對MT1?MMP特異性的雙環肽配體的制作方法

本發明涉及與分子骨架(molecularscaffold)共價結合的多肽，使得在與骨架的連接點之間對接(subtend)兩個或多個肽環。特別地，本發明描述作為膜1型金屬蛋白酶(mt1-mmp)的高親和力結合劑的肽。本發明還描述包含所述肽的藥物綴合物，所述肽與可用于成像和靶向癌癥治療的一種或多種效應子(effector)和/或官能團綴合。
背景技術：
：環肽能夠以高親和力和靶向特異性結合于蛋白質靶標，因此是治療學發展的有吸引力的一類分子。事實上，臨床上已經成功使用了幾種環肽，例如抗菌肽萬古霉素、免疫抑制劑藥物環孢菌素或抗癌藥奧曲肽(driggers等人(2008),natrevdrugdiscov7(7),608-24)。良好的結合性質來源于肽和靶標之間形成的相對大的相互作用表面以及環狀結構的降低的構象柔性。典型地，大環結合于數百平方埃的表面，例如環肽cxcr4拮抗劑cvx15(wu等人(2007),science330,1066-71)，結合整合蛋白αvb3的具有arg-gly-asp基序的環肽(xiong等人(2002),science296(5565),151-5)，或與尿激酶型纖溶酶原激活物結合的環肽抑制劑upain-1(zhao等人(2007),jstructbiol160(1),1-10)。由于其環狀構型，肽大環化合物較線性肽柔性小，導致其與靶標結合時熵的損失較小并產生更高的結合親和力。降低的柔性還導致鎖定靶標特異性構象，與線性肽相比增加結合特異性。這種作用已經通過一種有效的、選擇性基質金屬蛋白酶8(mmp-8)抑制劑來例證，當其環被打開時該抑制劑喪失對其它mmp的選擇性(cherney等人(1998),jmedchem41(11),1749-51)。通過大環化獲得的有利的結合性質在具有一個以上肽環的多環肽中更為顯著，例如在萬古霉素、乳鏈菌肽和放線菌素中。不同的研究團隊以前已經將具有半胱氨酸殘基的多肽連接到合成分子結構上(kemp和mcnamara(1985),j.org.chem；timmerman等人(2005),chembiochem)。meloen及其同事已經使用三(溴甲基)苯和相關分子將多個肽環快速和定量地環化到合成骨架上，用于蛋白質表面的結構模擬(timmerman等人(2005),chembiochem)。wo2004/077062和wo2006/078161中公開了產生候選藥物化合物的方法，其中所述化合物通過將含半胱氨酸的多肽與分子骨架例如三(溴甲基)苯連接產生。已經開發了基于噬菌體展示的組合方法以產生并篩選出對于目標靶標的雙環肽的大型文庫(heinis等人(2009),natchembiol5(7),502-7和wo2009/098450)。簡言之，在噬菌體上展示含有三個半胱氨酸殘基和六個隨機氨基酸的兩個區域(cys-(xaa)6-cys-(xaa)6-cys)的線性肽的組合文庫，并通過將半胱氨酸側鏈共價連接至一個小分子(三(溴甲基)苯)而環化。技術實現要素：根據本發明的第一方面，本發明提供一種對mt1-mmp特異性的肽配體，其包含多肽和分子骨架，所述多肽含有至少三個半胱氨酸殘基，并被至少兩個環序列分隔；所述分子骨架與所述多肽的半胱氨酸殘基形成共價鍵，使得在所述分子骨架上形成至少兩個多肽環；其中所述肽配體包含式(i)的氨基酸序列：-ci-x-u/o-x-x-g-cii-e-d-f-y-x-x-ciii-(seqidno:1)(i)或其修飾的衍生物，或其藥學上可接受的鹽；其中：ci、cii和ciii分別代表第一、第二和第三半胱氨酸殘基；x代表任何氨基酸殘基；u代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基；和o代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基。根據本發明的一個進一步方面，本發明提供一種藥物綴合物，其包含與一個或多個效應子和/或官能團例如細胞毒性劑，特別是dm1和mmae綴合的如本文定義的肽配體。根據本發明的一個進一步方面，本發明提供一種綴合物，其包含與一個或多個效應子和/或官能團例如帶有螯合基團的放射性核素，特別是dota綴合的如本文所定義的肽配體。根據本發明的一個進一步方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含如本文定義的肽配體或藥物綴合物和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。根據本發明的一個進一步方面，本發明提供一種如本文定義的肽配體，其用于預防、抑制或治療癌癥，特別是實體瘤如非小細胞肺癌的用途。附圖說明圖1：17-69-07-n219的小鼠血漿穩定性。如圖例中所示，監測數個離子，以及mrm模式中的兩個轉換。離子之間存在很好的相關性。小鼠血漿中肽在37℃的半衰期為6小時。圖2：小鼠中雙環肽17-69-07-n004的pk曲線(profile)。每個時間點2只動物。圖3：兩種穩定化的17-69-07分子(在9位具有4-溴苯丙氨酸：17-69-07-n244，在9位不具有4-溴苯丙氨酸：17-69-07-n231)的(a)小鼠和(b)人血漿穩定性，與非穩定化的17-69-07-n219相比。監測給定分析物的數個mrm轉換，其彼此之間很好關聯。為了該圖的目的，僅顯示一個轉換。圖4：177lu17-69-07-n144在ht-1080異種移植小鼠中的生物分布。圖5：177lu17-69-07-n246在ht-1080異種移植小鼠中的生物分布。圖6：177lu17-69-07-n248在ht-1080異種移植小鼠中的生物分布。圖7：(a)：bt17bdc-1和9的平均腫瘤體積相對于時間的圖。在第0、2、4、7、9和11天施用劑量。(b)：治療期間的體重，其表明藥物相關的毒理學和整體動物健康。圖8：使用具有17-69的固定環2個殘基的文庫的親和力成熟得出的序列輸出列表。右邊的序列標志圖顯示了環1殘基1、2、3、4和5中的殘基的總體偏好。圖9：上圖：bt17bdc-17在ebc-1異種移植小鼠中平均腫瘤體積相對于時間的圖。在第0、2、4、7、9、11和14天施用劑量。下圖：治療期間的體重，其表明藥物相關的毒理學和整體動物健康。圖10：上圖：bt17bdc-18在ebc-1異種移植小鼠中平均腫瘤體積相對于時間的圖。在第0、2、4、7、9、11和14天施用劑量。下圖：治療期間的體重，其表明藥物相關的毒理學和整體動物健康。圖11：上圖：bt17bdc-19在ebc-1異種移植小鼠中平均腫瘤體積相對于時間的圖。在第0、2、4、7、9、11和14天施用劑量。下圖：治療期間的體重，其表明藥物相關的毒理學和整體動物健康。圖12：上圖：bt17bdc-20在ebc-1異種移植小鼠中平均腫瘤體積相對于時間的圖。在第0、2、4、7、9、11和14天施用劑量。下圖：治療期間的體重，其表明藥物相關的毒理學和整體動物健康。圖13：與特定bdc相關的腫瘤體積隨時間的曲線下面積(auc)相對于對應劑量組的圖。使用標準ic50方程，使用在零時刻對腫瘤體積進行歸一化的所有可用數據點進行曲線擬合。具體實施方式除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解的相同的含義，例如肽化學、細胞培養和噬菌體展示、核酸化學和生物化學領域。對于分子生物學、遺傳和生物化學方法使用標準技術(參見sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第三版,2001,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny；ausubel等人,shortprotocolsinmolecularbiology(1999)第四版,johnwiley&sons,inc.)，其通過引用并入本文。術語編號當提及式(i)化合物中的氨基酸殘基的位置時，半胱氨酸殘基(ci、cii和ciii)的編號省略，因為其是不變的，因此式(i)化合物中的氨基酸殘基的編號如下所示：-ci-x1-u/o2-x3-x4-g5-cii-e6-d7-f8-y9-x10-x11-ciii-(seqidno:1)。對于本說明書的目的，假設所有雙環肽與tbmb(1,3,5-三(溴甲基)苯)環化得到三取代的1,3,5-三甲基苯結構。在ci、cii和ciii上發生與tbmb的環化反應。雙環肽核心序列對本文公開的每個雙環肽指定一個獨有的核心序列號，其被定義為第一n-末端半胱氨酸(ci)和最后一個c-末端半胱氨酸(ciii)之間的氨基酸序列。在標識符17-69-07的例子中，核心序列是ciynefgciiedfydiciii(seqidno：2)，并且其被稱為“17-69-07”或“(17-69-07)”。肽編碼對本文公開的某些雙環肽也指定一個獨有的標識符，使用肽編碼，例如17-69-07-n241，其中n241表示17-69-07雙環核心序列的特定衍生物。17-69-07的不同衍生物具有不同的n數字，即n001、n002、nxxx。分子格式將雙環核心序列的n-末端或c-末端延伸部分添加到核心序列的左側或右側，用連字符分隔。例如，n末端βala-sar10-ala尾部將被表示為：βala-sar10-a-(17-69-07)并且具有βala-sar10-a-cynefgcedfydic(seqidno：3)的全序列。修飾雙環核心序列中的非天然氨基酸取代在分子格式描述(molecularformatdescription)之后表示。例如，如果17-69-07中的酪氨酸1被d-丙氨酸取代，則描述為(17-69-07)d-ala1，并且全序列將被描述為c(d-ala1)nefgcedfydic(seqidno：4)。如果將n末端或c末端的尾部連接到還含有對核心序列的修飾的雙環肽，則以17-69-07-n241為例，分子格式描述是：βala-sar10-a-(17-69-07)dala11nal4dala5tbugly11。因此，17-69-07-n241的全氨基酸序列為：βala-sar10-a-c(d-ala)ne(1nal)(d-ala)cedfyd(tbugly)c(seqidno：5)。肽配體本文所述的肽配體是指與分子骨架共價結合的肽。典型地，這樣的肽包含能夠與骨架形成共價鍵的兩個或多個反應性基團(即，半胱氨酸殘基)，和所述反應性基團之間的對接的序列，所述序列被稱為環序列，因為當肽與骨架結合時其形成環肽。在這種情況中，肽包含至少三個半胱氨酸殘基(本文稱為ci、ci和ciii)，并在骨架上形成至少兩個環。本領域技術人員將理解，式(i)的1、3、4、10和11位的x可以代表在丙氨酸掃描結果(參見表5)和選擇輸出(圖8)之后的任何氨基酸，其允許在這些位置良好耐受的取代。在一個實施方案中，式(i)的1位的x選自任何一種以下氨基酸：y、m、f或v。在一個進一步實施方案中，式(i)的1位的x選自y、m或f。在一個更進一步實施方案中，式(i)的1位的x選自y或m。在一個依然更進一步實施方案中，式(i)的1位的x選自y。在一個實施方案中，式(i)的2位的u/o選自u，例如n。在一個替代實施方案中，式(i)的2位的u/o選自o，例如g。在一個實施方案中，式(i)的3位的x選自u或z，其中u代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基，并且z代表選自d或e的極性、帶負電荷的氨基酸殘基。在一個進一步實施方案中，式(i)的3位的u選自q。在一個替代實施方案中，式(i)的3位的z選自e。在一個實施方案中，式(i)的4位的x選自j，其中j代表選自f、w和y的非極性芳香族氨基酸殘基。在一個進一步實施方案中，式(i)的4位的j選自f。在替代實施方案中，式(i)的4位的j選自y。在替代實施方案中，式(i)的4位的j選自w。在一個實施方案中，式(i)的10位的x選自z，其中z代表選自d或e的極性、帶負電荷的氨基酸殘基。在一個實施方案中，式(i)的10位處的z選自d。在一個實施方案中，式(i)的11位的x選自o，其中o代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基。在一個實施方案中，式(i)的11位的o選自i。在一個實施方案中，式(i)的化合物為式(ia)的化合物：-ci-y/m/f/v-u/o-u/z-j-g-cii-e-d-f-y-z-o-ciii-(seqidno：6)(ia)；其中，u、o、j和z如本文之前所定義。在一個實施方案中，式(i)的化合物為式(ib)的化合物：-ci-y/m/f/v-n/g-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：7)(ib)。在一個實施方案中，式(i)的化合物為式(ic)的化合物：-ci-y/m/f-n/g-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：8)(ic)。在一個實施方案中，式(i)的化合物為式(id)的化合物：-ci-y/m-n-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：9)(id)。在一個實施方案中，式(i)的化合物為式(ie)的化合物：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)(ie)。在一個更進一步實施方案中，式(i)的肽包含選自以下的序列：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)；-ci-m-n-q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-12)(seqidno：10)；-ci-f-g-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-02)(seqidno：11)；-ci-v-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-03)(seqidno：12)；-ci-f-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-04)(seqidno：13)；-ci-y-n-e-y-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07-n057)(seqidno：14)；和-ci-y-n-e-w-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-44-n002)(seqidno：15)。在對于mt1-mmp的血紅素結合蛋白結構域的親和力成熟后該實施方案的肽被鑒定為有效的候選物(參見實施例1和表1和8)。在一個依然更進一步實施方案中，式(i)的肽包含選自以下的序列：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)；和-ci-m-n-q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-12)(seqidno：10)。在對于mt1-mmp的血紅素結合蛋白結構域的親和力成熟，合成核心雙環序列，和使用競爭實驗定量測量親和力后，本實施方案的肽被鑒定為最高親和力的候選物(參見實施例1和表1-3)。在一個依然更進一步實施方案中，式(i)的肽包含選自-ci-y-n-e-f-g-ci-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)的序列。該實施方案的肽被鑒定為式(i)中肽配體家族中最有效和穩定的成員(參見實施例1至4)。在一個實施方案中，本發明的某些肽配體與鼠、狗、食蟹猴和人mt1-mmp完全交叉反應。在一個進一步實施方案中，本發明的具體示例的肽配體與鼠、狗、食蟹猴和人mt1-mmp完全交叉反應。例如，本文呈現的數據證明17-69-07的非穩定和穩定的衍生物(即17-69-07-n219和17-69-07-n241)都是完全交叉反應的(參見表13)。在一個更進一步實施方案中，本發明的肽配體對mt1-mmp是選擇性的，但不與mmp-1、mmp-2、mmp-15和mmp-16交叉反應。本文呈現數據證明17-69-07核心序列和穩定變體17-69-07-n258對于mt1-mmp是唯一選擇性的(參見表14)。肽配體的優點本發明的某些雙環肽具有許多有利的性質，使得它們被認為是用于注射、吸入、鼻、眼、口服或局部施用的合適的藥物樣分子。這些有利的性質包括：-物種交叉反應。這是臨床前藥代動力學和藥代動力學評估的典型要求；-蛋白酶穩定性。理想的雙環肽配體應該證明對血漿蛋白酶、上皮(“膜錨定的”)蛋白酶、胃和腸蛋白酶、肺表面蛋白酶、細胞內蛋白酶等的穩定性。應保持不同物種之間的蛋白酶穩定性，使得可以在動物模型中開發雙環先導候選物并且可以有信心地施用給人類；-理想的溶解度曲線。這是帶電荷的和親水的殘基對于疏水殘基和分子內/分子間氫鍵的比例的函數，這對于制劑和吸收目的很重要；和-循環中最佳的血漿半衰期。根據臨床指征和治療方案，可能需要在急性疾病管理情況中開發用于短時間暴露的雙環肽，或開發具有增強的循環保留性的雙環肽，因此對于更慢性的疾病狀態的管理是最佳的。驅使合意的血漿半衰期的其它因素是用于最大治療功效的持續暴露相對于由于藥劑的持續暴露引起的所伴隨的毒理學的要求。藥學上可接受的鹽將理解鹽形式在本發明的范圍內，并且提及式(i)的化合物則包括所述化合物的鹽形式。本發明的鹽可以通過常規的化學方法，例如pharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse,p.heinrichstahl(編輯),camilleg.wermuth(編輯),isbn:3-90639-026-8,hardcover,388頁,2002年8月中描述的方法，由含有堿或酸部分的母體化合物合成。通常，這些鹽可以通過將這些化合物的游離酸或堿形式與適當的堿或酸在水中或在有機溶劑中或在兩者的混合物中反應制備。酸式加成鹽(單鹽或二鹽)可以用各種酸(無機和有機酸)形成。酸式加成鹽的示例包括與選自以下的酸形成的單鹽或二鹽：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗壞血酸(例如l-抗壞血酸)、l-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟腦酸、樟腦磺酸、(+)-(1s)-樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、檸檬酸、環己氨磺酸、十二烷基磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、甲酸、富馬酸、半乳糖酸、龍膽酸、葡庚糖酸、d-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如d-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如l-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、馬尿酸、氫鹵酸(如氫溴酸、鹽酸、氫碘酸)、羥乙磺酸、乳酸(如(+)-l-乳酸、(±)-dl-乳酸)、乳糖酸、馬來酸、蘋果酸、(-)-l-蘋果酸、丙二酸、(±)-dl-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、煙酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、l-焦谷氨酸、水楊酸、4-氨基-水楊酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、丹寧酸、(+)-l-酒石酸、硫氰酸、對甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及酰化氨基酸和陽離子交換樹脂。一組特別的鹽包括由乙酸、鹽酸、氫碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、馬來酸、蘋果酸、羥乙磺酸、富馬酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(甲磺酸鹽)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸和乳糖醛酸形成的鹽。一種特別的鹽是鹽酸鹽。另一種特別的鹽是乙酸鹽。如果化合物是陰離子的或具有可以是陰離子的官能團(例如，-cooh可以是-coo-)，則可以用產生適當的陽離子的有機或無機堿形成鹽。合適的無機陽離子的示例包括但不限于堿金屬離子如li+、na+和k+，堿土金屬陽離子如ca2+和mg2+，以及其它陽離子如al3+或zn+。合適的有機陽離子的示例包括但不限于銨離子(即nh4+)和取代的銨離子(例如，nh3r+、nh2r2+、nhr3+、nr4+)。一些合適的取代銨離子的示例為衍生自：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二環己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、芐胺、苯基芐胺、膽堿、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如賴氨酸和精氨酸的那些。常見的季銨離子的示例是n(ch3)4+。當式(i)的化合物含有胺官能團時，例如根據本領域技術人員熟知的方法通過與烷基化劑反應，它們可以形成季銨鹽。這樣的季銨化合物在式(i)的范圍內。修飾的衍生物應當理解，如本文定義的肽配體的修飾的衍生物在本發明的范圍內。這種合適的修飾的衍生物的示例包含一個或多個選自以下的修飾：n-末端和/或c-末端修飾；用一個或多個非天然氨基酸殘基替換一個或多個氨基酸殘基(例如用一個或多個等排或等電子氨基酸替換一個或多個極性氨基酸殘基；用其它非天然的等排或等電子氨基酸替換一個或多個非極性氨基酸殘基)；加入間隔子基團；用一個或多個抗氧化氨基酸殘基替換一個或多個氧化敏感性氨基酸殘基；用丙氨酸替換一個或多個氨基酸殘基，用一個或多個d-氨基酸殘基替換一個或多個l-氨基酸殘基；雙環肽配體中一個或多個酰胺鍵的n-烷基化；用替代鍵(surrogatebond)替換一個或多個肽鍵；肽骨架(peptidebackbone)長度修飾；用另一個化學基團取代一個或多個氨基酸殘基的α-碳上的氫，用合適的胺、硫醇、羧酸和酚反應性試劑修飾氨基酸如半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和酪氨酸，以功能化所述氨基酸，和引入或替換氨基酸，所述氨基酸引入適合于官能化的正交反應，例如攜帶氨基酸的疊氮化物或炔烴基團分別允許攜帶炔烴或疊氮化物的部分的官能化。在一個實施方案中，修飾的衍生物包含在氨基酸1位和/或9位的修飾。本文呈現的數據顯示這些位置，特別是存在酪氨酸的位置對蛋白水解降解最為敏感。在一個實施方案中，修飾的衍生物包含n-末端和/或c-末端修飾。在一個進一步實施方案中，其中所述修飾的衍生物包含使用合適的氨基反應性化學的n-末端修飾，和/或使用合適的羧基反應性化學的c-末端修飾。在一個進一步實施方案中，所述n-末端或c-末端修飾包含加入效應子基團，包括但不限于細胞毒性劑、放射螯合劑(radiochelator)或發色團。在一個進一步實施方案中，修飾的衍生物包含n-末端修飾。在一個進一步實施方案中，n-末端修飾包含n-末端乙酰基，例如本文公開的17-69-07-n004。在該實施方案中，在肽合成期間，n-末端半胱氨酸基團(該基團本文中稱為ci)被乙酸酐或其它合適的試劑封端，導致n-末端乙酰化的分子。該實施方案提供了除去氨基肽酶的潛在識別位點并避免雙環肽降解潛力的優點。在一個替代實施方案中，n-末端修飾包含加入有助于效應子基團綴合和保持雙環肽對其靶標的效力的分子間隔子基團，例如ala、g-sar10-a或bala-sar10-a基團。本文呈現的數據顯示將這些基團加入雙環肽17-69-07不會改變對靶蛋白的效力(表11-12)。在一個進一步實施方案中，修飾的衍生物包含c-末端修飾。在一個進一步實施方案中，c-末端修飾包含酰胺基。在該實施方案中，c-末端半胱氨酸基團(該基團本文中稱為ciii)在肽合成期間被合成為酰胺，導致c末端酰胺化的分子。該實施方案提供了除去羧肽酶的潛在識別位點并降低雙環肽的蛋白水解降解潛力的優點。在一個實施方案中，修飾的衍生物包含用一個或多個非天然氨基酸殘基替換一個或多個氨基酸殘基。在該實施方案中，可以選擇非天然氨基酸，其具有不被降解蛋白酶識別，也不對靶標效力產生任何副作用的等排/等電子側鏈。可替代地，可以使用具有約束的氨基酸側鏈的非天然氨基酸，使得在構象和空間上阻礙鄰近肽鍵的蛋白水解。特別地，這些涉及脯氨酸類似物、大體側鏈、cα-二取代衍生物(例如，氨基異丁酸，aib)、和環氨基酸、為氨基-環丙基羧酸的簡單的衍生物。在一個實施方案中，非天然氨基酸殘基取代于4位。本文呈現的數據顯示在該位置上許多非天然氨基酸殘基被良好耐受(參見表8)。在一個進一步實施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于4位的那些，選自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、環己基甘氨酸、苯基甘氨酸、叔丁基甘氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、環己基丙氨酸和高苯丙氨酸。在一個更進一步實施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于4位的那些，選自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸和3,4-二氯苯丙氨酸。本文呈現的數據顯示與未修飾的野生型序列相比，這些取代增加了親和力(參見表8)。在一個更進一步實施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于4位的那些，選自：1-萘基丙氨酸。本文呈現的數據顯示與野生型相比，該取代提供了最大程度的親和力增強(大于7倍)(參見表8)。在一個實施方案中，將非天然氨基酸殘基引入9位和/或11位。本文呈現的數據顯示在這些位置上許多非天然氨基酸殘基被良好耐受(參見表9)。在一個進一步實施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于9位的那些，選自：4-溴苯丙氨酸、五氟-苯丙氨酸。在一個進一步實施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于11位的那些，選自：叔丁基甘氨酸。在一個進一步實施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于9位的那些，選自：4-溴苯丙氨酸。本文呈現的數據顯示tyr9蛋白水解識別點的改變(參見表9)。在一個進一步實施方案中，非天然氨基酸殘基，例如存在于11位的那些，選自：叔丁基甘氨酸。本文提供的數據顯示活性增強，并通過空間位阻強力保護鄰近氨基酸骨架免受蛋白水解(參見表9)。在一個實施方案中，修飾的衍生物包含多個上面提及的修飾，例如2、3、4或5個或更多個修飾。在一個進一步實施方案中，修飾的衍生物包含2、3、4或5個或更多個以下修飾，例如所有以下5個修飾：1位和5位的d-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸，9位的4-溴苯丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。本文提供的數據顯示該多取代(17-69-07-n252、17-69-07-n244和17-69-07-n255)與優于野生型的效力相一致(參見表10-12)。在一個更進一步實施方案中，修飾的衍生物包含以下修飾：1位和5位的d-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。本文呈現的數據顯示該多取代(17-69-07-n239)與優于野生型的效力相一致(參見表11)。在一個實施方案中，修飾的衍生物包含加入間隔子基團。在一個進一步實施方案中，修飾的衍生物包含向n-末端半胱氨酸(ci)和/或c-末端半胱氨酸(ciii)加入間隔子基團。在一個實施方案中，修飾的衍生物包含用一個或多個抗氧化氨基酸殘基替換一個或多個氧化敏感性氨基酸殘基。在一個進一步實施方案中，修飾的衍生物包含用萘基丙氨酸或丙氨酸殘基替換色氨酸殘基。該實施方案提供改善所得到的雙環肽配體的藥物穩定性特征的優點。在一個實施方案中，修飾的衍生物包含用一個或多個疏水性氨基酸殘基替換一個或多個帶電荷的氨基酸殘基。在替代實施方案中，修飾的衍生物包含用一個或多個帶電荷的氨基酸殘基替換一個或多個疏水性氨基酸殘基。帶電荷的氨基酸殘基對于疏水性氨基酸殘基的正確平衡是雙環肽配體的重要特征。例如，疏水性氨基酸殘基影響血漿蛋白結合的程度，因此影響血漿中游離可利用級分的濃度，而帶電荷的氨基酸殘基(特別是精氨酸)可以影響肽與磷脂膜在細胞表面的相互作用。兩者組合可以影響肽藥物的半衰期、分布容積和暴露容積，并可以根據臨床終點進行調整。另外，帶電荷的氨基酸殘基對于疏水性氨基酸殘基的正確組合和數量可以減少注射部位的刺激(如果肽藥物已經被皮下施用)。在一個實施方案中，修飾的衍生物包含用一個或多個d-氨基酸殘基替換一個或多個l-氨基酸殘基。據信該實施方案通過空間位阻增加蛋白水解穩定性并通過d-氨基酸的傾向來穩定β-轉角的構象(tugyi等人(2005)pnas,102(2),413–418)。在一個進一步實施方案中，將1位的氨基酸殘基替換為d-氨基酸，例如d-丙氨酸。本文呈現的數據證明效力保留而不會導致降解(參見表6)。在一個進一步實施方案中，將5位的氨基酸殘基替換為d-氨基酸，例如d-丙氨酸或d-精氨酸。本文呈現的數據顯示了效力保留而不會導致降解(參見表7)。在一個實施方案中，修飾的衍生物包含除去任何氨基酸殘基和用丙氨酸的取代。該實施方案提供除去潛在的蛋白水解攻擊位點的優點。應當注意，上述提及的每種修飾用于有意地改善肽的效力或穩定性。基于修飾的進一步的效力改善可以通過以下機制來實現：-合并入展現疏水效應并導致降低速率的疏水部分，從而實現更高的親和力；-合并入展現長期離子相互作用的帶電荷基團，導致速率更快和更高的親和力(參見例如schreiber等人,rapid,electrostaticallyassistedassociationofproteins(1996),naturestruct.biol.3,427-31)；和-通過例如正確地約束氨基酸的側鏈，從而使靶標結合后的熵損失最小化；約束骨架的扭轉角，從而使靶標結合后的熵損失最小化；和出于相同的原因而在分子中引入另外的環化，在肽中合并入另外的約束。(綜述參見gentilucci等人,curr.pharmaceuticaldesign,(2010),16,3185-203,和nestor等人,curr.medicinalchem(2009),16,4399-418)。同位素變體本發明包括本發明的所有藥學上可接受的(放射性)同位素標記的化合物，即式(i)的化合物，其中一個或多個原子被具有相同原子數的原子代替，但原子質量或質量數不同于通常在自然界中發現的原子質量或質量數，和式(i)的化合物，其中連接能夠保持住相關的(放射性)同位素的金屬螯合基團(稱為“效應子”)，和式(i)的化合物，其中某些官能團被相關的(放射性)同位素或同位素標記的官能團共價替換。適合于包含在本發明化合物中的同位素的示例包括氫的同位素，如2h(d)和3h(t)，碳，如11c、13c和14c，氯，如36cl，氟，如18f，碘，如123i、125i和131i，氮，如13n和15n，氧，如15o、17o和18o，磷，如32p，硫，如35s，銅，如64cu，鎵，如67ga或68ga，釔，如90y，和镥，如177lu，鉍，如213bi。某些同位素標記的式(i)的化合物，例如合并入放射性同位素的化合物，可用于藥物和/或底物組織分布研究，并臨床評估患病組織如腫瘤和其它地方的mt1-mmp靶標的存在和/或不存在。式(i)的化合物可以進一步具有有價值的診斷性質，因為它們可用于檢測或鑒定標記化合物與其它分子、肽、蛋白質、酶或受體之間的復合物的形成。檢測或鑒定方法可以使用用標記試劑如放射性同位素、酶、熒光物質、發光物質(例如魯米諾、魯米諾衍生物、熒光素、發光蛋白和熒光素酶)標記的化合物。放射性同位素氚，即3h(t)和碳-14，即14c，鑒于其容易合并入和現有的檢測手段，而特別用于該目的。用較重的同位素如氘(即2h(d))取代可以提供由更大的代謝穩定性，例如增加的體內半衰期或降低的劑量需求產生的某些治療優勢，因此在一些情況下可能是優選的。用正電子發射同位素(如11c、18f、15o和13n)取代可用于正電子發射斷層掃描(pet)研究以檢查靶標占有率。將同位素合并入金屬螯合效應子基團(如64cu、67ga、68ga和177lu)可用于使用pet或spect成像顯現腫瘤特異性抗原。特別地，這樣的生物分布數據在本文實施例3中呈現。將同位素合并入金屬螯合效應子基團(例如，但不限于90y、177lu和213bi)可提供靶向放射治療的選擇，其中攜帶金屬螯合劑的式(i)的化合物將治療性放射性核素攜帶至靶蛋白和作用位點。同位素標記的式(i)的化合物通常可以通過本領域技術人員已知的常規技術或通過類似于所附實施例中所述的方法，使用適當的同位素標記的試劑替代之前采用的未標記的試劑制備。結合活性在本文中，特異性是指配體與其同源靶標結合或以其他方式相互作用以排除與靶標相似的實體的能力。例如，特異性可以指配體抑制人酶而不是來自不同物種的同源酶的相互作用的能力。使用本文描述的方法，可以調節特異性，即增加或減少特異性，以使配體或多或少地能夠與預期靶標的同源物或旁系同源物相互作用。特異性并不意味著與活性、親和力或親合力同義，并且配體對其靶標的作用的效力(如，例如結合親和力或抑制水平)不一定與其特異性相關。如本文所使用，結合活性是指來源于結合試驗的定量結合測量，例如如本文所述。因此，結合活性是指在給定靶標濃度下結合的肽配體的量。多重特異性是結合兩個或多個靶標的能力。典型地，由于其構象性質，結合肽能夠結合單個靶標，例如抗體情況下的表位。然而，可以開發肽，其可以結合兩個或更多靶標的肽，雙重特異性抗體，例如，如本領域已知的如上所述。在本發明中，肽配體能夠結合兩個或多個靶標，因此是多重特異性的。適當地，它們與兩個靶標結合，并且是雙重特異性的。結合可以是獨立的，這意味著肽上的靶標結合位點在結構上不受一種或另一種靶標的結合的阻礙。在這種情況下，兩個靶標可以獨立地結合。更一般地，預期一個靶標的結合將至少部分地阻礙另一個靶標的結合。雙重特異性配體和包含兩個相關靶標的具有特異性的配體之間存在根本區別。在第一種情況下，配體對于兩個靶標單獨具有特異性，并且以特定方式與每個靶標相互作用。例如，配體中的第一環可以與第一靶標結合，而第二環與第二靶標結合。在第二種情況下，配體是非特異性的，因為它不區分兩個靶標，例如通過與兩者共同的靶標的表位相互作用。在本發明的上下文中，對于例如靶標和同源物具有活性的配體有可能是雙重特異性配體。然而，在一個實施方案中，配體不是雙重特異性的，但是具有不太精確的特異性，使得其結合靶標和一種或多種同源物。一般地，由于缺少針對雙重特異性的選擇性壓力，尚未針對靶標和同源物選擇的配體不太可能是雙重特異性的。在提供調節的結合表面從而可以獲得良好的靶標和同源物交叉反應性，同時保持對較少相關同系物的高選擇性中，雙環肽中的環長度可以是決定性的。如果配體是真正的雙重特異性的，在一個實施方案中，配體的至少一種靶標特異性在選擇的配體中是常見的，并且該特異性的水平可以通過本文公開的方法調節。第二或進一步的特異性不需要分享，也不必是本文所述程序的主題。靶標是肽配體與其結合或以其它方式相互作用的分子或其部分。雖然結合被認為是大多數種類的活性的先決條件，而且其本身可能是一種活性，但也可以設想其它活性。因此，本發明不需要直接或間接地測量結合。分子骨架是能夠在多個位點連接肽以賦予肽一種或多種結構特征的任何分子。優選地，分子骨架包含至少三個肽的連接點，稱為骨架反應性基團。這些基團能夠與肽上的半胱氨酸殘基(ci、cii和ciii)反應以形成共價鍵。它們不僅形成二硫鍵(其經歷還原性裂解并伴隨分子分解)，還形成穩定的共價硫醚鍵。分子骨架的優選結構如下所述。分子骨架分子骨架表述于例如wo2009/098450和本文引用的參考文獻，特別是wo2004/077062和wo2006/078161中。如上述文獻中所指出的，分子骨架可以是小分子，例如小的有機分子。在一個實施方案中，分子骨架可以是或可以基于天然單體，例如核苷、糖或類固醇。例如，分子骨架可以包含這樣實體的短聚合物，例如二聚體或三聚體。在一個實施方案中，分子骨架是已知毒性的化合物，例如低毒性的化合物。合適的化合物的示例包括膽固醇、核苷酸、類固醇或現有的藥物如他馬西泮。在一個實施方案中，分子骨架可以是大分子。在一個實施方案中，分子骨架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物組成的大分子。在一個實施方案中，分子骨架包含能夠與多肽的官能團反應形成共價鍵的反應性基團。分子骨架可以包括與肽形成連接的化學基團，例如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烴、炔烴、疊氮化物、酸酐、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、烷基鹵化物和酰基鹵化物。在一個實施方案中，分子骨架可以包含三(溴甲基)苯，特別是1,3,5-三(溴甲基)苯(‘tbmb’)或其衍生物，或可以由其組成。在一個實施方案中，分子骨架是2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯。該分子類似于1,3,5-三(溴甲基)苯，但含有三個另外與苯環連接的甲基。這具有以下優點：另外的甲基可以與多肽形成進一步的聯系，并因此增加另外的結構約束。本發明的分子骨架含有允許本發明編碼文庫的多肽的官能團與分子骨架形成共價鍵的化學基團。所述化學基團選自多種官能團，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烴、炔烴、酸酐、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、疊氮化物、烷基鹵化物和酰基鹵化物。可用于分子骨架上與半胱氨酸的巰基反應的骨架反應性基團是烷基鹵化物(或也稱為鹵代烴或鹵代烷)。示例包括溴甲基苯(以tbmb為例的骨架反應性基團)或碘乙酰胺。用于選擇性地將化合物與蛋白質中的半胱氨酸偶聯的其它骨架反應性基團是馬來酰亞胺。可用作本發明分子骨架的馬來酰亞胺的示例包括：三-(2-馬來酰亞氨基乙基)胺、三-(2-馬來酰亞氨基乙基)苯、三-(馬來酰亞氨基)苯。硒代半胱氨酸也是與半胱氨酸具有相似反應性的天然氨基酸，并可用于相同的反應。因此，無論何時提及半胱氨酸，除非上下文另有說明，否則通常可以替換硒代半胱氨酸。效應子和官能團根據本發明的一個進一步方面，本發明提供一種藥物綴合物，其包含與一個或多個效應物和/或官能團綴合的如本文定義的肽配體。效應子和/或官能團可以連接于例如多肽的n和/或c末端、多肽內的氨基酸、或分子骨架。合適的效應子基團包括抗體及其部分或片段。例如，除了一個或多個恒定結構域之外，效應子基團可以包括抗體輕鏈恒定區(cl)、抗體ch1重鏈結構域、抗體ch2重鏈結構域、抗體ch3重鏈結構域、或其任何組合。效應子基團還可以包含抗體的鉸鏈區(通常在igg分子的ch1和ch2結構域之間發現這種區域)。在本發明該方面的一個進一步實施方案中，根據本發明的效應子基團是igg分子的fc區。有利地，根據本發明的肽配體-效應子基團包含具有一天或更多、兩天或更多、3天或更多、4天或更多、5天或更多、6天或更多、或7天或更多的tβ半衰期的肽配體fc融合物，或由其組成。最有利地，根據本發明的肽配體包含具有一天或更多的tβ半衰期的肽配體fc融合物，或由其組成。官能團通常包括結合基團、藥物、用于連接其它實體的反應性基團、有助于將大環肽攝取入細胞中的官能團等。肽透入細胞的能力將允許肽針對細胞內靶標是有效的。可以被具有透入細胞能力的肽接近的靶標包括轉錄因子、細胞內信號傳導分子如酪氨酸激酶和參與細胞凋亡途徑的分子。能夠穿透細胞的官能團包括已經加入肽或分子骨架的肽或化學基團。肽，如衍生自如vp22、hiv-tat、果蠅(觸角足突變(antennapedia))的同源盒蛋白的那些，例如，如chen和harrison,biochemicalsocietytransactions(2007)volume35,part4,p821；gupta等人，advanceddrugdiscoveryreviews(2004)volume579637中所描述。已經顯示在通過質膜的易位中有效的短肽的示例包括來自觸角足突變果蠅蛋白的16個氨基酸穿透肽(derossi等人(1994)jbiol.chem.volume269p10444)、18個氨基酸的“模型兩親肽”(oehlke等人(1998)biochimbiophysactsvolume1414p127)和hivtat蛋白的富含精氨酸的區域。非肽方法包括使用可以容易地連接到生物分子上的小分子模擬物或smoc(okuyama等人(2007)naturemethodsvolume4p153)。將胍基添加到分子中的其它化學策略也增強細胞穿透(elson-scwab等人(2007)jbiolchemvolume282p13585)。可以將小分子量分子如類固醇加入到分子骨架中以增強細胞攝取。可以與肽配體連接的一類官能團包括抗體及其結合片段，如fab、fv或單結構域片段。特別地，可以使用與蛋白質結合的能夠增加體內肽配體的半衰期的抗體。也可以合并入與許多細胞上存在的整合蛋白結合的rgd肽。在一個實施方案中，根據本發明的肽配體-效應子基團具有選自12小時或更多、24小時或更多、2天或更多、3天或更多、4天或更多、5天或更多、6天或更多、7天或更多、8天或更多、9天或更多、10天或更多、11天或更多、12天或更多、13天或更多、14天或更多、15天或更多、或20天或更多的tβ半衰期。有利地，根據本發明的肽配體-效應子基團或組合物將具有12至60小時范圍內的tβ半衰期。在一個進一步實施方案中，其將具有一天或更長的tβ半衰期。在一個依然進一步實施方案中，它將在12至26小時的范圍內。在本發明的一個特別的實施方案中，所述官能團選自金屬螯合劑，其適合于絡合具有藥用相關性的金屬放射性同位素。當與所述放射性同位素絡合時，這樣的效應子可以呈現用于癌癥治療的有用試劑。合適的示例包括dota、nota、edta、dtpa、heha、sarar等(targetedradionuclidetherapy,todspeer,wolters/kluverlippincottwilliams&wilkins,2011)。可能的效應子基團還包括酶，例如用于酶/前藥治療的羧肽酶g2，其中肽配體替換adept中的抗體。在本發明的一個特別的實施方案中，所述官能團選自藥物，例如用于癌癥治療的細胞毒性劑。合適的示例包括：烷化劑如順鉑和卡鉑，以及奧沙利鉑、氮芥、環磷酰胺、苯丁酸氮芥、異環磷酰胺；抗代謝物，包括嘌呤類似物硫唑嘌呤和巰嘌呤或嘧啶類似物；植物生物堿和萜類化合物，包括長春花生物堿類，如長春新堿、長春花堿、長春瑞濱和長春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇(paclitaxel)，最初稱為紫杉醇(taxol)；拓撲異構酶抑制劑包括喜樹堿：伊立替康和拓撲替康，以及ii型抑制劑，包括安丫啶、依托泊苷，依托泊苷磷酸酯和替尼泊苷。其它試劑可以包括抗腫瘤抗生素，其包括免疫抑制劑放線菌素(用于腎移植)、多柔比星、表柔比星、博來霉素、刺胞霉素等。在本發明的一個進一步特別的實施方案中，細胞毒性劑選自美登木素生物堿類(如dm1)或單甲基奧里斯他汀類(例如mmae)。dm1是一種細胞毒性劑，其是美登素的含巰基衍生物，并具有以下結構：單甲基奧里斯他汀e(mmae)是合成的抗腫瘤劑，并具有以下結構：在本文的實施例4和5中呈現的數據證明了與包含dm1或mmae的毒素綴合的肽配體的作用。在一個實施方案中，細胞毒性劑通過可裂解的鍵(例如二硫鍵或蛋白酶敏感鍵)與雙環肽連接。在一個進一步實施方案中，與二硫鍵相鄰的基團被修飾以控制二硫鍵的阻礙，并且由此控制細胞毒性劑的裂解和伴隨釋放的速率。已發表的工作確定了通過在二硫鍵的任一側引入空間位阻來改變二硫鍵的還原敏感性的潛力(kellogg等人(2011)bioconjugatechemistry,22,717)。更大程度的空間位阻降低細胞內谷胱甘肽和細胞外(全身的)還原劑的還原速率，從而降低了細胞內外釋放毒素的容易程度。因此，可以通過仔細選擇二硫鍵的任一側的阻礙程度來實現循環中二硫化物穩定性(其使毒素的不良副作用最小化)對于細胞內環境中的有效釋放(其最大化治療效果)的最佳選擇。通過在分子構建物的靶向實體(這里是雙環肽)或毒素這側上引入一個或多個甲基來調節二硫鍵的任一側的阻礙。因此，在一個實施方案中，細胞毒性劑為選自式(ii)的化合物的美登木素生物堿：其中n代表選自1至10的整數；和r1和r2獨立地代表氫、c1-6烷基或碳環基或雜環基。本文所用的術語c1-6烷基是指分別含有1至6個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴基團。這些基團的示例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基或己基等。除非上下文另有說明，本文所用的術語“雜環基”和“碳環基”包括芳香族和非芳香族環系統。因此，例如，術語“雜環基基團”和“碳環基基團”在其范圍內包括芳香族、非芳香族、不飽和、部分飽和和完全飽和的碳環基或雜環基環系統。一般地，除非上下文另有說明，這些基團可以是單環或雙環(包括稠合和橋連的雙環基團)，并且可以含有例如3至12個環成員，更通常為5至10個環成員。在式(ii)的化合物的一個實施方案中，r1和r2獨立地代表氫或甲基。在式(ii)的化合物的一個實施方案中，n代表1，并且r1和r2均代表氫(即美登素衍生物dm1)。在式(ii)的化合物的一個替代實施方案中，n代表2，r1代表氫并且r2代表甲基(即美登素衍生物dm3)。在式(ii)的化合物的一個實施方案中，n代表2，并且r1和r2均代表甲基(即美登素衍生物dm4)。應當理解，式(ii)的細胞毒性劑可以形成二硫鍵，并且在具有式(i)的雙環肽的綴合物結構中，巰基-毒素(ii)和巰基-雙環肽(iii)之間的二硫鍵連接是通過數種可能的合成方案引入的，兩種在方案ii或方案iii中描述。在一個實施方案中，所述綴合物的雙環肽組分具有式(iii)所示的結構：其中m代表選自0至10的整數，和r3和r4獨立地代表氫、c1-6烷基或碳環基或雜環基。在式(iii)的化合物的一個實施方案中，r3和r4獨立地代表氫或甲基。其中r3和r4均為氫的式(iii)的化合物被認為是不受阻礙的，并且其中r3和r4中的一個或全部代表甲基的式(iii)的化合物被認為是受阻礙的。應當理解，式(iii)的雙環肽可以形成二硫鍵，并且在具有式(ii)的細胞毒性劑的綴合物結構中，巰基-毒素(ii)和巰基-雙環肽(iii)之間的二硫鍵連接是通過數種可能的合成方案引入的，一種在方案ii中描述。在一個實施方案中，通過式(iv)定義的連接子將細胞毒性劑與雙環肽連接：其中r1、r2、r3和r4代表氫、c1-6烷基或碳環基或雜環基；毒素指本文定義的任何合適的細胞毒性劑；雙環代表本文定義的任何合適的雙環肽；n代表選自1至10的整數；和m代表選自0至10的整數。在一個實施方案中，r1、r2、r3和r4代表氫或甲基。當r1、r2、r3和r4各自為氫時，二硫鍵最不受阻礙并且最易于還原。當r1、r2、r3和r4各自為甲基時，二硫鍵最受阻礙并且最不易于還原。氫和甲基的部分取代產生抗還原作用的逐漸增加，以及伴隨的毒素裂解和釋放。在一個實施方案中，化合物(iv)的毒素是美登素，并且綴合物包含式(v)的化合物：其中r1、r2、r3和r4代表氫、c1-6烷基或碳環基或雜環基；雙環代表本文定義的任何合適的雙環肽；n代表選自1至10的整數；和m代表選自0至10的整數。在式(v)的化合物的一個進一步實施方案中，n代表1并且r1、r2、r3和r4各自代表氫，即式(v)a的化合物：式(v)a的bdc被稱為bt17bdc-17。bdcbt17bdc-17中不受阻礙的二硫化合物相當于bt17bdc-9，其差異在于雙環肽部分：bt17bdc-9采用非穩定化序列(17-69-07-n219)，而bt17bdc-17采用與毒素-二硫化物構建體酰胺鍵合的穩定的雙環肽配對物(17-69-07-n241)。n＝1的美登素的這種非阻礙性衍生物被稱為dm1。在式(v)的化合物的一個進一步實施方案中，n代表1，r1代表甲基，并且r2、r3和r4各自代表氫，即式(v)b的化合物：式(v)b的bdc被稱為bt17bdc-18，并且在雙環肽這側含有單個阻礙甲基，并且在抗體藥物綴合物的情況下，其對還原劑如二硫蘇糖醇的敏感性降低7倍(與非阻礙二硫化物相比)(kellogg等人(2011)bioconjugatechemistry,22,717)。降低的還原敏感性與較低的毒素釋放速率相關。n＝1的美登素的這種非阻礙性衍生物被稱為dm1。bt17bdc-18采用其與毒素-二硫化物構建體酰胺鍵合的穩定的雙環肽配對物(17-69-07-n241)。在式(v)的化合物的一個進一步實施方案中，n代表2，r1和r2均代表氫，并且r3和r4均代表甲基，即式(v)c的化合物：式(v)c的bdc被稱為bt17bdc-19，并且在美登素這側含有兩個受阻的甲基，并且在抗體藥物綴合物的情況下，其對還原劑如二硫蘇糖醇的敏感性降低14倍。降低的還原敏感性與較低的毒素釋放速率相關。n＝2的美登素的這種受阻礙的衍生物被稱為dm4。bt17bdc-19采用與毒素-二硫化物構建體酰胺鍵合的穩定的雙環肽配對物(17-69-07-n241)。在式(v)的化合物的一個進一步實施方案中，n代表2，r1和r3均代表甲基，并且r2和r4均代表氫，即式(v)d的化合物：式(v)d的bdc被稱為bt17bdc-20，并且在美登素這側含有一個阻礙的甲基，和在雙環肽這側含有一個阻礙的甲基，并且在抗體藥物綴合物的情況下，其對還原劑如二硫蘇糖醇的敏感性降低170倍。降低的還原敏感性與較低的毒素釋放速率相關。n＝2的美登素的這種受阻礙的衍生物被稱為dm3。bt17bdc-20采用與毒素-二硫化物構建體酰胺鍵合的穩定的雙環肽配對物(17-69-07-n241)。實際上，在抗體藥物綴合物的情況下，動物模型中功效對于耐受性的平衡顯示其最佳值與某些水平的阻礙相關，即dm4的情況(kellogg等人(2011)bioconjugatechemistry,22,717)，這在bt17bdc-19中也是如此。在一個實施方案中，綴合物選自bt17bdc-9、bt17bdc-17(式(v)a的化合物)、bt17bdc-18(式(v)b的化合物)、bt17bdc-19(式(v)c的化合物)和bt17bdc-20(式(v)d的化合物)。在實施例5和表16和17中呈現的數據表明bt17bdc-9、bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的有益性質。在一個進一步實施方案中，綴合物選自bt17bdc-9、bt17bdc-17(式(v)a的化合物)、bt17bdc-18(式(v)b的化合物)和bt17bdc-19(式(v)c的化合物)。實施例5和表16和17中呈現的數據表明這些綴合物被認為是用于靶向癌癥治療的合適分子。在一個進一步實施方案中，綴合物選自bt17bdc-17(式(v)a的化合物)、bt17bdc-18(式(v)b的化合物)和bt17bdc-19(式(v)c的化合物)。實施例5和表16和17中呈現的數據表明這些綴合物被認為是用于靶向癌癥治療的合適分子，并且在有效劑量下具有良好的耐受性。合成本發明的肽可以通過標準技術合成制備，然后在體外與分子骨架反應。當進行此操作時，可以使用標準化學方法。這使得能夠快速大規模制備可溶性材料用于進一步的下游實驗或驗證。這樣的方法可以使用例如timmerman等人(同上)中公開的常規化學方法來實現。因此，本發明還涉及如本文所述選擇的多肽或綴合物的制備，其中制備包括如下說明的任選的進一步步驟。在一個實施方案中，這些步驟在通過化學合成制得的最終產物多肽/綴合物上進行。當制備綴合物或復合物時，目標多肽中的氨基酸殘基任選可以被取代。肽也可以被延伸，以合并入例如另一個環，因此引入多個特異性。為了延伸肽，可以使用標準固相或溶液相化學法，使用正交保護的賴氨酸(和類似物)，簡單地在其n-末端或c-末端或在環內化學延伸。可以使用標準(生物)綴合技術來引入活化的或可活化的n-或c-末端。可替代地，可以通過片段縮合或天然化學連接進行添加(例如，如(dawson等人1994.synthesisofproteinsbynativechemicalligation.science266:776-779)中所述)，或通過酶，例如使用如(chang等人procnatlacadsciusa.1994dec20；91(26):12544-8或hikari等人bioorganic&medicinalchemistrylettersvolume18,issue22,15november2008,pages6000-6003)中描述的subtiligase進行添加。可替代地，可以通過二硫鍵進一步綴合來延伸或修飾肽。這具有允許第一和第二肽在細胞的還原環境中彼此分離一次的另外的優點。在這種情況下，可以在第一肽的化學合成期間加入分子骨架(例如tbmb)，以使得與三個半胱氨酸基團反應；然后可以將另外的半胱氨酸或硫醇附加到第一肽的n或c末端，使得該半胱氨酸或硫醇僅與第二肽的游離半胱氨酸或硫醇反應，形成二硫鍵連接的雙環肽-肽綴合物。類似的技術同樣適用于兩種雙環和雙重特異性大環化合物的合成/偶聯，潛在地產生四重特異性分子。此外，可以以相同的方式，使用適當的化學方法，在n-或c-末端或通過側鏈的偶聯來完成其它官能團或效應子基團的加入。在一個實施例中，以不阻礙任一實體的活性的方式進行偶聯。根據本發明的一個進一步方面，本發明提供制備如本文定義的藥物綴合物的方法，其包含方案i、ii或iii中任一項所述的合成路線。藥物組合物根據本發明的一個進一步方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含本文定義的肽配體或藥物綴合物和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。一般地，本發明的肽配體將與藥理學上適當的賦形劑或載體一起以純化的形式使用。典型地，這些賦形劑或載體包括水性或醇/水溶液、乳劑或混懸液，包括生理鹽水和/或緩沖介質。腸胃外空白載體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉和乳酸林格氏試劑。如果必要，合適的生理學上可接受的佐劑可以選自增稠劑如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽，以將多肽復合物保持在混懸液中。靜脈內空白載體包括液體和營養補充劑和電解質補充劑，如基于林格氏右旋糖的那些。還可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(mack(1982)remington'spharmaceuticalsciences，第16版)。本發明的肽配體可以用作單獨施用的組合物，或者與其他試劑結合施用。這些可以包括抗體、抗體片段和各種免疫治療藥物，例如環孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或順鉑和免疫毒素。藥物組合物可以包括與本發明的蛋白配體結合的各種細胞毒素或其它試劑的“雞尾酒混合物”，或甚至包括具有不同特異性的根據本發明選擇的多肽的組合，例如使用不同靶配體選擇的多肽，無論是否在施用之前匯集。根據本發明的藥物組合物的給藥途徑可以是本領域普通技術人員通常已知的那些。對于治療方法，包括但不限于免疫治療法，本發明的肽配體可以根據標準技術施用于任何患者。施用可以通過任何適當的模式，包括腸胃外、靜脈內、肌肉內、腹腔內、經皮、經肺途徑、或者適當地通過直接導管輸注。施用的劑量和頻率取決于患者的年齡、性別和狀況，其它藥物的聯合施用，相反指征和臨床醫生要考慮的其它參數。本發明的肽配體可以被凍干儲存并在使用前重構在合適的載體中。已經證明這種技術是有效的，并且可以采用本領域已知的凍干和重構技術。本領域技術人員將理解，凍干和重構可導致不同程度的活性損失，并且可能必須向上調整水平以進行補償。可以施用含有本發明肽配體或其雞尾酒混合物的組合物用于預防性和/或治療性治療。在某些治療應用中，將完成所選細胞群體的至少部分抑制、壓制、調節、殺死或某些其它可測量參數的足夠量定義為“治療有效劑量”。實現該劑量所需的量將取決于疾病的嚴重程度和患者自身免疫系統的一般狀態，但通常每千克體重0.005至5.0mg所選擇的肽配體，更常用0.05至2.0mg/kg/劑量的劑量。對于預防性應用，含有本發明肽配體或其雞尾酒混合物的組合物也可以以相似或稍低的劑量施用。包含根據本發明的肽配體的組合物可以用于在預防和治療環境中幫助改變、滅活、殺死或除去哺乳動物中的選擇性靶細胞群體。此外，本文所述的肽配體可以體外(extracorporeally)或體外(invitro)選擇性使用以從細胞的異質集合物中殺死、消耗或以其它方式有效去除靶細胞群體。來自哺乳動物的血液可以與選擇的肽配體體外組合，由此根據標準技術將不期望的細胞殺死或以其它方式從血液中除去以返回哺乳動物。治療用途本發明的雙環肽具有作為膜1型金屬蛋白酶(mt1-mmp，也稱為mmp14)的高親和力結合劑的特異性用途。mt1-mmp是一種跨膜金屬蛋白酶，其直接通過降解其數種組分并間接通過活化pro-mmp2在細胞外基質重塑中發揮主要作用。mt1-mmp對于腫瘤血管發生至關重要(sounni等人(2002)fasebj.16(6),555-564)，并且在多種實體瘤上過表達，因此本發明的mt1-mmp結合的雙環肽在靶向治療癌癥，特別是實體瘤如非小細胞肺癌中具有特殊用途。在一個實施方案中，本發明的雙環肽對人mt1-mmp是特異性的。在一個進一步實施方案中，本發明的雙環肽對小鼠mt1-mmp是特異性的。在一個更進一步實施方案中，本發明的雙環肽對人和小鼠mt1-mmp是特異性的。在一個更進一步實施方案中，本發明的雙環肽對人、小鼠和狗mt1-mmp是特異性的。根據本發明的方法選擇的多肽配體可用于體內治療和預防應用、體外和體內診斷應用、體外試驗和試劑應用等。具有選擇的特異性水平的配體在其中需要交叉反應性的涉及在非人動物中進行測試的應用中是有用的，或在需要仔細控制與同系物或旁系同源物的交叉反應性的診斷應用中是有用的。在一些應用中，例如疫苗應用，可以利用引發對預定范圍的抗原的免疫應答的能力來定制針對特定疾病和病原體的疫苗。對于哺乳動物施用，優選至少90至95％同質性的基本上純的肽配體，并且對于藥物用途，特別是當哺乳動物是人時，最優選優選98至99％或更高同質性。一旦按需要被純化(部分或同質的)，所選擇的多肽可以在診斷或治療(包括體外)或開發和進行測試程序、免疫熒光染色等中使用(lefkovite和pernis,(1979和1981)immunologicalmethods,volumesiandii,academicpress,ny)。本發明的肽配體的效應子基團和綴合物典型地可用于預防、抑制或治療癌癥，特別是實體瘤如非小細胞肺癌。因此，根據本發明的一個進一步方面，本發明提供本文定義的肽配體的效應子基團和藥物綴合物，其用于預防、抑制或治療癌癥，特別是實體瘤如非小細胞肺癌的用途。根據本發明的一個進一步方面，本發明提供一種預防、抑制或治療癌癥，特別是實體瘤如非小細胞肺癌的方法，其包括向有需要的患者施用如本文定義的肽配體的效應子基團和藥物綴合物。可以治療(或抑制)的癌癥(及其良性對應物)的示例包括但不限于上皮起源的腫瘤(各種類型的腺瘤和癌，包括腺癌、鱗狀癌、移行細胞癌和其它癌)，例如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃腸道癌(包括食管、胃(stomach)(胃部的(gastric))、小腸、結腸、直腸和肛門)、肝癌(肝細胞癌)、膽囊和膽道系統癌、外分泌胰腺癌、腎癌、肺癌(例如腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、細支氣管肺泡癌和間皮瘤)、頭頸部癌(例如舌頭、口腔、喉、咽、鼻咽、扁桃體、唾液腺、鼻腔和鼻旁竇癌)、卵巢癌、輸卵管癌、腹膜癌、陰道癌、外陰癌、陰莖癌、子宮頸癌、子宮肌層癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌(例如甲狀腺濾泡癌)、腎上腺癌、前列腺癌、皮膚和附屬物癌(例如黑素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、角化棘皮瘤、發育異常痣)；血液學惡性腫瘤(即白血病、淋巴瘤)和惡變前血液病和邊緣惡性腫瘤的疾病包括血液學惡性腫瘤和淋巴系統的相關病癥(例如急性淋巴細胞白血病[all]、慢性淋巴細胞性白血病[cll]、b-細胞淋巴瘤如彌漫大b細胞淋巴瘤[dlbcl]、濾泡性淋巴瘤、布基特氏(burkitt’s)淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、t細胞淋巴瘤和白血病、天然殺傷[nk]細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、不確定意義的單克隆丙種球蛋白病、漿細胞瘤、多發性骨髓瘤和移植后淋巴細胞增生性疾病)，以及血液學惡性腫瘤和骨髓系相關病癥(例如急性髓細胞白血病[aml]、慢性髓細胞白血病[cml]、慢性骨髓單核細胞白血病[cmml]、嗜酸細胞增多綜合征、骨髓增生性疾病如紅細胞增多癥、原發性血小板增多癥和原發性骨髓纖維化、骨髓增生綜合征、骨髓增生異常綜合征和早幼粒細胞性白血病)；間葉細胞源的腫瘤，例如軟組織、骨和軟骨的肉瘤如骨肉瘤、纖維肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因氏肉瘤、滑膜肉瘤、上皮樣肉瘤、胃腸道間質瘤、良性和惡性組織細胞瘤、和隆突性皮膚纖維肉瘤；中樞或周圍神經系統的腫瘤(例如星形細胞瘤、神經膠質瘤和成膠質細胞瘤、腦膜瘤、室管膜瘤、松果體瘤和神經鞘瘤)；內分泌腫瘤(例如垂體腫瘤、腎上腺腫瘤、胰島細胞腫瘤、甲狀旁腺腫瘤、良性腫瘤和甲狀腺髓樣癌)；眼和附屬器腫瘤(例如成視網膜細胞瘤)；生殖細胞和滋養細胞腫瘤(例如畸胎瘤、精原細胞瘤、無性細胞瘤、水泡狀胎塊和絨毛癌)；和兒科和胚胎腫瘤(例如成神經管細胞瘤、神經母細胞瘤、維耳姆斯瘤和原始神經外胚層腫瘤)；或先天性或其它綜合癥，其使患者易患惡性腫瘤(例如著色性干皮癥)。本文引用術語“預防”涉及在誘導疾病之前施用保護性組合物。“抑制”是指在誘導事件之后但在臨床出現疾病之前施用組合物。“治療”涉及在疾病癥狀明顯后施用保護性組合物。可用于篩選肽配體在保護或治療疾病中的有效性的動物模型系統是可用的。通過本發明促進了動物模型系統的使用，本發明允許開發可與人和動物靶標交叉反應的多肽配體，以允許使用動物模型。下面參照以下實施例進一步說明本發明。實施例材料和方法噬菌體選擇如heinis等人(2009),natchembiol5(7),502-507、wo2009/098450、wo2013/050615和wo2013/050616中所述，產生6x6雙環噬菌體文庫。使用所述6x6噬菌體文庫針對生物素化的人mt1-mmp血紅素結合蛋白結合域進行噬菌體展示選擇。蛋白質表達使用pexpr-iba42(iba)表達載體，將mt1-mmp血紅素結合蛋白樣重復序列(也稱為mt1-mmp血紅素結合蛋白結構域)，來自人類基因的殘基cys319-gly511在hek293細胞中瞬時表達，作為分泌型n末端his6標記的可溶性蛋白。表達后，通過鎳-nta親和層析法純化蛋白質，然后進行凝膠過濾，并通過sds-page檢測純度。還通過熒光熱轉移實驗，在存在/不存在血紅素結合蛋白結構域結合雙環的情況下，監測批次間的變化性。肽合成基于fmoc化學法進行肽合成，使用由peptideinstruments制造的symphony肽合成儀和multisyntech制造的syroii合成儀。采用標準的fmoc-氨基酸(sigma，merck)，其具有以下側鏈保護基：arg(pbf)、asn(trt)、asp(otbu)、cys(trt)、giu(otbu)、gln(trt)、his(trt)、lys(boc)、ser(tbu)、thr(tbu)、trp(boc)、和tyr(tbu)(sigma)。偶聯劑為hctu(pepceuticals)，采用二異丙基乙基胺(dipea，sigma)作為堿，并用dmf中20％的哌啶(agtc)實現脫保護。使用0.37mmol/grfmoc-rink酰胺am樹脂(agtc)進行合成，使用四倍過量的fmoc-氨基酸，并且堿相對于氨基酸四倍過量。將氨基酸以0.2m溶解于dmso中，hctu以0.4m溶解于dmf中，dipea以1.6m溶解于n-甲基吡咯烷酮(alfaaesar)中。條件使得偶聯反應物包含在dmf中20至50％的dmso中，這在固相合成期間減少聚集和缺失并提高產率。偶聯時間一般為30分鐘，并且脫保護時間為2×5分鐘。將fmoc-n-甲基甘氨酸(fmoc-sar-oh，merck)偶聯1小時，并且隨后的殘基的脫保護和偶聯時間分別為20分鐘和1小時。合成后，用二氯甲烷洗滌樹脂并干燥。使用10ml95:2.5:2.5:2.5v/v/v/wtfa/h2o/ipr3sih/二硫蘇糖醇，進行從載體上的側鏈保護基團的裂解3小時。裂解后，通過過濾除去用過的樹脂，并將濾液加入至35ml已經于-80℃冷卻的乙醚中。將肽球狀物離心，棄去乙醚上清液，并將肽球狀物用冷乙醚洗滌兩次以上。然后，將肽重新溶解于5-10ml的乙腈-水中并凍干。取出少量樣品用于通過質譜(maldi-tof，voyagerde來自appliedbiosystems)分析粗產物的純度。凍干后，將肽粉末吸收于補充有0.5ml1m的二硫蘇糖醇的10ml6m胍鹽酸鹽的水溶液中，并加載于c8luna制備型hplc柱(phenomenex)上。用0.1％的七氟丁酸酸化溶劑(h2o，乙腈)。使用gilson制備型hplc系統，梯度為15分鐘內30-70％乙腈，流速為15-20ml/min。合并含有純線性肽材料(通過maldi鑒定)的級分，并用1,3,5-三(溴甲基)苯(tbmb，sigma)修飾。為此，將線性肽用h2o稀釋至～35ml，加入～500μl100mmtbmb的乙腈溶液，并用5ml1mnh4hco3的水溶液引發反應。反應在室溫進行～30-60分鐘，并且一旦反應完成(用maldi判斷)即可凍干。凍干后，如上所述純化修飾的肽，同時用geminic18柱(phenomenex)替換lunac8，并將酸變為0.1％三氟乙酸。合并含有正確tmb修飾材料的級分，凍干，置于-20℃保存。除非另有說明，所有的氨基酸均使用l-構型。在固相肽合成期間，使用受保護的前體dota(tbu)3(tci，cas137076-54-1)將dota偶聯至肽鏈上。使用如上所述的一般方法將非天然氨基酸合并入肽序列。本文中采用的非天然氨基酸前體列表總結在下表中：用于藥代動力學研究的肽從0.1％tfa水溶液中凍干，得到化合物的tfa鹽或游離酸。使用17-69-07-n219作為前體雙環肽合成bdc使用17-69-07-n219作為前體肽，合成兩種雙環藥物綴合物(bdc)。將活化的vcmmae或二硫化物-dm1構建體(溶解在dmso中)在水性條件(100磷酸鈉ph8)中以1.4×過量直接與17-69-07-n219綴合(參見方案i和ii)。濃度為9mg/ml肽或更高濃度。反應后進行lc/ms，并在3.5小時后判斷為完成。然后使用c18半制備柱進行標準反相純化。分離純度大于95％的級分并凍干。這些材料不含有可測量的游離毒素。對于體外和體內研究，將凍干粉末吸收為濃縮的dmso儲存液(100mg/ml)，并在適當的緩沖液中稀釋以供進一步使用。使用17-69-07-n241作為前體雙環肽合成bdc對于bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的合成，使用二硫化物美登木素生物堿類的以下n-羥基琥珀酰亞胺酯(nhs酯)：其中r1、r2、r3、r4、m和n分別如本文之前對于bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的式(v)a、(v)b、(v)c、(v)d的化合物的定義。bt17bdc-18進一步通過如下文和方案iii所述的可替代路線合成。這里，通過將17-69-07-n241與spp(n-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯)在dmso中反應合成17-69-07-n277。于室溫，17-69-07-n241的濃度為10mm或更高，具有1.3倍過量的spp和20倍過量的二異丙基乙基胺。1小時后，通過lcms判斷反應完成。如上所述通過反相進行純化。將適當的級分凍干。在氮氣層下，于室溫，17-69-07-n277在半水性條件(補充有2mmedta的50％二甲基乙酰胺和50％100mm乙酸鈉ph5.0)中與1.15當量dm1(作為游離硫醇)進行二硫鍵交換21小時。反應中17-69-07-n277的濃度為10mm或更高。然后使用c18半制備柱進行標準反相純化。分離純度大于95％的級分并凍干。材料不含有可測量的游離毒素。對于體外和體內研究，如上所述將凍干粉末溶解于水性制劑中，或直接吸收于適當的緩沖液中。雙環結合物對mt1-mmp的解離速率常數測定直接結合熒光偏振(各向異性)試驗直接結合熒光偏振或各向異性試驗通過用其結合配對體(本文為mt1-mmp血紅素結合蛋白結構域)滴定恒定濃度的熒光示蹤劑(本文為待研究的熒光雙環肽)進行。隨著滴定過程中結合配對體的濃度增加，極化信號與結合和未結合材料的份數成比例變化。這允許定量地確定解離速率(kd)。試驗數據可以使用標準配體結合方程擬合。典型地，示蹤劑的理想濃度遠低于示蹤劑的kd：滴定劑對，并且所選擇的濃度通常為～1nm或更小。滴定劑(結合配對體)濃度從0.1nm變化至典型的5μm。選擇該范圍使得可以觀察到熒光偏振的最大變化。采用的緩沖液是在0.01％吐溫存在下的磷酸鹽緩沖鹽水。實驗在黑色384孔低結合/低體積板(corning3820)中進行，并且使用bmgpherastarfs平板讀數器測量熒光偏振信號。本文中提及的熒光示蹤劑是已經使用5,6-羧基熒光素熒光素化(fluoresceinated)的雙環肽。可以在肽的n末端氨基上進行熒光素化，所述肽通過肌氨酸間隔子(通常為sar5)與雙環核心序列分隔。這可以在fmoc固相合成期間或如果n末端氨基是肽獨有的，在合成后(用tbmb環化后和純化后)進行。熒光素化還可以在c末端進行，通常在作為第一個c末端殘基引入的賴氨酸上進行，然后通過肌氨酸間隔子(通常為sar6)與雙環核心序列分隔。因此，n末端示蹤劑可以具有描述為fluo-gly-sar5-a(bicyclecoresequence)和(bicyclecoresequence)-a-sar6-k(fluo)用于c末端熒光素化構建體的分子格式。實施例中使用的熒光示蹤劑是a-(17-69)-a-sar6-k(fluo)、a-(17-69-07)-a-sar6-k(fluo)、和a-(17-69-12)-a-sar6-k(fluo)。由于17-69熒光肽的酸性性質，其典型地以濃縮的dmso儲備液制備，由此在100mmtrisph8緩沖液中制備稀釋液。使用熒光偏振(各向異性)的競爭試驗由于其對mt1-mmp血紅素結合蛋白結構域(pex)的高親和力，17-69-07和17-69-12的熒光素化衍生物(分別表示為17-69-07-n040和17-69-12-n005)可用于競爭實驗(使用fp進行檢測)。本文中，用游離的、非熒光素化雙環肽滴定pex與熒光pex結合示蹤劑的預先形成的復合物。由于預期所有基于17-69的肽在相同的位點結合，所以滴定劑將從pex置換熒光示蹤劑。可以定量地測量復合物的解離，并確定競爭者(滴定劑)對靶蛋白的kd。競爭方法的優點是可以準確和快速地確定非熒光素化雙環肽的親和力。示蹤劑的濃度通常為kd或以下(本文中為1nm)，并且結合蛋白(本文中為mt1-mmp的血紅素結合蛋白)為15倍過量，使得結合了>90％的示蹤劑。隨后，滴定非熒光競爭劑雙環肽(通常僅僅是雙環核心序列)，使得其從靶蛋白置換熒光示蹤劑。測量示蹤劑的置換并與熒光偏振的下降相關聯。熒光偏振的降低與非熒光滴定劑結合的靶蛋白的份數成比例，因此是測量滴定劑對靶蛋白的親和力。原始數據適合于描述熒光示蹤劑、滴定劑和結合蛋白之間平衡的三次方程的解析解。擬合需要熒光示蹤劑對靶蛋白的親和力的值，其可以通過直接結合fp實驗單獨確定(參見前面的部分)。使用sigmaplot12.0進行曲線擬合，并使用zhi-xinwang(febsletters360(1995)111-114)描述的方程式的改編版本。血漿穩定性分析方法1：開發了采用質譜檢測(maldi-tof，voyagerde，appliedbiosystems)母體質量以及其血漿-蛋白酶誘導的片段的快速血漿穩定性分析測定。通過評估片段的性質，可以確定優選的裂解位點。本文中，將1-1.5mm肽儲備液(dmso中)直接稀釋到小鼠/大鼠/人血漿(sera實驗室，使用檸檬酸鹽作為抗凝血劑)中，得到最終濃度為50μm肽，并且于37℃孵育長達48小時。在適當的時間點取5μl樣品，并在-80℃冷凍。用于分析，將樣品除霜，與25μl的3:3:1乙腈:甲醇:水混合，并于13k離心5分鐘。吸出5μl含肽的上清液，并與在乙腈:h2o的1:1混合物中的30mm碳酸氫銨混合。然后將其中1μl點在maldi板上，干燥，并將matrix(α-氰基肉桂酸，sigma，制備成含有0.1％三氟乙酸的1:1乙腈:水中的飽和溶液)層鋪在樣品(1μl)上，干燥，并使用malditof分析。應當注意，這是一種定性試驗用于檢測不同雙環肽序列之間血漿穩定性的對比變化，并且作為確定優選的裂解位點的優異工具起作用。方法2：為了定量獲得雙環肽的血漿穩定性，將肽儲備液(dmso中200μm)與血漿(人或小鼠)混合，使得最終濃度為10μm。長達8小時定期取出40μl樣品，并在-80℃冷凍。在lc-ms分析之前，將樣品除霜，并與3體積(本文中為120μl)1:1乙腈/meoh水混合。將乳狀混懸液以13000rpm離心30分鐘，并使用watersxevotq-d儀器定量含肽的上清液的雙重/三重帶電荷物質和其ms/ms片段，同時使用同一肽的血漿提取標準曲線作為參考。血漿中降解的半衰期用于評估分子的對比穩定性。17-69-07在小鼠中的藥代動力學，代謝物鑒定17-69-07-n004的藥代動力學使用雙環肽17-69-04-n004獲得小鼠藥代動力學，其作為1.19mg/ml溶液的5ml/kg推注，以單次靜脈注射5.925mg/kg劑量給予一組12只雄性cd1小鼠。從100μl23.7mg/mldmso儲備液中制備配制的溶液，所述儲備液在給藥之前立即用1.9ml磷酸鹽緩沖鹽水稀釋，得到由ph7.4的pbs中的5％dmso組成的空白載體。經終端麻醉下的心臟穿刺，于給藥后0.08、0.5、1、2和4小時，在每個時間點從兩只動物取血樣，并轉移到edta管中進行血漿生成。血漿樣品立即冷凍在-20℃。用于分析，將樣品快速解凍，并用3體積的提取溶劑(2:9:9的10mm碳酸氫銨，ph8、乙腈和甲醇的混合物，含有分析內標)處理50μl等分試樣。通過離心除去沉淀的蛋白，并通過lc-ms/ms分析上清液。樣品的定量參考在對照小鼠血漿中制備的校準線。使用summitresearchservices的軟件包pksolutions2.0，通過非房室分析測定藥代動力學參數。術語的定義：cmax：最大測量濃度；tmax：測量到最大濃度的時間；auc0-t：從0分鐘到最后的可量化數據點的血漿藥物濃度/時間曲線下面積；和auc0-∞：從0分鐘基于終末半衰期外推到超出最終數據點的血漿藥物濃度/時間曲線下的面積。小鼠血漿中雙環肽代謝物的鑒定可以使用三種血漿樣品(0.5、1和2小時)分析17-69-07-n004的潛在小鼠體內代謝物。通過hplc-ms和帶有ltqorbitrapxl質譜儀的hplc-ms/ms進行分析。在血液循環中尋找肽代謝物的方法是計算假定代謝物的精確質量(10ppm窗)(加入1或2滴水(+18，+36)分別用于環1和/或環2的裂解；然后從環1和/或環2丟失單個氨基酸或丟失氨基酸的延伸)。其次，通過與空白小鼠血漿比較總離子色譜圖進行手動搜索。bt17bdc-1和bt17bdc-9在ht-1080異種移植小鼠中的功效用bdc或空白載體(pbs)處理攜帶皮下ht-1080異種移植腫瘤的balb/c裸鼠。給予bdc每周3次持續2周，當腫瘤測量約150-200mm3時開始給藥。監測小鼠，每周記錄3次腫瘤體積和體重的測量值。實施例1：使用mt1-mmp血紅素結合蛋白結構域鑒定具有高親和力的雙環肽采用先前建立的生成雙環肽噬菌體文庫的方法，對人mt1-mmp的血紅素結合蛋白結構域進行選擇。采用連續降低濃度的靶標從天然文庫進行三輪選擇后，對輸出進行測序。雙環肽17-69(cknrgfgcedfydic)(seqidno：16)被鑒定為最豐富的序列輸出之一，并且通過α篩選(alphascreen)驗證了與靶標的定性結合。產生了三個小噬菌體文庫，提供17-69序列的3個部分的全序列覆蓋。對這三個文庫進行兩輪針對血紅素結合蛋白的選擇。有趣的是，最有希望的序列輸出是5×6雙環肽，而起始文庫是6×6格式。由于雙環肽對靶蛋白的較高親和力，可能選擇較短的環長度。更短的環長度是由于在構建噬菌體文庫期間合并入的不正確合成的引物導致的。主要序列輸出是肽17-69-07，其具有序列cynefgcedfydic(seqidno：2)。基于觀察到5×6格式顯示最有成效，并且需要5×6結合物之間的區別，產生另外兩個文庫來測試產生雙環肽17-69-02、17-69-03、17-69-04和17-69-12的第一個環的有意截斷。這些包含在圖8中公開的序列中。某些殘基的傾向是明顯的，盡管結合試驗不能區分最佳結合物之間的區別因為它們已經達到測試上限。使用α篩選測試最常發生的序列的血紅素結合蛋白結合，其中所有信號高于原始17-69序列(參見表1)：表1：使用本發明的雙環肽的血紅素結合蛋白結合測試由于所有基于17-69的親和力成熟克隆產生接近測試上限的信號，表1所示的圖不允許明確鑒定最佳克隆。因此，一些肽被合成為熒光素化衍生物(17-69、17-69-07和17-69-12)，并用于直接結合熒光偏振(fp)實驗。本文中，熒光素通過連接子(通常為sar6)與雙環序列分隔，位于核心序列的n或c末端(表2)。表2：直接結合熒光偏振(fp)實驗的結果17-69-07和17-69-12的熒光素化衍生物(表示為17-69-07-n040和17-69-12-n005)分別顯示出0.52和3.1nm解離速率的強結合。它們比原來非成熟的17-69序列(17-69-n004)顯著改善。似乎包含5×6格式的序列在親和力成熟文庫的情況下誘導高親和力。由于它們對mt1-mmp血紅素結合蛋白結構域(pex)的高親和力，17-69-07和17-69-12的熒光素化衍生物(表示為17-69-07-n040和17-69-12-n005)用于隨后的競爭實驗(使用fp進行檢測)。本文中，用游離的、非熒光素化雙環肽滴定pex與熒光pex結合示蹤劑的預形成復合物。由于預期所有基于17-69的肽(含有保守的第二環基序cedfydic；seqidno：17)在相同的位點結合，所以滴定劑將從pex置換熒光示蹤劑。可以定量測定復合物的離解，并確定競爭者(滴定劑)的kd。競爭方法的優點是可以準確和快速地確定非熒光素化雙環肽的親和力。在這種情況下，重要的是要驗證17-69-07和17-69-12核心序列對pex的高親和力負全部責任。因此，肽被合成為具有n和c末端丙氨酸的變體，從而密切地模擬噬菌體顆粒上表達的序列，但缺少與熒光素化構建體一起使用的sar5/6分子間隔子。通過競爭實驗確定的親和力與用熒光素化衍生物獲得的親和力幾乎相同，明確地證明核心雙環序列負責與pex的高親和力結合(表3)。此外，熒光素化構建體顯示分子間隔子和效應子基團(本文中作為-a-sar6-k(熒光素))的c-末端連接是可以耐受的。表3：直接結合熒光偏振(fp)實驗的結果實施例2：17-69-07核心序列的蛋白水解穩定性17-69-07的小鼠血漿穩定性對于人類的治療應用和對于動物物種的臨床前評估，先導雙環肽在靜脈內施用后在循環中足夠穩定是相關的。需要足夠的穩定性，使得足夠水平的雙環肽可以與其靶標結合并發揮其生物學功能。臨床前模型通常采用如小鼠、大鼠、兔和食蟹猴等物種。首先，使用本文如上所述的方法(方法2)，在小鼠血漿的存在下，評估雙環肽17-69-07-n219的穩定性。雙環核心序列保留17-69-07序列的原始天然蛋白原性氨基酸，并且還包含用于與效應子基團綴合的n末端分子間隔子(序列：g-sar10-acynefgcedfydic；seqidno：20)。盡管存在分子間隔子，但保留了17-69-07-n219對pex的親和力(kd＝0.82nm)。該化合物在離體小鼠血漿中顯示出適度的穩定性，半衰期為6小時(參見圖1)。鑒定17-69-07的離體/體內蛋白水解切割位點為了了解小鼠血漿中17-69-07-n219降解的化學性質，使用maldi-tof分析樣品的任何潛在的降解產物。質譜顯示可能的酪氨酸損失，這意味著開環(水解)和環1中tyr1和/或環2中tyr9中的去除。使用最小雙環肽17-69-07-n004(ac-cynefgcedfydic(seqidno：2)，其構成17-69-07的最小核心雙環肽)進行小鼠藥代動力學(pk)研究以確定體內循環的清除率和消除率。進一步分析所得血液樣品，并分析血漿樣品中17-69-07-n004的任何潛在的蛋白水解降解產物。pk圖示于圖2。表4:17-69-07-n004的藥代動力學參數nc：由于有限的數據而未計算表4顯示肽的消除半衰期為14分鐘，并且以20.7ml/min/kg清除。清除率大于在小鼠中觀察到的腎小球濾過率(qi等人,americanjournalofphysiology-renalphysiology(2004)vol.286no.3,f590-f596中總結)，表明肽被另外的方式，例如由血漿和內皮蛋白酶驅動的蛋白水解清除。為了解決體內蛋白水解是否明顯有助于清除，使用lc-ms/ms技術，使在t＝0.5、1和2小時采集的血漿樣品經歷雙環片段的靶向分析。可以鑒定多種蛋白水解代謝物，并且具有最強信號的片段在下面降序列出：ac-ciynefgciiedfydiciii(seqidno：2)：環1中切除yne；環1中切除ynef(seqidno：21)；環1中切除ynefg(seqidno：22)(去除全部環)；環1和/或2中切除y；環2中切除yd；環2中切除fyd；環2中切除ydi；和環2中切除edfydi(seqidno：23)(去除全部環)。前三種代謝物以中等信號水平存在，而剩余的片段只能以痕量檢測。總之，離體和體內代謝物顯示集中于tyr1/9處或附近的初始裂解，隨后連續除去附近的殘基。這最終導致完整的一個或兩個環的去除。17-69-07序列的蛋白水解穩定性和效力增強穩定肽序列免于蛋白水解降解的方法很多(論述參見gentilucci等人,curr.pharmaceuticaldesign,(2010),16,3185-203，和nestor等人,curr.medicinalchem(2009),16,4399-418)，和wo2009/098450、wo2013/050615和wo2013/050616)。簡言之，它們包括對蛋白酶提供識別位點的氨基酸的取代，切割位點處的氨基酸骨架的改變(即n-甲基化，偽肽鍵等)，鄰近的鍵的空間位阻(即β-取代的氨基酸)，和包含d-對映體氨基酸。這些修飾(即n-甲基化，d-氨基酸)中的一些可以保護/屏蔽蛋白水解切割位點免于水解，即使它們位于遠離切割位點的兩個殘基。盡管保護序列免受蛋白水解攻擊是相對直接，但合并入不會顯著改變對于靶蛋白的效力(和特異性)的穩定的變化更具挑戰性。從前面部分顯示的17-69-07的離體/體內蛋白水解降解數據可以看出，tyr1/9和鄰近的殘基是穩定雙環肽的潛在位點。評估肽的成功穩定化的定量方法是通過增加其在小鼠和人血漿中的半衰期。首先，產生17-69-07的11個衍生物，其中每個位置被丙氨酸替代(稱為“丙氨酸掃描”)。這種類型的信息對某些殘基的能量貢獻和作用提出建議，并可能除去蛋白水解識別位點。表5：丙氨酸掃描結果17-69-07-n004是野生型，含有封端的n末端(n末端乙酰化，稱為“ac”)的未修飾的肽。一些ala取代被良好耐受，特別是在序列中的第1、3、4、10和11位。由于這些殘基的側鏈對于與靶標的高親和力結合不是必需的，所以在這些特定序列位置的式(i)的化合物被廣泛地定義。這使得殘基1(tyr1)的取代是非常有吸引力的可能性，因為它可以去除蛋白水解識別位點之一。用ala5取代gly5是有意義的，因為化學變化較小(加入甲基)，但產生顯著降低的效力。gly5可能采用在普通拉氏圖(ramachandronchart)外的不尋常的phi/psi角度，這些角度可能是由d-氨基酸誘導。另外的益處是鄰近該位點的肽鍵的穩定化。為此，進行部分d-丙氨酸掃描以評估它們是否在效力維持方面是耐受的：由于它們的蛋白水解穩定作用，在序列中包含d-氨基酸是非常需要的。表6：用d-丙氨酸取代第一環中的殘基的作用d-ala1代替tyr1以比野生型少10倍的親和力結合。然而，令人感興趣的是蛋白水解識別位點tyr1被去除并被穩定的氨基酸替代，卻不引起效力的重大損失。值得注意的是，用d-ala5取代gly5是良好耐受的，因為與野生型相比的親和力保持不變。在此情況下，d-arg5也被耐受(并且可能因此除了d-pro之外的所有d-氨基酸，參見表6)，如果物理化學性質在分子的進一步開發期間需要改變，則這可能是有意義的(表7)。表7：在5位取代殘基的作用肽編碼分子描述kd(nm)17-69-07-n004ac-(17-69-07)(野生型)2.47±0.2517-69-07-n018ac-(17-69-07)ala5>500017-69-07-n058ac-(17-69-07)d-ala52.37±0.8617-69-07-n120ac-(17-69-07)d-arg54.24±1.48接下來，由于噬菌體選擇輸出顯示對序列的4位處的疏水性和芳香族氨基酸的一定偏好，合成了一系列衍生物，其中合并入選擇的芳香族氨基酸，包括天然酪氨酸和色氨酸(表8)。表8：在4位取代殘基的作用肽編碼分子描述kd(nm)17-69-07-n004ac-(17-69-07)(野生型)2.47±0.2517-69-07-n057ac-(17-69-07)tyr41.78±0.4517-69-44-n002ac-(17-69-07)trp40.75±0.2317-69-07-n067ac-(17-69-07)1nal40.36±0.1217-69-07-n068ac-(17-69-07)2nal40.7±0.1917-69-07-n065ac-(17-69-07)chg4>500017-69-07-n071ac-(17-69-07)phg462817-69-07-n072ac-(17-69-07)tbugly4>500017-69-07-n137ac-(17-69-07)3,4-dcphe41.85±2.4517-69-07-n139ac-(17-69-07)cha436217-69-07-n140ac-(17-69-07)hphe443.31nal：1-萘基丙氨酸；2nal：2-萘基丙氨酸；chg：環己基甘氨酸；phg：苯基甘氨酸；tbugly：叔丁基甘氨酸；3,4-dcphe4：3,4-二氯苯丙氨酸；cha：環己基丙氨酸；和hphe：高苯丙氨酸。與野生型相比，4位處的數個取代增加親和力，這些包括酪氨酸、色氨酸、1和2-萘基丙氨酸(1/2nal)和3,4-二氯苯丙酸(3,4-dcphe)。最有效的取代是1-萘基丙氨酸，其增強7倍親和力。為了提高分子的穩定性，檢查了17-69-07環2中的某些殘基。這些包括殘基9，其含有潛在的tyr9識別位點。殘基11也是有吸引力的，因為它允許取代(表5)并與tyr9識別位點相鄰。表9：耐受的氨基酸取代的總結肽編碼分子描述kd(nm)17-69-07-n004ac-(17-69-07)(野生型)2.47±0.2517-69-07-n130ac-(17-69-07)4brphe92.45±1.0817-69-07-n182ac-(17-69-07)5fphe913.117-69-07-n100ac-(17-69-07)tbugly111.56±1.14感興趣的是4-溴苯丙氨酸(4brphe)，其改變tyr9蛋白水解識別位點，和叔丁基甘氨酸(tbugly)，其略微增強親和力和重要地，其通過空間位阻強烈保護鄰近氨基酸骨架不被蛋白水解。17-69-07的多位點取代實現總體蛋白水解保護前面的部分公開了允許包含蛋白水解穩定和/或親和力增強的氨基酸的17-69-07序列中的多個位置。為了在單個分子中組合這些修飾，合成了一個分子，其中合并入tyr1→d-ala1、phe4→1萘基丙氨酸4、gly5→d-ala5、tyr9→4brphe9和ile11→tbugly11取代。值得注意的是，所有的修飾是一致耐受的，并且效力優于野生型分子的效力(表10和11)。表10：特異性多取代的結果預期在分子的進一步開發期間將效應子基團連接至這樣的雙環肽上，用n末端肌氨酸分子間隔子(10個連續的sar，表示為sar10)產生各版本，所述間隔子用n末端甘氨酸起始和用c末端丙氨酸終止。為了本實驗的目的，將n末端gly用乙酰基封端，以除去正電荷。表11：g-sar10-a加入后的對比數據數據表明，分子間隔子(如所示與n末端連接)和雙環核心序列內的氨基酸取代均被良好地耐受，因為效力被保留或改善。表12顯示了表11所示分子的非乙酰化(非)穩定化衍生物。在小鼠和人血漿中定量評估其穩定性，以證明與非穩定化的17-69-07-n219相比有改善(圖1)。表12：用于血漿穩定性評估所選擇的分子，相關的效力圖3a顯示與原始的非穩定的野生型分子17-69-07-n219相比，五取代和四取代分子17-69-07-n244和17-69-07-n231分別的小鼠血漿穩定性。于37℃，肽在小鼠血漿中的半衰期為>>20小時，而非增強型野生型分子為6小時。圖3b顯示與原始的非穩定的野生型分子17-69-07-n219相比，五取代和四取代分子17-69-07-n244和17-69-07-n231分別的人血漿穩定性。于37℃，肽在小鼠血漿中的半衰期為>>20小時，而非增強型野生型分子為6小時。總之，在17-69-07雙環核心序列(tyr1→d-ala1、phe4→1萘基丙氨酸4、gly5→d-ala5、tyr9→4brphe9和ile11→tbugly11)中多達5個位置的靶向取代產生具有增強的效力和顯著改善血漿穩定性的優異分子。穩定的17-69-07衍生物(17-69-07-n241)的選擇性通過fp競爭測試了穩定的、含有衍生物17-69-07-n241的分子間隔子對于來源于其它物種的mt1-mmp血紅素結合蛋白結構域的親和力。數據總結在表13中：表13：17-69-07和衍生物的物種交叉反應性人/食蟹猴(kd,nm)狗(kd,nm)小鼠(kd,nm)17-69-07-n2190.820.9nd17-69-07-n2411.211.40.6317-69-07的非穩定和穩定的衍生物均是完全交叉反應的。針對相關的人金屬蛋白酶測試17-69-07-n241的n末端熒光素化衍生物(稱為17-69-07-n258，序列為：熒光素-(bala)-sar10-a-(17-69-07)d-ala11nal4d-ala5tbugly11)。數據證明17-69-07核心序列和這種穩定的變體對于mt1-mmp是獨特的選擇性(表14)。表14：17-69-07和衍生物對于相關金屬蛋白酶的選擇性實施例3：與螯合劑綴合的17-69-07的蛋白水解穩定變體的體內分析與金屬螯合劑連接的肽在診斷和治療中具有多種應用。某些成像或治療放射性同位素可以“負載”到螯合劑上，而肽將所述同位素攜帶到靶標。以這種方式，可以使用例如pet和spect掃描儀來可視化腫瘤特異性抗原。對于靶向放射治療，將治療性放射性核素(如90y和177lu)加載到螯合劑-肽上，并通過結合腫瘤相關抗原選擇性地攜帶到腫瘤中。在那里，他們通過發射的高能量輻射發揮其抗腫瘤活性。螯合物連接的17-69-07雙環肽的合成合成了五種衍生物，其中金屬螯合劑dota(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)與17-69-07雙環肽的n-末端丙氨酸連接。表15：分子和結構的總結17-69-07-n144是17-69-07的野生型序列，其中dota直接連接到用作一個氨基酸間隔子的n-末端丙氨酸。該分子保持對mt1-mmp的完全效力。為了證明在負載治療/成像放射性核素時保留效力，用天然(冷)175镥負載螯合劑作為安全取代物。保留效力。完全穩定的變體，17-69-07-n248也在dota綴合物的情況中保留效力。制備對照分子17-69-07-n246，其為17-69-07-n144的完全d-氨基酸等價物。該分子對蛋白水解降解完全耐受，因為與d氨基酸相鄰的酰胺鍵被保護免受蛋白酶水解，并且其沒有對mt1-mmp的任何活性。重要的是，該肽保留了完全相同的序列和化學成分。177lu負載的17-69-07-n144在ht1080異種移植小鼠中的生物分布將ht-1080細胞(已知豐富表達mt1-mmp)皮下接種至雄性6周齡balb/cnu/nu小鼠的右側軀干中。使腫瘤生長約1周。使用標準絡合技術，用1mbq的γ-和β-發射體177lu負載150皮摩爾的17-69-07-n144肽。每個荷瘤小鼠，然后注射150皮摩爾負載的17-69-07-n144(相當于17μg/kg)。每個時間點對3只動物進行安樂處死，各種器官和腫瘤切除并稱重，隨后確定每克腫瘤/器官組織的γ輻射計數。得到的圖給出了肽在體內小鼠中的定位的定量指征。特別地，ht1080腫瘤中的選擇性積累表明體內mt1-mmp結合。圖4總結了生物分布數據。值得注意的是，雙環肽對于腫瘤是特異性的，并且似乎持續長達24小時，盡管預測的循環半衰期為14分鐘。這可能表明攝入腫瘤細胞。在腎臟中顯著的定位是可見的，并且這可能是由于腎臟氨基酸轉運體瞬時結合肽。所有其他器官未顯示對分子的顯著吸收。值得注意的是，小鼠血紅素結合蛋白結構域與人類配對物具有完全同源性，表明如果小鼠pex在其它地方表達，則會觀察到相應的信號。為了評估異種移植模型中的腫瘤攝取是否是選擇性的并且由于pex結合，使用肽17-69-07-n246進行另外的研究，該肽是17-69-07-n144的d-氨基酸配對物(圖5)。比較生物分布模式與用活性雙環肽17-69-07-n144獲得的生物分布模式，顯然mt1-mmp非結合17-69-07-n246雙環肽不靶向腫瘤，證實了17-69-07-n144的腫瘤信號由體內mt1-mmp靶標結合驅動。最后，為了評估17-69-07序列的蛋白水解穩定對生物分布的影響，在相同的生物分布研究中采用雙環肽17-69-07-n248(dota-a-(17-69-07)d-ala11nal4d-ala54brphe9tbugly11)(圖6)。令人驚奇的是，與17-69-07-n144相比，肽的增強的蛋白水解穩定性在任何給定時間點導致腫瘤攝取的整體倍增，例證與原始的、非穩定化17-69-07序列相比分子的優異性質。預期這種效果可以產生有利的治療指數，無論是使用本實施例中描述的綴合物的放射性核素靶向治療，還是使用毒素-綴合的雙環肽(實施例4)的情況中的放射性核素靶向治療。實施例4：非穩定化雙環肽與細胞毒素的綴合對于靶向癌癥治療，高度有效的細胞毒性藥物通過可裂解的連接子連接到靶向實體(本文中為雙環肽)，其結合腫瘤相關細胞表面表達的蛋白質。由于其內化到細胞內部的能力，選擇過表達腫瘤相關的細胞表面蛋白靶標。當細胞毒性劑-綴合的靶向實體與腫瘤相關細胞表面蛋白結合時，整個分子復合體內化到細胞內部。在從全身循環過渡到不同的細胞內環境之后，細胞毒素藥物通過細胞內條件從靶向實體裂解，然后裂解的藥物通過細胞周期停止和其后的細胞凋亡誘導靶向細胞死亡，而發揮其抗腫瘤活性。雙環肽17-69-07-n219(參見實施例2和3)由在n-末端側連接至gly-sar10-ala分子間隔子(g-sar10-a-(17-69-07),其中完整序列描述是g-sar10-a-cynefgcedfydic；seqidno：20)的野生型雙環核心序列組成。(17-69-07)的該衍生物在0.8nm的kd保持對mt1-mmp的完全效力(表12)。分子間隔子的n末端側的游離的、獨特的氨基被理想地放置以與效應子基團如高效細胞毒性物質綴合。采用在n末端gly的綴合位點和雙環核心序列上之間的sar10連接子施加長的分子間距離，以保證與具有顯著分子大小的效應子基團的綴合后的靶標結合效力的完全保留。只要保持雙環核心序列對靶蛋白的效力，可以隨意選擇較短的分子間隔子。為了用靶向mt1-mmp的雙環肽藥物綴合物(稱為bdc)產生概念數據的證明，制備了17-69-07-n219的兩種綴合物，其使用微管聚合抑制毒素dm1(美登素，也稱為n2'-去乙酰基-n2'-(3-巰基-1-氧代丙基)-美登素)或mmae(單甲基奧里斯他汀e，也稱為(s)-n-((3r,4s,5s)-1-((s)-2-((1r,2r)-3-(((1s,2r)-1-羥基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-n,3-二甲基-2-((s)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺基)丁酰胺)。mmae綴合物稱為bt17bdc-1，并通過包含自我犧牲的對氨基芐基-羰基(pabc)基團的纈氨酸-瓜氨酸(val-cit)連接子與17-69-07-n219前體分隔。val-cit連接子通過在細胞內溶酶體中遇見的富含組織蛋白酶b的環境選擇性地裂解(水解)，并且在水解后，pabc犧牲釋放作為活性毒性物質的mmae。val-cit-pabc連接子在循環中是穩定的，并且因此僅在細胞內化時釋放毒素。綴合物的結構以及制備bt17bdc-1的合成方案如方案i所示：方案ibt17bdc-1的結構反應方案：用于制備bdc17bdc-1的合成策略：將完全純化的、tmb環化的17-69-07-n219雙環前體與戊二酰基-纈氨酸-瓜氨酸-對氨基芐基羰基-mmae(通常縮寫為vc-mmae或val-cit-pabc-mmae)的琥珀酰亞胺酯反應，得到綴合物bdc17bdc-1。17-69-07-n219的dm1綴合物稱為bt17bdc-9，并通過二硫鍵與17-69-07-n219前體分隔，所述二硫鍵可以通過在細胞內環境中遇到的還原環境而被裂解。據信還原通過細胞內谷胱甘肽發生，細胞內存在～10mm濃度的谷胱甘肽。相比之下，血液循環中谷胱甘肽和游離還原劑的濃度要低得多(<10μm)；因此毒素主要在細胞內環境中釋放，在此其可以展現其細胞殺傷活性。綴合物的結構以及制備bt17bdc-9的合成方案如方案ii所示：方案iibt17bdc-9的結構反應方案：用于制備bdc17bdc-9的合成策略：將含有游離的、n末端胺的完全純化的、tmb環化的17-69-07-n219雙環前體與二硫化物-dm1的琥珀酰亞胺酯(結構如所示)反應，得到綴合物bdc17bdc-9。因此，bdc17bdc-1和bdc17bdc-9中的毒素的釋放在機械上是不同的，即前者通過細胞內的蛋白水解條件，后者通過細胞內的還原條件。兩種bdc用于體外細胞毒性研究，并在細胞培養物如ht1080上顯示低的納摩爾/皮摩爾效力(數據未顯示)。在體內小鼠異種移植模型(攜帶ht1080腫瘤)中，與空白載體對照相比，兩種bdc在注射后9天后引起腫瘤體積的顯著降低。劑量方案如圖7(箭頭)所示。通過觸診判斷，對于兩個bdc在第14天完全清除腫瘤(圖7)。值得注意的是，bdc17bdc-1和bdc17bdc-9的動物體重大部分是穩定的，表明能夠足以用于治療目的治療窗口。實施例5：蛋白水解穩定的雙環肽與細胞毒性劑的綴合含有1位的d-丙氨酸、4位的d-丙氨酸、5位的d-丙氨酸和11位的α-叔丁基甘氨酸修飾的，具有或不具有9位4-溴苯丙氨酸的雙環核心序列17-69-07，可以增強離體血漿和體內的蛋白水解穩定性(實施例2、3)。在雙環藥物綴合物的情況下，由于降低的全身清除率和在蛋白水解侵襲性腫瘤微環境中更大的穩定性，更穩定的雙環核心序列可能導致更大的腫瘤暴露。兩者均可以產生增加的mt1-mmp驅動的bdc向細胞內吸收，導致治療效果的提高。穩定的雙環肽17-69-07-n241被設計為具有與非穩定化的17-69-07-n219(在實施例3和4中描述)整體相似的分子布局。其具有以下序列：(b-ala)-sar10-ac(d-ala)ne(1nal)(d-ala)cedfyd(tbugly)c(seqidno：5)其如前那樣與tbmb環化。選擇n-末端β-丙氨酸而不是如先前在17-69-07-n219中使用的甘氨酸，以便在與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)酯偶聯期間，具體地在本實施例中與細胞毒性劑的nhs酯偶聯(方案i、ii)期間最小化二酮哌嗪副產物形成(purdie等人(1973),j.chem.soc.,perkintrans.2,1845)。如在17-69-07-n219中一樣保留肌氨酸十聚體間隔子，以確保雙環肽與mt1-mmp的血紅素結合蛋白結構域的結合的完全保留。基于實施例4中所描述的小鼠異種移植模型中的功效和耐受性，選擇美登素毒素類與17-69-07-n241綴合，并再次選擇二硫鍵可裂解連接子。制備了四種bdc(本文之前稱為bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20)，其中毒素和17-69-07-n241都是不變的，而二硫鍵對還原/裂解的敏感性通過調節鄰近硫原子的阻礙程度來改變。綴合物的合成路線如方案ii所述，其中17-69-07-n219被17-69-07-n241替換。對于bt17bdc-18，另外的合成路線涉及產生吡啶基-二硫化物雙環前體(稱為17-69-07-n277)，其與dm1反應以形成全綴合物。合成路線描述于方案iii中。方案iiibt17bdc-18的結構反應方案用于制備bdc17bdc-18的合成策略：將含有游離的、n末端胺的完全純化的、tmb環化的17-69-07-n241雙環前體與spp(n-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯))，得到中間體17-69-07-n277。然后將其與作為游離巰基dm1反應，得到所需的綴合物bt17bdc-18。bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的體外表征評估四種bdc的數種體外參數，例如對人類mt1-mmp血紅素結合蛋白結構域的效力的保留，離體小鼠、大鼠和人血漿中的穩定性，以及對還原劑如二硫蘇糖醇的穩定性。數據總結在下表16中：表16：bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的體外性質其中n/a：不適用(notapplicable)，其中n＝重復次數a：使用17-69-07-n040作為示蹤劑，通過熒光偏振競爭實驗確定b：使用定量lc-ms測定。血漿中孵育時間長達24小時，含有4μmbdc。c：來自kellogg等人(2011)bioconjugatechemistry,22,717。請注意，這些值涉及本文中描述的包含二硫鍵連接子的抗體藥物綴合物d：通過定量lc-ms測定。請注意，這些值涉及本文中描述的含有二硫鍵連接子的雙環藥物綴合物。方法從kellogg等(2011)bioconjugatechemistry,22,717修改。e：在fp競爭中使用17-69-07-n004作為示蹤劑f：在fp競爭中使用17-69-07-n040作為示蹤劑所有分子構建體保留其對血紅素結合蛋白靶標的親和力(第二列)。數據表明，血漿穩定性取決于二硫鍵的性質(如由對于還原的敏感性所調節)，而不是雙環肽的性質，因為所有bdc均含有相同的雙環肽(17-69-07-n241)，其在來自三種測試物種的血漿中是穩定的。此外，bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20顯示出足夠治療用途的人血漿中的穩定性，因為人類中該分子大小的肽的預期腎臟過濾驅動清除具有預估2至4小時的半衰期，其比人血漿中bdc的降解半衰期(>14小時bt17bdc-18/19/20，參見表16)快幾倍。因此，預期bdc的大部分將在腎臟中清除，只有一部分在循環中降解，使得這些bdc可能適合于治療目的。bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20的體內功效使用人肺鱗狀細胞癌細胞系ebc-1，測試含有穩定的雙環核心序列的所有bdc在體內小鼠異種移植模型中的功效。bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19在9天內有效并清除腫瘤(圖9、10和11)。bt17bdc-17顯示出良好的功效，但在高劑量下有一些重量減輕。bt17bdc-20雖然基于恒重而被耐受，但是不是有效的，并且僅導致腫瘤大小的邊緣減少(圖12)。取腫瘤體積隨著時間的曲線下面積(auc)和bdc，并對于相應劑量組作圖(圖13)。由此，可以確定獲得50％腫瘤auc降低(ed50)的有效劑量，其總結在表17中。表17：bt17bdc-9、bt17bdc-17、bt17bdc-18、bt17bdc-19和bt17bdc-20獲得50％腫瘤auc降低的有效劑量bdcbt17bdc-9bt17bdc-17bt17bdc-18bt17bdc-19bt17bdc-20ed50a2.1±1.1b1.3±0.6b2.1±0.8b3.1±1.6b22±13baed50±95％置信限b單位為mg/kg，攜帶ebc-1腫瘤的小鼠因此，bt17bdc-9、bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19基于功效是用于靶向癌癥治療的合適分子，并且bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19在有效劑量下具有良好的耐受性。序列表<110>拜斯科醫療有限公司<120>對mt1-mmp特異性的雙環肽配體<130>bic-c-p1803pct<150>gb1419237.1<151>2014-10-29<150>gb1515245.7<151>2015-08-27<160>23<170>patentinversion3.5<210>1<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>xaa可以為任何天然存在的氨基酸<220><221>xaa<222>(3)..(3)<223>xaa代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基或選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基<220><221>misc_feature<222>(4)..(5)<223>xaa可以為任何天然存在的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(12)..(13)<223>xaa可以為任何天然存在的氨基酸<400>1cysxaaxaaxaaxaaglycysgluaspphetyrxaaxaacys1510<210>2<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>2cystyrasnglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>3<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(1)..(1)<223>xaa為βala<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為sar10<400>3xaaxaaalacystyrasnglupheglycysgluaspphetyraspile151015cys<210>4<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為d-ala<400>4cysxaaasnglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>5<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(1)..(1)<223>xaa為βala<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為sar10<220><221>xaa<222>(5)..(5)<223>xaa為d-ala<220><221>xaa<222>(8)..(8)<223>xaa為nal<220><221>xaa<222>(9)..(9)<223>xaa為d-ala<220><221>xaa<222>(16)..(16)<223>xaa為tbugly<400>5xaaxaaalacysxaaasngluxaaxaacysgluaspphetyraspxaa151015cys<210>6<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為y、m、f或v<220><221>xaa<222>(3)..(3)<223>xaa代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基或選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基<220><221>xaa<222>(4)..(4)<223>xaa代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基或選自d或e的極性、帶負電荷的氨基酸殘基<220><221>xaa<222>(5)..(5)<223>xaa代表選自f、w和y的非極性芳香族氨基酸殘基<220><221>xaa<222>(12)..(12)<223>xaa代表選自d或e的極性、帶負電荷的氨基酸殘基<220><221>xaa<222>(13)..(13)<223>xaa代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基<400>6cysxaaxaaxaaxaaglycysgluaspphetyrxaaxaacys1510<210>7<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為y、m、f或v<220><221>xaa<222>(3)..(3)<223>xaa為n或g<220><221>xaa<222>(4)..(4)<223>xaa為e或q<400>7cysxaaxaaxaapheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>8<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為y、m或f<220><221>xaa<222>(3)..(3)<223>xaa為n或g<220><221>xaa<222>(4)..(4)<223>xaa為e或q<400>8cysxaaxaaxaapheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>9<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為y或m<220><221>xaa<222>(4)..(4)<223>xaa為e或q<400>9cysxaaasnxaapheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>10<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>10cysmetasnglnpheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>11<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>11cyspheglyglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>12<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>12cysvalasnglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>13<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>13cyspheasnglupheglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>14<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>14cystyrasnglutyrglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>15<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>15cystyrasnglutrpglycysgluaspphetyraspilecys1510<210>16<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>16cyslysasnargglypheglycysgluaspphetyraspilecys151015<210>17<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>17cysgluaspphetyraspilecys15<210>18<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>18alacystyrasnglupheglycysgluaspphetyraspilecysala151015<210>19<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>19alacysmetasnglnpheglycysgluaspphetyraspilecysala151015<210>20<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>xaa<222>(2)..(2)<223>xaa為sar10<400>20glyxaaalacystyrasnglupheglycysgluaspphetyraspile151015cys<210>21<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>21tyrasngluphe1<210>22<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>22tyrasngluphegly15<210>23<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>23gluaspphetyraspile15權利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種對mt1-mmp特異性的肽配體，其包含多肽和分子骨架，所述多肽含有至少三個半胱氨酸殘基，并被至少兩個環序列分隔；所述分子骨架與所述多肽的半胱氨酸殘基形成共價鍵，使得在所述分子骨架上形成至少兩個多肽環，其中所述肽配體包含式(i)的氨基酸序列：-ci-x1-u/o2-x3-x4-g5-cii-e6-d7-f8-y9-x10-x11-ciii-(seqidno:1)(i)或其藥學上可接受的鹽；其中：ci、cii和ciii分別代表第一、第二和第三半胱氨酸殘基；x代表任何氨基酸殘基；u代表選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基；和o代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基。2.根據權利要求1所述的肽配體，其中x1選自任何一種以下氨基酸：y、m、f或v，如y、m或f，特別是y或m，更特別是y。3.根據權利要求1或權利要求2所述的肽配體，其中u/o2選自u，如n，或o，如g。4.根據權利要求1至3中任一項所述的肽配體，其中x3選自u或z，其中u表示選自n、c、q、m、s和t的極性、不帶電荷的氨基酸殘基，并且z代表選自d或e的極性、帶負電荷的氨基酸殘基，特別地3位的u選自q或3位的z選自e。5.根據權利要求1至4中任一項所述的肽配體，其中x4選自j，其中j代表選自f、w和y的非極性芳香族氨基酸殘基。6.根據權利要求1至5中任一項所述的肽配體，其中x10選自z，其中z代表選自d或e的極性、帶負電荷的氨基酸殘基，如d。7.根據權利要求1至6中任一項所述的肽配體，其中x11選自o，其中o代表選自g、a、i、l、p和v的非極性脂肪族氨基酸殘基，如i。8.根據權利要求1至7中任一項所述的肽配體，其中式(i)的化合物為式(ia)的化合物：-ci-y/m/f/v-u/o-u/z-j-g-cii-e-d-f-y-z-o-ciii-(seqidno：6)(ia)；其中，u、o、j和z如本文之前所定義；或為式(ib)的化合物：-ci-y/m/f/v-n/g-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：7)(ib)；或為式(ic)的化合物：-ci-y/m/f-n/g-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：8)(ic)；或為式(id)的化合物：-ci-y/m-n-e/q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(seqidno：9)(id)；或為式(ie)的化合物：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)(ie)。9.根據權利要求1至8中任一項所述的肽配體，其中式(i)的肽包含選自以下的序列：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)；-ci-m-n-q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-12)(seqidno：10)；-ci-f-g-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-02)(seqidno：11)；-ci-v-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-03)(seqidno：12)；-ci-f-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-04)(seqidno：13)；-ci-y-n-e-y-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07-n057)(seqidno：14)；和-ci-y-n-e-w-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-44-n002)(seqidno：15)；如：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)；和-ci-m-n-q-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-12)(seqidno：10)；特別是：-ci-y-n-e-f-g-cii-e-d-f-y-d-i-ciii-(17-69-07)(seqidno：2)。10.根據權利要求1至9中任一項所述的肽配體，其包括一個或多個選自以下的修飾：n-末端修飾和/或c-末端修飾；用一個或多個非天然氨基酸殘基替換一個或多個氨基酸殘基(例如用一個或多個等排或等電子氨基酸替換一個或多個極性氨基酸殘基；用其它非天然的等排或等電子氨基酸替換一個或多個疏水性氨基酸殘基)；加入間隔子基團；用一個或多個d-氨基酸殘基替換一個或多個l-氨基酸殘基；雙環肽配體中一個或多個酰胺鍵的n-烷基化；用替代鍵替換一個或多個肽鍵；肽骨架長度修飾；用另一個化學基團取代一個或多個氨基酸殘基的α-碳上的氫，和用合適的胺、硫醇、羧酸和酚反應性試劑合成后生物正交修飾氨基酸如半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸和酪氨酸。11.根據權利要求10所述的肽配體，其中所述修飾包含使用合適的氨基反應性化學的n-末端修飾，和/或使用合適的羧基反應性化學的c-末端修飾。12.根據權利要求10或11所述的肽配體，其中所述n-末端修飾包含加入有助于效應子基團綴合和保持雙環肽對其靶標的效力的分子間隔子基團，例如ala、g-sar10-a或bala-sar10-a基團。13.根據權利要求10至12中任一項所述的肽配體，其中所述n-末端修飾和/或c-末端修飾包含加入細胞毒性劑。14.根據權利要求10至13中任一項所述的肽配體，其包含在1位和/或9位氨基酸處的修飾。15.根據權利要求10至14中任一項所述的肽配體，其包含用一個或多個非天然氨基酸殘基替換一個或多個氨基酸殘基。16.根據權利要求15所述的肽配體，其中所述非天然氨基酸殘基取代于4位并且選自：1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸和高苯丙氨酸，如1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸和3,4-二氯苯丙氨酸；特別是1-萘基丙氨酸。17.根據權利要求15或權利要求16所述的肽配體，其中所述非天然氨基酸殘基取代于9位和/或11位并且選自：對于9位為4-溴苯丙氨酸或五氟-苯丙氨酸和/或對于11位為叔丁基甘氨酸。18.根據權利要求17所述的肽配體，其中所述非天然氨基酸殘基，如存在于9位的那些，選自：4-溴苯丙氨酸。19.根據權利要求17所述的肽配體，其中所述非天然氨基酸殘基，如存在于11位的那些，選自：叔丁基甘氨酸。20.根據權利要求15所述的肽配體，其包含多個修飾，例如2、3、4或5個或更多個以下修飾，特別是所有以下5個修飾：1位和/或5位的d-丙氨酸，4位的1-萘基丙氨酸，9位的4-溴苯丙氨酸和11位的叔丁基甘氨酸。21.根據權利要求10所述的肽配體，其中將1位的氨基酸殘基取代為d-氨基酸，例如d-丙氨酸。22.根據權利要求10所述的肽配體，其中將5位的氨基酸殘基取代為d-氨基酸，例如d-丙氨酸或d-精氨酸。23.根據權利要求1至22中任一項所述的肽配體，其中所述藥學上可接受的鹽選自游離酸或鈉、鉀、鈣、銨鹽。24.根據權利要求1至23中任一項所述的肽配體，其為人、小鼠和狗的mt1-mmp血紅素結合蛋白結構域的高親和力結合劑。25.根據權利要求1至24中任一項所述的肽配體，其對于mt1-mmp是選擇性的，但不與mmp-1、mmp-2、mmp-15和mmp-16交叉反應。26.一種藥物綴合物，其包含與一種或多種效應子和/或官能團綴合的根據權利要求1至25中任一項所述的肽配體。27.根據權利要求26所述的藥物綴合物，其中所述效應子和/或官能團包含細胞毒性劑或金屬絡合劑。28.根據權利要求27所述的藥物綴合物，其中所述細胞毒性劑通過可裂解鍵如二硫鍵或蛋白酶敏感鍵與雙環肽連接。29.根據權利要求27或權利要求28所述的藥物綴合物，其中所述細胞毒性劑選自具有以下結構的dm1：或具有以下結構的mmae：30.根據權利要求26至29中任一項所述的藥物綴合物，其為具有以下結構的化合物：31.根據權利要求26至29中任一項所述的藥物綴合物，其為具有以下結構的化合物：32.根據權利要求27至權利要求28所述的藥物綴合物，其中所述細胞毒性劑為美登素并選自式(ii)的化合物：其中n代表選自1至10的整數；和r1和r2獨立地代表氫、c1-6烷基或碳環基或雜環基，如氫或甲基。33.根據權利要求32所述的藥物綴合物，其中：n代表1，并且r1和r2均代表氫(即美登素衍生物dm1)；或n代表2，r1代表氫且r2代表甲基(即美登素衍生物dm3)；或n代表2，并且r1和r2均代表甲基(即美登素衍生物dm4)。34.根據權利要求26至33所述的藥物綴合物，其中綴合物的雙環肽組分具有式(iii)所示的結構：其中m代表選自0至10的整數，和r3和r4獨立地代表氫、c1-6烷基或碳環基或雜環基，如氫或甲基。35.根據權利要求27至34所述的藥物綴合物，其中通過式(v)定義的連接子將細胞毒性劑與雙環肽連接：其中r1、r2、r3和r4代表氫、c1-6烷基或碳環基或雜環基，如氫或甲基；毒素指任何合適的細胞毒性劑；雙環代表根據權利要求1至24中任一項所述的肽配體；n代表選自1至10的整數；和m代表選自0至10的整數。36.根據權利要求35所述的藥物綴合物，其中化合物(iv)的毒素為美登素，并且綴合物包含式(v)的化合物：其中r1、r2、r3和r4代表氫、c1-6烷基或碳環基或雜環基；雙環代表根據權利要求1至24中任一項所述的肽配體；n代表選自1至10的整數；和m代表選自0至10的整數。37.根據權利要求36所述的藥物綴合物，其中：n代表1并且r1、r2、r3和r4各自代表氫，即式(v)a的化合物：n代表1，r1代表甲基，并且r2、r3和r4各自代表氫，即式(v)b的化合物：n代表2，r1和r2均代表氫，并且r3和r4均代表甲基，即式(v)c的化合物：n代表2，r1和r3均代表甲基，并且r2和r4均代表氫，即式(v)d的化合物：38.根據權利要求26或權利要求27所述的藥物綴合物，其選自：bt17bdc-9：bt17bdc-17：bt17bdc-18：bt17bdc-19：和bt17bdc-20：如bt17bdc-9、bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19，特別是bt17bdc-17、bt17bdc-18和bt17bdc-19。39.一種制備根據權利要求38所述的藥物綴合物的方法，其包括如方案i、ii、iii中任一項所描述的合成路徑。40.一種藥物組合物，其包含根據權利要求1至25中任一項所述的肽配體或根據權利要求26至38中任一項所述的藥物綴合物，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。41.根據權利要求26至38中任一項所述的藥物綴合物，其用于預防、抑制或治療癌癥，特別是實體瘤如非小細胞肺癌的用途。當前第1頁12