用于誘導細胞因子的環狀二核苷酸的制作方法

本發明屬于免疫治療領域。它涉及式i、ii和iii的環狀二核苷酸(cdn)。特別地，它涉及氟化脫氧核糖-cdn及其可藥用鹽和前藥，它們能夠在人細胞和動物細胞中誘導i型干擾素產生。這些環狀二核苷酸的細胞因子誘導活性需要真核細胞受體干擾素基因刺激物(sting)的存在，如體外所展示的。

發明背景

細胞因子誘導免疫療法

免疫療法是快速擴張的醫學治療領域，其中為治療益處而人為激活、抑制或否則調節患者的免疫系統。免疫治療劑包括細胞、抗原(例如細菌或病毒的片段)、抗體、核酸、肽、蛋白質、天然存在的配體和合成分子。細胞因子是主要因其借助復雜信號傳導網絡協調免疫應答的作用而知名的小分子糖蛋白信使，不過它們還執行非免疫功能。已經將它們作為免疫治療劑廣泛地探索。然而，直接施用細胞因子作為免疫治療藥受多種因素限制，包括細胞因子在血液中的半壽期非常短，這必須采用頻繁給藥和高劑量予以補償。一個高度有前景的免疫療法方案是細胞因子誘導法，因而患者用根據需要在其身體中觸發一種或多種治療有益性細胞因子產生的免疫調節劑治療。

sting、細胞因子和免疫應答

細胞因子生理產生的主要參與者是干擾素基因刺激物(sting；也稱作eris、mita、mpys或tm173)，一種在天然免疫中最重要的跨膜受體蛋白。人sting由基因tmem173編碼。sting的激活通過irf3(干擾素調節因子3)途徑導致i型干擾素(例如ifn-α和ifn-β)產生并且通過致瘤性轉錄因子nf-κb(活化型b細胞核因子κ-輕鏈增強子)途徑導致促炎細胞因子(il-1α、il-1β、il-2、il-6、tnf-α等)產生。另外，研究者最近報道，響應于病毒性感染，sting激活stat6(信號傳導者和轉錄激活物6)以誘導(th2型)、增加(il-12)或減少(il-10)各種細胞因子(包括趨化因子ccl2、ccl20和ccl26)的產生(chen等人,2011)。

sting激動劑

目前已知人sting以三種方式激活：通過結合正在侵入的細菌或古細菌釋放的外源(3’,3)環狀二核苷酸(c-digmp、c-diamp和c-gamp)是通過(參見(gomelsky,2011)及其中參考文獻)；通過結合(2’,3’)環狀鳥苷單磷酸–腺苷單磷酸酯((2’,3’)c-gamp)(一種最近發現的由環狀gmp-amp合酶(cgas；也稱作c6orf150或mb21d1)在外源雙鏈dna(例如由正在侵入的細菌、病毒或原蟲釋放的)或哺乳動物中的自我-dna存在下產生的內源環狀二核苷酸)(參見，例如(ablasser等人,2013)和(zhang等人,2013))；或通過結合合成性配體，如前述天然存在的環狀二核苷酸的類似物(參見，例如(dubensky,kanne和leong,2013)和(li等人,2014))。

sting在免疫療法中的調節作用

受到sting、細胞因子和免疫應答之間互作的鼓舞以及受到關于sting及其突變之臨床意義的知識體系日益增長鼓舞，研究者最近已經開始探索sting作為多種適應癥的治療靶。正在尋求新的sting激動劑作為多種領域(如癌癥或傳染性疾病)中人和動物健康的治療劑。已知的環狀二核苷酸sting激動劑是一類優異的作為堿基類似物之基礎的化合物，所述化合物可能顯示出令人感興趣的生物學活性或合乎需要的藥物樣特性。本發明包括治療性用于人類和動物健康中的新環狀二核苷酸。

本發明的具體實施例

cdnsting激動劑

在us/2014/0329889和wo/2014/189805中描述了環狀二核苷酸(cdn)sting激動劑的一些示例。然而，作者僅化學合成了從他們提供的非常上位的化學結構圖中理論可能的很少數的化合物并對其進行生物測試。他們沒有公開任何詳細的結構-活性關系或沒有描述特定cdn結構類別的任何類別效應。因此，作者為所需的sting相關應用提供單薄基本原理以確證根據實際sting活性或其他特性(例如藥物樣特性)，選擇一個結構類別的cdn勝過另一個類別。最近，wo/2015/077354(pct/us2014/066436)探索了sting激動劑，包括cdn，所述激動劑均是其中兩個核苷酸含有核糖糖部分并且兩個核苷酸由硫代磷酸酯二酯鍵連接的(2’,3’)-cdn。

cdnsting激動劑的知識鴻溝

對不同結構類別的cdn的生物學活性知之甚少。具體而言，關于根據cdn結構類別的類別效應在先申請的專利稀少，也沒有關于這些類別效應可能怎樣特別用于與sting活性相關的特定治療應用、診斷應用或研究應用的在先申請的任何專利。這種信息將對基于操作sting活性，發現并利用具有治療應用、診斷應用或研究應用需要之特性的新cdnsting激動劑至關重要。

發明簡述

考慮缺乏已報道的sting激動劑結構-活性關系，sting激動劑領域的發明時機成熟。在這種情況下，本發明涉及氟化脫氧核糖-cdnsting激動劑，所述激動劑相對于其相應非氟化類似物顯示出獨特、非顯而易見和先前未報道的類別效應。

在我們探索環狀二核苷酸(cdn)作為免疫調節性化合物和sting潛在激動劑的工作中，我們最初力圖合成并分析以下式(i)、(ii)和(iii)的cdn：

其中：

·x1是h、oh或f；

·x2是h、oh或f；

·z是oh、or1、sh或sr1，其中：

i)r1是na或nh4，或者

ii)r1是在體內提供oh或sh的酶不穩定基團，如新戊酰氧基甲基；

·b1和b2是選自以下的堿基：

條件是：

-在式(i)中：x1和x2不是oh，

-在式(ii)中：當x1和x2是oh時，b1不是腺嘌呤并且b2不是鳥嘌呤，并且

-在式(iii)中：當x1和x2是oh時，b1不是腺嘌呤，b2不是鳥嘌呤，并且z不是oh。

在本發明中，術語“環狀二核苷酸”(縮寫為“cdn”)代表一類在兩個核苷之間具有兩個磷酸二酯鍵或兩個硫代磷酸酯二酯鍵或一個磷酸二酯鍵和一個硫代磷酸酯二酯鍵的環狀分子。這包括(3’,5’)-(3’,5’)核苷酸鍵(縮寫為(3’,3’))；(3’,5’)-(2’,5’)核苷酸鍵(縮寫為(3’,2’))；(2’,5’)-(3’,5’)核苷酸鍵(縮寫為(2’,3’))；和(2’,5’)-(2’,5’)核苷酸鍵(縮寫為(2’,2’))。

術語“核苷”指包含氮堿基和五碳糖的糖基胺，其中含氮堿基通過β-糖苷鍵與五碳糖結合。

術語“核苷酸”指在糖部分的位置5’、3’或2’連接到磷酸酯基團的任何核苷。

“可藥用鹽”包括從可藥用無機或有機堿和酸衍生的那些鹽。合適的鹽包括衍生自堿金屬如鉀和鈉、堿土金屬如鈣和鎂的那些，連同制藥技術中熟知的許多其他酸。

術語“可藥用前藥”在本文指這樣的化合物，其中所述化合物在宿主(即接受化合物的人類或動物受試者)中經代謝例如水解或氧化以形成本發明的化合物。前藥的常見示例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不穩定保護基的化合物。前藥包括可以氧化、還原、胺化、去胺化、羥化、去羥化、水解、去水化、烷基化、去烷基化、酰化、去乙酰化、磷酸化或去磷酸化以產生活性化合物的化合物。

如本文所用，術語“前藥”指由如上文定義的結構式(i)、(ii)或(iii)或其任一個具體實施方案代表的化合物的無活性或活性衍生物，所述衍生物在動物(例如哺乳動物，如人類)的身體內部經歷自發或酶促轉化，以釋放藥理活性形式的化合物。關于綜述，參見(rautio等人,2008)。

特別地出于本發明的目的，由結構式(i)、(ii)或(iii)代表的前藥化合物，包括其任一個上述具體實施方案，可以如(hecker和erion,2008)中詳述那樣形成。

磷酸酯前藥可以采取酯、尤其酰氧基烷基酯(例如新戊酰氧基甲基酯(pom))或s-酰基硫代乙基(sat)酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺如氨基酸前藥的形式。

表達“酶不穩定保護基”指這樣的基團，所述基團設計成借助電荷掩蔽而令化合物跨細胞膜或寄生物膜被動擴散成為可能，從而一旦在細胞或寄生物內部，化合物發生提供oh或sh基的酶促轉化(或去保護)。例如，酶不穩定保護基的示例包括酰氧基烷基如新戊酰氧基甲基(pom)或s-酰基硫代乙基(sat)或氨基酸基團。

在本說明書中，認為表述“式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸”還包括所述式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸的可藥用鹽或可藥用前藥。

當b1或b2是鳥嘌呤時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

當b1或b2是腺嘌呤時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

當b1或b2是次黃嘌呤時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

當b1和b2獨立地選自鳥嘌呤或腺嘌呤時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

當b1或b2獨立地選自鳥嘌呤或次黃嘌呤時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

當b1和b2獨立地選自腺嘌呤或次黃嘌呤時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

當z是oh時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

當z是sh時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

z是oh或sh時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

當z是sr1時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸，其中：

i)r1是na或nh4，或者

ii)r1是在體內提供oh或sh的酶不穩定基團，如新戊酰氧基甲基。

當b1和b2獨立地選自腺嘌呤或次黃嘌呤并且x1和x2相同時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。優選地，x1和x2是oh或氟原子。在一個具體實施方案中，z是oh或sh。

當b1和b2獨立地選自鳥嘌呤或次黃嘌呤并且x1和x2相同時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。優選地，x1和x2是oh或氟原子。在一個具體實施方案中，z是oh或sh。

當b1和b2獨立地選自腺嘌呤或鳥嘌呤并且x1和x2相同時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。優選地，x1和x2是oh或氟原子。在一個具體實施方案中，z是oh或sh。

當x1和x2不是氟原子時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。

當x1和x2當中至少一者是氟原子時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。在一個具體實施方案中，x1和x2均是氟原子。

一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸是以下環狀二核苷酸(每者賦予格式為“cl###”的五字符代碼)：

或其可藥用鹽或前藥。

當一個或兩個核苷在2’位置受修飾時是一個特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸。這個類別包括以下化合物：

我們鑒定了這些cdn的一個在結構上前所未有的亞群，所述亞群顯示令人驚訝的生物學活性及先前從未曾作為sting激動劑報道。這些cdn形成本發明的基礎并且區別于先前報道的cdnsting激動劑(參見，例如：us/2014/0329889和wo/2014/189805)。因此，在一個方面，本發明提供由以下全部結構標準限定的cdn：首先，不同于其中每個核苷酸的糖部分是核糖的天然存在的cdn，在本發明的cdn中，每個核苷酸的糖部分是2'-脫氧核糖；其次，在本發明的cdn中，在兩個核苷酸中糖部分的2’位置必須以氟原子取代，或一個核苷酸的糖部分的2’位置必須以氟原子取代，而另一個核苷酸的糖部分的2’位置必須以氫原子取代；再者，在本發明的cdn中，每個核苷酸中的堿基優選地選自鳥嘌呤、腺嘌呤或次黃嘌呤，條件是cdn的兩個核苷酸不能含有相同的堿基。

因此，在一個實施方案中，本發明提供根據權利要求1所述的式(i)的cdn，即式(i)的化合物：

其中：

·x1是h或f；

·x2是h或f；

·x1和x2當中至少一者是氟原子；

·z是oh、or1、sh或sr1，其中：

i)r1是na或nh4，或者

ii)r1是在體內提供oh或sh的酶不穩定基團，如新戊酰氧基甲基；

·b1和b2是選自以下的堿基：

并且b1是與b2不同的堿基，

或其可藥用鹽。

表達“b1是與b2不同的堿基”包括b1是鳥嘌呤并且b2是腺嘌呤，或b1是鳥嘌呤并且b2是次黃嘌呤，或b1是腺嘌呤并且b2是鳥嘌呤，或b1是腺嘌呤并且b2是次黃嘌呤，或b1是次黃嘌呤并且b2是鳥嘌呤，或b1是次黃嘌呤并且b2是腺嘌呤。

當b1和b2不同并且x1和x2均是f時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

當b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是oh時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

當b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是如上文定義的or1時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

當b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是如上文定義的sh時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

當b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是如上文定義的sr1時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

當b1和b2不同并且x1和x2不同(即x1＝h和x2＝f或x1＝f和x1＝h)時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

當b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是oh時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

當b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是如上文定義的or1時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

當b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是如上文定義的sh時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

當b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是如上文定義的sr1時是一個特定類別的如上文定義的式(i)的環狀二核苷酸。

本發明的環狀二核苷酸在體外在人細胞、動物細胞和人血中誘導i型干擾素和/或促炎細胞因子。這些環狀二核苷酸的細胞因子誘導活性需要sting的存在，如人細胞或動物細胞中體外實驗所證實的。

本發明的環狀二核苷酸是受體sting的激動劑。

術語“激動劑”指在體外或在體內激活生物受體以誘發生理反應的任何物質。

“sting”是“干擾素基因刺激物”的縮寫，其也稱作“內質網干擾素刺激物(eris)”、“irf3激活中介物(mita)”、“mpys”或“跨膜蛋白173(tm173)”。sting是人類中由基因tmem173編碼的跨膜受體蛋白。sting由環狀二核苷酸(cdn)激活導致irf3途徑和nf-κb途徑的激活及后續導致分別誘導i型干擾素和促炎細胞因子。響應于病毒性感染，sting激活stat6(信號傳導者和轉錄激活物6)以誘導(th2型)、增加(il-12)或減少(il-10)各種細胞因子(包括趨化因子ccl2、ccl20和ccl26)的產生(chen等人,2011)。

術語“sting激動劑”在本文中指在體外或在體內激活受體sting的物質。根據本發明，如果符合以下情況，則認為某化合物為sting激動劑：

-它在體外在含有活性sting的人細胞或動物細胞中誘導i型干擾素；并且

-它在體外在不含有活性sting的人細胞或動物細胞中不誘導i型干擾素。

確定某配體是否為sting激動劑的常見試驗是在野生型人細胞系或動物細胞系中和已經通過堿基小缺失或長缺失以遺傳方式失活sting編碼基因的相應細胞系(例如純合的sting敲除細胞系)中孵育配體。sting的激動劑將在野生型細胞中誘導i型干擾素，但是在sting編碼基因已經失活的細胞中將不誘導i型干擾素。

本發明的環狀二核苷酸在體外在含有活性sting的人細胞或動物細胞中誘導i型干擾素。然而，它們不在體外在不含有活性sting的人細胞或動物細胞中誘導i型干擾素。

本發明涉及氟化脫氧核糖-環狀二核苷酸(cdn)。具體而言，它涉及(3’,3’)-2’(單氟化或雙氟化)-2'-脫氧核糖-(cdn)。

其中x1和x2當中至少一者是氟原子，尤其x1和x2均是氟原子并且z是oh的式(i)、(ii)或(iii)環狀二核苷酸在人細胞系和鼠細胞系中比其非氟化對應物誘導更多的i型干擾素和nf-κb活性。

如與其相應的非氟化cdn相比，其中x1和x2當中至少一者是氟原子，尤其x1和x2均是氟原子并且z是oh或sh的式(i)、(ii)和(iii)的環狀二核苷酸在小鼠中靜脈內注射后顯示從血液消除較慢，即動力學清除過程較長，并且在體外顯示出更大的抗酶剪切性。

環狀二核苷酸的鹽或前藥形式

可藥用鹽包括從可藥用無機或有機堿和酸衍生的那些鹽。合適的鹽包括衍生自堿金屬如鉀和鈉、堿土金屬如鈣和鎂的那些，連同制藥技術中熟知的許多其他酸。術語“可藥用前藥”指這樣的化合物，其中所述化合物在宿主(即接受化合物的人類或動物受試者)中經代謝例如水解或氧化以形成本發明的化合物。前藥的常見示例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不穩定保護基的化合物。前藥包括可以氧化、還原、胺化、去胺化、羥化、去羥化、水解、去水化、烷基化、去烷基化、酰化、去乙酰化、磷酸化或去磷酸化以產生活性化合物的化合物。

可以施用本文所述的cdn前藥以額外地增加活性、生物利用率或穩定性，或否則改變cdn單磷酸酯的特性。

多種cdn前藥配體是已知的。通常而言，磷酸酯部分上的烷基化、酰化或其他親脂修飾或使用核苷的其他類似物將增加核苷酸的穩定性。

可以代替在磷酸酯部分上一個或多個氫的取代基的示例是烷基、芳基、類固醇、糖，包括但不限于糖、1,2-二酰甘油和醇類。許多示例在(jones,1995)中描述。

本發明化合物的用途

本發明的另一個目的是用于人類或動物中治療性療法的式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸。

特別地，本發明的化合物可以用于人類或動物健康中的治療性或診斷性應用。以下示例起到顯示本發明的不同可能應用的作用；然而，這些示例不意在限制本發明的范圍。

術語“治療劑”指向人類或動物施用的一種或多種物質，其旨在人類或動物中實現某種治療作用，包括旨在阻止、治愈或緩和感染或疾病的結果和/或否則旨在改善人類或動物的健康。

術語“單藥療法”指在任何臨床或醫療情境下使用單一物質和/或策略治療人類或動物，而與相同臨床或醫療情境下使用多種物質和/或策略治療人類或動物相反，無論多種物質和/或策略是否以任何順序依次或同時使用。

術語“化療藥”在本文中指向人類或動物施用旨在殺傷腫瘤或減緩或終止腫瘤生長和/或減緩或終止癌細胞分裂和/或防止或減慢轉移的一種或多種化學物質。經常施用化療藥以治療癌癥，但是還適用于其他疾病。

術語“化療”指用一種或多種化療藥(參見上文定義)醫學治療人類或動物。

術語“化學免疫療法”指化療物質和/或策略和免疫療法物質和/或策略的合并使用，無論是否以任何順序依次或同時進行。化學免疫療法經常用來治療癌癥，但是也可以用來治療其他疾病。

術語“免疫系統”指涉及在身體內預防感染、在感染期間或疾病期間保護身體和/或輔助身體在感染或疾病后恢復的分子、物質(例如體液)、解剖結構(例如細胞、組織和器官)和生理過程的全體或其任一種或多種組分。“免疫系統”的完整定義超出本專利的范圍；然而，這個術語應當由本領域的任何普通執業者理解。

術語“免疫介質”指可以與任一種或多種免疫系統組分相互作用的任何內源或外源物質。術語“免疫介質”包括抗體、抗原、疫苗及其構成組分、核酸、合成性藥物、天然或合成性有機化合物、細胞因子、天然或修飾的細胞、其合成性類似物和/或其片段。

術語“免疫療法”指其中人為調節人免疫系統或動物免疫系統的一種或多種組分以直接或間接實現某種治療益處(包括全身性和/或局部效果和預防性和/或治愈性效果)的任何醫學治療。免疫治療可以包括通過任何途徑(例如口服、靜脈內、皮膚、通過注射、通過吸入等)(無論是否為全身途徑、局部途徑或這兩種途徑)，單獨或以任何組合施用一種或多種免疫介質(參見上文定義)至人類或動物受試者。“免疫治療”可以包括激發、增加、減少、制止、阻止、阻斷或否則調節細胞因子的產生，和/或激活或失活細胞因子或免疫細胞，和/或調節免疫細胞水平，和/或輸送一種或多種治療性或診斷性物質至身體內特定部位或至特定類型的細胞或組織，和/或摧毀特定細胞或組織。免疫治療可以用來實現局部效果、全身性效果或二者的組合。

術語“免疫抑制”描述任何人類或動物受試者的狀態，所述受試者的免疫系統在功能上削弱、失活或否則受損，或在所述受試者中一種或多種免疫組分在功能上削弱、失活或否則受損。“免疫抑制”可以是疾病、感染、衰竭、營養不良、醫學治療或某種其他生理或臨床狀態的原因、結果或副產物。

本文中同義使用的術語“免疫調節性物質”、“免疫調節物質”、“免疫調節劑”和“免疫調節劑”指施用至人類或動物時直接影響人類或動物免疫系統運行的任何物質。常見免疫調節劑的示例包括但不限于抗原、抗體和小分子藥物。

術語“疫苗”指施用至人類或動物以激發或增強針對人類或動物中一種或多種抗原的特異性免疫系統應答和/或保護作用的生物學制品。

術語“接種”指用疫苗治療人類或動物或指向人類或動物施用疫苗的行為。

術語“輔藥”指與主要治療性物質一起(或者以任何順序依次或與其同時)施用以實現不能通過單獨使用主要治療性物質實現的某種互補性、協同性或其他有益作用的次要治療性物質。輔藥可以與疫苗、化療或某種其他治療性物質一起使用。輔藥可以增強主要治療性物質的功效、減少主要治療性物質的毒性或副作用或向接受主要治療性物質的受試者提供某種保護，如但不限于改善免疫系統的運行。

在一個實施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸可以作為免疫療法施用人類或動物，以體內誘導對人類或動物有治療益處的一種或多種細胞因子的產生。這種類型的免疫治療可以單獨使用或與其他治療策略組合使用，無論是否以任何順序依次或同步使用。它可以用來防止、治愈、和/或緩和人類或動物中感染或疾病的影響，和/或用來調節人類或動物的免疫系統以實現某種其他治療益處。

在一個具體實施方案中，本發明的環狀二核苷酸可以用于免疫抑制的個體的細胞因子誘導免疫療法。

在這個示例中，式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸將施用至免疫抑制的人類或動物受試者，以體內誘導直接或間接增強人類或動物免疫系統的一種或多種細胞因子的產生。可能從這種治療中獲益的受試者包括患有自體免疫疾病、免疫系統缺損或缺陷、微生物感染或病毒性感染、傳染性疾病或癌癥的那些。

本發明因此公開了一種在免疫抑制的個體中誘導細胞因子的方法，所述方法包括向有需要的患者施用式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸或其可藥用鹽或前藥。

在另一個實施方案中，本發明的環狀二核苷酸可以用于與化療組合的細胞因子誘導免疫療法。

在這個示例中，式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸將與一種或多種化療藥一起以任何順序依次或同時施用至癌癥患者，以終止患者中腫瘤的生長、使其收縮和/或摧毀之。因本發明化合物提供的細胞因子誘導和化療藥提供的細胞毒性組合產生的化學免疫療法可能對患者的毒性較小，在患者中造成更少的副作用和/或比化療藥作為單藥療法使用時顯示更大的抗腫瘤功效。

本發明因此公開一種用于治療癌癥的方法，所述方法包括向有需要的患者施用：

-化療藥；和

-式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸或其可藥用鹽或前藥。

在另一個實施方案中，本發明的環狀二核苷酸可以作為疫苗輔助療法用于細胞因子誘導免疫療法。

在這個示例中，式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸將施用至已經接受、正在接受或將要接受接種的人類或動物受試者。本發明提供的益處可能包括增強接種對靶抗原的功效，降低接種的毒性、減少接種的不良副作用或增強人類或動物受試者的免疫保護作用。

本發明的另一個目的是用于治療細菌性感染、病毒性感染或癌癥的式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸。

如本文所用，“癌癥”指受試者中以細胞生長或死亡不受調節或失調節為特征的生理狀況。術語“癌癥”包括實體瘤和血液源腫瘤，無論是否為惡性或良性。

在優選的實施方案中，癌癥從以下群組：膀胱癌、乳腺癌、膽管細胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌和尿路上皮癌。

在一個具體實施方案中，癌癥是胰腺實體瘤。

本發明因此公開一種用于治療細菌性感染、病毒性感染或癌癥的方法，所述方法包括向有需要的患者施用式(i)、(iii)或(iii)的環狀二核苷酸或其可藥用鹽或前藥。

本發明的另一個目的是用于治療可以借助sting途徑誘導免疫應答而減輕的病理學的式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸。

本發明的另一個目的是一種包含式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸和化療藥的組分套裝，其用于治療胰腺實體瘤。

術語“組分套裝”在本文中指合用制品，其中對于通過同時施用或依次施用至患者用于合并治療的有效成分在物理上分離。

因此，根據本發明，化療藥和環狀二核苷酸或其可藥用鹽或前藥以分離的形式同時、獨立或依次地以任何順序施用至患者，以治療癌癥。

在一個實施方案中，所述化療藥是吉西他濱。

合成環狀二核苷酸的脫氧核苷

天然核苷2'-脫氧-腺苷(da)、2'-脫氧-鳥苷(dg)或2'-脫氧-肌苷(di)可以用于合成式(i)和(ii)的cdn。

用于式(ii)和(iii)的cdn的3’-脫氧-腺嘌呤、3’-脫氧-鳥苷或3’-脫氧-肌苷指具有糖部分(例如在3'位置經如此修飾從而羥基(3'-oh)由氫基團替換的核糖基部分或木糖基部分)的核苷單元。

合成cdn的氟取代的核苷

由于sting位于內質網并且檢測細胞質中的環狀二核苷酸，所以注定治療性使用的任何sting激動劑必須能夠滲入細胞。另外，化合物的更大細胞攝取量轉換成更高的生物利用率，這是合乎臨床使用需要的特性。在本發明中，設計氟化的化合物以探索以下可能性：一個或兩個氟原子賦予的更大細胞攝取量將導致比不含有任何氟原子的參考化合物c-aimp更大的i型干擾素誘導活性。

在本發明中，我們令人驚訝地發現，作為sting激動劑，全部含有至少一個氟原子的主題cdn比其相應的非氟化類似物更有活性。具體而言，本發明的cdn在人類細胞、動物細胞和人血中比其相應的非氟化類似物顯示出更大的sting依賴性細胞因子誘導活性。

藥物在身體內酶促降解更迅速，其半壽期越短并且因此，其活性越小。因此，意圖治療性使用的化合物的合乎需要特性是抗酶降解性。存在體外酶促切割試驗可以提供給定化合物抵抗常見酶的某種指示，所述的常見酶降解在結構上與正在測試的化合物類似的化合物。在我們工作中，我們非常驚訝發現了本發明主題cdn的又一個區別型特征：與它們的相應非氟化核糖-cdn相比，這些氟化脫氧核糖-cdn始終顯示優越的蛇毒磷酸二酯酶(svpd)或核酸酶p1(np1)切割抗性。

單氟-核苷

式(i)和(ii)的cdn的腺苷、鳥苷或肌苷的2'-脫氧-2'-氟指在2'位置經如此修飾，從而羥基(2'-oh)由氟基團(2'-f)替換的核苷。

可以通過本領域已知的任何方法制備合成式(i)和(ii)的cdn的2'-氟核苷衍生物(參見，例如：(herdewijna,1989；thomas,1994)和(ross,1997))。

式(ii)和(iii)的cdn的腺苷、鳥苷或肌苷的3'-脫氧-3'-氟指在3'位置經如此修飾，從而羥基(3'-oh)由氟基團(3'-f)替換的核苷。

硫代磷酸酯核苷酸間鍵

硫代磷酸酯核苷酸間鍵指用p＝s基團替換p＝o基團，并且包括二硫代磷酸酯核苷間鍵。環狀二核苷酸中存在的一個或兩個核苷酸間鍵可以是硫代磷酸酯核苷酸間鍵。

可以將cdn的磷酸二酯鍵中的磷原子描述為具有“前手性”。一旦替換或修飾磷酸二酯鍵的非成鍵氧原子，則生成手性糖-磷酸酯鍵。所得到的糖間鍵是sp糖間鍵或rp糖間鍵。為獲得硫代磷酸酯鍵，用硫原子替換天然磷酸二酯鍵中的非成鍵氧原子產生了手性中心并且因此提供sp和rp非對映異構體。其中糖主鏈中基本上全部磷原子為sp或rp的分子在本文中稱作“手性純的”。

環狀二核苷酸由核酸酶和/或磷酸二酯酶以酶促方式降解(參見，例如：(li等人,2014)(diner等人,2013)(danilchanka和mekalanos,2013)(shanahan,gaffney,jones和strobel,2013)(simm,morr,kader,nimtz和romling,2004))，并且因此，當作為治療劑使用時，這些化合物可以遭遇半壽期削弱。選擇化合物cl655和cl656以使得最大半壽期成為可能，以及可能令活性在體內更高，因為它們含有硫代磷酸酯(也稱作“p(s)”或“硫代磷酸酯”)核苷酸間鍵。使用這類鍵是酶促水解的已知規避策略(參見，例如：us2014/0205653a1)。比其磷酸二酯類似物更抵抗酶促水解的硫代磷酸酯化合物的示例是(2’,3’)c-g^sa^smp或(2’,3’)c-gamp(s)(invivogen目錄代碼：tlrl-scga；li,2014)。硫代磷酸酯鍵在磷原子上引入額外的手性中心，所述手性中心在每個硫代磷酸酯鍵產生非對映異構體對([rp]和[sp])。在本發明中，將cl655和cl656作為外消旋混合物獲得并測試。

制備活性化合物的一般方案

簡單制備本文公開的環狀二核苷酸或其前藥的方法可以如下文詳述中那樣制備或通過其他本領域技術人員已知的方法制備。本領域普通技術人員將理解，這些方案無論如何將不起限制作用并且可以作出細節的變化而不脫離本發明的精神和范圍。

如本文所用和除非另有限定，術語“保護基”指與氧、氮或磷原子連接以防止該原子進一步反應或用于其他目的的化學官能團。氧和氮的多種類型保護基是有機合成領域技術人員已知的，并且例如在(wuts,greene和greene,2014)中描述。

通常，通過以下方式制備式(i)、(ii)或(iii)的環狀二核苷酸或其前藥：首先制備相應的核苷，隨后準備5’-羥基，在2’位置或3’位置的官能團(oh)，并且如果需要，隨后保護嘌呤堿基的環外胺。隨后，將適當保護的核苷轉化成相應的3’-磷酰亞胺、2’-磷酰亞胺、3’-h-膦酸酯或2’-h-膦酸酯，它們構成制備本文所述的環狀二核苷酸的原料。

下文顯示的反應方案適用于合成式i的cdn并且可以用于合成式(ii)和(iii)的cdn：

方案1是合成本發明活性化合物的非限制性示例，并且尤其是式(i)的cdn的合成方案，其中b1、b2、x1、x2和z如上文限定。str是三苯甲基衍生物，如二甲氧基三苯甲基(dmtr)，p是保護基，r2是烷基如異丙基，r3是保護基如氰基乙基，r4是保護基如烯丙基，并且x3是o或s。

方案2是合成本發明活性化合物的非限制性示例，并且尤其是式(i)的cdn的替代性合成方案，其中b1、b2、x1、x2和z如上文限定。str是三苯甲基衍生物，如二甲氧基三苯甲基(dmtr)，p是保護基，r2是烷基如異丙基，r4是保護基如氰基乙基，r5是保護基如烯丙基，并且x3是o或s。

制備式(i)和(ii)的cdn，通過首先制備適當保護的式(ia)的磷酰亞胺或式(if)的h-膦酸酯：

方案3是合成式(ia)的磷酰亞胺或式(if)的h-膦酸酯的非限制性示例，其中b2、yp、xp、r7、r8和str如上文限定。

可以通過首先制備適當保護的式(iv)的核苷，合成式(ia)的磷酰亞胺或式(if)的h-膦酸酯，其可以由本領域普通技術人員完成。首先，保護具有環外胺的堿基，并且隨后同時地或選擇性地保護3’-和5’-羥基。最終保護置換x2，當x2是羥基時使用保護基如tbdms或四氫吡喃(thp)。最后，切去在3’-和5’-羥基的保護基，并且隨后用三苯甲基衍生物保護5’-羥基以產生式(iv)的核苷：

方案4是合成適當保護的式(iv)的核苷的非限制性示例，其中b2、x2、p和str如上文限定。r5和r6是保護基。

式(iva)的核苷可以通過chu,2002；rajagopalan,2003；schinazi,2004；vorbrüggen,2001中略述的方法制備。

附圖簡述

圖1.細胞中的sting信號傳導。sting由環狀二核苷酸(cdn)激活導致irf3途徑和nf-κb途徑的激活及后續導致分別誘導i型干擾素和促炎細胞因子。

圖2.thp1-dual^tm細胞培養物中的體外i型干擾素誘導活性：非氟化對氟化的環狀二核苷酸。

圖3.thp1-dual^tm細胞培養物中的體外nf-κb通路誘導作用：非氟化對氟化的環狀二核苷酸。

圖4.野生型b16細胞與sting敲除b16細胞中的體外i型干擾素誘導活性。它顯示了在野生型b16細胞培養物(圖左側)或sting-敲除的b16細胞(圖右側)培養物中孵育24小時的非氟化環狀二核苷酸對氟化環狀二核苷酸的相對isg54活性(作為i型干擾素誘導作用的間接量度)。wt：野生型；sko：sting敲除(純合)。

圖5.野生型raw細胞與sting敲除raw細胞中的體外i型干擾素誘導活性。它顯示了在野生型raw細胞培養物(圖左側)或sting-敲除的raw細胞(圖右側)培養物中孵育24小時的非氟化環狀二核苷酸對氟化環狀二核苷酸的相對isg54活性(作為i型干擾素誘導作用的間接量度)。wt：野生型；sko：sting敲除(純合)。

圖6：小鼠中環狀二核苷酸的i型干擾素誘導活性。來自處理后4小時的小鼠的血清中i型干擾素誘導作用的測量。

圖7.小鼠中環狀二核苷酸的il-6誘導活性。來自處理后4小時的小鼠的血清中il-6誘導作用的測量。

圖8.小鼠中環狀二核苷酸的體內消除。處理的小鼠中環狀二核苷酸的血漿濃度的時間變化。

圖9.人全血中cdn的細胞因子誘導活性。

圖10a-d.不同cdn隨時間推移對svpd和np1酶切割作用的抗性，如通過hplc監測。就svpd(a)或np1(b)的抗性，將cl614和cl656與c-aimp比較。就svpd(c)或np1(d)的抗性，相對于c-gamp比較cl603和cl656。

圖11.thp-1dual^tm細胞中與酶svpd和np1孵育之前和之后不同cdn的體外活性。

本發明將由以下非限制性實施例說明。

實施例

作為本發明代表的特定化合物按照以下實施例制備并且通過說明方式提供以輔助理解本發明。它們不應當解釋成以任何方式限制在后續權利要求書中所述的本發明。本發明的化合物也可以用作后續實施例中的中間體以產生本發明的額外化合物。并不必然作出嘗試以優化在任何反應中獲得的產率。本領域技術人員將知道怎樣通過反應時間、溫度、溶劑、試劑和其他化學合成參數的例行變化增加這種產率。

本發明在顯示用于合成cdn的制備性方法的實施例1中及在顯示用于生物學評價這些cdn的方法的實施例2中進一步說明。本領域普通技術人員將理解，這些實施例無論如何不起限制作用并且可以作出細節的變化而不脫離本發明的精神和范圍。

描述本發明中使用的術語是常用的并且是本領域技術人員已知的。如本文所用，以下縮略語具有所示的意思：

℃為攝氏度；a為腺苷；acn為乙腈；aq.為水質；cdcl3為氘化氯仿；c18為十八烷基碳鏈結合的二氧化硅；d為二重峰；da為脫氧腺苷；dd為二重峰的二重峰；di為脫氧肌苷；d2o為氧化氘；dca為二氯乙酸；dcm為二氯甲烷；dmso-d6為氘化二甲基亞砜；dmtrcl為4,4′-二甲氧基三苯甲基氯化物；equiv.為當量；es為電噴霧電離；et2o為二乙醚；etoac乙酸乙酯；etoh為乙醇；et3n·3hf為三乙胺三氟化氫；g為克；¹h為質子；h為小時；hz為赫茲；hplc為高效液相色譜；i為肌苷；ifn為干擾素；ifn-α為干擾素α；ifn-β為干擾素β；iproh為異丙醇；irf3為干擾素調節因子3；isg(或isg54)為干擾素刺激基因；isre為干擾素刺激反應元件；i.v.為靜脈內；lc為液相色譜；m為多重峰；m為摩爾；m/z為質荷比；meoh為甲醇；mg為毫克；mgso4為硫酸鎂；mhz為兆赫茲；min為分鐘；ml(或ml)為毫升；mmol為毫摩爾；mol/l為摩爾/升；ms為質譜法；nahco3為碳酸氫鈉；nahso3為硫代硫酸鈉；nh4oh為氫氧化銨；nf-κb為活化型b細胞核因子κ-輕鏈增強子；nmr為核磁共振；pads為苯乙酰基二硫化物；ppm為百萬分之一；ppts為對甲苯磺酸吡啶鎓；rt為室溫；seap為分泌型胚堿性磷酸酶；s為單峰；sl為大單峰；t為三重峰；sko為純合sting敲除；sting為干擾素基因刺激物；tbaf為四正丁基氟化銨；thf為四氫呋喃；tbdmscl為叔丁基二甲基氯硅烷；teaa為三乙基乙酸銨；tfa為三氟乙酸；tipscl2為1,3-二氯-1,1,3,3-四異丙基二硅氧烷；wt為野生型；μg為微克；μl(或μl)為微升；μm為微米；δ為化學位移。

購買適于合成核苷和核苷酸的無水溶劑和試劑并且在干燥氬氣或氮氣下使用無水技術操作。亞酰胺(amidite)偶聯反應和環化在無水乙腈或吡啶中在干燥氬氣或氮氣下進行。無水吡啶中全部反應的原料通過從吡啶濃縮(3次)而干燥。使用二氯甲烷中的甲醇梯度，使用fluka高純度級或merck9385級二氧化硅進行制備性硅膠快速色譜。在agilent1290uhplc系統上進行分析性lc/esms，所述系統連接至二極管陣列探測器(dad)agilent1260infinity和配備電噴霧電離源(esi)并受chemstation軟件控制的agilent6130四極質譜儀。使用流量為300μl/分鐘的10mm甲酸銨和乙腈梯度，lc系統配備aquitycshc1850×2.1mm1.7μm柱。uv檢測波長是254nm。質譜儀以esi正模式和負模式運行。使用流量為60ml/分鐘的10mm甲酸銨和乙腈梯度在sunfireprepc185μmobd30x150mm柱上，在254nm監測的waters制備性150qhplc系統上進行制備性hplc。在bruker300mhz(fourrier300)上在室溫獲得¹hnmr譜并且以ppm低磁場報告。在真空下250℃干燥商業供應的產品12小時后，使用分子篩(ms)商業核苷磷酰亞胺從chemgenes供應。

以下實施例起到說明本發明的作用。這些實施例無論如何不意在限制本發明范圍。

實施例1：合成本發明的化合物

實施例1.a：制備磷酸三酯的一般方案：

將適當保護的磷酰亞胺或市售磷酰亞胺與無水acn一起共蒸發3次，并且將所產生的固體在分子篩存在下溶解于(0.1mol/l，2當量)的溶液中。向溶液添加烯丙醇(2當量)并且將所得到的混合物攪拌30分鐘。

對于磷酸三酯鍵：

將癸烷中的叔丁基過氧化氫(5.5m，2當量)添加至混合物，將所述混合物攪拌40分鐘。將溶液過濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮。

對于硫代磷酸酯三酯鍵：

將混合物在真空下濃縮并且將殘留物溶解于無水吡啶中的0.2mpads溶液(2.5當量)內。將混合物在室溫攪拌45分鐘。將溶液過濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮并且隨acn共蒸發3次。

將殘留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10當量)處理15分鐘。借助添加meoh和吡啶猝滅反應。在真空下移除溶劑，并且使用dcm/meoh作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化殘留物。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.b：制備h-膦酸酯的一般方案：

將適當保護的磷酰亞胺或商業磷酰亞胺溶解于acn的溶液中。向溶液添加水(2當量)和吡啶tfa(1.2當量)，并且將混合物攪拌15分鐘。隨后，在真空下移除溶劑。將殘留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10當量)處理15分鐘。借助添加meoh和吡啶猝滅反應。在真空下移除溶劑，并且使用dcm/meoh作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化殘留物。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.c：合成二核苷酸的方案：

在分子篩存在下，向溶液中實施例1.a的化合物或適當保護的化合物的溶液(0.1mol/l，2當量)一次性添加適當保護的磷酰亞胺或商業磷酰亞胺。將混合物攪拌30分鐘。

對于磷酸三酯鍵：

將癸烷中的叔丁基過氧化氫(5.5m，2當量)添加至混合物，將所述混合物攪拌40分鐘。將溶液過濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮。

對于硫代磷酸酯三酯鍵：

將混合物在真空下濃縮并且將殘留物溶解于無水吡啶中的0.2mpads溶液(2.5當量)內。將混合物在室溫攪拌45分鐘。將溶液過濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮并且隨acn共蒸發3次。

將殘留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10當量)處理15分鐘。通過添加meoh和吡啶猝滅反應。在真空下移除溶劑，并且使用dcm/meoh作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化殘留物。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.d：合成二核苷酸的備選方案：

在分子篩存在下，向(0.1mol/l，2當量)溶液中實施例1.b的化合物的溶液一次性添加適當保護的磷酰亞胺或商業磷酰亞胺。將混合物攪拌30分鐘。

對于磷酸三酯鍵：

將癸烷中的叔丁基過氧化氫(5.5m，2當量)添加至混合物，將所述混合物攪拌40分鐘。將溶液過濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮。

對于硫代磷酸酯三酯鍵：

將混合物在真空下濃縮并且將殘留物溶解于無水吡啶中的0.2mpads溶液(2.5當量)內。將混合物在室溫攪拌45分鐘。將溶液過濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮并且隨acn共蒸發3次。

將殘留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10當量)處理15分鐘。借助添加meoh和吡啶猝滅反應。在真空下移除溶劑，并且使用dcm/meoh作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化殘留物。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.e：移除烯丙基的方案：

向來自實施例1.c的二核苷酸在丙酮中的溶液添加碘化鈉(10當量)，并且將所產生的懸液在回流下攪拌2小時。通過過濾收集所產生的無色沉淀物并且用冷丙酮洗滌。這種沉淀物具有高度吸濕性并且因此立即用于下一個程序中。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.f：移除烯丙基的備選方案：

向來自實施例1.c的二核苷酸在無水thf中的溶液添加n-甲基苯胺(3當量)和四(三苯基膦)鈀(0)(0.2當量)。將所得到的懸液在室溫攪拌15分鐘。隨后，在真空下移除溶劑并且將殘留物隨二乙醚一起粉碎。通過過濾收集所產生的無色沉淀物并且用冷二乙醚洗滌。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化這種沉淀物。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.g：二核苷酸環化的方案：

將實施例1.e或1.f中獲得的固體隨無水吡啶并且隨后隨無水acn一起共蒸發3次。將殘留物懸浮于thf中，并且向所產生的不均勻混合物連續添加n-甲基咪唑(10當量)和2,4,6-三異丙基苯磺酰氯(10當量)。將所產生的混合物在25℃攪拌3小時至36小時。隨后，在真空下移除溶劑并將殘留物隨etoac一起粉碎。通過過濾收集所產生的無色沉淀物并且用冷etoac洗滌。這種沉淀物在不作任何進一步純化的情況下用于下一個步驟中。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.h：二核苷酸環化的備選方案：

從實施例1.e或1.f中獲得的固體隨無水吡啶一起共蒸發3次。將殘留物懸浮于無水吡啶中，并且向所得溶液添加1-(均三甲苯-2-磺酰)-3-硝基-1,2,4-三唑(msnt)(5當量)。將所產生的混合物在25℃攪拌3小時至18小時。隨后，在真空下移除溶劑，并且將所產生的產物在不作任何進一步純化的情況下用于下一個步驟中。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.i：二核苷酸環化的備選方案：

將實施例1.d中獲得的固體或適當保護的化合物隨無水吡啶一起共蒸發3次。將殘留物懸浮于無水吡啶中，并且向所得溶液添加5,5-二甲基-2-氧代-2-氯-1,3,2-二氧磷雜環己烷(dmocp)(3當量)。將所產生的混合物在25℃攪拌3小時至18小時。

對于磷酸二酯鍵：

添加碘(1.3當量)和水(30當量)至混合物。在10分鐘后，直接添加nahso3(0.15％)水溶液直至觀察到完全褪色，并且隨后添加nahco3水溶液。將水層用etoac/et2o的1:1(v/v)混合物提取3次。將有機層匯集，在mgso4上干燥，過濾并且隨后在真空下濃縮。

對于硫代磷酸酯三酯鍵：

添加元素硫(5當量)。將混合物在室溫攪拌45分鐘。隨后將混合物在真空下濃縮并且隨甲苯一起共蒸發3次，在acn中沉淀以移除過量硫并濃縮至干燥。

殘留物在不作任何進一步純化的情況下用于下一個步驟中。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.j：環狀二核苷酸去保護和純化的方案：

將實施例1.g、1.h或1.i的受保護環狀二核苷酸用etoh中的甲胺溶液(33％)處理，并且將所產生的混合物在50℃攪拌4小時。將反應混合物濃縮，并且將所產生的殘留物真空干燥。將干燥的材料與et3n·3hf(25當量)混合并且在25℃攪拌6小時。向這種混合物添加1m甲酸銨緩沖溶液，并且將混合物在30℃至40℃劇烈攪拌10分鐘。將所得到的沉淀物過濾，并且使用c18sunfire柱(19x150mm，5μm)和甲酸銨/acn作為洗脫液，對濾液進行制備性hplc。將含有所需化合物的級分匯總并凍干。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

實施例1.k：環狀二核苷酸去保護和純化的方案：

將實施例1.g、1.h或1.i的受保護環狀二核苷酸用etoh中的甲胺溶液(33％)處理，并且將所產生的混合物在50℃攪拌4小時。將反應混合物濃縮，并且使用c18sunfire柱(19x150mm，5μm)和甲酸銨/acn作為洗脫液，對所產生的殘留物進行制備性hplc。將含有所需化合物的級分匯總并凍干。通過lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時的離子證實化合物的結構。

使用與實施例1.b中所述相似的程序，從市售的腺苷磷酰亞胺制備中間體1，以提供6.20g(93％產率)中間體1。lc-ms：rt＝4.41分鐘，m/z＝550[m+h]⁺，m/z＝548[m-h]^-。

使用與實施例1.d中所述相似的程序，從中間體1和市售的肌苷磷酰亞胺制備中間體2，以提供8.04g(68％產率)中間體2。lc-ms：rt＝5.22分鐘，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用與實施例1.i中所述相似的程序，從中間體2制備中間體3，以提供8.04g(68％產率)中間體3。lc-ms：rt＝5.41分鐘，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

向在無水吡啶(200ml)中的肌苷(10.0g，37.2mmol)溶液添加tipscl2(14.1g，44.7mmol)。將溶液在室溫攪拌18小時。隨后，通過添加meoh(50ml)猝滅反應并且在真空下移除溶劑。將殘余物溶解于etoac中并且用飽和nahco3水溶液、水和鹽水洗滌。將有機層在mgso4上干燥，過濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化粗制化合物，以產生13.5g(70％產率)中間體4。lc-ms：rt＝5.32分鐘，m/z＝511[m+h]⁺，m/z＝509[m-h]^-。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)13.04(s,1h),8.10(s,1h),8.03(s,1h),5.99(s,1h),4.93(t,1h),4.50(d,1h),4.11(m,3h),1.83(m,4h),1.09(m,32h)。

向中間體4(5g，9.79mmol)在無水dcm(75ml)中的溶液添加3,4-二氫-2h-吡喃(24.7g，293.7mmol)和ppts(7.38g，29.37mmol)。將溶液在室溫攪拌18小時。隨后，通過飽和nahco3溶液猝滅反應。分離不同的層，并且將有機層用水和鹽水洗滌，在mgso4上干燥，過濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化粗制化合物，以產生4.71g(80％產率)中間體5。lc-ms：rt＝6.72分鐘，m/z＝595[m+h]⁺，m/z＝593[m-h]^-。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)12.89(d,1h),8.12(s,1h),8.09(s,1h),8.04(d,1h),6.05(d,1h),5.07(t,1h),4.76(m,1h),4.53(m,2h),4.40-4.05(m,5h),1.85-1.55(m,10h),1.04(m,32h)。

向中間體5(4.71g，7.92mmol)在thf(100ml)中的溶液添加硅膠上的tbaf(10.56g，15.84mmol)。將溶液在室溫攪拌3小時。隨后，過濾反應，用thf洗滌硅膠，并且在真空下濃縮濾液。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化粗制化合物，以產生2.7g(96％產率)中間體6。lc-ms：rt＝4.32分鐘，m/z＝353[m+h]⁺，m/z＝351[m-h]^-。

向中間體6(2.70g，7.66mmol)在無水吡啶(40ml)中的溶液逐滴添加dmtrcl(2.17g，6.42mmol)在dcm(5ml)中的溶液。將溶液置于室溫2小時。隨后，通過添加5％nahco3水溶液(110ml)猝滅反應，將水層用dcm提取3次。將有機層匯集并在mgso4上干燥，過濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh中的1％吡啶作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化殘余物，以產生4.78g(95％產率)中間體7。lc-ms：rt＝6.80分鐘，m/z＝655[m+h]⁺，m/z＝653[m-h]^-。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)12.80(s,1h),8.02(s,1h),8.00(s,1h),7.71(m,2h),7.73(m,2h),7.24(m,9h),6.20(d,1h),5.07(t,1h),4.83(m,1h),4.35(m,2h),3.78(s,6h),3.45-3.30(m,4h),1.77-1.56(m,6h)。

向中間體7(4.78g，7.30mmol)在無水吡啶(40ml)中的溶液添加咪唑(1.29g，18.98mmol)和tbdmscl(1.43g，9.49mmol)，將反應在室溫攪拌18小時。隨后，用dcm(100ml)稀釋反應，用飽和nahco3水溶液、水和鹽水洗滌溶液。將有機層在mgso4上干燥，過濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh中的1％吡啶作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化殘余物，以產生5.12g(91％產率)中間體8。lc-ms：rt＝8.15分鐘，m/z＝769[m+h]⁺，m/z＝767[m-h]^-。1hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)12.70(s,1h),8.02(s,1h),7.97(s,1h),7.40(m,2h),7.26(m,11h),6.09(d,1h),4.80(m,1h),4.36(m,1h),4.16(m,2h),3.72(s,6h),3.45-3.26(m,4h),1.61-1.37(m,8h),0.81(s,9h),0.09(dd,6h)。

將中間體8(4.93g，6.41mmol)溶解于znbr2(0.5m)在dcm/iproh(1/1)(40ml，19.3mmol)中的溶液中。將溶液在室溫攪拌40分鐘。用1nnahco3溶液中和反應。分離不同的層，并且將有機層用水和鹽水洗滌，在mgso4上干燥，過濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過硅膠柱色譜純化殘留物，以產生2.68g(90％產率)中間體9。lc-ms：rt＝6.22分鐘，m/z＝467[m+h]⁺，m/z＝465[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體9和市售的腺苷磷酰亞胺制備中間體10，以產生1.9g(64％產率)中間體10。rt＝6.99分鐘，m/z＝1068[m+h]⁺，m/z＝1066[m-h]^-。

向中間體10(1.9g，1.78mmol)在無水吡啶(20ml)中的溶液添加二苯基亞磷酸酯(1.25g，5.34mmol)。將反應在室溫攪拌2小時。向反應添加0.1mteaa溶液(53ml，5.34mmol)。將反應在室溫攪拌45分鐘。隨后，在真空下移除溶劑并將殘留物溶解于dcm(100ml)中。將有機層用nahco3(5％)水溶液，水和鹽水洗滌，在mgso4上干燥，過濾并且隨后在真空下濃縮，以產生2.0g(99％產率)粗制中間體11。這種中間體在不作任何進一步純化的情況下用于下一個步驟中。lc-ms：rt＝6.06分鐘，m/z＝1132[m+h]⁺，m/z＝1130[m-h]^-。

將中間體11(2.0g，2.12mmol)用dca10％在dcm(50ml)中的溶液處理。將反應在室溫攪拌2小時。隨后，通過添加吡啶(17ml)中和反應。在真空下移除溶劑以產生2.2g(100％產率)粗制中間體12。這種中間體在不作任何進一步純化的情況下用于下一個步驟中。lc-ms：rt＝7.38分鐘，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用與實施例1.i中所述相似的程序，從中間體12制備中間體13，以提供1.73g(83％產率)中間體13。lc-ms：rt＝7.20分鐘，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體9和市售的腺苷磷酰亞胺制備中間體14，以提供1.9g(60％產率)中間體14。rt＝7.08分鐘，m/z＝1068[m+h]⁺，m/z＝1066[m-h]^-。

向中間體14(1.9g，1.78mmol)在無水吡啶(20ml)中的溶液添加二苯基亞磷酸酯(1.25g，5.34mmol)。將反應在室溫攪拌2小時。向反應添加0.1mteaa溶液(53ml，5.34mmol)。將反應在室溫攪拌45分鐘。隨后，在真空下移除溶劑并將殘留物溶解于dcm(100ml)中。將有機層用nahco3(5％)水溶液，水和鹽水洗滌，在mgso4上干燥，過濾并且隨后在真空下濃縮，以產生2.0g(99％產率)粗制中間體15。這種中間體在不作任何進一步純化的情況下用于下一個步驟中。lc-ms：rt＝6.11分鐘，m/z＝1132[m+h]⁺，m/z＝1130[m-h]^-。

將中間體15(2.0g，1.76mmol)用dca10％在dcm(50ml，85.0mmol)中的溶液處理。將反應在室溫攪拌2小時。隨后，通過添加吡啶(17ml，177.0mmol)中和反應。在真空下移除溶劑以產生1.8g(100％產率)粗制中間體16。這種中間體在不作任何進一步純化的情況下用于下一個步驟中。lc-ms：rt＝5.39分鐘，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用與實施例1.i中所述相似的程序，從中間體16制備中間體17，以提供1.5g(75％產率)中間體17。lc-ms：rt＝5.41分鐘，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

使用與實施例1.b中所述相似的程序，從市售的腺苷磷酰亞胺制備中間體18，以提供1.1g(94％產率)中間體18。lc-ms：rt＝4.47分鐘，m/z＝550[m+h]⁺，m/z＝548[m-h]^-。

使用與實施例1.d中所述相似的程序，從中間體18和市售的肌苷磷酰亞胺制備中間體19，以提供410mg(44％產率)中間體19。rt＝4.70分鐘，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用與實施例1.i中所述相似的程序，從中間體19制備中間體20，以提供364mg(89％產率)中間體20。lc-ms：rt＝5.66分鐘，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

使用與實施例1.d中所述相似的程序，從中間體1和市售的肌苷磷酰亞胺制備中間體21，以提供1.05g(65％產率)中間體21。lc-ms：rt＝5.42和5.52分鐘，m/z＝1064[m+h]⁺，m/z＝1062[m-h]^-。

使用與實施例1.i中所述相似的程序，從中間體21制備中間體22，以提供579mg(55％產率)中間體22。lc-ms：rt＝5.61和5.71分鐘，m/z＝1078[m+h]⁺，m/z＝1076[m-h]^-。

使用與實施例1.a中所述相似的程序，從市售的2’-脫氧腺苷磷酰亞胺制備中間體23，以提供1.84g(95％產率)中間體23。lc-ms：rt＝4.31分鐘，m/z＝529[m+h]⁺，m/z＝527[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體23和市售的2'-脫氧肌苷磷酰亞胺制備中間體24，以提供500mg(32％產率)中間體24。rt＝5.28分鐘，m/z＝896[m+h]+，m/z＝894[m-h]-。

使用與實施例1.e中所述相似的程序，從中間體24制備中間體25，以提供390mg(83％產率)中間體25。lc-ms：rt＝3.35分鐘，m/z＝856[m+h]⁺，m/z＝854[m-h]^-。

使用與實施例1.g中所述相似的程序，從中間體25制備中間體26，以提供0.38g(99％產率)中間體26。lc-ms：rt＝3.91分鐘，m/z＝838[m+h]⁺，m/z＝836[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體23和市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體27，以提供3.16g(62％產率)中間體27。rt＝4.27分鐘，m/z＝914[m+h]⁺，m/z＝912[m-h]^-。

使用與實施例1.e中所述相似的程序，從中間體27制備中間體28，以提供1.10g(69％產率)中間體28。lc-ms：rt＝3.52分鐘，m/z＝874[m+h]⁺，m/z＝872[m-h]^-。

使用與實施例1.h中所述相似的程序，從中間體28制備中間體29，以提供1.01g(99％產率)中間體29。lc-ms：rt＝4.23和4.07分鐘，m/z＝856[m+h]⁺，m/z＝854[m-h]^-。

使用與實施例1.a中所述相似的程序，從市售的2'-脫氧-2'-氟腺苷磷酰亞胺制備中間體30，以提供2.68g(85％產率)中間體30。lc-ms：rt＝4.50分鐘，m/z＝547[m+h]⁺，m/z＝545[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體30和商業的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體31，以提供2.53g(55％產率)中間體31。rt＝4.39分鐘，m/z＝932[m+h]⁺，m/z＝930[m-h]^-。

使用與實施例1.e中所述相似的程序，從中間體31制備中間體32，以提供4.4g(92％產率)中間體32。lc-ms：rt＝3.58和3.59分鐘，m/z＝892[m+h]⁺，m/z＝891[m-h]^-。

使用與實施例1.g中所述相似的程序，從中間體32制備中間體33，以提供1.40g(99％產率)中間體33。lc-ms：rt＝4.21和4.42分鐘，m/z＝874[m+h]⁺，m/z＝872[m-h]^-。

使用與實施例1.a中所述相似的程序，從市售的2'-脫氧-2'-氟腺苷磷酰亞胺制備中間體34，以提供647mg(55％產率)中間體34。lc-ms：rt＝5.06分鐘，m/z＝563[m+h]⁺，m/z＝561[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體34和市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體35，以提供447mg(35％產率)中間體35。rt＝6.20分鐘，m/z＝964[m+h]⁺，m/z＝962[m-h]^-。

使用與實施例1.e中所述相似的程序，從中間體35制備中間體36，以提供232mg(43％產率)中間體36。lc-ms：rt＝4.25和4.55分鐘，m/z＝924[m+h]⁺，m/z＝922[m-h]^-。

使用與實施例1.g中所述相似的程序，從中間體36制備中間體37，以提供35mg(36％產率)中間體37。lc-ms：rt＝5.00和5.32分鐘，m/z＝906[m+h]⁺，m/z＝904[m-h]^-。

使用與實施例1.b中所述相似的程序，從市售的腺苷2’-磷酰亞胺制備中間體38，以提供1.81g(95％產率)中間體38。lc-ms：rt＝4.53分鐘，m/z＝550[m+h]⁺，m/z＝548[m-h]^-。

使用與實施例1.d中所述相似的程序，從中間體38和市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體39，以提供340mg(55％產率)中間體39。rt＝4.28分鐘，m/z＝935[m+h]⁺，m/z＝933[m-h]^-。

使用與實施例1.i中所述相似的程序，從中間體39制備中間體40，以提供340mg(95％產率)中間體40。lc-ms：rt＝4.44分鐘，m/z＝933[m+h]⁺，m/z＝931[m-h]^-。

使用與實施例1.a中所述相似的程序，從市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體41，以提供600mg(98％產率)中間體41。lc-ms：rt＝3.78分鐘，m/z＝444[m+h]⁺，m/z＝442[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體41和市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體42，以提供610mg(55％產率)中間體42。rt＝5.50分鐘，m/z＝829[m+h]⁺，m/z＝827[m-h]^-。

使用與實施例1.f中所述相似的程序，從中間體42制備中間體43，以提供580mg(90％產率)中間體43。lc-ms：rt＝3.40分鐘，m/z＝789[m+h]⁺，m/z＝787[m-h]^-。

使用與實施例1.h中所述相似的程序，從中間體43制備中間體44，以提供500mg(99％產率)中間體44。lc-ms：rt＝3.86分鐘，m/z＝771[m+h]⁺，m/z＝769[m-h]^-。

使用與實施例1.a中所述相似的程序，從市售的2’-脫氧-2’-氟鳥苷磷酰亞胺制備中間體45，以提供3.75g(60％產率)中間體45。lc-ms：rt＝4.25分鐘，m/z＝529[m+h]⁺，m/z＝527[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體45和市售的2’-脫氧-2’-氟鳥苷磷酰亞胺制備中間體46，以提供1.07g(67％產率)中間體46。rt＝4.80分鐘，m/z＝999[m+h]⁺，m/z＝997[m-h]^-。

使用與實施例1.f中所述相似的程序，從中間體46制備中間體47，以提供610mg(99％產率)中間體47。lc-ms：rt＝4.05分鐘，m/z＝959[m+h]⁺，m/z＝957[m-h]^-。

使用與實施例1.h中所述相似的程序，從中間體47制備中間體48，以提供580mg(96％產率)中間體48。lc-ms：rt＝4.77分鐘，m/z＝941[m+h]⁺，m/z＝939[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體45和市售的2'-脫氧-2'-氟腺苷磷酰亞胺制備中間體49，以提供4.96g(68％產率)中間體49。rt＝4.98分鐘，m/z＝1017[m+h]⁺，m/z＝1015[m-h]^-。

使用與實施例1.e中所述相似的程序，從中間體47制備中間體50，以提供4.4g(92％產率)中間體50。lc-ms：rt＝4.36分鐘，m/z＝977[m+h]⁺，m/z＝975[m-h]^-。

使用與實施例1.g中所述相似的程序，從中間體50制備中間體51，以提供4.30g(99％產率)中間體51。lc-ms：rt＝5.72分鐘，m/z＝838[m+h]⁺，m/z＝836[m-h]^-。

使用與實施例1.a中所述相似的程序，從市售的2’-脫氧-2’-氟鳥苷磷酰亞胺制備中間體52，以提供632mg(50％產率)中間體52。lc-ms：rt＝5.86分鐘，m/z＝545[m+h]⁺，m/z＝543[m-h]^-。

使用與實施例1.c中所述相似的程序，從中間體52和市售的2'-脫氧-2'-氟腺苷磷酰亞胺制備中間體53，以提供310mg(25％產率)中間體53。rt＝6.60分鐘，m/z＝1049[m+h]⁺，m/z＝1047[m-h]^-。

使用與實施例1.e中所述相似的程序，從中間體53制備中間體54，以提供100mg(33％產率)中間體54。lc-ms：rt＝4.58和4.70分鐘，m/z＝1009[m+h]⁺，m/z＝1007[m-h]^-。

使用與實施例1.g中所述相似的程序，從中間體54制備中間體55，以提供75mg(76％產率)中間體55。lc-ms：rt＝5.32和5.54分鐘，m/z＝991[m+h]⁺，m/z＝989[m-h]^-。

中間體56：特戊酸碘甲酯

將特戊酸氯甲酯(1.0g，6.64mmol)在無水acn(15ml)中的溶液用碘化鈉(1.9g，13.28mmol)處理。將混合物在室溫在黑暗下攪拌過夜。隨后在真空下移除溶劑并將殘留物溶解于dcm中。將溶液用水、5％nahso3溶液和鹽水洗滌。將有機層在mgso4上干燥，過濾并且在真空下濃縮以提供1.22g粗制中間體53，所述中間體在不作任何進一步純化的情況下用于下一個步驟中。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)5.86(s,2h),1.12(s,9h)。

使用與實施例1.j中所述相似的程序，從中間體3制備實施例1.1，以提供2.4g(60％產率)實施例1.1。lc-ms：rt＝2.72分鐘，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.34(s,1h),8.27(s,1h),8.10(s,1h),7.86(s,1h),5.94(s,2h),5.06-4.80(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h)。

使用與實施例1.j中所述相似的程序，從中間體13制備實施例1.2，以提供22.5mg(21％產率)實施例1.2。lc-ms：rt＝2.46分鐘，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.27(s,1h),8.15(s,1h),8.04(s,1h),7.88(s,1h),5.99(s,2h),4.95(m,2h),4.86(m,1h),4.42(m,4h),4.05(m,2h)。

使用與實施例1.j中所述相似的程序，從中間體17制備實施例1.3，以提供17.5mg(22％產率)實施例1.3。lc-ms：rt＝1.35分鐘，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.44(s,1h),8.13(s,1h),8.08(s,1h),8.07(s,1h),6.20(d,1h),6.07(d,1h),5.22(m,1h),4.91(m,1h),4.79(m,2h),4.63(m,1h),4.56(m,1h),4.22(m,2h),4.07(m,2h)。

使用與實施例1.j中所述相似的程序，從中間體20制備實施例1.4，以提供50mg(19％產率)實施例1.4。lc-ms：rt＝1.53分鐘，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.50(s,1h),8.14(s,1h),8.13(s,1h),8.09(s,1h),6.24(d,1h),6.08(s,1h),5.20(m,1h),4.83-4.73(m,2h),4.58(d,1h),4.40(m,2h),4.26(m,2h),4.04(m,2h)。

使用與實施例1.j中所述相似的程序，從中間體22制備實施例1.5，以提供7mg(20％產率)實施例1.5。lc-ms：rt＝3.45分鐘，m/z＝692[m+h]⁺，m/z＝690[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.54(s,1h),8.37(s,1h),8.22(s,1h),7.97(s,1h),6.65(dd,1h),6.15(dd,1h),4.60-4.50(m,4h),4.45(m,4h),4.05(m,2h)。

使用與實施例1.k中所述相似的程序，從中間體26制備實施例1.6，以提供90mg(31％產率)實施例1.6。lc-ms：rt＝2.47分鐘，m/z＝628[m+h]⁺，m/z＝626[m-h]^-。¹hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm)8.37(s,1h),8.32(s,1h),8.13(s,1h),8.05(s,1h),7.26(sl,2h),6.28(m,2h),4.68(m,2h),4.08(m,2h),3.85(m,2h),2.83(m,2h)。

使用與實施例1.k中所述相似的程序，從中間體29制備實施例1.7，以提供40mg(21％產率)實施例1.7。lc-ms：rt＝1.97分鐘，m/z＝646[m+h]⁺，m/z＝644[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.29(s,1h),8.12(s,1h),7.98(s,1h),7.88(s,1h),6.25(m,2h),5.54(m,1h),5.07(m,2h),4.37(m,4h),4.06(m,2h)。

使用與實施例1.k中所述相似的程序，從中間體33制備實施例1.8，以提供104mg(10％產率)實施例1.8。lc-ms：rt＝2.78分鐘，m/z＝664[m+h]⁺，m/z＝662[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.37(s,1h),8.35(s,1h),8.14(s,1h),7.95(s,1h),6.23(m,2h),5.45(m,2h),5.39(m,1h),4.95(m,2h),4.50(m,2h),4.06(m,2h)。

使用與實施例1.k中所述相似的程序，從中間體37制備實施例1.9，以提供10mg(18％產率)實施例1.9。lc-ms：rt＝3.41分鐘，m/z＝696[m+h]⁺，m/z＝694[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.55(s,1h),8.38(s,1h),8.20(s,1h),7.99(s,1h),6.63(dd,1h),6.15(dd,1h),5.16-4.95(m,4h),4.52(m,4h),4.07(m,2h)。

使用與實施例1.j中所述相似的程序，從中間體40制備實施例1.10，以提供50mg(19％產率)實施例1.10。lc-ms：rt＝2.25分鐘，m/z＝662[m+h]⁺，m/z＝660[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.58(s,1h),8.35(s,1h),8.12(s,1h),7.97(s,1h),6.65(d,1h),6.16(d,1h),4.50(m,2h),5.15(m,2h),4.41(m,4h),4.02(m,1h),3.73(m,1h)。

使用與實施例1.k中所述相似的程序，從中間體44制備實施例1.11，以提供157mg(35％產率)實施例1.11。lc-ms：rt＝1.48分鐘，m/z＝665[m+h]⁺，m/z＝663[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.34(s,2h),8.08(s,2h),7.85(s,2h),6.21(m,2h),5.66(m,1h),5.49(m,1h),5.20(m,2h),4.97(m,4h),4.06(m,2h)。

使用與實施例1.k中所述相似的程序，從中間體48制備實施例1.12，以提供15mg(5％產率)實施例1.12。lc-ms：rt＝1.58分鐘，m/z＝695[m+h]⁺，m/z＝693[m-h]^-.1hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.70(s,2h),6.05(d,2h),5.06-4.05(m,8h),4.08(m,2h)。

使用與實施例1.k中所述相似的程序，從中間體51制備實施例1.13，以提供320mg(31％產率)實施例1.13。lc-ms：rt＝2.48分鐘，m/z＝679[m+h]⁺，m/z＝677[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.17(s,1h),7.83(s,1h),7.63(s,1h),6.09(d,1h),5.94(d,1h),5.62(m,1h),5.50(m,1h),5.15(m,2h),4.42(m,4h),4.03(m,2h)。

使用與實施例1.k中所述相似的程序，從中間體55制備實施例1.14，以提供15mg(28％產率)實施例1.14。lc-ms：rt＝2.66分鐘，m/z＝711[m+h]⁺，m/z＝709[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.58(s,1h),8.35(s,1h),7.97(s,1h),6.65(d,1h),6.19(d,1h),4.94(d,1h),4.62-4.50(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h)。

向實施例1.14(7mg，9.85μmol)在水(200μl)中的溶液逐滴添加中間體56(19mg，79.0μmol)在丙酮(500μl)中的溶液。將混合物在黑暗下攪拌過夜。隨后，將混合物用na2s2o3飽和溶液(15μl)中和并隨后用水(10ml)稀釋。水層用etoac(3x10ml)提取3次。將有機層匯集，在mgso4上干燥，過濾并且在真空下濃縮以提供4mg(45％產率)實施例1.15。lc-ms：rt＝4.11分鐘，m/z＝907[m+h]⁺，m/z＝905[m-h]^-。¹hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm)8.61(s,1h),8.37(s,1h),8.00(s,1h),6.70(d,1h),6.22(d,1h),4.70-4.50(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h),3.77(s,4h),1.20(s,18h)。

向實施例1.9(5mg，7.19μmol)在水(200μl)中的溶液逐滴添加中間體56(17mg，70μmol)在丙酮(500μl)中的溶液。將混合物在黑暗下攪拌過夜。隨后，將混合物用na2s2o3飽和溶液(15μl)中和并隨后用水(10ml)稀釋。水層用etoac(3x10ml)提取3次。將有機層匯集，在mgso4上干燥，過濾并且在真空下濃縮以提供5mg(78％產率)實施例1.16。lc-ms：rt＝4.55分鐘，m/z＝892[m+h]⁺，m/z＝890[m-h]^-。¹hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm)8.61(s,1h),8.37(s,1h),8.00(s,1h),6.70(d,1h),6.22(d,1h),4.70-4.50(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h),3.77(s,4h),1.20(s,18h)。

實施例2：生物學測定法

我們已經確定本發明的幾種環狀二核苷酸在人類或動物細胞中誘導多種細胞因子的產生。具體而言，這些環狀二核苷酸誘導i型干擾素和/或促炎細胞因子的產生。本文報告一組代表性的這些環狀二核苷酸的體外細胞因子誘導活性需要真核細胞受體干擾素基因刺激物(sting)的存在。

體外細胞因子誘導作用

已經通過使用不同報告細胞系展示了本發明中公開的非氟化環狀二核苷酸對氟化環狀二核苷酸的細胞因子誘導活性。下文解釋細胞系和實驗。

細胞系

全部細胞系均從invivogen獲得。本文描述它們并提供其相應的invivogen目錄代碼。

thp1-dual^tm(invivogen目錄代碼：thpd-nfis)：通過穩定整合兩個誘導型報道構建體，從人單核細胞系thp-1衍生這些細胞。它們使得同時研究sting的兩個主要信號傳導途徑成為可能：通過監測分泌型胚堿性磷酸酶(seap)活性研究nf-κb途徑；和通過評估分泌性螢光素酶(lucia)的活性研究irf途徑。

當使用quanti-blue^tm(invivogen目錄代碼：rep-qb1)(在seap存在下變成紫/藍色的seap檢測試劑(通過測量620nm至655nm的光密度定量))和quanti-luc^tm(invivogen；目錄代碼：rep-qlc1)(測量螢光素酶表達以報告isg54表達(作為ifn-α/β產生的指示物)的發光酶測定法)時，在細胞培養上清液中可容易地測量兩種報道蛋白。

luciaisg細胞系：以下兩個細胞系各自在irf誘導型啟動子控制下表達分泌型螢光素酶(lucia)報道基因。這種復合啟動子包含與人isg54基因的最小啟動子融合的五個ifn-刺激反應元件(isre)，所述最小啟動子不響應于nf-κb途徑或ap-1途徑的激活物。因此，這些細胞使得基于螢光素酶(lucia)活性監測irf途徑成為可能。在本發明中，對irf途徑的監測用來測量主題環狀二核苷酸的sting激動劑活性。

1.raw-lucia^tmisg(invivogen目錄代碼：rawl-isg)：這些細胞從鼠raw264.7巨噬細胞細胞系產生。

2.raw-lucia^tmisg-ko-sting(invivogen目錄代碼：rawl-kostg)：通過sting基因的穩定純合敲除，從raw-lucia^tmisg54細胞系(見上文)產生這些細胞。

b16blue^tmisg54細胞系：以下兩個細胞系各自在啟動子下表達seap報道基因：i-isg54報道分子，其包含由多聚體isre增強的ifn誘導型isg54啟動子。用干擾素或i型干擾素的或nf-κb途徑的誘導物刺激這些細胞，觸發i-isg54啟動子的激活(和因此產生seap)或ifn-β最小啟動子的激活(和因此產生tnf-α)。可以使用quanti-blue^tm(invivogen目錄代碼：rep-qb1)(在seap存在下變成紫/藍色的試劑)，通過測量620nm至655nm的光密度，輕易測定上清液中seap的水平。

1.b16-blue^tmisg(invivogen目錄代碼：bb-ifnabg)：這些細胞從鼠b16f1黑色素瘤細胞株系衍生。使用quanti-blue^tm測量這些細胞中i型干擾素的產生。

2.b16-blue^tmisg-ko-sting(invivogen目錄代碼：bb-kostg)：這些細胞通過sting基因的穩定純合敲除，從b16-blue^tmisg細胞系(見上文)產生這些細胞。使用quanti-blue^tm測量這些細胞中i型干擾素的產生。

hek-blue^tm細胞系：以下三個細胞系也用于cdn的生物學評價。

1.hek-blue^tmifn-α/β-ko-sting：這些細胞從其中sting基因已經失活的hek-blue^tmifn-α/β細胞(invivogen目錄代碼：hkb-ifnab)衍生。hek-blue^tmifn-α/β細胞能夠實現通過監測isgf3途徑活化檢測生物活性的人i型ifn。通過用人stat2基因和irf9基因穩定轉染hek293細胞以獲得有完整活性的i型ifn信號傳導途徑，產生這些細胞。該途徑的其他基因(ifnar1、ifnar2、jak1、tyk2和stat1)天然地以足夠量表達。細胞進一步用ifn-α/β誘導型isg54啟動子控制下的seap報道基因轉染。用人ifn-α或ifn-β刺激hek-blue^tmifn-α/β細胞激活了jak/stat/isgf3途徑并隨后誘導seap的產生。使用quanti-blue^tm測量這些細胞中i型干擾素的產生。

2.hek-blue^tmil-1r(invivogen目錄代碼：hkb-il1r)：hek-blue^tmil-1r細胞設計成通過監測nf-κb途徑和ap-1途徑活化檢測生物活性的人和鼠il-1β。另外，這些細胞檢測來自食蟹猴、犬和大鼠的生物活性il-1β。實際上，hek-blue^tmil-1r細胞可以檢測il-1α和il-1β，因為這些細胞因子與相同受體il-1r結合。這些細胞從其中阻斷tnf-α反應的hek-blue^tmil-1β細胞衍生(invivogen目錄代碼：hkb-il1b)。因此，hek-blue^tmil-1r細胞特異性反應于il-1。這些細胞內源地表達人il-1受體并且用鼠il-1受體穩定轉染，令其對人il-1β和鼠il-1β非常敏感。hek-blue^tmil-1r細胞表達在融合于5個nf-κb結合位點和5個ap-1結合位點的ifn-β最小啟動子控制下的seap報道基因。il-1β與hek-blue^tmil-1r細胞表面上il-1r的結合觸發了導致nf-κb激活和seap后續產生的信號傳導級聯。使用quanti-blue^tm測量這些細胞中il-1β的產生。

3.hek-blue^tmtnf-α(invivogen目錄代碼：hkb-tnfdmyd)：hek-blue^tmtnf-α細胞能夠實現通過監測nf-κb途徑活化而檢測生物活性的人和鼠tnf-α。通過用融合于5個nf-κb結合位點和5個ap-1結合位點的ifn-β最小啟動子控制下的seap報道基因穩定轉染hek293細胞，產生這些細胞。通過敲除myd88基因，進一步使其不響應于il-1β。用tnf-α刺激hek-blue^tmtnf-α細胞觸發了nf-κb誘導型啟動子的激活和seap的產生。使用quanti-blue^tm測量這些細胞中tnf-α的產生。

實驗中il-6的定量

根據制造商的說明(r&dsystems)使用酶聯免疫測定法(elisa)，定量白介素-6。

在細胞培養物中

在將不同細胞培養物分別與環狀二核苷酸孵育的多個實驗，環狀二核苷酸誘導這些細胞中i型干擾素和/或促炎細胞因子的產生，如通過isg54(干擾素刺激基因)報道分子測定法間接地測定(fensterl,white,yamashita和sen,2008)。這些實驗如下文描述那樣進行。

實施例2.1：測量處理的細胞培養物中的細胞因子誘導

·所用的細胞因子報告細胞系：thp1-dual^tm

·受檢的環狀二核苷酸：cl609、cl614、cl656、cl647、cl629、cl626、cl603、cl632和cl633

·參考化合物：c-aimp(invivogen制造)、c-digmp(invivogen目錄代碼：tlrl-cdg)、c-diimp(invivogen目錄代碼：tlrl-cdi)和c-gamp(invivogen目錄代碼：tlrl-cga)

·評價的活性：i型ifn誘導作用和nf-κb途徑誘導作用。

向平底96孔板的每個孔添加20μl環狀二核苷酸溶液(無菌水中100μg/ml)，隨后添加180μl單細胞株系懸液(thp1-dual^tm：大約100,000個細胞/孔)。將平板在37℃在5％co2下孵育18小時至24小時。使用根據制造商的說明制備及使用的quanti-luc^tm間接定量ifn-α/β的水平。使用根據制造商的說明制備及使用的quanti-blue^tm間接定量nf-κb活性。

圖2和圖3中顯示來自這個實驗的結果，所述結果揭示三個重要發現：首先，全部受檢的環狀二核苷酸均在thp1-dual^tm細胞中誘導i型干擾素(圖2)；其次，它們全部在這些細胞中誘導nf-κb途徑(圖3)；并且最后，對于這兩種活性，大部分的氟化環狀二核苷酸比相應的參考化合物(c-aimp、c-digmp、c-diimp和c-gamp)更有活性。

細胞因子誘導活性呈sting依賴性

本發明中公開的環狀二核苷酸在體外未在缺少受體sting的細胞上清液中誘導細胞因子產生。

在野生型(wt)報告細胞和純合sting敲除(stingko)報告細胞各自與環狀二核苷酸獨立孵育18小時至24小時的實驗中，環狀二核苷酸在wt細胞中誘導i型干擾素產生，但在stingko細胞中未誘導。這項發現顯示，環狀二核苷酸在體外在細胞中的細胞因子誘導活性需要sting。這些實驗如下文描述那樣進行。

實施例2.2：在cdn處理的野生型細胞或sting敲除細胞中測量細胞因子誘導作用

·所用的細胞因子報告細胞系：b16-blue^tmisg和raw-lucia^tmisg

·受檢的環狀二核苷酸：cl609、cl614、cl656、cl647、cl629、cl626、cl603、cl632和cl633

·參考化合物：c-aimp(invivogen制造)、c-digmp(invivogen目錄代碼：tlrl-cdg)、c-diimp(invivogen目錄代碼：tlrl-cdi)和c-gamp(invivogen目錄代碼：tlrl-cga)

·所用的細胞系：raw-lucia^tmisg、raw-lucia^tmisg-ko-sting、b16-blue^tmisg和b16-blue^tmisg-ko-sting(取決于實驗)。

這些實驗如實施例2.1中所述那樣進行。

圖4和圖5中顯示來自這個實驗的結果，所述結果揭示了三個重要發現。首先，每種受檢的環狀二核苷酸均在wtb16細胞(圖4)和wtraw細胞(圖5)中誘導i型干擾素產生。其次，這些化合物無一在sting敲除的b16細胞(圖4)或sting敲除的raw細胞(圖5)中顯示出這種活性，因而這表明，這種活性需要sting的存在。最后，大部分的氟化環狀二核苷酸比相應的參考化合物(c-aimp、c-digmp、c-diimp和c-gamp)更有活性。

體內細胞因子誘導作用

本發明中公開的環狀二核苷酸在體內在小鼠中誘導細胞因子。

實施例2.3：在cdn處理的小鼠中測量細胞因子誘導作用

·評價的物種：小鼠

·受檢的環狀二核苷酸：cl604、cl606、cl609、cl611和cl614

·參考化合物：c-aimp和鹽水。

·評價的細胞因子：ifn-α/β(使用rawisg54報告細胞)和il-6(依據elisa)。

將21只小鼠(swiss；雌性；平均年齡：8周)分成7個組，每組三只：一個組充當對照(鹽水)并且其他六個組各自用環狀二核苷酸(或者c-aimp、cl604、cl606、cl609、cl611或cl614)處理。在第7天，從全部小鼠采集基礎細胞因子水平的血液樣品并且貯存在-20℃直至分析。在第1天，通過靜脈內(i.v.)注射，用200μl生理血清(含有0.9％nacl)或200μl環狀二核苷酸(劑量：10mg/kg)在生理血清(含有0.9％nacl)中的溶液處理小鼠。在注射后4小時從小鼠采集血液樣品并且隨后貯存在-20℃直至分析。在來自血液樣品的血清中測量細胞因子誘導作用。

圖6和圖7中顯示來自這個實驗的結果，所述結果揭示了兩個重要發現：首先，在所示的劑量，在處理后4小時范圍內，全部受檢的環狀二核苷酸(cl611例外)均在小鼠中強烈地誘導i型干擾素(圖6)；并且其次，全部環狀二核苷酸(cl611例外)均誘導il-6(圖7)。

實施例2.4：測量cdn在小鼠中的體內消除

我們已經測量了本發明的代表性環狀二核苷酸在小鼠中的體內消除。

·受檢的環狀二核苷酸：cl603、cl609、cl614、cl626和cl656

·參考化合物：c-aimp(invivogen制造)。

將30只小鼠(c57bl/6)分成六個組，每組5只。在每個組內部，用不同的環狀二核苷酸(50mg/kg；靜脈內推注)處理每只小鼠。每個組的小鼠在處理后的不同時間點處死：2分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘或1小時。緊鄰處死前，采集血液樣品(500μl)。將血液樣品采集于肝素管中，并且隨后離心。將上清液(血漿)貯存在–20℃直至分析。在通過高效液相色譜法-質譜法(hlpc/ms)分析之前，血漿樣品如下加工：

血漿：將每種樣品用甲醇按比率1:4處理、振搖和過濾(0.22μm)。將1μl處理的樣品上樣到hplc/ms柱上。

使用以下hplc梯度(a：10mm甲酸銨；b：乙腈；總時間：6分鐘)：100％a1分鐘；隨后4分鐘內100％a至100％b；隨后100％b1分鐘。在不同的時間洗脫每種環狀二核苷酸并且通過測量254nm處的吸光度進行檢測。

圖8中顯示這個實驗的結果，所述結果揭示，氟化環狀二核苷酸在小鼠血液中比非氟化環狀二核苷酸更長地保留。

實施例2.5：比較氟化cdn和非氟化cdn在體外在來自健康人供體的全血中誘導細胞因子的能力

·所用的報告細胞系：hek-blue^tmifn-α/β-ko-sting、hek-blue^tmil-1r和hek-blue^tmtnf-α

·受檢的主題cdn：cl603、cl632、cl614和cl656

·受檢的參比(非氟化)cdn：c-gamp、2’,3’-c-gamp、c-aimp和c-aimp(s)

·評價的活性：i型ifn誘導作用(hek-blue^tmifn-α/β-ko-sting)、il-1誘導作用(hek-blueil-1r)和tnf-α誘導作用(hek-bluetnf-α)。

人血樣品的獲得和處置

在圣迭戈血庫(3636gatewaycenterave,suite100；sandiego,ca92102；美國；www.sandiegobloodbank.org)從健康供體獲得20份人血樣品。簡而言之，在捐贈時通過靜脈穿刺，將樣品采集入肝素鈉(綠蓋)管，并且隨后貯存在4℃直至取件。將管在采集日取件，轉運期間在冰上貯存，并且隨后在同一日與cdn一起檢驗。

人血樣品的處理和檢驗

每份血液樣品在rpmi培養基中稀釋(1:1)并等分入按六個不同濃度(30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml和0.1μg/ml)含有每種cdn的96孔板(180μl孔)。將平板在37℃在co2培養箱中孵育18至20小時。次日，將上清液收集，轉移入圓底96孔板的相應孔，并貯存在-80℃。在后續日，為三個受檢的報告細胞系的每一個如下制備新的96孔板：添加來自先前平板(含有孵育的cdn和血漿)的10μl上清液至新報告細胞平板中的相應孔。隨后，將含有熱滅活血清的培養基中事先收獲并計數的所需報告細胞系的180μl等分細胞添加至每個孔(大約50,000個細胞/孔)，并將平板孵育大約20小時。如先前所描述那樣，使用quanti-blue^tm測定法測定所需的細胞因子誘導活性。簡而言之，轉移來自先前孵育的平板中的20μl上清液至新96孔板的相應孔，所述孔中事先已經添加180μlquanti-blue^tm試劑。

圖9中總結了來自這個實驗的結果，所述結果顯示本發明的代表性氟化cdn和相關的參考cdn的三種細胞因子誘導活性(i型ifn、il-1和tnf-α)。所示值是受檢的整個濃度范圍(30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml和0.03μg/ml)內全部20名供體的總平均數。cdn的活性依據術語“有效濃度”(本文限定為在所示濃度產生至少0.5的seap強度值的cdn)從7個受檢濃度的最低者(0.03μg/ml)至受檢濃度的最高者(30μg/ml)表述。該圖揭示了兩個主要發現：首先，在受檢濃度范圍內，每一個受檢cdn均誘導每種所評估的細胞因子；并且其次，對于每種細胞因子誘導活性，每種氟化cdn比其相應的非氟化類似物更有活性(cl603與c-gamp；cl614與c-aimp；以及cl656與c-aimp[s]比較)。

實施例2.6：比較氟化脫氧核糖-cdn和非氟化核糖-cdn的抗svpd或np1酶切割性，如通過uhplc-ms監測

·所用的酶：蛇毒磷酸二酯酶(svpd)和核酸酶p1(np1)

·受檢的主題cdn：cl603、cl632、cl614和cl656

·受檢的參比(非氟化)cdn：c-gamp和c-aimp

·性能評價：抗酶切割性

我們將每種cdn與已知切割核酸和cdn的兩種酶中任一者孵育，并且隨后通過測量與cdn相對應的峰的面積降幅，觀察隨時間推移受uhplc降解的跡象(根據ms鑒定)。具體而言，我們評估了cdn對蛇毒磷酸二酯酶(svpd)和核酸酶p1(np1)的抗性，所述兩種酶均可以通過切割磷酸二酯核苷酸鍵降解cdn。實驗如下進行：

每種cdn(7μg)分別在37℃的水浴中與(21μl)任一種酶(含有0.6mmmgcl2的pbs緩沖液中的160μgsvpd；或含有2mmzncl2的30mm乙酸鹽緩沖液[ph5.3]中的2.5munp1)的溶液或與水(作為對照)孵育。在0小時至120小時的各個時間點收集等分量的反應混合物，在100℃加熱2分鐘，并且隨后在0℃冷凍。最后，將10μl每種等分試樣直接上樣至hplc(配備uv-檢測器的agilent1290infinityuhplc；柱：watersacquityuplccshc181.7μm[2.1mmx50mm；流量：0.3ml/分鐘]；在254nm檢測；自動進樣器溫度：25℃)供分析。使用以下梯度：100％a(10mm甲酸銨水溶液)1分鐘；隨后經5分鐘100％a至100％b(乙腈)。

通過以下方式計算在每個時間點cdn的吸光度百分數：母cdn相對應的峰面積除以色譜圖中全部峰面積總和，并且隨后乘以100。

圖10a-d中顯示來自這個實驗的結果，所述結果揭示了兩個重要發現：首先，本發明的氟化脫氧核糖-cdn比其相應的非氟化核糖-cdn類似物更抵抗任一種酶的酶降解作用(在圖10a和圖10b中將cl656或cl614與c-aimp比較，并且在圖10c和圖10d中將cl603或cl632與c-gamp比較)；其次；在本發明的氟化脫氧核糖-cdn當中，含有兩個硫代磷酸酯二酯鍵(cl656和cl632)的那些比其含有兩個磷酸二酯鍵的相應類似物(分別是cl614和cl603)具有更多svpd抗性。

實施例2.7：在氟化脫氧核糖-cdn和非氟化核糖-cdn暴露于svpd或np1之前和之后，比較這些cdn的體外活性

·所用的報告細胞系：thp1-dual^tm

·受檢的主題cdn：cl603、cl632、cl614和cl656

·受檢的參比(非氟化)cdn：c-gamp和c-aimp

·評價的活性：i型ifn誘導作用

在這個實驗中，本發明的四種代表性氟化脫氧核糖-cdn(cl603、cl632、cl614和cl656)及其相應的非氟化核糖-cdn類似物(分別是c-gamp和c-aimp)就其抵抗兩種已知的cdn切割酶：蛇毒磷酸二酯酶(svpd)和核酸酶p1(np1)的切割作用的相對穩定性進行比較。它如下文描述那樣進行。

如實施例2.6中所述那樣，將每種cdn(7μg)與svpd、np1或水(作為對照)在水浴中在37℃孵育2小時，并且隨后在100℃孵育10分鐘。將所得的溶液冷卻至室溫。隨后如實施例2.1中所述，將等分量(20μl)的每種溶液分別與thp1-dual^tm細胞(180μl；濃度：100,000個細胞/孔)孵育。如上文解釋，用quanti-luc^tm定量isg54表達(作為ifn-α/β產生的指示物)。

圖11中顯示來自這個實驗的結果，所述結果揭示了兩個重要發現：首先，與任一種酶孵育之前或與單一的水(對照)孵育后，全部cdn均在細胞中誘導isg54表達；并且其次，與任一種酶孵育后，與非氟化核糖-cdn相對應的溶液完全喪失這種活性，而與氟化脫氧核糖-cdn相對應的那些溶液極大保留這種活性。這些結果顯示，氟化脫氧核糖-cdn比其相應的非氟化核糖-類似物更抵抗svpd或np1的酶促切割。

氟化脫氧-環狀二核苷酸的類別效應

我們確定，與其相應非氟化核糖-cdn相比，本發明的氟化脫氧核糖-cdn令人驚訝地顯示出獨特、非顯而易見和先前未報道的類別效應，所述類別效應可以用于涉及操作sting活性的治療應用、診斷應用和研究應用。例如，氟化cdn更有活性，如我們已經在體外通過在不同細胞系中和在全血中測量細胞因子誘導作用而確定。另外，它們在體內消除得更緩慢，如我們已經在小鼠中測定。最后，它們顯示出優越的抗酶切割性。

參考文獻

專利參考文獻：

1.us2015/0056224a1

2.us2014/0329889a1

3.wo2015/077354a1

4.wo2014/189805a1

非專利參考文獻：

1.ablasser,a.,goldeck,m.,cavlar,t.,deimling,t.,witte,g.,rohl,i.,hornung,v.(2013).cgasproducesa2'-5'-linkedcyclicdinucleotidesecondmessengerthatactivatessting.nature,498(7454),380-384。

2.chen,h.,sun,h.,you,f.,sun,w.,zhou,x.,chen,l.,jiang,z.(2011).activationofstat6bystingiscriticalforantiviralinnateimmunity.cell,147(2),436-446。

3.chu,c.k.(2002).recentadvancesinnucleosides:chemistryandchemotherapy:elsevier。

4.danilchanka,o.和mekalanos,j.j.(2013).cyclicdinucleotidesandtheinnateimmuneresponse.cell,154(5),962-970。

5.diner,e.j.,burdette,d.l.,wilson,s.c.,monroe,k.m.,kellenberger,c.a.,hyodo,m.,vance,r.e.(2013).theinnateimmunednasensorcgasproducesanoncanonicalcyclicdinucleotidethatactivateshumansting.cellrep,3(5),1355-1361。

6.dubensky,t.w.,jr.,kanne,d.b.和leong,m.l.(2013).rationale,progressanddevelopmentofvaccinesutilizingsting-activatingcyclicdinucleotideadjuvants.theradvvaccines,1(4),131-143。

7.fensterl,v.,white,c.l.,yamashita,m.和sen,g.c.(2008).novelcharacteristicsofthefunctionandinductionofmurinep56familyproteins.jvirol,82(22),11045-11053。

8.gomelsky,m.(2011).camp,c-di-gmp,c-di-ampandnowcgmp:bacteriausethemall！molmicrobiol,79(3),562-565。

9.hecker,s.j.和erion,m.d.(2008).prodrugsofphosphatesandphosphonates.jmedchem,51(8),2328-2345。

10.herdewijna,p.v.a.a.a.k.l.(1989).synthesisofnucleosidesfluorinatedinthesugarmoiety.theapplicationofdiethylaminosulfurtrifluoridetothesynthesisoffluorinatednucleosides.nucleosidesandnucleotides,8(1),65-96。

11.jones,r.b.,n.(1995).nucleotideprodrugs.antiviralresearch,27(1-2),1-17。

12.li,l.,yin,q.,kuss,p.,maliga,z.,millan,j.l.,wu,h.和mitchison,t.j.(2014).hydrolysisof2'3'-cgampbyenpp1anddesignofnonhydrolyzableanalogs.natchembiol,10(12),1043-1048。

13.rajagopalan,p.b.,f.d；chu,c.k.；tennant,b.c；baldwin,b.h.(2003).antiviralnucleosides:chiralsynthesisandchemotherapy:elsevier。

14.rautio,j.,kumpulainen,h.,heimbach,t.,oliyai,r.,oh,d.,jarvinen,t.和savolainen,j.(2008).prodrugs:designandclinicalapplications.natrevdrugdiscov,7(3),255-270。

15.ross,b.s.s.,r.h.；sprankle,k.g.和vasquez,g.(1997).anefficientandscalablesynthesisofarabinosylguanineand2′-deoxy-2′-fluoro-guanosine.nucleosidesandnucleotides,16(7-9),1645-1647。

16.schinazi,r.f.l.d.c.(2004).frontiersinnucleosides&nucleicacids:ihlpress。

17.shanahan,c.a.,gaffney,b.l.,jones,r.a.和strobel,s.a.(2013).identificationofc-di-gmpderivativesresistanttoanealdomainphosphodiesterase.biochemistry,52(2),365-377。

18.simm,r.,morr,m.,kader,a.,nimtz,m.和romling,u.(2004).ggdefandealdomainsinverselyregulatecyclicdi-gmplevelsandtransitionfromsessilitytomotility.molmicrobiol,53(4),1123-1134。

19.thomas,h.j.,tiwaria,k.n.；claytona,s.j.；secristj.a.；&montgomeryj.a.(1994).synthesisandbiologicactivityofpurine2′-deoxy-2′-fluoro-ribonucleosides.nucleosidesandnucleotides,13(1-3),309-323。

20.vorbrüggen,h.和ruh-pohlenz,c..(2001).handbookofnucleosidesynthesis.newyork:wiley。

21.wuts,p.g.m.,greene,t.w.和greene,t.w.(2014).greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis(第五版).hoboken,newjersey:johnwiley&sons,inc。

22.zhang,x.,shi,h.,wu,j.,zhang,x.,sun,l.,chen,c.和chen,z.j.(2013).cyclicgmp-ampcontainingmixedphosphodiesterlinkagesisanendogenoushigh-affinityligandforsting.molcell,51(2),226-235。