性對照。[表3]asperphenina和asperpheninb的細胞生長抑制濃度(ic50,μm)a549hct116snu638sk-hep-1mda-mb-231asperphenina14.61.75.82.33.1asperpheninb41.82.611.73.06.0依托泊甙0.71.90.80.610.6如表3中所示，asperphenina針對肺癌、結腸癌、胃癌和乳腺癌的細胞系呈現強的細胞抑制效果。asperpheninb針對除了細胞系a549以外的結腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌的細胞系呈現強的細胞抑制效果。具體地，與作為陽性對照的依托泊甙相比，asperphenina和asperpheninb針對結腸癌細胞系hct116均呈現類似抗癌活性或者較好的抗癌活性。2-2.鑒定asperpheninb針對結腸癌細胞系的抗癌活性如表3中所示，已經證實是否asperpheninb不僅針對結腸癌細胞系hct116具有細胞生長抑制效果，而且對其它結腸癌細胞系也具有細胞生長抑制效果。如實施例2-1中所述，由結腸癌細胞系hct116(atcc)、hct15(koreancelllinebank)、ls174t(koreancelllinebank)、rko(atcc)和sw480(atcc)計算細胞生長抑制濃度(ic50,μm)，且結果在表4中示出。在這里，使用紫杉醇(sigmaaldrich)作為陽性對照。[表4]asperpheninb針對癌細胞的生長抑制值(ic50)hct15hct116ls174trkosw480asperpheninb(μm)7.204.051.841.1731.35紫杉醇(nm)>1000.420.460.21>100如表4中所示，除了細胞系sw480，asperpheninb強烈抑制4個結腸癌細胞系的細胞生長，并且更具體地，asperpheninb針對細胞系rko呈現最強抑制效果。2-3.測量由asperpheninb導致的結腸細胞系的細胞周期變化通過流式細胞儀證實了asperpheninb對于結腸癌細胞系rko的細胞周期的影響。將rko細胞(atcc)在含有10％(v/v)fbs的培養基中稀釋至1x105個細胞/ml，然后在60mm培養皿中培育。將培育的細胞在37℃的溫度在5％co2的條件下培養約24小時。將培養的細胞用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)洗滌一次，并將所述培養基用新鮮培養基替代。將終濃度為0.625μm、1.25μm、2.5μm、5μm或者10μm的asperpheninb添加至培養的細胞，然后將細胞在37℃的溫度在5％co2的條件下培養。在一段時間之后，收集附著至培養皿的細胞和未附著至培養基的細胞。將收集的細胞用pbs洗滌一次，然后用1ml冷的70％(v/v)乙醇洗滌。將細胞在4℃的溫度培育約12小時以固定細胞。在除去70％(v/v)乙醇之后，將固定的細胞用pbs洗滌一次。將濃度為50μg/ml的500μlrnasea(sigmaaldrich)添加至細胞，并將細胞在室溫培育約30分鐘。將終濃度為50μg/ml的碘化丙啶(pi)添加至細胞，然后將細胞在室溫在反應物呈遮光狀態的條件下培育約30分鐘。將用pi染色的細胞通過使用bdfacscalibur流式細胞儀(由bdbiosciences制造)進行細胞周期分析。基于流式細胞儀的結果，計算在sub-g1、g0/g1、s和g2/m階段的細胞比率。在這里，使用未添加asperpheninb的細胞作為陰性對照。當將rko細胞在asperpheninb的存在下培育48小時時，在圖3a和表5中示出取決于asperpheninb濃度的細胞比率(％)。當將rko細胞在濃度為2.5μm和5μm的asperpheninb的存在下培育時，在圖3b和3c以及表6中示出取決于培育時間的細胞比率(％)。[表5][表6]如圖3a和表5中所示，在將rko細胞和asperpheninb培育48小時的情況中，與對照相比，在sub-g1階段的細胞隨asperphenin的濃度增加，而在g0/g1和s階段的細胞隨asperphenin的濃度減少。相比于用低濃度asperpheninb處理的對照，在g2/m階段的細胞增加，并且相比于用高濃度asperpheninb處理的對照，在g2/m階段的細胞減少。此外，如圖3b和3c和表6中所示，在sub-g1和g2/m階段的細胞隨著asperpheninb的處理時間而改變。在用濃度為2.5μm或者5μm的asperpheninb處理約24小時的情況下，在g2/m階段的細胞與對照相比增加。在濃度為2.5μm或者5μm的asperpheninb被處理約48小時的情況下，在g2/m階段的細胞與用濃度為2.5μm或者5μm的asperpheninb處理約24小時的情況相比減少。在用asperpheninb處理0至24小時期間未發生變化的sub-g1階段細胞比率增加。已經證實，直到用asperpheninb處理24小時，在g2/m階段中的細胞出現細胞周期停滯，但是在用asperpheninb處理48小時之后，誘導了細胞凋亡。2-4.測量由asperpheninb誘導的細胞凋亡在細胞系rko中使用膜聯蛋白v-fitc細胞凋亡測量試劑盒(由dpharmingen制造)證實了由asperpheninb導致的細胞凋亡過程。如實施例2-3中所述，將濃度為0.625μm、1.25μm、2.5μm、5μm或者10μm的asperpheninb添加至rko細胞，培養48小時以得到細胞。將300μl1x結合緩沖液添加至所得細胞，并充分混合在一起。然后，將5μl膜聯蛋白v和5μlpi添加至100μl細胞混合物，并在遮光狀態下在室溫反應15分鐘。將400μl1x結合緩沖液添加至反應物，使用facscalibur流式細胞儀(bdfacscalibur,bdbiosciences)分析細胞凋亡。基于流式細胞儀的結果，計算未染色細胞(即，活細胞)、被膜聯蛋白v染色的細胞(即，在早期階段凋亡的細胞)、被pi和膜聯蛋白v兩者染色的細胞(即，在晚期階段凋亡的細胞或者壞死的細胞)或者僅被pi染色的細胞(即，壞死的細胞)的比率。作為陰性對照，使用未添加asperpheninb的細胞。當將rko細胞在asperpheninb的存在下培育48小時時，在圖4中示出了取決于asperpheninb的濃度的細胞比率(％)。如圖4中所示，與對照的比率相比，早期凋亡細胞和晚期凋亡或者壞死的細胞的比率增加。在這里，與對照的比率相比，壞死細胞的比率增加。由此證實，asperpheninb誘導rko結腸癌細胞系的凋亡和壞死。2-5.評價asperpheninb對于細胞周期相關蛋白和細胞凋亡相關蛋白的影響如實施例2-3中所述，按以下方式得到細胞：將濃度為0.625μm、1.25μm、2.5μm、5μm或者10μm的asperpheninb添加至rko細胞，然后培養48小時。然而，按以下方式得到細胞：將濃度為5μm的asperpheninb添加至rko細胞，然后培養0至48小時。然后，從所得細胞得到蛋白質。關于細胞周期相關蛋白的表達，使用抗-p-細胞周期蛋白b1(ser147)抗體(cellsignalingtechnology)、抗-細胞周期蛋白b1抗體(santacruz)、抗-p-cdc2(tyr15)抗體(cellsignalingtechnology)、抗-cdc2抗體(santacruz)，和抗-β-肌動蛋白抗體(santacruz)對其境內性免疫印跡。通過免疫印跡得到的圖像在圖5a和5b中示出。如圖5a中所示，當將rko細胞在asperpheninb的存在下培育48小時時，非活性p-cdc2(tyr15)蛋白的表達以濃度依賴性方式增加。在用2.5μmasperpheninb處理的細胞中，非活性p-細胞周期蛋白b1(ser147)蛋白的表達增加。在用5μm和10μmasperpheninb處理的細胞中，p-細胞周期蛋白b1(ser147)蛋白和細胞周期蛋白b1蛋白的表達減少。此外，如圖5b中所示，當將細胞用5μmasperpheninb處理時，p-cdc2(tyr15)蛋白的表達以時間依賴性方式增加，且p-細胞周期蛋白b1(ser147)的表達在約24小時時最高。由此證實，asperpheninb在rko結腸癌細胞中調節細胞周期相關因子的表達。此外，關于細胞凋亡相關蛋白的表達，使用抗-atm抗體(cellsignalingtechnology)、抗-p-chk(thr68)抗體(cellsignalingtechnology)、抗-chk抗體(cellsignalingtechnology)、抗-p-h2ax抗體(cellsignalingtechnology)、抗-p53抗體(santacruz)、抗-bax抗體(santacruz)、抗-bid抗體(cellsignalingtechnology)、抗-半胱天冬酶-8抗體(cellsignalingtechnology)、抗-半胱天冬酶-3抗體(cellsignalingtechnology)、抗-半胱天冬酶-9抗體(cellsignalingtechnology)、抗-裂解的parp抗體(bdbiosciences)，和抗-β-肌動蛋白抗體(santacruz)進行免疫印跡。通過免疫印跡得到的圖像在圖6a和6b中示出。如圖6a中所示，當將rko細胞在asperpheninb的存在下培育48小時時，atm蛋白的表達以濃度依賴性方式增加，而chk2和h2ax(其為atm蛋白的亞調節因子)被磷酸化，從而被活化。p53蛋白的表達以濃度依賴性方式增加，從而導致bax表達增加。此外，asperpheninb誘導了聚(adp-核糖)聚合酶(parp)(其為bid、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-3的底物)的裂解。如圖6b中所示，當將細胞用5μmasperpheninb處理時，細胞凋亡誘導蛋白和標志蛋白如p-chk2(thr68)、p-h2ax(ser139)、裂解的半胱天冬酶-8、裂解的半胱天冬酶-9、裂解的半胱天冬酶-3和parp的表達在被處理48小時的細胞組中增加。p53和bax的表達以時間依賴性方式增加。因此證實，asperpheninb調節rko結腸癌細胞的細胞凋亡相關因子的表達。2-6.由asperpheninb導致的活性氧(ros)的產生ros能夠在細胞中誘導細胞凋亡，因此，檢查了是否通過asperpheninb在細胞中產生了ros。具體地，如實施例2-3中所述，將濃度為2.5μm、5μm或者10μm的asperpheninb添加至rko細胞。在將rko細胞培養24小時之后，收集細胞。此外，制備細胞組作為對比組，其中將5mmn-乙酰基半胱氨酸(nac)(sigmaaldrich)(其為抗氧化劑)添加至5μm和10μmasperpheninb中，而將其中不含asperpheninb和nac的細胞組作為對照。然后，將終濃度為20μm的2',7'-二氯熒光素二乙酸鹽(dcfh-da)(sigmaaldrich)添加至細胞培養基，然后在37℃的溫度在5％co2的條件下培養30分鐘。收集附著至細胞培養基的細胞和未附著至細胞培養基的細胞兩者，用冷的pbs洗滌兩次，然后再次懸浮在1mlpbs中以通過使用bdfacscalibur流式細胞儀(由bdbiosciences制造)測量2',7'-二氯熒光素(dcf)的強度。基于dcf的強度，計算產生ros的細胞的比率，其結果在表7中示出。[表7]藥物產生ros的細胞的比率無藥物處理(對照)5.95％2.5μmasperpheninb8.14％5μmasperpheninb13.86％10μmasperpheninb14.26％5μmasperpheninb+5mmnac1.41％10μmasperpheninb+5mmnac2.55％如表7中所示，當將rko細胞在asperpheninb的存在下培育24小時時，相比于對照中ros的產量，ros的產量增加約2.4倍。然而，由asperpheninb導致的ros產生被nac(其為抗氧化劑)抑制。由此證實，asperpheninb在rko結腸癌細胞中誘導ros產生。2-7.asperpheninb與其它抗癌藥物組合的給藥體外檢查asperpheninb與其它抗癌藥物組合給藥的效果。將在含10％(v/v)fbs的培養基中稀釋的rko細胞在96孔微量培養板的每一孔中培育，使得每一孔包括7x103個細胞，然后將細胞在37℃的溫度在5％co2的條件下培養約24小時。在所述含10％(v/v)fbs的培養基中，將依立替康(sigmaaldrich)、5-氟尿嘧啶(sigmaaldrich)或者吉西他濱(sigmaaldrich)與asperpheninb以1:1的比率混合，然后將混合物添加至培養的細胞。然后，將細胞在37℃的溫度在5％co2的條件下培養48小時。細胞生存根據srb測定測得，并將測得的細胞生存結果在圖7a至7c中示出。圖7a示出在僅使用濃度為1.25μm至10μm的依立替康的情況中(●)和在使用依立替康和2.5μmasperpheninb的組合的情況中(■)的細胞生存(％)。圖7b示出在僅使用濃度為1nm至100nm的吉西他濱的情況中(●)或者在使用吉西他濱和8μmasperpheninb的組合的情況中(■)的細胞生存(％)。圖7c示出在使用濃度為0.1μm至10μm的5-氟尿嘧啶(●)或者5-氟尿嘧啶和8μmasperpheninb的組合(■)的情況中的細胞生存(％)。此外，組合給藥的效果根據方程1測得，其結果在表8中示出。[方程1]組合給藥的效果＝d1/(dx)1+d2/(dx)2d1：在組合給藥中具有預期效果的asperpheninb的濃度d2：在組合給藥中具有預期效果的其它抗癌藥物的濃度(dx)1：在僅給藥asperpheninb中具有預期效果的asperpheninb的濃度(dx)2：在僅給藥其它抗癌藥物中具有預期效果的其它抗癌藥物的濃度當計算的組合給藥效果為<1、＝1和>1時，分別意味著具有協同效果、加和效果和拮抗效果。[表8]如圖7a至7c和表8中所示，與單獨給藥依立替康、5-氟尿嘧啶或者吉西他濱的情況相比，在與asperpheninb組合給藥的情況下細胞生長抑制的效果增加。2-8.在腫瘤異種移植小鼠模型中驗證asperpheninb的抗癌效果asperpheninb的抗癌效果在移植了人結腸癌細胞系的腫瘤異種移植小鼠模型中被驗證。具體地，將rko細胞以3.5x106個細胞/150μl的濃度皮下注射至裸鼠(centrallab.aminolinc.,無毛小鼠，其無胸腺并且在出生時具有干燥胡須)的右肋。在注射rko細胞14天之后，當腫瘤尺寸達到60mm3時，將4mg/kg或者8mg/kgasperpheninb進行腹膜內給藥，一周三次，即，總共21天(n＝5)。以3至4天的間隔，使用數字卡尺測量腫瘤尺寸21天。在這里，使用未給藥asperpheninb的裸鼠(n＝5)作為對照。腫瘤體積根據方程2計算，以及腫瘤生長抑制比率根據方程3基于計算的腫瘤體積計算。[方程2]腫瘤體積(mm3)＝(長度)×(寬度)×(高度)×π/6[方程3]腫瘤生長抑制比率(％)＝[1-(asperpheninb治療組中的最終平均腫瘤體積)/(對照中的最終平均腫瘤體積)]×100在給藥asperpheninb之后，在圖8中示出取決于天數的小鼠的腫瘤體積(mm3)(●：對照；■：給藥4mg/kgasperpheninb；▲：給藥8mg/kgasperpheninb；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.005)，以及在表9中示出計算的腫瘤生長抑制比率。[表9]給藥組4mg/kgasperpheninb8mg/kgasperpheninb抑制比率(％)38.968.7如表8和9中所示，在給藥asperpheninb的組中觀察到化合物濃度依賴性方式的對腫瘤生長的抑制。保存機構的名稱：微生物資源中心(國際)登記號：kctc12688bp登記日期：2014年10月13日序列表<110>首爾大學校產學協力團<120>新的肽化合物、其制備方法及其用途<130>gx-050805-pct<160>1<170>kopatentin2.0<210>1<211>572<212>dna<213>人工序列<220><223>曲霉屬f452的18srdna<400>1tccgtaggtgaacctgcggaaggatcattactgagtgcgggctgcctccgggcgcccaac60ctcccacccgtgactacctaacactgttgcttcggcggggagccctctcgggggcgagcc120gccggggactactgaacttcatgcctgagagtgatgcagtctgagtctgaatatacaatc180agtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaact240gcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgc300gccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgcccatcaagcccgg360cttgtgtgttgggtcgtcgtcccccccccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcac420cgtgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctcgatttagggccggccgggc480gccagccgacgtctccaaccattttttcttcaggttgacctcggatcaggtagggatacc540cgctgaacttaagcatatcaataagcggagga572當前第1頁12