β?內酰胺酶制劑及其用途的制作方法
相關申請的交叉引用
本申請要求2014年10月8日提交的美國臨時專利申請號62/061,507；2015年2月28日提交的美國臨時專利申請號62/126,556；以及2015年8月14號提交的美國臨時專利申請號62/205,443的權益，所有這些專利申請的全部內容均以引用的方式并入本文。
發明領域
本發明部分提供包含β-內酰胺酶的藥物劑型以及其用途。
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背景
β-內酰胺抗生素的特征在于在其分子結構中的β-內酰胺環。β-內酰胺環的完整性對于生物活性是重要的，所述生物活性導致催化肽聚糖合成的最終交聯反應的一組轉肽酶的失活。β-內酰胺抗生素家族的成員包括青霉素、頭孢菌素、克拉維烷(或氧青霉烷)、頭霉素以及碳青霉烯。
β-內酰胺酶是水解β-內酰胺抗生素的細菌防御性酶。革蘭氏陰性細菌產生β-內酰胺酶來實現對β-內酰胺抗生素的抗性。具體地說，β-內酰胺酶能夠有效催化β-內酰胺環的酰胺鍵的不可逆水解，從而產生生物學失活的產物。
人可被視為“超級生物體”，其為哺乳動物和微生物細胞的聚集體，其中據估計后者在數目上超過前者10比1。此微生物組分及其微生物遺傳庫微生物組大于人宿主約100倍。引人注目地，盡管外來生物體具有此巨大的多樣性，人免疫系統通常仍維持協同狀態。對于遠側胃腸道(gi)尤其如此，其容納多至1000種不同細菌物種和據估計超過1×1014個微生物，并且看起來是限定人宿主健康狀態的核心。失去在微生物組中，尤其是在胃腸道中的謹慎平衡可以導致各種疾病。
雖然如此，但是治療疾病的某些方面所需要的抗生素醫學治療可以誘導在微生物組中，包括在胃腸道中的破壞，并且導致另外的疾病。例如，某些非腸內施用的β-內酰胺如氨芐西林、頭孢曲松、頭孢哌酮以及哌拉西林通過膽汁排泄到小腸的近側部分(十二指腸)來部分消除。胃腸道內殘余的未吸收β-內酰胺可引起對正常腸道微生物群的生態平衡的不良效應，從而導致例如艱難梭菌感染(cdi)、抗生素相關性腹瀉、病原細菌諸如耐萬古霉素腸球菌(vre)、產超廣譜β-內酰胺酶的革蘭氏陰性桿菌(esbl)和真菌的過度生長以及在正常腸道微生物群和潛在病原細菌兩者中的抗生素抗性菌株的選擇。
一種用于避免或重新平衡正常腸道微生物群的生態平衡的方法是β-內酰胺酶的治療性使用，例如，通過滅活胃腸道內分泌或未吸收的抗生素，從而維持正常腸道微生物群，并且防止其與潛在病原微生物的過度生長。
因此，仍需要用于治療性干預的改進的β-內酰胺酶制劑。
發明概要
因此，本發明提供改進釋放制劑，所述改進釋放制劑包含β-內酰胺酶(例如，“p3a”，如seqidno:1或2中所示的，或其變體)和/或另外的治療劑。在各個實施方案中，所述制劑在胃腸道中釋放大量的β-內酰胺酶。在一個實施方案中，所述制劑包含至少一個核心顆粒和所述核心顆粒上的底涂層，其中所述底涂層包含β-內酰胺酶。在另一個實施方案中，所述制劑包含至少一個核心顆粒，其中所述β-內酰胺酶被封裝在所述核心顆粒內。在各個實施方案中，所述制劑包含設置在所述核心顆粒上的改進釋放包衣，諸如延遲釋放包衣。在一些實施方案中，所述延遲釋放包衣在胃液中是基本上穩定的。在一個實施方案中，所述延遲釋放包衣包含eudragit化合物。在各個實施方案中，所述制劑可以呈膠囊或片劑的形式。在一些實施方案中，所述膠囊或片劑包含多個核心顆粒。
這些改進的β-內酰胺酶用于許多療法中，包括cdi和/或艱難梭菌相關性疾病或胃腸道內的其他抗生素誘導的不利效應的預防或治療。例如，β-內酰胺酶用于允許患者經歷抗生素療法同時預防可由不利地影響微生物組的過量抗生素引起的疾病。此類用途并不干擾抗生素的全身性效用。相反，β-內酰胺酶去除可構成胃腸道的一部分的過量抗生素并且這樣做時防止了與本文所述的各種疾病狀態相關的微生物群的破壞。
在一些方面，本發明提供了一種用于預防艱難梭菌感染(cdi)和/或艱難梭菌相關性疾病的方法，所述方法包括向正在經歷使用主要抗生素的療法的患者施用有效量的上述權利要求中任一項所述的改進釋放制劑，所述主要抗生素諸如頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢呋辛以及哌拉西林中的一種或多種，并且所述主要抗生素為靜脈內施用。
附圖描述
圖1a描繪了一種用于產生p3a延遲釋放膠囊的制造工藝的一個實施方案。
圖1b示出根據本發明的一個實施方案產生的p3a腸溶包衣的丸粒的照片。
圖2描繪了根據本發明的一個實施方案產生的p3a丸粒的ph溶出曲線。
圖3描繪了p3a丸粒在來自五個不同供體的人食糜樣品中的穩定性。
圖4描繪了p3a在五個人食糜樣品和混合食糜樣品中的穩定性。
圖5描繪了在使用10nmp1a或p3a(又稱為syn-004)藥物(ref)或溶解的p1a或p3a丸粒材料(pel)消化30秒、60秒、90秒和120秒后水解的頭孢曲松的量(nmol)。
圖6描繪了一種用于產生p3a延遲釋放的膠囊的制造工藝的另外的實施方案。
圖7示出了用于評價p3a介導的微生物組保護的豬研究的設計。“*”指示豬9為患病的并且沒有增加體重。“**”指示豬8為垂死的并且在艱難梭菌施用之后第14天處死。并未確認cdi。除豬8和豬9之外，沒有其他動物患病。在任何動物(包括豬8)中經由艱難梭菌毒素a或il8elisa或經由腸道組織學分析并未確認cdi。
圖8示出了用于評價p3a(syn-004)-介導的微生物組保護的豬研究的示意性時間軸。在第0天經由剖腹產生下豬并且保持在微型隔離籠中。在第5天，用一個正常的人糞便微生物群落集合強飼動物。在第8天開始p3a施用(75mg/劑量，qid)(組4)并且持續7天(直到第14天)。每天經由ip注射施用一次抗生素(克林霉素，50mg/kg；第2組)或頭孢曲松(cro，50mg/kg，組3和組4)，在第9天開始并且持續4天，直到第12天為止。在第13天向所有動物口服遞送艱難梭菌(2.6x106cfu)。在第11、12、14、18、20天使用無菌棉簽直接從直腸收集糞便并且在第21天在尸檢時直接從腸道中收集糞便。
圖9示出在研究第14天在從豬糞便中分離的dna中鑒別的細菌各門的分類學分類。在每只豬中，從下到上，各柱表示以下各項的相對豐度：擬桿菌門(bacteroidetes)、變形菌門(proteobacteria)、厚壁菌門(firmicutes)以及未分類菌。例如，在組1中，在豬2的糞便dna樣品中存在的細菌顯示所有類型的細菌的存在。在組2中，豬7和豬8顯示主要地擬桿菌門和變形菌門的存在。在組3中，豬5的糞便dna樣品顯示主要地擬桿菌門，而豬6顯示主要地擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門。在組4中，豬10和豬12顯示所有類型的細菌的存在，而豬11顯示主要地擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門的存在。
圖10a和圖10b示出了在研究第21天在尸檢時收集的糞便樣品的細菌生長量化。圖10a示出了lb+amp平板的照片。圖10b示出了在每個平板上的細菌菌落的量化。將在尸檢時從動物中收集的每個量的稀釋的糞便接種在lb+amp平板上并且在37℃下在需氧條件下生長。對菌落進行計數，同時考慮到稀釋系數。
圖11提供了在每個糞便樣品中基于相對豐度的細菌菌株的熱圖。基于細菌分類群的組成類似性使用最大距離函數和ward層級群集算法來群集樣品，以創建在圖的頂側和左側顯示的系統樹。在右側顯示了樣品鑒定。在圖的頂部上的方框突出顯示了組1(對照)和組4(頭孢曲松加上p3a)比組2(克林霉素)和組3(單獨的頭孢曲松)彼此更類似。
圖12提供了在每個糞便樣品中基于相對豐度的細菌屬類的熱圖。基于細菌分類群的組成類似性使用最大距離函數和ward層級群集算法來群集樣品，以創建在圖的頂側和左側顯示的系統樹。
圖13提供了使用質心分類的比較性宏基因組分析，以比較每個研究組內每種細菌菌株的頻率與所有研究組的總體平均頻率的平均偏差。
圖14示出了使用質心分類的比較性宏基因組分析，以比較每個研究組內每種細菌菌株的頻率與所有研究組的總體平均頻率的平均偏差。
圖15示出了樣品子集的種類水平的質心分類，以比較組3(頭孢曲松)和組4(頭孢曲松加上p3a)中的每種細菌種類的頻率與組1(對照)的平均偏差。在圖的頂部和底部上的方框突出顯示了蘇黎士桿菌屬某些種(turicibacterspp)的豐度的減少，所述蘇黎士桿菌屬某些種為與狗的特發性炎癥性腸病和急性出血性腹瀉相關的種類(minamoto等，2015,gutmicrobes6(1),33-47；rossi等，2014,plosone9(4),e94699)，以及產甲烷古菌(methanogenicarchaea)、史氏甲烷短桿菌(methanobrevibactersmithii)的過剩(overabundance)，所述菌據報道為與便秘、腸道易激綜合癥和肥胖癥相關的種類(pimentel等，2002,am.j.gastroenter.supple.1:28)。
圖16示出了樣品子集的種類水平的質心分類，其比較厭氧和兼性需氧細菌種類的頻率與所有組的種類的平均獨特頻率的平均偏差。橢圓突出顯示了組4(頭孢曲松加上p3a)展示出比組2(克林霉素)或組3(單獨的頭孢曲松)更類似于組1(對照)的厭氧和兼性需氧細菌種類的圖案。
圖17示出了樣品子集的種類水平的質心分類，以比較專性需氧細菌種類的頻率與所有組的種類的平均獨特頻率的平均偏差。
圖18示出了樣品子集的種類水平的質心分類，以比較革蘭氏陽性細菌種類的頻率與來自組1、組2和組3的種類的平均獨特頻率的平均偏差。橢圓突出顯示了組4(頭孢曲松加上p3a)展示與組1(對照)和組3(單獨的頭孢曲松)相比過剩的革蘭氏陽性種類。
圖19示出了樣品子集的種類水平的質心分類，以比較革蘭氏陽性細菌種類的頻率與來自組1的種類的平均獨特頻率的平均偏差。橢圓突出顯示了組4(頭孢曲松加上p3a)展示與組1(對照)相比過剩的革蘭氏陽性種類。
圖20示出了樣品子集的種類水平的質心分類，以比較革蘭氏陰性細菌種類的頻率與來自組1、組2和組3的種類的平均獨特頻率的平均偏差。
圖21示出了樣品子集的種類水平的質心分類，以比較革蘭氏陽性細菌種類的頻率與來自組3和組4的種類的平均獨特頻率的平均偏差。
圖22示出了治療的豬的血清中的頭孢曲松水平。將總計10只豬用iv頭孢曲松(cro；50mg/kg)每天治療一次，持續總計7天。一組5只豬還接受口服p3a(75mg，一天四次)，在cro治療之前的那天開始并且在cro之后延長一天停止，持續總計9天。在cro治療的第2天，在cro施用之后1、6和19小時收集血清。使用已驗證的高效液相色譜測定來測定血清的cro水平。將數據顯示為平均值和標準偏差。在19小時收集的血清中的cro水平低于測定的檢測限(0.5ug/ml)。對于兩組直方圖(1小時和6小時)，左側柱為單獨的頭孢曲松并且右側柱為頭孢曲松和p3a。
發明詳述
β-內酰胺酶
在一些方面，本發明涉及一種或多種β-內酰胺酶的組合物和制劑以及用途。如本文所用的，β-內酰胺酶是指水解β-內酰胺的酶。β-內酰胺環的酰胺鍵的水解使抗微生物劑變成生物學失活的。如本文所用的，a類β-內酰胺酶(ambler分類)是指絲氨酸β-內酰胺酶，其中β-內酰胺的水解通過活性部位中的絲氨酸介導，所述活性部位通常是在α螺旋2中的氨基酸位置70處。a類β-內酰胺酶包括但不限于len-1、shv-1、tem-1、pse-3/pse-3、rob-1、蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)(諸如5/b1型、569/h1型和569/h3型)、炭疽桿菌某種(bacillusanthrasissp)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)(諸如penp)、韋氏芽孢桿菌(bacillusweihenstephanensis)、克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、pc1、sme-1、nmca、imi-、per-、veb-、ges-、kpc-、cme-以及ctx-m型β-內酰胺酶。
在各個方面，所述β-內酰胺酶具有seqidno：1(即，如wo2011/148041中所述的“p3a”，所述專利的全部內容以引用的方式并入本文)的氨基酸序列。可對此序列進行突變，以生成可通過本發明的方法利用的β-內酰胺酶衍生物。
seqidno：1
temkddfakleeqfdaklgifaldtgtnrtvayrpderfafastikaltvgvllqqksiedlnqritytrddlvnynpitekhvdtgmtlkeladaslrysdnaaqnlilkqiggpeslkkelrkigdevtnperfepelnevnpgetqdtstaralvtslrafaledklpsekrellidwmkrnttgdaliragvpdgwevadktgaasygtrndiaiiwppkgdpvvlavlssrdkkdakydnkliaeatkvvmkalnmngk.
在一些實施方案中，β-內酰胺酶包含與seqidno：1具有至少約60％(例如，約60％、或約61％、或約62％、或約63％、或約64％、或約65％、或約66％、或約67％、或約68％、或約69％、或約70％、或約71％、或約72％、或約73％、或約74％、或約75％、或約76％、或約77％、或約78％、或約79％、或約80％、或約81％、或約82％、或約83％、或約84％、或約85％、或約86％、或約87％、或約88％、或約89％、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中，seqidno：1可在序列的第一個殘基之前具有met和/或thr。在各個實施方案中，met可裂解。如本文所描述的，可對在第一個殘基之前包含met和/或thr的序列進行突變，以生成β-內酰胺酶衍生物。在一些實施方案中，前導thr相對于另一種前導氨基酸(例如lys)可帶來增加的酶穩定性。例如，此殘基賦予對氨基肽酶的增加的抗性。
本文還提供了作為seqidno：2的p3a的核苷酸序列：
seqidno：2
atgactgagatgaaagatgattttgcgaagctggaagaacagtttgacgcaaaattgggcattttcgcgttggacacgggtacgaatcgtacggttgcctaccgtccggacgagcgcttcgccttcgcgagcacgatcaaagccctgaccgtcggcgtgctgctccagcaaaagagcatcgaggacctgaaccagcgcattacctacacccgtgatgatctggtgaactataatccgatcaccgagaaacacgttgataccggtatgaccctgaaagaactggcagatgcaagcctgcgctacagcgataacgcggctcagaatctgattctgaagcaaatcggtggtccggagagcttgaagaaagaactgcgtaaaatcggcgatgaagtcactaatccggagcgttttgagccggagctgaacgaagtgaatccgggtgaaacgcaagacacgagcaccgcgcgtgcgcttgtcacctccctgcgcgctttcgcactggaagataagctgccgtcggagaaacgcgagctgctgatcgactggatgaagcgcaatacgaccggcgacgcgctgattcgtgcgggcgttccggacggttgggaagtggctgacaagaccggtgcggcgagctacggcacccgtaacgatatcgcgatcatttggccacctaaaggtgacccggtcgtgctggccgtactgagcagccgtgacaagaaagacgcaaagtatgataacaagctgattgcagaggcgaccaaagttgttatgaaggcactgaacatgaatggtaag
在一些實施方案中，本發明的多核苷酸可與seqidno：2具有至少約60％(例如，約60％、或約61％、或約62％、或約63％、或約64％、或約65％、或約66％、或約67％、或約68％、或約69％、或約70％、或約71％、或約72％、或約73％、或約74％、或約75％、或約76％、或約77％、或約78％、或約79％、或約80％、或約81％、或約82％、或約83％、或約84％、或約85％、或約86％、或約87％、或約88％、或約89％、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％)的序列同一性。
在一些實施方案中，β-內酰胺酶例如p3a具有實質性頭孢曲松水解活性。在一些實施方案中，β-內酰胺酶例如p3a基本上比p1a更有效地水解頭孢曲松。
在說明性實施方案中，β-內酰胺酶包含與seqidno：1具有至少60％序列同一性并且具有ambler分類的以下突變的氨基酸序列：在位置232處除丙氨酸(a)以外的疏水性殘基；在位置237處除丙氨酸(a)以外的親水性殘基；在位置238處除丙氨酸(a)以外的疏水性殘基；在位置240處除絲氨酸(s)以外的親水性殘基；以及在位置276處除天冬氨酸(d)以外的親水性殘基。在一些實施方案中，在位置232處除丙氨酸(a)以外的疏水性殘基是甘氨酸(g)。在一些實施方案中，在位置237處除丙氨酸(a)以外的親水性殘基是絲氨酸(s)。在一些實施方案中，在位置238處除丙氨酸(a)以外的疏水性殘基是甘氨酸(g)。在一些實施方案中，在位置240處除絲氨酸(s)以外的親水性殘基是天冬氨酸(d)。在一些實施方案中，在位置276處除天冬氨酸(d)以外的親水性殘基是天冬酰胺(n)。在一些實施方案中，β-內酰胺酶包含a232g、a237s、a238g、s240d以及d276n中的一個或多個。在一些實施方案中，β-內酰胺酶包含a232g、a237s、a238g、s240d以及d276n中的所有，其序列是seqidno：3，即p4a。在一些實施方案中，所述β-內酰胺酶和/或藥物組合物包含與seqidno：3具有至少90％、或95％、或97％、或99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
seqidno：3
emkddfakleeqfdaklgifaldtgtnrtvayrpderfafastikaltvgvllqqksiedlnqrittrddlvnynpitekhvdtgmtlkeladaslrysdnaaqnlilkqiggpeslkkelrkigdevtnperfepelnevnpgetqdtstaralvtslrafaledklpsekrellidwmkrnttgdaliragvpdgwevgdktgsgdygtrndiaiiwppkgdpvvlavlssrdkkdakydnkliaeatkvvmkalnmngk
在一些實施方案中，本發明的β-內酰胺酶多肽包含與seqidno：3具有至少約60％(例如，約60％、或約61％、或約62％、或約63％、或約64％、或約65％、或約66％、或約67％、或約68％、或約69％、或約70％、或約71％、或約72％、或約73％、或約74％、或約75％、或約76％、或約77％、或約78％、或約79％、或約80％、或約81％、或約82％、或約83％、或約84％、或約85％、或約86％、或約87％、或約88％、或約89％、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％)序列同一性的氨基酸序列。
seqidno：4源自seqidno：3，并且還包含qaskt氨基酸的信號和添加(編碼區加下劃線)：
miqkrkrtvsfrlvlmctllfvslpitktsaqasktemkddfakleeqfdaklgifaldtgtnrtvayrpderfafastikaltvgvllqqksiedlnqritytrddlvnynpitekhvdtgmtlkeladaslrysdnaaqnlilkqiggpeslkkelrkigdevtnperfepelnevnpgetqdtstaralvtslrafaledklpsekrellidwmkrnttgdaliragvpdgwevgdktgsgdygtrndiaiiwppkgdpvvlavlssrdkkdakydnkliaeatkvvmkalnmngk
在一些實施方案中，本發明的β-內酰胺酶多肽包含與seqidno：4具有至少約60％(例如，約60％、或約61％、或約62％、或約63％、或約64％、或約65％、或約66％、或約67％、或約68％、或約69％、或約70％、或約71％、或約72％、或約73％、或約74％、或約75％、或約76％、或約77％、或約78％、或約79％、或約80％、或約81％、或約82％、或約83％、或約84％、或約85％、或約86％、或約87％、或約88％、或約89％、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中，所述β-內酰胺酶和/或藥物組合物包含與seqidno：4具有至少90％、或95％、或97％、或99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
本發明的說明性多核苷酸是seqidno：5，其為a232g、a237s、a238g、s240d和d276n突變體、hindiii位點(aagctt以粗體顯示)以及附加的k和t氨基酸的全核苷酸序列。在一些實施方案中，seqidno：5的加下劃線部分被省略。前導序列和附加的核苷酸(hindiii位點以及k和t氨基酸-用于添加氨基酸序列qaskt)加下劃線。
atgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagcgc
在一些實施方案中，本發明的多核苷酸與seqidno：5(具有或沒有下劃線部分)具有至少約60％(例如，約60％、或約61％、或約62％、或約63％、或約64％、或約65％、或約66％、或約67％、或約68％、或約69％、或約70％、或約71％、或約72％、或約73％、或約74％、或約75％、或約76％、或約77％、或約78％、或約79％、或約80％、或約81％、或約82％、或約83％、或約84％、或約85％、或約86％、或約87％、或約88％、或約89％、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％)的序列同一性。
在各個方面，所述β-內酰胺酶多肽具有seqidno：6(即，p2a)的序列或者由seqidno：6中的一個或多個突變衍生：
etgtisisqlnknvwvhtelgyfngeavpsnglvlntskglvlvdsswdnkltkeliemvekkfqkrvtdviithahadriggitalkergikahstaltaelaknsgyeeplgdlqtitslkfgntkvetfypgkghtednivvwlpqyqilaggclvksaeakdlgnvadayvnewstsienvlkrygninsvvpghgevgdkglllhtldllk.
在一些實施方案中，本發明的β-內酰胺酶多肽包含與seqidno：6具有至少約60％(例如，約60％、或約61％、或約62％、或約63％、或約64％、或約65％、或約66％、或約67％、或約68％、或約69％、或約70％、或約71％、或約72％、或約73％、或約74％、或約75％、或約76％、或約77％、或約78％、或約79％、或約80％、或約81％、或約82％、或約83％、或約84％、或約85％、或約86％、或約87％、或約88％、或約89％、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中，所述β-內酰胺酶和/或藥物組合物包含與seqidno：6具有至少90％、或95％、或97％、或99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
β-內酰胺酶(包括p1a(即seqidno：1，除了位置276是d而不是n之外)、p2a、p3a以及p4a及其衍生物)的附加序列例如在wo2011/148041和pct/us2015/026457中進行描述，所述專利的全部內容以引用的方式并入本文。
另外，所述β-內酰胺酶多肽可包含來自seqidno：1的第一個殘基的附加上游殘基(參見，例如，jbc258(18)：11211，1983，所述文獻的內容以引用的方式并入本文-包括penp和penp1的大外型和小外型版本)。另外，所述β-內酰胺酶多肽還可包含來自seqidno：1的最后殘基的附加下游殘基。
在一些實施方案中，β-內酰胺酶包含相對于seqidno：1或seqidno:2的一個或多個(例如，約1個、或約2個、或約3個、或約4個、或約5個、或約6個、或約7個、或約8個、或約9個、或約10個)突變。在一些實施方案，β-內酰胺酶包含p3a的變體，例如與seqidno:1或seqidno:2具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％同一性的序列。在各個實施方案中，seqidno:1的一個或多個氨基酸被天然存在的氨基酸取代，所述天然存在的氨基酸諸如親水性氨基酸(例如，極性和帶正電荷的親水性氨基酸，諸如精氨酸(r)或賴氨酸(k)；極性和帶中性電荷的親水性氨基酸，諸如天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)、脯氨酸(p)以及半胱氨酸(c)；極性和帶負電荷的親水性氨基酸，諸如天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)；或者芳香族極性和帶正電荷的親水性氨基酸，諸如組氨酸(h))或疏水性氨基酸(例如，疏水性脂肪族氨基酸，諸如甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、亮氨酸(l)、異亮氨酸(i)、甲硫氨酸(m)或纈氨酸(v)；疏水性芳香族氨基酸，諸如苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)或酪氨酸(y)；或者非經典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸、n-甲酰甲硫氨酸β-丙氨酸、gaba以及δ-氨基乙酰丙酸。4-氨基苯甲酸(paba)、常見氨基酸的d型異構體、2,4-二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、abu、2-氨基丁酸、γ-abu、ε-ahx、6-氨基己酸、aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、設計者氨基酸(designeraminoacid)，諸如β甲基氨基酸、cα-甲基氨基酸、nα-甲基氨基酸以及一般的氨基酸類似物)。在一些實施方案中，seqidno:1可在序列的第一個殘基之前具有met和/或thr。這些殘基可如以上類似地突變。
說明性突變體包括：
在所有這些突變體中，殘基的編號對應于seqidno:1。可通過使用任何常規的生物信息學方法，例如通過使用blast(基本局部對比檢索工具)或fasta(fast-aii)來將這些殘基編號轉換為ambler編號(ambler等，1991,astandardnumberingschemefortheclassaβ-lactamases,biochem.j.276:269-272，所述文獻的內容以引用的方式并入本文)。
在各個實施方案中，用于本發明中的β-內酰胺酶以細菌細胞諸如大腸桿菌細胞產生(參見，例如，pct/us15/47187，所述專利的全部內容以引用的方式并入本文)。
改進釋放曲線
在一方面，本發明提供包含至少一種β-內酰胺酶的改進釋放制劑，其中所述制劑將大量的β-內酰胺酶釋放到胃腸道的一個或多個區域內。在一些實施方案中，β-內酰胺酶為p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體(例如，如以上所述的)。例如，制劑可在胃部之后釋放至少約60％的β-內酰胺酶例如p3a并且釋放到胃腸道的一個或多個區域中。
在各個實施方案中，本發明的改進釋放制劑被設計用于立即釋放(例如在攝取后)。在各個實施方案中，改進釋放制劑可具有持續釋放曲線，即活性成分在身體內(例如胃腸道)延長時間段的緩慢釋放。在各個實施方案中，改進釋放制劑可具有延遲釋放曲線，即未在攝取后立即釋放活性成分；而是延期釋放活性成分，直到組合物在胃腸道下段；例如，在小腸(例如，十二指腸、空腸、回腸中的一個或多個)或大腸(例如，盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸或乙狀結腸部分以及直腸中的一個或多個)中釋放。例如，組合物可以被腸溶包衣，以延遲釋放活性成分，直到它到達小腸或大腸。在一些實施方案中，在糞便中不存在大量的本發明制劑的活性成分。
在各個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在胃部之后將至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)釋放到一個或多個腸區域中。例如，改進釋放制劑在腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在各個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在小腸內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在小腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在一個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在十二指腸內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在十二指腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在一個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在空腸內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在空腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在一個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在回腸和/或回盲連接內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在回腸和/或回盲連接內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在各個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在大腸內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在大腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在一個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在盲腸內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在盲腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在一個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在升結腸內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在升結腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在一個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在橫結腸內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在橫結腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在一個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在降結腸內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在降結腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在一個實施方案中，本發明的改進釋放制劑在乙狀結腸內釋放至少60％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，改進釋放制劑在乙狀結腸內釋放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在各個實施方案中，改進釋放制劑在胃部基本上不釋放β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在某些實施方案中，改進釋放制劑在特定ph下釋放β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，在一些實施方案中，改進釋放制劑在酸性環境中基本上穩定并且在近中性至堿性環境中基本上不穩定(例如，快速溶解或物理上不穩定)。在一些實施方案中，穩定性指示基本上不釋放，而不穩定性指示基本上釋放。例如，在一些實施方案中，改進釋放制劑在以下ph下基本上穩定：約7.0或更小、或約6.5或更小、或約6.0或更小、或約5.5或更小、或約5.0或更小、或約4.5或更小、或約4.0或更小、或約3.5或更小、或約3.0或更小、或約2.5或更小、或約2.0或更小、或約1.5或更小、或約1.0或更小。在一些實施方案中，本發明制劑在較低ph區域內是穩定的并且因此在例如胃部基本上不釋放。在一些實施方案中，改進釋放制劑中約1至約4或更小的ph下基本上穩定并且在更大的ph值下基本上不穩定。在這些實施方案中，改進釋放制劑在胃部基本上不釋放。在這些實施方案中，改進釋放制劑基本上在小腸(例如，十二指腸、空腸和回腸中的一個或多個)和/或大腸(例如，盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸或乙狀結腸中的一個或多個)中釋放。在一些實施方案中，改進釋放制劑中約4至約5或更低的ph下基本上穩定并且因此在更大的ph值下基本上不穩定，并且因此在胃部和/或小腸(例如，十二指腸、空腸和回腸中的一個或多個)中基本上不釋放。在這些實施方案中，改進釋放制劑基本上在大腸(例如，盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸以及乙狀結腸中的一個或多個)中釋放。在各個實施方案中，本文列舉的ph值可如本領域所已知地來調整，以考慮受試者的狀態，例如是否處于禁食或食后狀態。
在一些實施方案中，改進釋放制劑在胃液中基本上穩定并且在腸液中基本上不穩定，并且因此基本上在小腸(例如，十二指腸、空腸和回腸中的一個或多個)和/或大腸(例如，盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸以及乙狀結腸中的一個或多個)中釋放。
在一些實施方案中，改進釋放制劑在胃液中穩定或者在酸性環境中穩定。這些改進釋放制劑在約15、或約30、或約45、或約60、或約90分鐘內在具有約4至約5或更小的ph的胃液內或者具有約4至約5或更小的ph的模擬胃液內釋放約30重量％或更少的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或改進釋放制劑中另外的治療劑。本發明的改進釋放制劑在約15、或約30、或約45、或約60、或約90分鐘內在具有4-5或更小的ph的胃液內或者具有4-5或更小的ph的模擬胃液內釋放約0重量％至約30重量％、約0重量％至約25重量％、約0重量％至約20重量％、約0重量％至約15重量％、約0重量％至約10重量％、約5重量％至約30重量％、約5重量％至約25重量％、約5重量％至約20重量％、約5重量％至約15重量％、約5重量％至約10重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或改進釋放制劑中另外的治療劑。本發明的改進釋放制劑可在約15、或約30、或約45、或約60、或約90分鐘內在具有5或更小的ph的胃液內或者具有5或更小的ph的模擬胃液內釋放約1重量％、約2重量％、約3重量％、約4重量％、約5重量％、約6重量％、約7重量％、約8重量％、約9重量％或約10重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或改進釋放制劑中另外的治療劑。
在一些實施方案中，改進釋放制劑在腸液中不穩定。這些改進釋放制劑在約15、或約30、或約45、或約60、或約90分鐘內在腸液內或者模擬腸液內釋放約70重量％或更多的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或改進釋放制劑中另外的治療劑。在一些實施方案中，改進釋放制劑在近中性至堿性環境中不穩定。這些改進釋放制劑在約15、或約30、或約45、或約60、或約90分鐘內在具有約4-5或更大的ph的腸液內或者具有約4-5或更大的ph的模擬腸液內釋放約70重量％或更多的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或改進釋放制劑中另外的治療劑。在近中性或堿性環境中不穩定的改進釋放制劑可在約5分鐘至約90分鐘、或約10分鐘至約90分鐘、或約15分鐘至約90分鐘、或約20分鐘至約90分鐘、或約25分鐘至約90分鐘、或約30分鐘至約90分鐘、或約5分鐘至約60分鐘、或約10分鐘至約60分鐘、或約15分鐘至約60分鐘、或約20分鐘至約60分鐘、或約25分鐘至約90分鐘、或約30分鐘至約60分鐘內，在具有大于約5的ph的流體(例如，具有約5至約14、約6至約14、約7至約14、約8至約14、約9至約14、約10至約14或約11至約14的ph的流體)內釋放約70重量％或更多的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或改進釋放制劑中另外的治療劑。
模擬胃液和模擬腸液的實例包括但不限于2005年藥典23nf/28usp的測試溶液(2005pharmacopeia23nf/28uspintestsolutions)第2858頁公開的那些和/或本領域技術人員已知的其他模擬胃液和模擬腸液，例如未使用酶制備的模擬胃液和/或模擬腸液。
在一個實施方案中，改進釋放制劑可在胃液中保持大致上完整的，或者可以是大致上不溶的。改進釋放制劑可包含一種或多種ph依賴的延遲釋放包衣。ph依賴的延遲釋放包衣將在酸性環境(約5或更小的ph)中基本上穩定，并且在近中性至堿性環境(大于約5的ph)中基本上不穩定。例如，延遲釋放包衣可在近中性至堿性環境中大致上崩解或溶解，所述環境諸如在小腸(例如，十二指腸、空腸和回腸中的一個或多個)和/或大腸(例如，盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸以及乙狀結腸中的一個或多個)中可見的。
可選地，改進釋放制劑的穩定性可以是酶依賴性的。在此類實施方案中，改進釋放制劑可包含一種或多種酶依賴性的延遲釋放包衣。酶依賴性的延遲釋放包衣將在不含有特定酶的流體中基本上穩定并且在含有所述酶的流體中基本上不穩定。延遲釋放包衣將在含有適當酶的流體中大致上崩解或溶解。酶依賴性控制可以例如通過使用僅在暴露于腸中的酶時釋放活性成分的材料(諸如半乳甘露聚糖)來實現。而且，改進釋放制劑的穩定性可以依賴于在腸道菌群中存在的微生物酶存在下的酶穩定性。
在各個實施方案中，包含β-內酰胺酶(例如，p3a或其變體)的改進釋放制劑在食糜中基本上穩定。例如，在一些實施方案中，從施用開始約10、或9、或8、或7、或6、或5、或4、或3、或2、或1小時內存在小于約50％或約40％、或約30％、或約20％、或10％的β-內酰胺酶活性喪失。
在一些實施方案中，提供一種雙脈沖制劑。在各個實施方案中，本發明提供了在沿著腸的不同位置、在不同時間和/或在不同ph下釋放多個劑量的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)的改進釋放制劑。在一個說明性實施方案中，改進釋放制劑包含第一劑量的β-內酰胺酶和第二劑量的β-內酰胺酶，其中所述第一劑量和所述第二劑量在沿著腸的不同位置處、在不同時間和/或在不同ph下釋放。例如，第一劑量在十二指腸處釋放并且第二劑量在回腸處釋放。在另一個實例中，第一劑量在空腸處釋放并且第二劑量在回腸處釋放。在其他實施方案中，第一劑量在沿著小腸的位置(例如，十二指腸)處釋放，而第二劑量沿著大腸(例如，升結腸)釋放。在各個實施方案中，改進釋放制劑可在沿著腸的不同位置處、在不同時間和/或在不同ph下釋放至少一個劑量、至少兩個劑量、至少三個劑量、至少四個劑量、至少五個劑量、至少六個劑量、至少七個劑量或至少八個劑量的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。另外，本文的雙脈沖描述適用于釋放β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和另一種治療劑的改進釋放制劑。
改進釋放制劑和劑型
β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)的改進釋放制劑還可包含藥學上可接受的載體或賦形劑。如本領域技術人員將認識到的，制劑可以呈適用于所需用途和施用路徑的任何適合的形式。
在一些實施方案中，包含β-內酰胺酶(和/或另外的治療劑)的改進釋放制劑的施用為口服、靜脈內和胃腸外中的任一種。在一些實施方案中，包含β-內酰胺酶(和/或另外的治療劑)的改進釋放制劑的施用不是靜脈內，以便例如防止干擾全身性施用的抗生素。在其他實施方案中，施用路徑可包括例如：口服、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外、舌下、鼻內、腦內、陰道內、經皮、直腸、通過吸入或局部，特別是施用到耳、鼻、眼或皮膚。
包含如本文所述的β-內酰胺酶(和/或另外的治療劑)的任何改進釋放制劑可以是口服施用的。此類發明性制劑也可以通過任何其他常規路徑施用，例如通過靜脈內輸注或快速濃注、通過經上皮或粘膜皮膚襯層(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并且可以與另一種治療劑一起施用。施用可以是全身性或局部的。在一些實施方案中，施用不是在感染部位，以避免例如抗生素在感染部位處的水解。各種遞送系統為已知的，例如脂質體、微粒、微膠囊、膠囊等中的包囊化，并且可用于施用。在特定實施方案中，向需要治療的區域局部施用可為希望的。
用于口服使用的適合的劑型包括例如固體劑型，諸如片劑、可分散粉劑、顆粒劑以及膠囊。在一個實施方案中，改進釋放制劑呈膠囊的形式。在另一個實施方案中，改進釋放制劑呈片劑的形式。在又一個實施方案中，改進釋放制劑呈軟凝膠膠囊的形式。在另一個實施方案中，改進釋放制劑呈明膠或羥丙甲基纖維素(hpmc)膠囊的形式。
在一些劑型中，本文所述的藥劑與至少一種藥學上可接受的惰性賦形劑或載體(諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣等)和/或以下物質混合：a)填充劑或增量劑，諸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、硅酸、微晶纖維素以及面包專用糖(bakersspecialsugar)等；b)粘合劑，例如像羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、阿拉伯膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羥丙基纖維素(hpc)以及羥甲基纖維素等；c)保濕劑，諸如甘油等；d)崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽、碳酸鈉、交聯聚合物諸如交聯聚維酮(交聯聚乙烯吡咯烷酮)、交聯羧甲基纖維素鈉(交聯羧甲基纖維素鈉)、淀粉乙醇酸鈉等；e)溶液阻燃劑，諸如石蠟等；f)吸收促進劑，諸如季銨化合物等；g)潤濕劑，例如像十六醇和單硬脂酸甘油酯等；h)吸附劑，諸如高嶺土和膨潤土等；以及i)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、山崳酸甘油酯等，以及此類賦形劑的混合物。本領域技術人員將認識到特定賦形劑在口服劑型中可具有兩種或更多種功能。在口服劑型例如膠囊或片劑的情況下，所述劑型還可包含緩沖劑。
改進釋放制劑可以另外包含表面活性劑。適用于本發明中的表面活性劑包括但不限于任何藥學上可接受的無毒表面活性劑。適用于本發明的組合物中的表面活性劑的類別包括但不限于聚乙氧基化脂肪酸、peg-脂肪酸二酯、peg-脂肪酸單酯和二酯混合物、聚乙二醇甘油脂肪酸酯、醇-油轉酯產物、丙二醇脂肪酸酯、丙二醇酯-甘油酯的混合物、單甘油酯和二甘油酯、甾醇和甾醇衍生物、聚乙二醇山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚、糖酯、聚乙二醇烷基酚、聚氧乙烯-聚氧基丙烯(olyoxypropylene)嵌段共聚物、山梨糖醇脂肪酸酯、低級醇脂肪酸酯、離子型表面活性劑以及其混合物。在一些實施方案中，本發明的組合物可包含一種或多種表面活性劑，包括但不限于月桂基硫酸鈉、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80以及枸櫞酸三乙酯。
改進釋放制劑還可以含有藥學上可接受的增塑劑，以獲得所需的機械特性諸如柔性和硬度。此類增塑劑包括但不限于三醋汀、檸檬酸酯、檸檬酸三乙酯、苯二甲酸酯、癸二酸二丁酯、十六醇、聚乙二醇、聚山梨醇酯或其他增塑劑。
改進釋放制劑還可以包含一種或多種應用溶劑。可用于施加例如延遲釋放包衣組合物的一些更常見溶劑包括異丙醇、丙酮、二氯甲烷等。
改進釋放制劑還可以包含一種或多種堿性物質。適用于本發明的組合物中的堿性物質包括但不限于諸如磷酸、碳酸、檸檬酸的酸的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽以及鋁鹽以及其他鋁/鎂化合物。另外，堿性物質可選自抗酸物質，諸如氫氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鎂以及氧化鎂。
固體口服劑型可以通過例如使用一種或多種適合的賦形劑對本發明的藥劑進行制粒(例如，濕法制粒或干法制粒)來制備。可選地，本發明的藥劑可以使用常規方法諸如流化床或鍋包衣層疊到惰性核心(例如，獨粒(nonpareil)/糖球，諸如蔗糖球或二氧化硅球)，或者使用本領域已知的方法擠出并滾圓成含有活性化合物的丸粒。在實施方案中，β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)被噴霧涂覆到蔗糖球上。此類丸粒然后可以使用常規方法并入到片劑或膠囊中。
除活性劑之外，混懸劑還可包含助懸劑，例如像乙氧基化異十八醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂、黃蓍膠等以及其混合物。
除惰性稀釋劑之外，口服組合物還可以包含佐劑如甜味劑、調味劑和芳香劑。
適用于胃腸外施用(例如，靜脈內、肌內、腹膜內、皮下以及關節內注射和輸注)的劑型包括例如溶液、混懸液、分散液、乳液等。它們也可以無菌固體組合物(例如凍干組合物)的形式制造，所述固體組合物可以在使用之前即時溶解或懸浮在無菌可注射介質中。它們可例如包含本領域已知的助懸劑或分散劑。
包含β-內酰胺酶(和/或另外的治療劑)的制劑可方便地以單位劑型提供并且可通過制藥領域所熟知的任何方法進行制備。此類方法通常包括將治療劑與構成一種或多種附加成份的載體結合的步驟。通常，制劑通過將治療劑與液態載體、細化的固態載體或這兩者均一而緊密地結合，并且隨后在必要的情況下將產品塑形成所需制劑的劑型(例如濕法制粒或干法制粒、粉末共混等，隨后使用本領域已知的常規方法制成片劑)來制備。
在各個實施方案中，本發明的改進釋放制劑可利用一種或多種改進釋放包衣，諸如延遲釋放包衣，以提供β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)連同任選地其他另外的治療劑到胃腸道的有效的、延遲的且大量的遞送。
在一個實施方案中，延遲釋放包衣包括在酸性環境中基本上穩定并且在近中性至堿性環境中基本上不穩定的腸溶劑。在一個實施方案中，延遲釋放包衣含有胃液中基本上穩定的腸溶劑。腸溶劑可以選自例如甲基丙烯酸共聚物、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯鄰苯二甲酸酯、羧甲基乙基纖維素以及
在某些實施方案中，一種或多種包衣系統添加劑與腸溶劑一起使用。例如，一種或多種plasacryltm添加劑可用作抗粘劑包衣添加劑。示例性plasacryltm添加劑包括但不限于plasacryltmhtp20和plasacryltmt20。在一個實施方案中，plasacryltmhtp20與
在另一個實施方案中，當在與溶液中的ph和/或酶在溶液中的存在無關的水溶液中時，延遲釋放包衣可隨著時間降解。此包衣可包含水不溶性聚合物。其在水溶液中的溶解度因此獨立于ph。如本文所用的術語“ph獨立的”意指聚合物的水滲透性及其釋放藥物成分的能力不隨ph而變化和/或僅極輕微地依賴于ph。此類包衣可用于制備例如持續釋放制劑。適合的水不溶性聚合物包括藥學上可接受的無毒聚合物，所述聚合物在水性介質(例如水)中獨立于溶液的ph為基本上不溶的。適合的聚合物包括但不限于纖維素醚、纖維素酯或纖維素醚-酯，即其中纖維素骨架上的一些羥基被烷基取代并且一些羥基被烷酰基修飾的纖維素衍生物。實例包括乙基纖維素、乙酰纖維素、硝化纖維素等。不溶性聚合物的其他實例包括但不限于漆以及丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯聚合物、具有低季銨含量的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的聚合物或共聚物或其混合物等。不溶性聚合物的其他實例包括eudragit
在另一個實施方案中，延遲釋放包衣可通過腸道菌群中存在的微生物酶降解。在一個實施方案中，延遲釋放包衣可通過小腸中存在的細菌降解。在另一個實施方案中，延遲釋放包衣可通過大腸中存在的細菌降解。
在各個實施方案中，本發明提供一種包含以下的制劑：具有包含一種或多種β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)的底涂層的核心顆粒以及設置在所述涂覆的核心顆粒上的延遲釋放包衣。延遲釋放包衣可在酸性環境和/或胃液中為基本上穩定的，和/或在近中性至堿性環境或腸液中為基本上不穩定的，從而將涂覆的核心顆粒暴露于腸液。包含一種或多種β-內酰胺酶的底涂層還可包含一種或多種另外的治療劑。任選地，多種底涂層可應用于核心，每個底涂層可含有β-內酰胺酶和/或另外的治療劑。在一個實施方案中，核心顆粒包含蔗糖。制劑可以通過本領域中已知的方法來制備。例如，β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)可以噴霧到惰性核心(例如，蔗糖核心或蔗糖球)上，并且與腸溶層(例如，eudragitl30d-55)一起噴霧干燥以形成含有β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)的丸粒。
任選地，核心顆粒可包含一種或多種β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或一種或多種另外的治療劑。在一個實施方案中，一個或多個劑量的β-內酰胺酶可封裝在核心顆粒(例如，呈微球形式)中。例如，β-內酰胺酶可與聚合物(例如，膠乳)組合，并且然后在未使用蔗糖核心的情況下成形為微粒的微封裝酶制備物。因此形成的微球可任選地被延遲釋放包衣覆蓋。
用于生成微粒(諸如微球、聚集物、其他微粒)的多種方法為已知易于包含酶的。它們通常涉及至少兩個相，一個相含有酶并且一個相含有形成微粒骨架的聚合物。最常見的是團聚，其中聚合物通過添加第三種組分來與其溶劑相分離，或者多相乳液諸如水包油包水(w/o/w)乳液，其中內水相含有蛋白質，中間有機相含有聚合物，并且外水相含有支持w/o/w雙重乳液直到可以去除溶劑以形成微球的穩定劑。可選地，β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和穩定賦形劑(例如，海藻糖、甘露醇、吐溫80、聚乙烯醇)被組合并且由水溶液噴霧并收集。然后將顆粒懸浮在干燥的、水不混溶的含有聚合物的有機溶劑中并且釋放改性化合物，并且超聲處理所述懸浮液以分散所述顆粒。另一種方法使用水相而不是有機溶劑。確切地說，將酶、緩沖劑組分、聚合物膠乳以及穩定和改進釋放的賦形劑溶解/分散在水中。將水性分散體噴霧干燥，從而使得膠乳團聚，并且蛋白質和賦形劑摻入在團聚膠乳的顆粒中。當釋放改性劑在酸性條件下不溶但是在較高ph(諸如羧酸)下可溶時，那么在胃環境中阻止了從基質中釋放。
在一些實施方案中，在將延遲釋放包衣應用于涂覆的核心顆粒之前，顆粒可以任選地被一個或多個分離層覆蓋，所述分離層包含藥物賦形劑，包括堿性化合物，例如像ph-緩沖化合物。分離層大致上分離涂覆的核心顆粒與延遲釋放包衣。
分離層可以通過包衣或分層程序應用于涂覆的核心顆粒，所述包衣或分層程序通常與使用水和/或有機溶劑用于包衣過程的包衣設備例如包衣鍋、包衣造粒機或者流化床裝置一起使用。作為一個替代方案，分離層可以通過粉末包衣技術應用于核心材料。用于分離層的材料為藥學上可接受的化合物，例如像糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉以及其他化合物，它們單獨或混合地使用。在分離層中還可以包含添加劑諸如增塑劑、著色劑、顏料、填料、抗粘劑和抗靜電劑，例如像硬脂酸鎂、二氧化鈦、滑石以及其他添加劑。
在一些實施方案中，具有延遲釋放包衣的涂覆顆粒還可被外涂層覆蓋。外涂層可以如對于其他包衣化合物所述地應用。外涂層材料為藥學上可接受的化合物，諸如糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉以及其他化合物，它們單獨或混合地使用。外涂層材料可以防止涂覆有延遲釋放包衣的顆粒潛在地團聚，防止延遲釋放包衣在壓縮過程期間破碎或者增強壓片過程。
在各個實施方案中，制劑可包含多個改進釋放顆粒丸粒或微球。在一個實施方案中，制劑呈包含多個丸粒的膠囊形式。在一個實施方案中，制劑呈包含多個微球的膠囊形式。
在一些實施方案中，改進釋放制劑為填充有多個含有β-內酰胺酶的丸粒(例如，含有p3a(或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)的丸粒)的膠囊，所述β-內酰胺酶從所述丸粒中釋放。在一個實施方案中，膠囊為明膠膠囊，諸如硬明膠膠囊。在另一個實施方案中，膠囊為羥丙基甲基纖維素(hpmc)膠囊。例如，制劑可以呈包含多個丸粒的膠囊形式。例如，制劑可呈膠囊形式，例如像明膠或羥丙甲基纖維(hpmc)膠囊，其包含含有β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)的多個腸溶包衣的丸粒。在這個實施方案中，可利用丸粒的組合，其中每個丸粒被設計在特定時間點或位置處釋放。在各個實施方案中，丸粒(例如，腸溶包衣的丸粒)被設計為未改變地穿過胃部并且然后將β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)釋放到一個或多個腸區域中。在一些實施方案中，含有β-內酰胺酶的丸粒被腸溶包衣，以在不同的腸ph值下釋放β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。
在各個實施方案中，本發明的制劑呈膠囊(例如，硬明膠或hpmc膠囊)的形式，其包含多個腸溶包衣的含有β-內酰胺酶的丸粒。在此類實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)、蔗糖球(其上噴霧β-內酰胺酶，例如p3a或變體)、粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))、腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)、增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)、助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)、乳化劑以及緩沖鹽。
在各個實施方案中，本發明的制劑呈膠囊(例如，硬明膠或hpmc膠囊)的形式，其包含多個腸溶包衣的含有β-內酰胺酶的丸粒。在此類實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含約10重量％-20重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)可以約10重量％、約11重量％、約12重量％、約13重量％、約14重量％、約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、約19重量％或約20重量％存在。在一些實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含約20重量％-30重量％的蔗糖球，將β-內酰胺酶例如p3a或變體噴霧到所述蔗糖球上。例如，蔗糖球可以約20重量％、約21重量％、約22重量％、約23重量％、約24重量％、約25重量％、約26重量％、約27重量％、約28重量％、約29重量％或約30重量％存在。在各個實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含約30重量％-40重量％的粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))。例如，粘合劑賦形劑可以約30重量％、約31重量％、約32重量％、約33重量％、約34重量％、約35重量％、約36重量％、約37重量％、約38重量％、約39重量％或約40重量％存在。在一些實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含約15重量％-25重量％的腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)。例如，腸溶聚合物可以約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、約19重量％、約20重量％、約21重量％、約22重量％、約23重量％、約24重量％或約25重量％存在。在一些實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含約1.5重量％-2.5重量％的增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)。例如，增塑劑可以約1.5重量％、約1.6重量％、約1.7重量％、約1.8重量％、約1.9重量％、約2重量％、約2.1重量％、約2.2重量％、約2.3重量％、約2.4重量％、約2.5重量％存在。在一些實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含約0.5重量％-1.5重量％的助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)。例如，助流劑可以約0.5重量％、約0.6重量％、約0.7重量％、約0.8重量％、約0.9重量％、約1重量％、約1.1重量％、約1.2重量％、約1.3重量％、約1.4重量％或約1.5重量％存在。在一些實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含約0.1重量％-1.0重量％的乳化劑(例如，聚山梨醇酯-80)。例如，乳化劑可以約0.1重量％、約0.2重量％、約0.3重量％、約0.4重量％、約0.5重量％、約0.6重量％、約0.7重量％、約0.8重量％、約0.9重量％或約1重量％存在。在一些實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)還包含約1重量％-2重量％的緩沖鹽。例如，緩沖鹽可以約1.1重量％、約1.2重量％、約1.3重量％、約1.4重量％、約1.5重量％、約1.6重量％、約1.7重量％、約1.8重量％、約1.9重量％或約2重量％存在。如本文所述的重量是指所有組分的總重量，排除膠囊本身的重量。
在一些實施方案中，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含約16重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)；約23重量％的蔗糖球；約35重量％的粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))；約21重量％的腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)；約2重量％的增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)；約1重量％的助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)；約0.5重量％的乳化劑(例如，聚山梨醇酯-80)；以及約2重量％的緩沖鹽。如本文所述的重量是指所有組分的總重量，排除膠囊本身的重量。
例如，丸粒(或每個單獨的丸粒)包含約15.8重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)；約23.3重量％的蔗糖球；約35重量％的粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))；約20.8重量％的腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)；約2.1重量％的增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)；約1.0重量％的助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)；約0.4重量％的乳化劑(例如，聚山梨醇酯-80)；以及約1.6重量％的緩沖鹽。如本文所述的重量是指所有組分的總重量，排除膠囊本身的重量。
在各個實施方案中，本發明的制劑呈膠囊(例如，硬明膠或hpmc膠囊)的形式，其包含約75mg的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。膠囊包含多個腸溶包衣的含有β-內酰胺酶的丸粒。在此類實施方案中，制劑包含約10重量％-20重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)可以約10重量％、約11重量％、約12重量％、約13重量％、約14重量％、約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、約19重量％或約20重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約15重量％-25重量％的蔗糖球。例如，蔗糖球可以約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、約19重量％、約20重量％、約21重量％、約22重量％、約23重量％、約24重量％或約25重量％存在。在各個實施方案中，制劑包含約25重量％-35重量％的粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))。例如，粘合劑賦形劑可以約25重量％、約26重量％、約27重量％、約28重量％、約29重量％、約30重量％、約31重量％、約32重量％、約33重量％、約34重量％或約35重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約10重量％-25重量％的腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)。例如，腸溶聚合物可以約10重量％、約11重量％、約12重量％、約13重量％、約14重量％、約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、約19重量％、約20重量％、約21重量％、約22重量％、約23重量％、約24重量％或約25重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約1.5重量％-2.5重量％的增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)。例如，增塑劑可以約1.5重量％、約1.6重量％、約1.7重量％、約1.8重量％、約1.9重量％、約2重量％、約2.1重量％、約2.2重量％、約2.3重量％、約2.4重量％、約2.5重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約0.5重量％-1.5重量％的助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)。例如，助流劑可以約0.5重量％、約0.6重量％、約0.7重量％、約0.8重量％、約0.9重量％、約1重量％、約1.1重量％、約1.2重量％、約1.3重量％、約1.4重量％或約1.5重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約0.1重量％-1.0重量％的乳化劑(例如，聚山梨醇酯-80)。例如，乳化劑可以約0.1重量％、約0.2重量％、約0.3重量％、約0.4重量％、約0.5重量％、約0.6重量％、約0.7重量％、約0.8重量％、約0.9重量％或約1重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約1重量％-2重量％的緩沖鹽。例如，緩沖鹽可以約1重量％、約1.1重量％、約1.2重量％、約1.3重量％、約1.4重量％、約1.5重量％、約1.6重量％、約1.7重量％、約1.8重量％、約1.9重量％或約2重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約10重量％-20重量％的明膠或hpmc膠囊。例如，明膠或hpmc膠囊可以約10重量％、約11重量％、約12重量％、約13重量％、約14重量％、約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、約19重量％或約20重量％存在。
在一些實施方案中，本發明的制劑包含約75mg的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。在此類實施方案中，制劑包含約13重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)；約19重量％的蔗糖球；約29重量％的粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))；約17重量％的腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)；約2重量％的增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)；約1重量％的助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)；約0.5重量％的乳化劑(例如，聚山梨醇酯-80)；約1重量％的緩沖鹽；以及約17重量％的明膠或hpmc膠囊。
例如，制劑包含約13.1重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)；約19.4重量％的蔗糖球；約29.1重量％的粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))；約17.3重量％的腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)；約1.7重量％的增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)；約0.9重量％的助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)；約0.4重量％的乳化劑(例如，聚山梨醇酯-80)；約1.3重量％的緩沖鹽；以及約16.8重量％的明膠或hpmc膠囊。
在各個實施方案中，本發明的制劑呈膠囊(例如，硬明膠或hpmc膠囊)的形式，其包含約25mg的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。膠囊包含多個腸溶包衣的含有β-內酰胺酶的丸粒。在此類實施方案中，制劑包含約5重量％-15重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。例如，β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)可以約5重量％、約6重量％、約7重量％、約8重量％、約9重量％、約10重量％、約11重量％、約12重量％、約13重量％、約14重量％或約15重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約10重量％-20重量％的蔗糖球。例如，蔗糖球可以約10重量％、約11重量％、約12重量％、約13重量％、約14重量％、約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、約19重量％或約20重量％存在。在各個實施方案中，制劑包含約15重量％-25重量％的粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))。例如，粘合劑賦形劑可以約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、約19重量％、約20重量％、約21重量％、約22重量％、約23重量％、約24重量％或約25重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約10重量％-20重量％的腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)。例如，腸溶聚合物可以約10重量％、約11重量％、約12重量％、約13重量％、約14重量％、約15重量％、約16重量％、約17重量％、約18重量％、約19重量％或約20重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約1.0重量％-2.0重量％的增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)。例如，增塑劑可以約1.0重量％、約1.1重量％、約1.2重量％、約1.3重量％、約1.4重量％、約1.5重量％、約1.6重量％、約1.7重量％、約1.8重量％、約1.9重量％或約2.0重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約0.1重量％-1.0重量％的助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)。例如，助流劑可以約0.1重量％、約0.2重量％、約0.3重量％、約0.4重量％、約0.5重量％、約0.6重量％、約0.7重量％、約0.8重量％、約0.9重量％或約1重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約0.1重量％-1.0重量％的乳化劑(例如，聚山梨醇酯-80)。例如，乳化劑可以約0.1重量％、約0.2重量％、約0.3重量％、約0.4重量％、約0.5重量％、約0.6重量％、約0.7重量％、約0.8重量％、約0.9重量％或約1重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約0.5重量％-1.5重量％的緩沖鹽。例如，緩沖鹽可以約0.5重量％、約0.6重量％、約0.7重量％、約0.8重量％、約0.9重量％、約1.0重量％、約1.1重量％、約1.2重量％、約1.3重量％、約1.4重量％或約1.5重量％存在。在一些實施方案中，制劑包含約30重量％-40重量％的明膠或hpmc膠囊。例如，明膠或hpmc膠囊可以約30重量％、約31重量％、約32重量％、約33重量％、約34重量％、約35重量％、約36重量％、約37重量％、約38重量％、約39重量％或約40重量％存在。
在一些實施方案中，本發明的制劑包含約25mg的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)。在此類實施方案中，制劑包含約10重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)；約15重量％的蔗糖球；約22重量％的粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))；約13重量％的腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)；約1重量％的增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)；約0.5重量％的助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)；約0.3重量％的乳化劑(例如，聚山梨醇酯-80)；約1重量％的緩沖鹽；以及約38重量％的明膠或hpmc膠囊。
例如，制劑包含約9.8重量％的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)；約14.5重量％的蔗糖球；約21.8重量％的粘合劑賦形劑(例如，羥丙基纖維素(hpc))；約13重量％的腸溶聚合物(例如，eudragitl30d-55)；約1.3重量％的增塑劑(例如，檸檬酸三乙酯)；約0.6重量％的助流劑(例如，單硬脂酸甘油酯)；約0.3重量％的乳化劑(例如，聚山梨醇酯-80)；約1.0重量％的緩沖鹽；以及約37.7重量％的明膠或hpmc膠囊。
本發明還提供沿著胃腸道釋放多個劑量的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或另外的治療劑的改進釋放制劑。在此類實施方案中，此制劑的總體釋放曲線可通過例如利用多種顆粒類型或多個層來調整。在一個實施方案中，第一劑量的β-內酰胺酶可被配制為在例如小腸(例如，十二指腸、空腸、回腸中的一個或多個)或大腸(例如，盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸或乙狀結腸部分以及直腸中的一個或多個)中釋放，而第二劑量被配制為在小腸(例如，十二指腸、空腸、回腸中的一個或多個)或大腸(例如，盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸或乙狀結腸部分以及直腸中的一個或多個)的不同區域中延遲釋放。可選地，多個劑量在沿著腸道的不同位置處釋放。例如，在一個實施方案中，第一劑量的β-內酰胺酶可被配制為在例如小腸(例如，十二指腸、空腸、回腸中的一個或多個)中釋放，而第二劑量被配制為在例如小腸的另一部分(例如，十二指腸、空腸、回腸中的一個或多個)中延遲釋放。在另一個實施方案中，第一劑量的β-內酰胺酶可被配制為在例如大腸(例如，盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸或乙狀結腸部分以及直腸中的一個或多個)中釋放，而第二劑量被配制為在另一部分大腸(例如，盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸或乙狀結腸部分以及直腸中的一個或多個)中延遲釋放。
在各個實施方案中，本文所述的藥劑可呈藥學上可接受的鹽的形式，即適用于接觸人和其他動物的組織而不具有異常的毒性、刺激性、過敏反應等，并且與合理的獲益/風險比相對應的那些鹽。藥學上可接受的鹽為本領域已熟知的。所述鹽在治療劑的最終分離和純化期間原位制備，或者單獨地通過將游離堿官能團與適合的酸反應或者將游離酸官能團與適當的堿性部分反應來制備。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽、戊酸鹽等。代表性堿金屬鹽或堿土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等以及無毒的銨、季銨和胺陽離子，包括但不限于銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。
在各個實施方案中，本發明制劑提供了許多優點。例如，本發明人已成功配制一種蛋白質(即β-內酰胺酶)，所述蛋白質本身是有挑戰性的。這通過胃腸道環境進一步配混，其中本發明制劑在各個實施方案中釋放藥物。另外，在各個實施方案中，本發明制劑提供了胃腸道釋放，所述釋放足夠緩慢以允許胃腸道內的良好保護性覆蓋來防止各種抗生素的不利效應，例如在小腸中(通過與更慢釋放相應的β-內酰胺酶半衰期的增加來增強的益處)。另外，例如與eudragit相比，通過用hpc包衣本發明丸粒的藥物層，本發明制劑使制劑內的eugragit的量最小化并且因此減輕可能的劑量限制性毒性和制造復雜性。
施用和劑量
將了解的是，根據本發明施用的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)的實際劑量將根據例如具體劑型和施用模式來改變。本領域技術人員應考慮到可改變β-內酰胺酶的作用的許多因素(例如，體重、性別、膳食、施用時間、施用路徑、排泄速率、受試者病狀、藥物組合、遺傳傾向和反應敏感性)。施用可以連續地或者以最大耐藥量內的一個或多個分散劑量進行。用于一組給定病狀的最佳施用速率可以通過本領域技術人員使用常規劑量施用測試來判斷。
個別劑量的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)可以含有例如以下的單位劑型(例如，片劑或膠囊)施用：每單位劑型約0.01mg至約1,000mg、約0.01mg至約950mg、約0.01mg至約900mg、約0.01mg至約850mg、約0.01mg至約800mg、約0.01mg至約750mg、約0.01mg至約700mg、約0.01mg至約650mg、約0.01mg至約600mg、約0.01mg至約550mg、約0.01mg至約500mg、約0.01mg至約450mg、約0.01mg至約400mg、約0.01mg至約350mg、約0.01mg至約300mg、約0.01mg至約250mg、約0.01mg至約200mg、約0.01mg至約150mg、約0.01mg至約100mg、約0.1mg至約90mg、約0.1mg至約80mg、約0.1mg至約70mg、約0.1mg至約60mg、約0.1mg至約50mg、約0.1mg至約40mg活性成分、約0.1mg至約30mg、約0.1mg至約20mg、約0.1mg至約10mg、約0.1mg至約5mg、約0.1mg至約3mg、約0.1mg至約1mg或者每單位劑型約5mg至約80mg。例如，單位劑型可以是約0.01mg、約0.02mg、約0.03mg、約0.04mg、約0.05mg、約0.06mg、約0.07mg、約0.08mg、約0.09mg、約0.1mg、約0.2mg、約0.3mg、約0.4mg、約0.5mg、約0.6mg、約0.7mg、約0.8mg、約0.9mg、約1mg、約2mg、約3mg、約4mg、約5mg、約6mg、約7mg、約8mg、約9mg約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100mg、約150mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約450mg、約500mg、約550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約750mg、約800mg、約850mg、約900mg、約950mg或約1,000mg，包括它們之間的所有值和范圍。在一個實施方案中，個別劑量的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)以含有25mg的β-內酰胺酶的單位劑型施用。在另一個實施方案中，個別劑量的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)以含有50mg的β-內酰胺酶的單位劑型施用。在又一個實施方案中，個別劑量的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)以含有75mg的β-內酰胺酶的單位劑型施用。
在一個實施方案中，β-內酰胺酶以以下量施用：每天約0.01mg至約100mg的量、每天約0.01mg至約1,000mg、每天約0.01mg至約950mg、每天約0.01mg至約900mg、每天約0.01mg至約850mg、每天約0.01mg至約800mg、每天約0.01mg至約750mg、每天約0.01mg至約700mg、每天約0.01mg至約650mg、每天約0.01mg至約600mg、每天約0.01mg至約550mg、每天約0.01mg至約500mg、每天約0.01mg至約450mg、每天約0.01mg至約400mg、每天約0.01mg至約350mg、每天約0.01mg至約300mg、每天約0.01mg至約250mg、每天約0.01mg至約200mg、每天約0.01mg至約150mg、每天約0.1mg至約100mg、每天約0.1mg至約95mg、每天約0.1mg至約90mg、每天約0.1mg至約85mg、每天約0.1mg至約80mg、每天約0.1mg至約75mg、每天約0.1mg至約70mg、每天約0.1mg至約65mg、每天約0.1mg至約60mg、每天約0.1mg至約55mg、每天約0.1mg至約50mg、每天約0.1mg至約45mg、每天約0.1mg至約40mg、每天約0.1mg至約35mg、每天約0.1mg至約30mg、每天約0.1mg至約25mg、每天約0.1mg至約20mg、每天約0.1mg至約15mg、每天約0.1mg至約10mg、每天約0.1mg至約5mg、每天約0.1mg至約3mg、每天約0.1mg至約1mg或每天約5mg至約80mg的量。
在各個實施方案中，β-內酰胺酶以以下每日劑量施用：約0.01mg、約0.02mg、約0.03mg、約0.04mg、約0.05mg、約0.06mg、約0.07mg、約0.08mg、約0.09mg、約0.1mg、約0.2mg、約0.3mg、約0.4mg、約0.5mg、約0.6mg、約0.7mg、約0.8mg、約0.9mg、約1mg、約2mg、約3mg、約4mg、約5mg、約6mg、約7mg、約8mg、約9mg約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100mg、約150mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約450mg、約500mg、約550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約750mg、約800mg、約850mg、約900mg、約950mg或約1,000mg，包括它們之間的所有值和范圍。
在一些實施方案中，β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)的適合劑量的范圍為約0.01mg/kg至約100mg/kg受試者體重，例如約0.01mg/kg、約0.02mg/kg、約0.03mg/kg、約0.04mg/kg、約0.05mg/kg、約0.06mg/kg、約0.07mg/kg、約0.08mg/kg、約0.09mg/kg、約0.1mg/kg、約0.2mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg、約1.5mg/kg、約1.6mg/kg、約1.7mg/kg、約1.8mg/kg、1.9mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg或約100mg/kg體重，包括它們之間的所有值和范圍。在其他實施方案中，β-內酰胺酶的適合劑量的范圍為約0.01mg/kg至約10mg/kg體重，范圍為約0.01mg/kg至約9mg/kg體重，范圍為約0.01mg/kg至約8mg/kg體重，范圍為約0.01mg/kg至約7mg/kg體重，范圍為0.01mg/kg至約6mg/kg體重，范圍為約0.05mg/kg至約5mg/kg體重，范圍為約0.05mg/kg至約4mg/kg體重，范圍為約0.05mg/kg至約3mg/kg體重，范圍為約0.05mg/kg至約2mg/kg體重，范圍為約0.05mg/kg至約1.5mg/kg體重，或者范圍為約0.05mg/kg至約1mg/kg體重。
根據本發明的某些實施方案，β-內酰胺酶可例如約每天一次、約每隔一天一次、約每隔三天一次、約每周一次、約每兩周一次、約每個月一次、約每兩個月一次、約每三個月一次、約每六個月一次或約每年一次地施用。在某些實施方案中，β-內酰胺酶可每天多于一次地施用，例如每天約兩次、約三次、約四次、約五次、約六次、約七次、約八次、約九次或約十次。
另外的治療劑和組合療法或共制劑
本發明制劑的施用可與另外的治療劑組合。另外的治療劑與本發明制劑的共同施用可以是同時的或依序的。另外，本發明制劑可包含另外的治療劑(例如，經由共制劑)。
在一些實施方案中，本發明的改進釋放制劑與另外的治療劑組合施用。在一個實施方案中，另外的治療劑和β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)被組合成單一改進釋放制劑。在一些實施方案中，治療和/或預防方法包括向正在經歷使用另外的治療劑的治療的受試者施用本發明的改進釋放制劑。
在一個實施方案中，另外的藥劑和β-內酰胺酶同時施用于受試者。如本文所用的術語“同時”意指另外的藥劑和β-內酰胺酶以不超過約60分鐘，諸如不超過約30分鐘、不超過約20分鐘、不超過約10分鐘、不超過約5分鐘或不超過約1分鐘的時間分隔來施用。另外的藥劑和β-內酰胺酶的施用可以是通過同時施用單一制劑(例如，包含另外的藥劑和β-內酰胺酶的制劑)或單獨的制劑(例如，包含另外的藥劑的第一制劑和包含β-內酰胺酶的第二制劑)。
如果其施用時間使得另外的藥劑和β-內酰胺酶的藥理學活性在時間上重疊，則共同施用并不需要同時施用另外的治療劑，從而發揮出組合的治療效果。另外，另外的藥劑和β-內酰胺酶可以依序施用。如本文所用的術語“依序”意指另外的藥劑和β-內酰胺酶以超過約60分鐘的時間分隔施用。例如，在另外的藥劑與β-內酰胺酶的依序施用之間的時間可以超過約60分鐘、超過約2小時、超過約5小時、超過約10小時、超過約1天、超過約2天、超過約3天或超過約1周間隔。最佳施用時間將取決于所施用的另外的藥劑和β-內酰胺酶的代謝速率、排泄速率和/或藥效學活性。另外的治療劑或β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)可首先施用。
共同施用也不需要通過相同施用途徑將另外的治療劑施用給受試者。相反，每種另外的治療劑可以通過任何適當的途徑，例如胃腸外或非胃腸外途徑來施用。
在一些實施方案中，另外的治療劑為另外的抗生素降解酶，例如像類別ec3.5.2.6的β-內酰胺酶。在一些實施方案中，抗生素降解酶選自功能性組1、組2、組3或組4β-內酰胺酶(參見，例如bush等，antimicrob.agentschemother,39:1211，所述文獻的內容以引用的方式并入本文)：在不希望受到理論約束的情況下，組1由克拉維酸不能很好地抑制的頭孢菌素酶組成；組2由通常活性位點引導的β-內酰胺酶抑制劑抑制的青霉素酶、頭孢菌素酶和光譜β-內酰胺酶組成；組3由水解青霉素、頭孢菌素和碳青霉烯并且被幾乎所有含β內酰胺分子較差地抑制的金屬-β-內酰胺酶組成；并且組4由克拉維酸不能很好地抑制的青霉素酶組成)和/或分子/amblera類、或b類、或c類、或d類β-內酰胺酶(參見，例如，ambler1980,philostransrsoclondbbiolsci.289:321，所述文獻的內容以引用的方式并入本文)，在不希望受到理論約束的情況下：a類、c類和d類在進化上聚集絲氨酸β-內酰胺酶的不同組，并且b類為鋅依賴性(“edta抑制性”)β-內酰胺酶(參見amblerr.p.等，1991,biochemj.276:269-270，所述文獻的內容以引用的方式并入本文)。在一些實施方案中，抗生素降解酶為絲氨酸β-內酰胺酶或鋅依賴性(edta抑制性)β-內酰胺酶。例如，在一些實施方案中，β-內酰胺酶為p1a、p2a、p3a或p4a中的一種或多種。另外，β-內酰胺酶可以是廣譜性β-內酰胺酶(esbl)，任選地選自tem、shv、ctx-m、oxa、per、veb、ges以及ibcβ-內酰胺酶。另外，β-內酰胺酶可以是抑制劑抗性的β-內酰胺酶，任選地選自ampc-型β-內酰胺酶、碳青霉烯酶、imp-型碳青霉烯酶(金屬-β-內酰胺酶)、vim(verona整合子編碼的金屬-β-內酰胺酶)、β-內酰胺酶的oxa(苯唑西林酶(oxacillinase))組、kpc(肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶)、cmy(c類)、sme、imi、nmc和ccra以及ndm(新德里金屬-β-內酰胺酶，例如ndm-1)β-內酰胺酶。
在一些實施方案中，另外的治療劑為用于例如本文所述的cdi治療中的輔助性療法。在一些實施方案中，另外的藥劑為甲硝唑(例如，flagyl)、非達霉素(fidaxomicin)(例如，dificid)或萬古霉素(例如，萬古霉素(vancocin))、利福昔明、糞便細菌療法、基于木炭的粘合劑(例如，dav132)、益生菌療法(參見，例如，intnat’ljinfdis,16(11):e786，所述文獻的內容以引用的方式并入本文，說明性益生菌包括布拉氏酵母(saccharomycesboulardii)；鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)gg；植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)299v；丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)m588；艱難梭菌(clostridiumdifficile)vp20621(無毒性艱難梭菌菌株)；干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)、嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)(bio-k+cl1285)的組合；干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌(lactobacillusbulgaricus)、嗜熱鏈球菌(streptococcusthermophilus)(actimel)的組合；嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌(bifidobacteriumbifidum)(florajen3)的組合；嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌德氏亞種(lactobacillusbulgaricusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、保加利亞干酪乳桿菌(lactobacillusbulgaricuscasei)、保加利亞植物乳桿菌(lactobacillusbulgaricusplantarum)、長雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)、嬰兒雙岐桿菌(bifidobacteriuminfantis)、短雙岐桿菌(bifidobacteriumbreve)、唾液鏈球菌嗜熱亞種(streptococcussalivariussubsp.thermophilus)(vsl#3)的組合)以及抗體或其他生物療法(例如，針對艱難梭菌毒素a和b的單克隆抗體，如nengljmed.2010；362(3):197所述的，所述文獻的內容以引用的方式整體并入本文；中和結合蛋白，例如，排列為多聚物，其涉及美國專利公布號2013/0058962中列出的一種或多種seqidno.(例如，seqidno.:59、60、95、67、68和87中的一種或多種)，所述專利的內容以引用的方式并入本文)；或者針對艱難梭菌二元毒素的任何中和結合蛋白。在一些實施方案中，本文所述的任何青霉素和頭孢菌素可以是另外的藥劑。
在一些實施方案中，另外的治療劑為止瀉劑。適用于本發明的止瀉劑包括但不限于dpp-iv抑制劑、天然的阿片樣物質(諸如鴉片酊、止痛劑和可待因)、合成的阿片樣物質(諸如苯乙哌啶、地芬諾辛和洛哌丁胺)、次水楊酸鉍、蘭瑞肽(lanreotide)、伐普肽(vapreotide)和奧曲肽(octreotide)、胃動素拮抗劑(motilnantagonist)、cox2抑制劑(如塞來昔布)、谷氨酰胺、沙利度胺和傳統的止瀉藥(諸如高嶺土、果膠、小檗堿和蕈毒堿劑)。
在一些實施方案中，另外的治療劑為抗炎劑，諸如類固醇類抗炎劑或非類固醇類抗炎劑(nsaids)。類固醇類，具體地是腎上腺皮質類固醇類及其合成類似物為本領域已熟知的。適用于本發明的皮質類固醇類的實例包括而不限于羥基去炎松、α-甲基地塞米松、β-甲基倍他米松、二丙酸倍氯米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、戊酸氯倍他索、羥潑尼縮松、去氧米松、地塞米松、二乙酸二氟拉松、戊酸二氟可龍、fluadrenolone、氟氯縮松(flucloroloneacetonide)、戊酸氟米松、醋酸氟輕松(fluosinoloneacetonide)、氟輕松醋酸酯(fluocinonide)、二氟美松(flucortine)丁基酯、氟可龍、醋酸氟潑尼定(fluprednidene，fluprednylidene)、氟氫縮松、哈西縮松、醋酸氫化可的松、丁酸氫化可的松、甲基強的松龍、丙酮曲安縮松、可的松、可托多松、醋酸氟輕松(flucetonide)、氟氫可的松、雙醋酸雙氟拉松(difluorosonediacetate)、丙酮氟拉諾龍(fluradrenoloneacetonide)、甲羥松、安西法爾(amcinafel)、安西非特、倍他米松及其酯的平衡量、氯潑尼松、氯可托龍(clocortelone)、clescinolone、二氯松、二氟潑尼松龍酯、氟氯奈德、氟尼縮松、氟米龍(fluoromethalone)、氟培龍、氟潑尼龍、氫化可的松、甲潑尼松、帕拉米松、脫氫皮質醇、脫氫可的松、二丙酸倍氯米松。可用于本發明的(nsaids)包括但不限于水楊酸、乙酰水楊酸、水楊酸甲酯、水楊酸乙二醇酯、水楊酰胺、芐基-2,5-雙乙酰氧基苯甲酸、異丁苯丙酸、舒林酸(fulindac)、甲氧萘丙酸、酮洛芬、依托芬那酯、苯乙丁氮酮以及吲哚美辛。另外的抗炎劑描述于例如美國專利號4,537,776中，所述專利的全部內容以引用的方式并入本文。
在一些實施方案中，另外的治療劑為止痛劑。適用于本發明的組合物和方法中的止痛劑包括而不限于嗎啡、可待因、海洛因、美沙酮和相關化合物、蒂巴因、東罌粟堿(orpiavine)、以及其衍生物、丁丙諾啡、哌啶類、嗎啡喃、苯并嗎吩烷、四氫異喹啉、thiambutane、芐胺、替利定、維米醇、奈福泮、辣椒素(8-甲基-n-香草基-6e-壬烯酰胺)、“合成的”辣椒素(n-香草基壬酰胺)以及相關化合物。
對于所有另外的藥劑，可采用如本文所述的靶向胃腸道不同部分的組合物和方法。
在一些實施方案中，本發明制劑施用給患者以避免使用另外的治療劑的治療。例如，在預防艱難梭菌感染(cdi)和/或艱難梭菌相關性疾病的情況下，可為患者提供本發明制劑以避免接受例如萬古霉素的需要。
治療方法
在各個方面，本發明提供包含β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的改進釋放制劑，以用于治療胃腸道內抗生素誘導的不利效應和/或預防或治療艱難梭菌感染(cdi)和/或艱難梭菌相關性疾病。在其他方面，提供了包含β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的改進釋放制劑用于治療胃腸道內抗生素誘導的不利效應和/或預防或治療艱難梭菌感染(cdi)和/或艱難梭菌相關性疾病的用途。
在各個方面，本發明提供用于治療或預防胃腸道內抗生素誘導的不利效應的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或本文所述的另外的治療劑的改進釋放制劑。在一方面，本發明提供用于預防胃腸道內抗生素誘導的不利效應的方法，所述方法包括向有需要的患者(作為非限制性實例，為正在施用或將施用抗生素(包括本文所述的那些抗生素)的患者)施用有效量的包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或本文所述的另外的治療劑的改進釋放制劑。
在各個方面，本發明提供用于保護受試者胃腸道微生物組的方法，所述方法包括用有效量的包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或本文所述的另外的治療劑的改進釋放制劑。在各個實施方案中，受試者正在經歷使用抗生素的治療或者最近已經歷所述治療。在各個實施方案中，抗生素為如本文所述的青霉素、頭孢菌素、單菌霉素以及碳青霉烯中的一種或多種。在一個實施方案中，β-內酰胺酶為p3a。
在各個實施方案中，受試者包括但不限于處于微生物組介導的病癥的特定風險下的受試者，諸如作為非限制性實例，經歷使用抗生素的治療或最近經歷使用抗生素的治療的那些受試者。例如，受試者可在過去約30天或左右期間服用抗生素，和/或具有弱免疫系統(例如，來自慢性疾病)，和/或為女性，和/或為老年人(例如，超過約65歲)，和/或為老年女性，和/或正在經歷(或已經歷)胃灼熱或胃酸病癥的治療(例如，使用諸如蘭索拉唑(prevacid)、泰胃美(tagamet)、奧美拉唑(prilosec)或埃索美拉唑(nexium)以及相關藥物的藥劑)，和/或最近已在醫院，包括在特護病房中，或者生活在療養院中。因此，在一些實施方案中，本發明的方法和用途治療或預防醫院內感染和/或繼發性突發感染和/或醫院內獲得性感染(hai)。
在各個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)保護腸微生物組使其免于抗生素誘導的損害。在一個說明性實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)保護腸微生物組使其免于頭孢菌素誘導的損害。例如，在一些實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)保護腸微生物組使其免于頭孢菌素誘導的損害，所述頭孢菌素可以是以下一種或多種：
在一個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)保護腸微生物組使其免于頭孢曲松(cro)-誘導的損害。在一些實施方案中，本發明的方法治療或預防頭孢曲松相關的不利效應(例如，腹瀉、惡心、嘔吐、味覺障礙以及假膜性結腸炎疾病和/或癥狀)。
抗生素治療諸如頭孢曲松治療可導致產甲烷菌異常生長(例如，過度生長和/或過剩)。產甲烷菌包括產生作為代謝副產物的甲烷的微生物。產甲烷菌的實例包括但不限于布氏甲烷桿菌(methanobacteriumbryantii)、methanobacteriumformicum、嗜樹甲燒短桿菌(methanobrevibacterarboriphilicus)、methanobrevibactergottschalkii、反芻獸甲烷短桿菌(methanobrevibacterruminantium)、史氏甲烷短桿菌(methanobrevibactersmithii)、耐鹽甲烷菌(methanocalculuschunghsingensis)、布氏擬甲燒球菌(methanococcoidesburtonii)、雜色甲烷球菌(methanococcusaeolicus)、德爾塔甲烷球菌(methanococcusdeltae)、詹氏甲烷球菌(methanococcusjannaschii)、海藻產甲烷球菌(methanococcusmaripaludis)、萬氏甲烷球菌(methanococcusvannielii)、拉布雷亞甲烷粒菌(methanocorpusculumlabreanum)、布儒瓦甲烷囊菌(methanoculleusbourgensis)(methanogeniumolentangyi、布爾日產甲烷菌(methanogeniumbourgense))、黑海甲烷袋狀菌(methanoculleusmarisnigri)、methanofollisliminatans、卡里亞薩產甲烷菌(methanogeniumcariaci)、嗜冷產甲烷菌(methanogeniumfrigidum)、嗜器官產甲烷菌(methanogeniumorganophilum)、沃氏產甲烷菌(methanogeniumwolfei)、活動甲烷微菌(methanomicrobiummobile)、甲烷嗜熱菌(methanopyruskandleri)、嗜酸產甲烷菌(methanoregulaboonei)、甲烷毛狀菌(methanosaetaconcilii)、嗜熱甲烷絲菌(methanosaetathermophile)、乙酸甲烷八疊球菌(methanosarcinaacetivorans)、巴氏甲烷八疊球菌(methanosarcinabarkeri)、馬氏甲烷八疊球菌(methanosarcinamazei)、斯氏甲烷球形菌(methanosphaerastadtmanae)、亨氏甲烷螺菌(methanospirilliumhungatei)、德氏嗜熱甲烷桿菌(methanothermobacterdefluvii)(德氏甲烷桿菌(methanobacteriumdefluvii))、熱自養甲烷熱桿菌(methanothermobacterthermautotrophicus)(嗜熱自養甲烷桿菌(methanobacteriumthermoautotrophicum))、彎曲甲烷熱桿菌(methanothermobacterthermoflexus)(methanobacteriumthermoflexum)、沃氏甲烷嗜熱桿菌(methanothermobacterwolfei)(沃氏甲烷桿菌(methanobacteriumwolfei))以及索氏甲烷絲菌(methanothrixsochngenii)。在一個實施方案中，產甲烷菌為史氏甲烷短桿菌。在各個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)防止了以下一種或多種：產甲烷菌的異常存在或不存在、產甲烷菌的異常水平、產甲烷菌的過度生長、產甲烷作用的升高水平、升高的腸甲烷水平、由消耗氫的產甲烷菌清除過量氫氣或者產甲烷菌定殖在異常位置(例如在小腸中而不是大腸中)。在一個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)保護腸微生物組使其免于產甲烷菌諸如史氏甲烷短桿菌的過度生長和/或過剩。
在各個實施方案中，抗生素治療諸如頭孢曲松治療也可導致異常生長，諸如細菌種類的減少或代表性不足(underrepresentation)。在一個實施方案中，抗生素治療導致蘇黎士桿菌屬某些種的減少或代表性不足。示例性蘇黎士桿菌屬某些種包括但不限于t.sanguinis、蘇黎士桿菌屬某種hgf1、蘇黎士桿菌屬某種la61、蘇黎士桿菌屬某種la62、蘇黎士桿菌屬某種hga0205和蘇黎士桿菌屬某種hgh0181。在一個實施方案中，細菌種類為t.sanguinis。蘇黎士桿菌屬某些種的減少與狗中的特發性炎癥性腸病和急性出血性腹瀉相關(minamoto等，2015,gutmicrobes6(1),33-47；rossi等，2014,plosone9(4),e94699)。因此，在各個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)保護腸微生物組使其免于蘇黎士桿菌屬某些種諸如t.sanguinis的減少和/或代表性不足。
在各個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)用于保持腸道內的正常細菌多樣性。此類治療保持擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門的平衡。在一些實施方案中，p3a(任選地配制為如本文所述的改進釋放形式)防止或減少菌群失調。在一些實施方案中，p3a(任選地配制為如本文所述的改進釋放形式)防止或減少胃腸道中厚壁菌門的根除或大量減少。
在一個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)通過保護厭氧和兼性需氧細菌種類使其免于抗生素介導的改變來保護腸微生物組。說明性厭氧和兼性需氧細菌種類包括但不限于嬰兒鏈球菌(s.infantarius)、脆弱擬桿菌(b.vulgatus)、毛螺菌科細菌(lachnospiraceaebacterium)、蘇黎士桿菌屬某種、活潑瘤胃球菌(r.gnavus)、兩岐雙岐桿菌(b.bifidum)、p.merdae、腐敗擬桿菌(a.putredinis)、梭菌屬某種(clostridiumsp.)、共生梭菌(c.symbiosum)、海瑟薇梭菌(c.hathewayi)、c.citroniae、多枝梭菌(c.ramosum)、系結梭菌(c.nexile)、艱難梭菌(c.difficile)、產氣莢膜梭菌(c.clostridioforme)、大腸桿菌(e.coli)、alistipes某種、雙歧桿菌某種(bifidobacteriumsp.)、屎腸球菌(e.faecium)、植物乳桿菌(l.plantarum)、糞腸球菌(e.faecalis)、r.torques、發酵乳桿菌(l.fermentum)、克雷伯氏肺炎菌(k.pneumoniae)、嗜熱鏈球菌(s.thermophllus)、p.distasonis、柔膜細菌(mollicutesbacterium)、腸球菌某種(enterococcussp.)、擬桿菌屬某種(bacteroidessp.)、ruminococcaceaebacterium、梭菌屬細菌、克雷伯氏菌屬某種(klebsiellasp.)、乳酸乳球菌(l.lactis)、a.caccae以及鶉雞腸球菌(e.gallinarum)。
在一個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)能夠在腸內維持適當比例的革蘭氏陽性/革蘭氏陰性微生物。例如，在一個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)能夠在腸內維持過剩的革蘭氏陽性微生物。在另一個實施方案中，任選地配制為如本文所述的改進釋放形式的β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)能夠減少在腸內的革蘭氏陰性微生物的數目。
在各個實施方案中，本發明提供了減輕或防止患者腸內各種大腸桿菌群(包括致命性和/或抗生素抗性的大腸桿菌群)過度生長的組合物和方法。在各個方面，本文所述的方法和組合物防止或減少了抗性生物體的二次感染并且在一些實施方案中可減少β-內酰胺抗性發展。另外，本文所述的方法和組合物可允許使用β-內酰胺抗生素，所述抗生素目前由于抗性問題而避免使用和/或減少與一種或多種β-內酰胺酶抑制劑的共同施用或共制劑的需要(例如，augmentin為阿莫西林和克拉維酸的混合物)。
在各個方面，本發明提供用于治療或預防急性出血性腹瀉的方法。在各個方面，本發明提供用于治療或預防炎癥性腸病的方法，所述炎癥性腸病包括例如特發性炎癥性腸病。在各個方面，本發明提供用于治療或預防便秘、腸道易激綜合癥和肥胖癥中的一種或多種的方法。
在各個方面，本發明提供用于治療或預防艱難梭菌感染(cdi)和/或艱難梭菌相關性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或本文所述的另外的治療劑的改進釋放制劑。在一方面，本發明提供用于預防艱難梭菌感染(cdi)和/或艱難梭菌相關性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者(作為非限制性實例，為正在施用或將施用抗生素(包括本文所述的那些)的患者)施用有效量的包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或本文所述的另外的治療劑的改進釋放制劑。
在一些實施方案中，本發明涉及一種預防艱難梭菌感染(cdi)和/或艱難梭菌相關性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或本文所述的另外的治療劑的改進釋放制劑，其中所述患者正在經歷使用主要抗生素的療法并且主要抗生素為頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢呋辛以及哌拉西林中的一種或多種，并且為靜脈內施用。在一些實施方案中，患者未經歷使用初始和/或輔助療法的治療，所述療法為甲硝唑、萬古霉素、非達霉素、利福昔明、糞便細菌療法、益生菌療法以及抗體療法中的一種或多種。
在各個實施方案中，抗生素誘導的不利效應和/或cdi或艱難梭菌相關性疾病為以下一種或多種：抗生素相關性腹瀉、艱難梭菌腹瀉(cdd)、艱難梭菌腸炎癥性疾病、結腸炎、假膜性結腸炎、發熱、腹痛、脫水和電解質紊亂、巨結腸、腹膜炎以及結腸穿孔和/或破裂。
在各個實施方案中，在初始發作或復發(relapse)/再發(recurrence)的情況下治療或預防cdi和/或艱難梭菌相關性疾病(例如，由于繼續或再次開始的抗生素療法)。例如，在先前已罹患cdi的患者中，包含β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的本發明改進釋放制劑可在復發的第一癥狀時施用。作為非限制性實例，再發的癥狀包括在輕度情況下每天排水樣便約5次至約10次，無顯著發熱，且僅有輕度腹部絞痛，同時血液測試可顯示白血細胞計數緩和升高至多達約15,000(正常水平是多達約約10,000)，以及在重度情況下每天排水樣便多于約10次、惡心、嘔吐、高熱(例如，約102-104°f)、直腸出血、嚴重腹痛(例如，伴隨觸痛)、腹脹以及高白血細胞計數(例如約15,000至約40,000)。
無論是初始發作還是復發/再發，cdi和/或艱難梭菌相關性疾病可經由本文所述的任何癥狀(例如，每天水樣便約3次或更多次，持續約2天或更多天，輕度至重度絞痛以及腹部疼痛、發熱、糞便中的血液或膿、惡心、脫水、食欲喪失、體重減輕等)診斷。無論是初始發作還是復發/再發，cdi和/或艱難梭菌相關性疾病也可通過酶免疫測定，例如，以檢測艱難梭菌毒素a或b抗原和/或由艱難梭菌生物體產生的谷氨酰胺脫氫酶(gdh)、聚合酶鏈反應(例如，以檢測艱難梭菌毒素a或b基因或其部分(例如，tcda或tcdb)，包括illumigenelamp測定)、細胞毒性測試來診斷。例如，可使用任何以下測試：meridianimmunocardtoxinsa/b；wampoletoxina/bquikchek；wampolec.diffquikchekcomplete；remelxpectclostridiumdifficiletoxina/b；meridianpremiertoxinsa/b；wampolec.difficiletoxa/bii；remelprospecttoxina/beia；biomerieuxvidasc.difficiletoxina&b；bdgeneohmc.diff；prodesseprogastrocd；以及cepheldxpertc.diff。在各個實施方案中，臨床樣品為患者糞便樣品。
而且，可屈性乙狀結腸鏡檢查“范圍”測試和/或腹部x-射線和/或計算機化斷層顯像(ct)掃描(提供結腸圖像)可用于評定患者(例如，查看附接于結腸壁的特征性乳白或黃色斑塊)。另外，活組織檢查(例如，胃腸道的任何區域)可用于評定潛在cdi和/或艱難梭菌相關性疾病的患者。
另外，本發明的方法可治療的患者包括但不限于處于cdi和/或艱難梭菌相關性疾病的特定風險下的患者，諸如在過去30天左右期間服用抗生素和/或具有弱免疫系統(例如，來自慢性疾病)和/或為女性和/或為老年人(例如，超過約65歲)和/或為老年女性和/或經歷胃灼熱或胃酸病癥(例如，使用諸如蘭索拉唑、泰胃美、奧美拉唑或埃索美拉唑以及相關藥物的藥劑)的治療和/或最近已經住院，包括在重癥監護病房或住在療養院的患者。因此，在一些實施方案中，本發明的方法和用途治療或預防醫院內感染和/或繼發性突發感染和/或醫院內獲得性感染(hai)。
在一些實施方案中，本發明的方法和用途涉及正在經歷使用一種或多種主要抗生素的治療或最近已經歷所述治療的患者。“主要抗生素”是指施用給患者并且可導致cdi和/或艱難梭菌相關性疾病的抗生素。這些抗生素包括最常導致cdi和/或艱難梭菌相關性疾病的抗生素：氟喹諾酮、頭孢菌素、克林霉素以及青霉素。
在一些實施方案中，本發明的方法和用途涉及包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或另外的治療劑的改進釋放制劑，所述β-內酰胺酶和另外的治療劑在主要抗生素進入胃腸道(包括小腸和/或大腸)之前水解主要抗生素。在一些實施方案中，本發明的方法和用途涉及包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或另外的治療劑的改進釋放制劑，所述β-內酰胺酶和另外的治療劑在主要抗生素進入大腸之前水解主要抗生素。在一些實施方案中，本發明的方法和用途涉及包含水解胃腸道內過量的抗生素殘余物的β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的改進釋放制劑。在一些實施方案中，本發明的方法和用途涉及包含維持正常腸微生物群和/或防止一種或多種病原微生物在患者胃腸道內過度生長的β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的改進釋放制劑。在一些實施方案中，本發明的方法和用途涉及包含維持正常腸微生物群和/或防止患者胃腸道內的一種或多種有益微生物減少的β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的改進釋放制劑。在各個實施方案中，β-內酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)基本上不干擾主要抗生素的血漿水平。例如，本發明的β-內酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)允許患者接受感染可需要的主要抗生素并且不干擾抗生素的全身性效用。相反，β-內酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)滅活可構成胃腸道的一部分的過量抗生素并且這樣做時防止了與本文所述的各種疾病狀態相關的微生物群的破壞。
在各個實施方案中，包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或另外的治療劑的發明性改進釋放制劑并不是全身性吸收的。在各個實施方案中，包含β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的改進釋放制劑基本上不干擾全身性施用的抗生素的活性。在各個實施方案中，包含β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的改進釋放制劑起到消除抗生素使其免于干擾微生物組的微生物群(例如，腸道，包括大腸)的作用。在一些實施方案中，包含β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的改進釋放制劑并不干擾腸道對抗生素的吸收和/或在腸肝上充分地改變抗生素循環的半衰期。在一些實施方案中，包含β-內酰胺酶(和/或另外的藥劑)的改進釋放制劑并不干擾腸道對抗生素的吸收和/或在腸肝上足以是臨床上重要的。
在一些實施方案中，本發明的方法和用途包括其中初始和/或輔助療法施用于患者的那些。初始和/或輔助療法指示在檢測例如微生物組介導的病癥或疾病后用于治療此病癥或疾病的療法。在一個實施方案中，初始和/或輔助療法指示在檢測cdi和/或艱難梭菌相關性疾病后用于治療此疾病的療法。在一些實施方案中，初始和/或輔助療法為如本文所述的甲硝唑、萬古霉素、非達霉素、利福昔明、基于木炭的粘合劑/吸附劑、糞便細菌療法、益生菌療法以及抗體療法中的一種或多種。在各個實施方案中，本發明的方法和用途包括包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或本文所述的另外的治療劑的改進釋放制劑作為任何這些初始和/或輔助療法的輔助(包括共同施用或依序施用)的用途。在各個實施方案中，本發明的方法和用途包括包含β-內酰胺酶(例如，p3a或本文所述的其他β-內酰胺酶試劑以及其變體)和/或本文所述的另外的治療劑的改進釋放制劑在經歷初始和/或輔助療法的受試者中的用途。
在各個實施方案中，本發明用途和方法涉及使用包含β-內酰胺酶和本文所述的任何另外的治療劑的改進釋放制劑和/或任何初始和/或輔助療法的共同治療(同時或依序)、或者使用包含β-內酰胺酶和本文所述的任何另外的治療劑的改進釋放制劑和/或用于治療本文所述的各種疾病的任何初始和/或輔助療法的共制劑的治療、或者在經歷使用本文所述的任何另外的藥劑和/或本文所述的任何初始和/或輔助療法的治療的患者中通過向所述患者施用包含β-內酰胺酶的改進釋放制劑來治療本文所述的各種疾病的方法。
在一些實施方案中，術語“患者”和“受試者”可互換使用。在一些實施方案中，受試者和/或動物為哺乳動物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、馬、牛、豬、兔、羊或非人靈長類，諸如猴子、猩猩或狒狒。在其他實施方案中，受試者和/或動物為非哺乳動物，例如像斑馬魚。在一些實施方案中，受試者和/或動物可包含熒光標記的細胞(使用例如gfp)。在一些實施方案中，受試者和/或動物為包含熒光細胞的轉基因動物。
在各個實施方案中，本發明的方法適用于治療人受試者。在一些實施方案中，人為兒童。在其他實施方案中，人為成人。在其他實施方案中，人為老人。在其他實施方案中，人可稱為患者。在一些實施方案中，人為女性。在一些實施方案中，人為男性。
在某些實施方案中，人的年齡的范圍為約1至約18個月大、約18至約36個月大、約1至約5歲大、約5至約10歲大、約10至約15歲大、約15至約20歲大、約20至約25歲大、約25至約30歲大、約30至約35歲大、約35至約40歲大、約40至約45歲大、約45至約50歲大、約50至約55歲大、約55至約60歲大、約60至約65歲大、約65至約70歲大、約70至約75歲大、約75至約80歲大、約80至約85歲大、約85至約90歲大、約90至約95歲大或約95至約100歲大。
試劑盒
本發明提供可簡化本文所述的改進釋放制劑的施用的試劑盒。所述試劑盒為包括至少一種本文所述的改進釋放制劑的材料或組分的集合。試劑盒中配置的組分的準確性質取決于其預定目的。在一實施方案中，試劑盒被配置來達成治療人受試者的目的。
使用說明書可包括在試劑盒中。使用說明書通常包括描述在使用試劑盒的組分來實現所需結果(諸如治療本文所述的相關病癥)時采用的技術的明確表述。任選地，試劑盒也含有其他適用組分，如稀釋劑、緩沖劑、藥學上可接受的載體、注射器、導管、施用器、吸移或測量工具、綁扎材料或如將易于由本領域技術人員認識到的其他適用附件。
可向從業者提供試劑盒中組裝的材料和組分，所述材料和組分以保持其可操作性和效用的任何便利和適合方式儲存。例如，可在室溫、冷凍溫度或冰凍溫度下提供組分。所述組分通常包含于合適的包裝材料中。在各個實施方案中，包裝材料通過熟知的方法構造，優選提供無菌、無污染物的環境。所述包裝材料可具有指示試劑盒和/或其組分的內容物和/或目的的外部標簽。
實施例
實施例1：p3a延遲釋放丸粒和膠囊的制造
產生包含p3a腸溶包衣的丸粒的p3a制劑。為了產生丸粒，將p3a噴霧涂覆到蔗糖核心上并且用腸溶層eudragitl30d-55噴霧干燥，以保護p3a活性藥物成分使其免于胃部的酸性條件。當在小腸中ph升高至5.5及以上時eudragitl30d55聚合物開始解聚，從而從丸粒中釋放活性藥物。
在如圖1a所示出的gmp過程中制造包含p3a腸溶包衣的丸粒的延遲釋放膠囊。確切地說，p3a延遲釋放膠囊的gmp制造為三階段順序過程，包括：1)通過噴霧應用將p3a藥物層疊到蔗糖核心上，2)使用噴霧應用利用
使用羥丙基纖維素(hpc)作為粘合劑賦形劑、使用水作為溶劑并且使用蔗糖球作為起始材料來噴霧應用p3a藥物，從而產生p3a分層的丸粒。在六個工作輪次內使用流化床系統進行噴霧應用，以便實現至少15％的最終活性藥劑(api)百分比。在噴霧應用p3a/hpc混合物的六個工作輪次之后，將p3a分層的丸粒在室溫下在托盤上干燥過夜，然后通過1.4mm篩網篩分，之后散裝在聚乙烯(pe)袋和pe容器中。將藥物分層的丸粒保存在5℃±3℃下，以用于進一步處理。應當注意，使用羥甲基纖維素(hmc)作為粘合劑賦形劑的嘗試并不成功，因為這產生不能進一步處理(例如，噴霧干燥)的片狀丸粒。
在后一個過程中，使用甲基丙烯酸丙烯酸乙酯共聚物(
使用具有膠囊輸送和給藥單元的自動膠囊裝填器將腸溶包衣的p3a分層的丸粒封裝在硬明膠膠囊中，以填充0號膠囊。將最終的75mg的p3a延遲釋放膠囊作為原料藥產品填充在pe袋和pe容器中，并且保存在5℃±3℃下以備運輸。
在制造25mg的p3a延遲釋放膠囊的單獨手動過程中，使用分析天平、膠囊進料漏斗將腸溶的p3a分層的丸粒封裝在硬明膠膠囊中，以填充0號膠囊。將最終的25mg的p3a延遲釋放膠囊作為原料藥產品填充在pe袋和pe容器中，并且保存在5℃±3℃下以備運輸。
將意圖用于臨床試驗和穩定性研究的p3a延遲釋放膠囊包裝在具有38mm聚丙烯(pp)小兒安全瓶蓋、具有感應密封的100cc高密度聚乙烯(hdpe)圓瓶。
在制造期間，將如表1所示的一系列進程內控制用于75mg和25mg的p3a延遲釋放膠囊。對制造的p3a延遲釋放丸粒進行這些測試，之后進行封裝。
表1：p3a延遲釋放膠囊制造的進程內控制
作為對照，還使用與p3a延遲釋放膠囊大致上相同的過程制備含有安慰劑緩沖物的安慰劑膠囊。確切地說，根據與p3a延遲釋放膠囊的75mg藥物產品類似的批記錄制造安慰劑膠囊。
將最終的安慰劑膠囊作為原料產品填充在pe袋和pe容器中，并且保存在5℃±3℃下以備運輸。將意圖用于臨床試驗的安慰劑膠囊包裝在具有38mmpp小兒安全瓶蓋、具有感應密封的100cchdpe圓瓶
在安慰劑膠囊的制造期間，還采用如表2所示的一系列進程內控制。對安慰劑丸粒進行測試，之后封裝。
表2：p3a安慰劑膠囊制造的進程內控制
另外，使用與圖1a所述地相同的工藝流程(除了最終通過制造商封裝丸粒之外)來制造非gmp批次的p3a延遲釋放丸粒以用于非臨床使用。相反，對散裝的p3a延遲釋放丸粒進行測試并且散裝地保存。在用于非臨床使用的釋放測試之后，將非gmp批次封裝在0號硬明膠膠囊中并且將其置于穩定性研究中
實施例2：p3a延遲釋放丸粒和膠囊的組成和外觀
p3a劑型為填充有延遲釋放丸粒的硬明膠膠囊或羥丙基甲基纖維素(hpmc)膠囊。所述膠囊為不透明白色或白色的并且為0號的。延遲釋放膠囊含有由賦形劑中被p3a藥物內層涂覆的蔗糖球和賦形劑中的ph敏感性腸溶外包衣組成的丸粒。丸粒被設計為在ph升高至超過5.5時在上段小腸中開始溶解，從而釋放藥物。
在表3中提供了p3a延遲釋放膠囊(75mg和25mg強度)和安慰劑膠囊中的組分和量的列表。對于75mg和25mg強度的p3a延遲釋放膠囊，將來自相同制造批次的丸粒封裝至所需膠囊強度，因此每種組分的百分比為相同的。對于安慰劑膠囊，封裝安慰劑丸粒，以匹配p3a延遲釋放膠囊的75mg藥物產品的
表3：75mg和25mg的p3a延遲釋放膠囊和安慰劑膠囊的組成
在圖1b中示出了p3a延遲釋放丸粒和膠囊的代表性照片。丸粒為直徑1.0至1.3mm的均勻球，其具有光滑的外觀。用丸粒填充0號膠囊。每個膠囊含有大約75mg的p3a(15％-16％p3a/丸粒)，其中重量為大約475mg的活性丸粒藥物產品+96mg空膠囊重量，總計大約571mg。
實施例3：p3a延遲釋放丸粒的ph溶解曲線和p3a延遲釋放丸粒在人食糜中的穩定性
將腸溶包衣的p3a丸粒(如實施例1和2所配制的)保持在0.1mhcl溶液中，持續2小時，之后在具有5.5、5.8或6.8的ph的緩沖液中孵育15至240分鐘。在15、30和45分鐘取出等分試樣，并且在45分鐘、1、2、3和4小時對ph5.5和5.8樣品取出等分試樣，并且在1、2、3和4小時對ph6.8樣品取出等分試樣。使用centa顯色測定來測定所有樣品等分試樣的β-內酰胺酶活性。
如圖2所示的，p3a腸溶包衣的丸粒在低ph下受到保護，同時在大于5.5的ph下發生溶解，其中ph5.8和6.8顯示比ph5.5更快的溶解。
實施例4：p3a延遲釋放丸粒在人食糜中的穩定性
評價p3a丸粒(如實施例1和2所配制的)在人食糜中在37℃下的穩定性。確切地說，在五份不同食糜樣本中孵育p3a丸粒。在0、0.5、1、2、3、4、5以及6小時取出等分試樣，使用centaβ-內酰胺酶底物測量β-內酰胺酶活性。表4示出所使用的五種食糜樣品的特征。
表4.食糜樣本
對每個食糜中的重復測定計算相對于峰值活性時間的活性百分比并且使用graphpadprism5.0將所述值繪制成圖。在圖3中呈現了在每個時間點對所有食糜樣本測量的在405nm處的吸光度的平均相對變化(δab405)，其顯示了p3aβ-內酰胺酶活性的釋放和相對穩定性。
如圖3所示的，當在所有原始食糜樣本中在孵育6小時后有小于50％的總體活性損失的情況下評價時，p3aβ-內酰胺酶活性為相對穩定的。在五份食糜樣本的四份樣本中在30分鐘內檢測到峰值活性，這指示丸粒在孵育的前30分鐘內在這些食糜樣品中完全溶解。在人食糜中，p3a丸粒顯示在30-60分鐘內快速溶解。觀察到至少6小時的高水平p3a活性，這表明人食糜中的p3a酶穩定性。
在原始和澄清的食糜樣本中評價p3a在人食糜中的穩定性。在37℃下在食糜樣本中進行p3a的孵育，對每個食糜樣本(1至5)和混合食糜基質一式三份。在0、30、60、120、180、240、300以及360分鐘去除樣品，并且使用centaβ-內酰胺酶底物分析β-內酰胺酶的酶促活性。基于在反應前一分鐘(線性部分)在405nm處的吸光度每分鐘的變化(δa405/分鐘)，測定食糜/p3a樣本的β-內酰胺酶活性。通過將δa405/分鐘值除以測定的路徑長度，將δa405/分鐘值歸一化至1cm路徑長度。將每個食糜樣本的單次重復的歸一化δa405/分鐘值的平均值用于計算在每個時間點時的相對β-內酰胺酶活性。
如表5所示，p3aβ-內酰胺酶在澄清的食糜1中為最小穩定性的，這顯示243分鐘的半衰期。在其他基質中的相對穩定性對于食糜2、4、5和混合食糜而言大于5小時(300分鐘)，并且對于食糜3而言大于6小時(360分鐘)。
表5.p3aβ-內酰胺酶活性在澄清的食糜中的半衰期
(a)食糜3樣本的半衰期由線性方程式y＝-0.1621x+113.94推導，所述線性方程式通過從120分鐘(僅在最初觀察到活性減小之前的點)到360分鐘的活性百分比的線性回歸生成。
實施例5：頭孢曲松的p3a丸粒介導的降解
使用利用頭孢曲松作為底物的體外生物化學測定確定含有p1a或p3a(syn-004)的配制丸粒的β-內酰胺酶的酶促活性。如先前實施例1和2所述地配制丸粒。確切地說，p1a和p3a在50mm磷酸鉀緩沖鹽6.8緩沖液中從配制的丸粒中溶出(丸粒通過將p1a或p3a藥物噴霧干燥到蔗糖核心上，然后使用保護性腸溶包衣噴霧干燥來制造)。通過hplc分析方法測定p1a和p3a在溶出緩沖液中的濃度，并且對于頭孢曲松的水解，使用體外生物化學測定評價溶出的丸粒的β-內酰胺酶的酶促活性。
如圖5所示的，p3a(也稱為syn-004)表現出比p1a大3.4倍的頭孢曲松催化速率，其中與p1a的平均kcat值40.9sec-1相比，在三個濃度的p3a下平均kcat值為139sec-1。p1a和p3a溶出的物質水解頭孢曲松的活性相當于每種β-內酰胺酶的相應藥物參考標準的活性。
實施例6：p3a-介導的微生物組保護
在初步研究中在人源化豬中評價p3a保護腸微生物組使其免于頭孢曲松(cro)誘導的損害的能力。圖7和圖8分別示出了研究設計和時間軸。
向5日齡限菌豬的胃腸(gi)道填充人成人糞便微生物群落。兩天后，動物接受抗生素(克林霉素或cro，ip，50mg/kg)，持續4天。每天口服遞送4次p3a(75mg/劑量)，持續7天，在cro施用前一天開始。確切地說，向動物施用如實施例1和2所述的p3a延遲釋放膠囊。在第13天向所有動物口服遞送艱難梭菌(2.6x106cfu)。在第11、12、14、18、20天使用無菌棉簽直接從直腸收集糞便并且在第21天在尸檢時直接從腸道中收集糞便。將dna從糞便中分離并且使其經歷16srrna基因v1v2的高通量測序，以監測微生物組的變化。通過將等量的第21天糞便接種在lb+amp平板上來評定預期對cro敏感但對克林霉素不敏感的特定細菌群體即氨芐西林抗性需氧微生物(包括變形菌門的那些細菌)的水平。通過elisa作為艱難梭菌感染(cdi)的測量來評定糞便艱難梭菌毒素a和白介素-8(il8)。在組織學上評價在第21天在尸檢時收集的腸道的cdi體征。
基于cdi典型的組織病理學的缺乏和艱難梭菌毒素a和il8的陰性elisa結果以及艱難梭菌的陰性糞便培養，沒有動物顯示典型cdi的證據。兩只動物患病，即來自組1的豬9和來自組2的豬8。在艱難梭菌感染之后，豬9并未增加重量并且豬8瀕死并在第14天安樂死。然而，在豬8或任何研究動物中并未確認cdi。
在圖9中示出了在第14天收集的糞便dna樣品中存在的細菌的門水平的分類學分類。組1僅顯示豬2，因為豬9并未茁壯生長。組1(無抗生素)和組4(cro+p3a，即syn-004)看起來類似并且顯示擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門的良好代表，而組2(克林霉素)和組3(單獨的cro)顯示微生態失調，其中擬桿菌門為非常顯著的門，而沒有或幾乎沒有厚壁菌門的代表菌。lb+amp數據(圖10a和圖10b)確證這些發現，因為組1、組2和組4顯示類似的高細菌水平，而組3(單獨的cro)顯示至少兩個更低log水平，這表明變形菌門群體減少。值得注意的是，克林霉素(組2)預期并不影響氨芐西林抗性需氧微生物(包括變形菌門的那些)并且主要殺死厭氧細菌(包括厚壁菌門的那些)。組1、2和4中存在的變形菌的水平為類似的(圖9)，并且厚壁菌門不存在于組2微生物組中，這與此假設相符。
這些數據表明p3a可以保護人微生物組并且可用作預防性療法，設計所述預防性療法來防止接受β內酰胺抗生素的患者中的抗生素介導的微生物組損害，包括cdi
實施例7：p3a介導的微生物組保護的基因組分析
為了研究p3a保護腸微生物組使其免于抗生素誘導的(例如，頭孢曲松(cro)誘導的)損害的能力，使從以上所述的研究中獲得的豬糞便樣品經歷另外的基因組分析。確切地說，對16srrna基因v1v2區域進行測序。另外，使糞便dna經歷全基因組鳥槍法測序。使用illuminahiseqrapidrun進行鳥槍法測序，這靶向100bp單次讀取，其目標為實現每個樣品約1-2千萬次的讀取(表6)。
表6.鳥槍法測序數據統計表
*這兩個數據集與其他數據集相比含有太少的測序讀取并且從比較性分析中去除
將這些序列數據在分類學上分類，以鑒別與豬糞便樣品相關的微生物群落。使用生物信息學算法進行分類學分類并且驗證基因組數據庫。簡言之，使用用于快速鑒別細菌群落以及其相對豐度的genius軟件包，針對驗證的genebook細菌和病毒數據庫，探測原始的未組裝的鳥槍法序列讀取(hasan等，2014,plosone9:e97699；lax等，2014,science345:1048)。所述分析鑒別了治療組內的139種細菌菌株、79個種類以及35個屬類(表7)。
表7.檢測的分類群的數目
表8中示出了在不同治療組內的細菌分類群的相對分布。
表8.在治療組內的細菌分類群的相對分布
通過基于每種樣品(參見圖11)中和細菌屬水平(參見圖12)下的每種細菌菌株的相對豐度使用nmfr軟件包創建熱圖來進行比較性宏基因組學分析(gaujoux和seoighe,2010,bmcbioinformatics,11:367)。使用最大距離函數和ward層級群集算法來群集樣品。使用距離函數測量每種樣品之間的組成的不同。群集算法使用每種樣品之間的距離創建系統樹，所述系統樹群集具有類似組成的樣品，包括在相同進化枝中的生物體的存在和不存在。基于細菌菌株比較(圖11)，將組1(對照)和組4(頭孢曲松加上p3a)樣品群集，通過藍色框(圖11)突出顯示，這指示組1和組4與組2(克林霉素)和組3(單獨的頭孢曲松)相比彼此更相似。這些數據表明p3a起到保護微生物組使其免于頭孢曲松(組3)影響的作用，使微生物更類似于未暴露于抗生素的對照組(組1)。
還進行比較性宏基因組學分析，以研究跨越不同治療組的微生物組的改變。對于這些分析，使用來自pamr包(tibshirani等，2002,pnas99:6567)的質心分類方法比較樣品中每種細菌菌株的平均頻率(絕對豐度)。通過所有研究組的總體質心將來自每個研究組的每種細菌菌株的質心偏差繪制成圖(圖13)。
由于由每個單個樣品生成的序列讀取的數目為可變的，所以選擇來自每種樣品的子樣品代表1千萬讀取的子集。完成此選擇，以避免由于不同樣品尺寸而引起的任何偏向并且能夠測量樣品中的細菌生物體的絕對豐度。使用這些子集來減少偏向，通過將來自每個研究組的每種細菌菌株的質心與所有研究組的總體質心的偏差繪制成圖(圖14)來如先前對于圖13所述地進行比較性宏基因組學分析。數據表明組4(頭孢曲松加上p3a)當與組1(對照)相比時顯示比組2(克林霉素)或組3(單獨的頭孢曲松)更不嚴重的種類豐度的畸變，這指示p3a保護微生物組使其免于抗生素介導的損害。
還在細菌種類水平下進行樣品子集的質心分類，其比較組3(頭孢曲松)和組4(頭孢曲松加上p3a)中的每種細菌種類的頻率與組1(對照)的平均偏差(圖15)。值得注意的是，組3(單獨的頭孢曲松)顯示蘇黎士桿菌屬某些種的代表性不足和產甲烷古菌史氏甲烷短桿菌的過剩，而組4(頭孢曲松加上p3a)顯示與組1(對照)類似的蘇黎士桿菌屬某些種和史氏甲烷短桿菌的豐度水平。蘇黎士桿菌屬某些種的減少與狗的特發性炎癥性腸病和急性出血性腹瀉相關(minamoto等，2015,gutmicrobes6(1),33-47；rossi等，2014,plosone9(4),e94699)，而史氏甲烷短桿菌為據報道與便秘、腸道易激綜合癥和肥胖癥相關的產甲烷古菌種類(pimentel等，2002,am.j.gastroenter.supple.1:28)。總之，這些數據表明p3a保護腸道微生物群落使其免于抗生素使用的不利效應。確切地說，這些數據表明p3a保護微生物組使其免于通過使用頭孢曲松的治療誘導的蘇黎士桿菌屬某些種的損失和產甲烷菌的過剩。因此，蘇黎士桿菌屬某些種的損失和產甲烷菌的增殖似乎為腸道微生物群落的抗生素誘導的變化，它們可以通過使用p3a來預防。
另外，在細菌種類水平下進行樣品子集的質心分類，其比較了厭氧和兼性需氧細菌種類的頻率與所有組中的種類的平均獨特頻率的平均偏差(圖16)。數據表明組4(頭孢曲松加上p3a)當與組1(對照)相比展示出比組2(克林霉素)或組3(單獨的頭孢曲松)更類似于組1(對照)的厭氧和兼性需氧細菌種類的圖案。也在細菌種類水平下進行樣品子集的質心分類，其比較了專性需氧細菌種類的頻率與所有組中的種類的平均獨特頻率的平均偏差(圖17)。在所有組中均觀察到變化，然而組4(頭孢曲松加上p3a)展示出與組3(單獨的頭孢曲松)不同的細菌種類圖案，這指示p3a改變了抗生素誘導的對豬腸道微生物群落的改變的圖案。這些數據指示p3a能夠通過保護厭氧和兼性需氧細菌種類使其免于抗生素介導的改變來修改抗生素對腸道微生物組的作用。
也在細菌種類水平下進行樣品子集的質心分類，其比較了革蘭氏陽性細菌種類的頻率與組1、組3和組4中的種類的平均獨特頻率的平均偏差(圖18)，并且與組1種類的平均獨特頻率相比較(圖10)。類似地，也在細菌種類水平下進行樣品子集的質心分類，其比較了革蘭氏陰性細菌種類的頻率與組1、組3和組4中的種類的平均獨特頻率的平均偏差(圖20)，并且與組3和組4種類的平均獨特頻率相比較(圖21)。數據表明革蘭氏陽性生物體在用p3a處理的組中為過剩的，而革蘭氏陰性生物體在p3a處理的組中與單獨的抗生素處理的組(組3)或未處理的對照組(組1)相比更不豐富。
總之，這些研究指示除其他事項之外，p3a(即syn-004)保護微生物組使其免于抗生素誘導的改變。與使用單獨的抗生素的治療相比，p3a抵抗抗生素對腸道微生物組的組成和負荷的作用。值得注意的是，p3a抵抗產甲烷菌(確切地為史氏甲烷短桿菌)的過剩，所述過剩為抗生素誘導的腸道微生物群落的變化。史氏甲烷短桿菌與便秘、腸道易激綜合癥和肥胖癥相關(pimentel等，2012,am.j.gastroent.supp.1:28)。p3a也防止蘇黎士桿菌屬某些種的豐度的減少，所述減少為另一種抗生素誘導的對微生物群落的變化，它與狗中的特發性炎癥性腸病和急性出血性腹瀉相關(minamoto等，2015,gutmicrobes6(1),33-47；rossi等，2014,plosone9(4),e94699)。
實例8.p3a并不影響全身性頭孢曲松水平
進行另一個豬研究，以確定口服施用p3a(即syn-004)是否對抗生素的全身性水平具有任何作用。對于此研究，用50mg/kg的靜脈內頭孢曲松(cro)處理十只約2個月大并且稱重約20kg的yorkshire仔豬，每天一次，持續七天。五只動物接受p3a膠囊(1粒膠囊含有75mgp3a，每天四次)，在cro處理前一天開始并且延伸到cro處理后一天，持續總計九天。確切地說，向動物施用如實施例1和2所述的p3a延遲釋放膠囊。在第2天，麻醉動物并且在三個時間點即cro施用后1小時、6小時和19小時從腔靜脈中抽取大約9ml血液。立即將血液分配到血清分離器采血針(vacutainer)管中。在凝結之后，將樣品離心并且將血清轉移至冷凍管中并且在-80℃下保存直到分析。使用驗證的高效液相色譜法測定量化血清樣品中的cro(owens等，2001,int.j.antimicrobialagents,17:483)。以陰性對照(未處理)豬血清制備cro的標準曲線并且其含有從0.5至50ug/ml范圍內的6個點。所述測定在0.5至50ug/ml的范圍內為線性的。如圖22所示的，在一個小時的時間點時，cro血清水平對于單獨的cro處理的組為79.43±12.08ug/ml并且對于cro+p3a處理的組為76.28±15.83ug/ml。在6小時，cro血清水平對于單獨的cro處理的組為5.83±1.15ug/ml并且對于cro+p3a處理的組為3.76±1.01ug/ml(圖22)。這些數據表明p3a對處理的動物中的峰值cro水平不具有影響并且對6小時的時間點水平具有極少的影響(如果有的話)。在cro處理后的19小時取出的血清低于測定的檢測限(0.5ug/ml)。這些數據表明口服遞送p3a對豬中的血清cro水平幾乎不具有或不具有影響，這表明p3a并未全身性吸收并且將不會干擾抗生素功效。
實施例9：另外的p3a制劑
制造具有200mg藥物的0號或1號p3a膠囊，以增加填充有p3a丸粒的膠囊的p3a藥物負荷和/或減少所述膠囊的尺寸。確切地說，將p3a與膠乳或其他聚合物組合，并且然后在未使用蔗糖核心的情況下成形為微粒的微封裝酶制備物。任選地，用ph依賴性腸溶包衣覆蓋微球。
使用三種方法制造此制劑(圖6)。首先，開發一種顆粒，所述顆粒具有已建立到基質本身的腸溶功能(例如，在胃部不釋放，在小腸完全釋放)，以減少賦形劑負荷。任選地，將腸溶包衣添加到顆粒中，以提供針對酸性條件的保護。
用于生成微粒(諸如微球、聚集物、其他)的多種方法為已知易于包含蛋白質的。它們通常涉及至少兩個相，一個相含有蛋白質并且一個相含有形成微粒骨架的聚合物。最常見的是團聚，其中聚合物通過添加第三種組分來與其溶劑相分離，或者多相乳液諸如水包油包水(w/o/w)乳液，其中內水相含有蛋白質，中間有機相含有聚合物，并且外水相含有支持w/o/w雙重乳液直到可以去除溶劑以形成微球的穩定劑。
可選地，將p3a蛋白質和穩定賦形劑(例如，海藻糖、甘露醇、吐溫80、聚乙烯醇)組合并且由水溶液噴霧并收集。然后將顆粒懸浮在含有聚合物的干燥的、水不混溶的有機溶劑中并且釋放改性化合物，并且超聲處理所述懸浮液以分散所述顆粒。p3a蛋白質在此過程之后保持其活性。
另一種方法使用水相而不是有機溶劑。在此，將酶、緩沖劑組分、聚合物膠乳以及穩定和改進釋放的賦形劑溶解/分散在水中。將水性分散體噴霧干燥，從而使得膠乳團聚，并且蛋白質和賦形劑摻入在團聚膠乳的顆粒中。當釋放改性劑在酸性條件下不溶但是在較高ph(諸如羧酸)下可溶時，那么在胃環境中阻止了從基質中釋放。
定義
如本文所用的，“一個/種(a/an)”或“所述(the)”可以意指一個或多于一個。
此外，術語“約”當與參考數字指示結合使用時意指參考數字指示加上或減去該參考數字指示的10％。例如，語言“約50％”覆蓋了45％至55％的范圍。
當與醫學用途聯合使用時，“有效量”為有效提供目標的可測量治療、預防或降低目標疾病的發病率的量。
如本文所用的，如果在藥劑或刺激物存在下相對于此調節不存在時活性和/或作用的讀出減少了大量，諸如減少了至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約98％或更大、多至并包括至少約100％，則某事物“降低”。如本領域普通技術人員將了解的，在一些實施方案中，活性降低并且一些下游讀出將降低但其他讀出可以增加。
相反，如果在藥劑或刺激物存在下相對于此藥劑或刺激不存在時活性和/或作用的讀出增加了大量，例如增加了至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約98％或更大、多至并包括至少約100％或更大、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約50倍、至少約100倍，則活性“增加”。
如本文所提及的，所有組成的百分比為按總組合物的重量計的，除非另外指定。如本文所用的，單詞“包括”及其變型意圖為非限制性的，以使得列表中的項目的詳述不排除也可適用于此技術的組合物和方法的其他類似項目。類似地，術語“可以”和“可”以及其變型意圖為非限制性的，以使得實施方案可以或可包括某些元素或特性的詳述不排除不包含哪些元素或特性的本技術的其他實施方案。
盡管作為諸如包括、含有或具有等術語的同義詞的開放式術語“包含”在本文中用于描述和要求保護本發明，可以使用諸如“由…組成”或“基本上由…組成”等替代性術語可選地描述本發明或其實施方案。
如本文所用的，單詞“優選的”和“優選地”是指本技術在某些情況下提供某些益處的實施方案。然而，在相同或其他情況下，其他實施方案也可為優選的。此外，一個或多個優選實施方案的詳述并不意味著其他實施方案不適用的，并且并不意圖從本技術的范圍內排除其他實施方案。
本文描述的實現治療效果所需要的組合物的量可出于特定目的根據常規程序憑經驗確定。通常，對于出于治療目的而施用治療劑(例如，β-內酰胺酶和/或本文所述的另外的治療劑)，以藥理學有效劑量給予治療劑。“藥理學有效量”、“藥理學有效劑量”、“治療有效量”或“有效量”是指足以產生所需生理效果的量或能夠實現所需結果，尤其是治療病癥或疾病的量。如本文所用的有效量包括足以例如延遲病癥或疾病的癥狀的發展、改變病癥或疾病的癥狀的進程(例如，減緩疾病癥狀的進展)、減少或消除病癥或疾病的一個或多個癥狀或表現并且逆轉病癥或疾病的癥狀的量。治療益處還包括停止或減緩潛在疾病或病癥的進展，而不論是否實現改善。
可以通過標準藥物程序在細胞培養物、組織樣品、組織勻漿或實驗動物中測定有效量、毒性以及治療效力，所述標準藥物程序例如用于測定ld50(對約50％群體致死的劑量)和ed50(在約50％群體中治療有效的劑量)。所述劑量可根據所采用的劑型和使用的施用途徑而改變。毒性作用與治療效果之間的劑量比為療效指數并且可表示為比例ld50/ed50。在一些實施方案中，表現出大治療指數的組合物和方法為優選的。可以初始由體外測定，包括例如細胞培養物測定評估治療有效劑量。另外，可以在動物模型中配制劑量，以實現循環血漿濃度范圍，所述循環血漿濃度范圍包括如在細胞培養物中或在適當的動物模型中測定的ic50。可以例如通過高效液相色譜測量血漿中所述組合物的水平。可通過適合生物測定監控任何特定劑量的作用。可由醫師確定劑量并且必要時進行調整以適合所觀察到的治療作用。
在某些實施方案中，所述效果將引起至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約70％或至少約90％的可量化變化。在一些實施方案中，所述效果將引起約10％、約20％、約30％、約50％、約70％或甚至約90％或更大的可量化變化。治療益處還包括停止或減緩潛在疾病或病癥的進展，而不論是否實現改善。
如本文所用的，“治療方法”同樣適用于用于治療本文所述的疾病或病癥的組合物和/或用于制造治療本文所述的疾病或病癥的藥劑的組合物的用途和/或在制造所述藥劑方面的用途。
等效方案
雖然本發明已經結合其具體實施方案進行了描述，但應理解能夠進一步地修改，并且本申請意圖涵蓋一般按照本發明的原理和包括自本發明出發的變化、用途或改變，所述變化、用途或改變在本發明所屬領域內的已知或常規實踐，并可以應用于本文提出的和以下所附權利要書的范圍內的必要特征。
本領域技術人員僅使用常規實驗將認識到或能夠確定本文確切描述的具體實施方案的許多等效方案。此類等效方案意圖涵蓋在以下權利要求書的范圍中。
以引用的方式并入
本文引用的所有專利和出版物特此以引用的方式整體并入。
提供本文中討論的公布僅僅是針對它們在本申請的提交日期之前的公開。本文中的任何內容均不應被理解為承認由于先前發明而使本發明無權享有這些公布的優先權。
如本文所用的，所有標題僅用于組織，并不意圖以任何方式限制本公開。任何單個部分的內容可同樣適用于所有部分。
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