針對肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型8的疫苗的制作方法

本發明涉及通式(I)所示的合成糖，其綴合物以及所述的糖和綴合物用于在人類和/或動物宿主中引發保護性免疫應答的用途，其中所述的合成糖與肺炎鏈球菌血清型8的莢膜多糖有關。此外，在用于檢測針對肺炎鏈球菌細菌的抗體的免疫測定中，通式(I)所示的合成糖結構可用作標志物。

背景技術：

肺炎鏈球菌為革蘭氏陽性的有莢膜細菌，其是呼吸道感染的主要原因，并且可以導致嚴重的侵襲性肺炎球菌病(IPD)。到目前為止，已經描述了超過90種不同的肺炎球菌血清型。通過肺炎球菌莢膜多糖(CPS)的結構將它們進行了分類，其中所述的莢膜多糖是每一種血清型獨特的。因此，針對CPS所生成的免疫應答在不同的血清型之間不同。在兔中，這用于生成針對每種血清型的抗原的特異性抗體。由于不同血清型的CPS的結構相似性，所以經常觀察到這些特異性抗體與其他血清型(除了它們所針對的而產生的那些外)之間的交叉反應性。由于CPS的免疫學性質，其被用作肺炎鏈球菌疫苗的主要成分。

在1945年描述了第一種有效的疫苗，其中包含4種不同血清型CPS。然后，經歷了30多年時間才得到了覆蓋14種血清型的疫苗，隨后很短時間內出現了23價疫苗。但是，這些多糖疫苗具有多個缺點。它們不能激發持久的保護，并且在最易被感染的人群(即，2歲以下的兒童、以及免疫缺陷型和老年患者)中是無效的。這些缺點是由于碳水化合物的免疫學所導致的，通過引入碳水化合物-蛋白質綴合物疫苗得到了克服。第一種肺炎球菌綴合物疫苗為7價(PCV-7)和10價(PCV-10)疫苗。PCV-7后來被最近的疫苗(PCV-13)替代，所述的疫苗(PCV-13)包含13種不同血清型的CPS-糖綴合物。

最近市場上出售的疫苗在北美洲和歐洲對特定年齡的個體是有效的。這些疫苗的制造工藝是復雜的，導致較高的價格。因此，在大部分的發展中國家中負擔不起這種疫苗。本發明的目的是提供負擔得起的合成糖疫苗，其包含發展中國家中最普遍的一種血清型。

肺炎鏈球菌血清型8與血清型替換和最近十年穩定增長的侵襲性肺炎球菌疾病的情況有關。

肺炎鏈球菌8型是普遍的肺炎鏈球菌血清型之一。天然Sp8莢膜多糖重復單元的結構為具有以下順序的四糖→4)-Glcα-(1→4)-Galα-(1→4)-GlcAβ-(1→4)-Glcβ(1→(J.Am.Chem.Soc.1957，79(11)，2787)：

有趣地，天然血清型8的四糖重復單元具有血清型3的二糖重復單元。結果，發現在針對血清型3和8的血清中發生有交叉反應性，只是相應異源多糖對抗體的沉淀是不完全的。盡管在制造所述的疫苗之前廣泛地考慮了交叉反應性，但是不充分的表位重疊可能是為何得自2種血清型的莢膜多糖(CPS)都包含在該23價多糖疫苗中的原因。

WO 9640225 A1提供了肺炎鏈球菌血清型8寡糖蛋白質綴合物，其由2至4個重復單元的混合物組成，所述的重復單元使用EDC與破傷風類毒素偶聯。所述的2至4個重復單元的混合物是通過非選擇性地切割莢膜多糖、然后通過尺寸排阻色譜法獲得的。公知的是通過莢膜多糖的降解而獲得的寡糖由于共同分離的雜質和新的表位(其是在降解過程中或者作為通過病原體的免疫侵襲策略的一部分被引入的) 而呈現高度的異質性。在WO 9640225 A1的情況下，這種異質性通過非選擇性切割而增加(TFA，100℃)，這使得包含2個重復單元的級份是至少4種糖的混合物。因此，由莢膜多糖分離的寡糖包含一組取決于結構決定簇(其被宿主免疫系統識別為“非自我的”)的潛在免疫原性的表位。因此，使用基于分離的寡糖的綴合物(例如WO 9640225 A1的綴合物)的疫苗進行免疫的缺點是產生多克隆免疫應答，其涉及多個免疫原性的表位，其中一些是非保護性的(即，激發的抗體不能提供免于與肺炎鏈球菌8型有關的疾病的保護)或是免疫顯性的。這種多克隆免疫應答導致疫苗不可接受的毒性，其中所述的疫苗預防性地給予健康人群(通常為嬰兒)。這種缺點可以通過本發明的純糖來克服，所述的純糖呈現明確的結構、適用于臨床應用的純度并且無批次之間的差異性。

此外，WO 9640225 A1公開了包含1個重復單元的寡糖的混合物(即四糖的混合物)不包含免疫原性的表位，并且需要至少八糖的混合物來制備針對肺炎鏈球菌8型的綴合物。吃驚地，本發明人發現本發明所述的甚至短的糖也包含保護性聚糖表位，并且能夠在人類和/或動物宿主中誘導針對肺炎鏈球菌血清型8細菌的保護性免疫應答。

因此，本發明的目的是提供通式(I)所示的純的合成糖，其與肺炎鏈球菌血清型8的莢膜多糖有關，并且包含保護性的免疫原性聚糖的表位，即，激發保護免于肺炎鏈球菌8型導致的疾病的抗體并且被其識別的聚糖表位。所述的糖適于與免疫原性載體綴合，從而提供綴合物及其藥物組合物，它們可以用于預防和/或治療與肺炎鏈球菌有關的疾病，并且更具體而言，對抗肺炎鏈球菌血清型8有關的疾病。此外，在用于檢測針對肺炎鏈球菌細菌的抗體的免疫測定中，通式(I)所示的合成糖可用作標志物。

本發明的目的通過獨立權利要求的教導來解決。本發明更多的有利特征、方面和細節通過本申請的從屬權利要求、說明書、附圖和實施例而顯而易見。

發明概述

定義

如本文所用，術語“連接子”涵蓋了能夠連接糖的還原性末端單糖與免疫原性載體或固體支持物的分子片段，其中任選地通過結合至少一個相互連接分子來實現。因此，連接子本身或者與相互連接分子一起的功能是建立、保持和/或橋接還原性末端單糖與免疫原性載體或固體支持物之間的特定距離。更具體而言，連接子的一個端點與與還原末端單糖的異頭碳中心處的環外氧原子連接，而另一端點通過氮原子與相互連接分子連接，或者與免疫原性載體或固體支持物直接連接。

如本文所用，術語“相互連接分子”是指包含官能團X和官能團Y的雙官能分子，其中官能團X能夠與連接子L上的末端氨基基團反應，而官能團Y能夠與免疫原性載體或固體支持物上存在的官能度反應。圖1展示了市售可得的相互連接分子的實例，但是未將可以根據本發明使用的相互連接分子局限于本發明展示的實施例。

如本文所用，術語“佐劑”是指免疫佐劑，即，在疫苗組合物中使用的一種材料，該材料通過增強對疫苗中所包含的給定抗原的免疫應答、但與其不具有抗原相關性而改良或增強所述疫苗的作用。對于本領域的技術人員而言，傳統上公認的佐劑的實例包括：

-包含礦物質的組合物，包括鈣鹽和鋁鹽(或它們的混合物)。鈣鹽包括磷酸鈣。鋁鹽包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等，并且所述的鹽采用任何合適的形式(例如凝膠、結晶、無定形等)。吸附于這些鹽上是優選的。包含礦物質的組合物還可以配制成金屬鹽顆粒。還可以使用已知的氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。本發明可以使用通常被用作佐劑的“氫氧化物”或“磷酸鹽”佐劑中的任意一種。已知為“氫氧化鋁”的佐劑通常為鋁氧基氧化物鹽，其通常是至少部分結晶的。已知為“磷酸鋁”的佐劑通常為羥基磷酸鋁，其通常還包含少量的硫酸鹽(即，羥基磷酸硫酸鋁)。它們可以通過沉淀獲得，并且在沉淀過程中的反應條件和濃度將影響鹽中磷酸根取代為羥基的程度。在根據本發明的配制物中可以使用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物；

-皂苷類，其為在多種植物物種的樹皮、葉、莖、根、甚至花中發現的一個異質的固醇苷和三萜類糖苷組。得自南美皂皮樹(Quillaia saponaria，Molina)的樹皮的皂苷已經作為佐劑被廣泛地研究。皂苷還可以購自墨西哥菝葜(Smilax ornata)(洋菝契)，滿天星(Gypsophilla paniculata)(brides veil)，和Saponaria of icianalis(皂根)。皂苷佐劑配制物包括純化的配制物(例如QS21)、以及脂質配制物(例如ISCOM)。使用HPLC和RP-HPLC已經純化了皂苷組成。已經鑒定了使用這些技術得到的純化的特定級份，包括QS7，QS 17，QS 18，QS2 1，QH-A，QH-B和QH-C。皂苷配制物還可以包括固醇，例如膽固醇。皂苷和膽固醇的組合可以用于形成獨特的顆粒，稱為免疫刺激性復合物(ISCOM)。ISCOM通常包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷都可以用于ISCOM中。優選地，ISCOM包括QuilA，QHA和QHC中的一種或多種；

-由可生物降解的且無毒性的材料形成的微顆粒(即，直徑為100nm至150pm的顆粒，更優選地，直徑為200nm至30pm，或者直徑為500nm至10pm)。此類無毒性且可生物降解的材料包括但不限于聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己內酯；

-CD1d配體，例如α-糖基神經酰胺，含植物鞘氨醇的α-糖基神經酰胺，OCH，KRN7000[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰基氨基)-1,3,4-十八烷三醇]，CRONY-101，3"-磺基-半乳糖基-神經酰胺；

-免疫刺激性寡核苷酸，例如包含CpG基元的免疫刺激性寡核苷酸(包含非甲基化的胞嘧啶殘基通過磷酸酯鍵與鳥嘌呤核苷殘基連接的二核苷酸序列)，或者包含CpI基元的免疫刺激寡核苷酸(包含與次黃嘌呤核苷連接的胞嘧啶的二核苷酸序列)，或者雙鏈RNA，或者包含回文序列的寡核苷酸，或者包含poly(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激寡核苷酸可以包括核苷酸的修飾/類似物，例如硫代磷酸酯修飾，并且可以是雙鏈或(除了RNA)單鏈的；

-包含脂質的化合物，其中所述的脂質與含磷酸的非環狀主鏈連接，例如TLR4拮抗劑E5564；

-油乳液(例如弗氏佐劑)。

理論上，在免疫事件的級聯中能夠有利于或增強特定的情況，最終導致更顯著的免疫應答的各種分子或物質都可以定義為佐劑。原則上，通過在疫苗配制物中使用佐劑，人們可以：

-指導并優化對于所述的疫苗而言是合適的或理想的免疫應答；

-能夠使疫苗進行粘膜遞送，即，可以使疫苗與粘膜表面接觸的給予方式，其中所述的粘膜表面例如為口腔、胃或肺上皮、以及相關的淋巴組織；

-促進細胞介導的免疫應答；

-增強弱免疫原的免疫原性，例如高度純化的或重組的抗原；

-減少提供保護性免疫力所需的抗原的量，或者降低接種的頻率；以及

-在具有降低的或弱化的免疫應答的個體中，改善疫苗的效力，所述的個體例如為新生兒、老年人和免疫受損的疫苗受者。

盡管關于佐劑的作用方式了解的較少，但是目前認為佐劑通過以下機制之一增強免疫應答：

-增加抗原的生物學或免疫學半衰期；

-改善向抗原呈遞細胞(APC)的抗原傳遞，以及通過APC的抗原加工和呈遞，例如通過在抗原-佐劑復合物被APC消化后使得抗原穿過內體膜進入胞質溶膠；

-模擬應激細胞或受損細胞的危險誘導信號，其起到引發免疫應答的作用；

-誘導免疫調節細胞因子的產生；

-使免疫應答偏向于免疫系統的特定的子集；以及

-阻斷抗原攻擊的快速擴散。

本領域的技術人員已知糖為TI-2(T細胞非依賴性-2)抗原和較差的免疫原。因此，為了生產糖基疫苗，將所述的糖與免疫原性載體綴合，從而提供綴合物，其與糖相比呈現增強的免疫原性。就此而言，術語“免疫原性載體”被定義為一種結構，其與糖綴合，從而形成比糖本身呈現增加的免疫原性的綴合物。因此，糖與免疫原性載體的綴合具有刺激針對所述的糖的免疫應答的作用，但不會誘導針對所述的免疫原性載體的免疫應答。

吃驚地發現，根據本發明的通式(I)所示的純糖包含保護性免疫原性聚糖表位，并且在人類和/或動物宿主中能夠誘導針對肺炎鏈球菌血清型8細菌的保護性免疫應答。通式(I)所示的糖會激發抗體，該抗體與肺炎鏈球菌血清型8莢膜多糖交叉反應，特異性識別肺炎鏈球菌血清型8細菌，并調理它們以便通過吞噬細胞殺死。

本發明提供了通式(I)所示的糖，或者其藥物可接受的鹽：

V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L–NH₂ (I)

其中：

x為選自1，2，3和4的整數；

V*–表示H–，H–U_x–或H–U_x+1–U_x–；

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

L表示連接子。

–L–被定義為連接子，作為片段–O–L–NH₂的一部分。因此，連接子–L–與氧原子和NH₂-基團的氮原子結合。優選所述的連接子的至少2個碳原子在氧原子與NH₂-基團之間，例如–O–C–C–NH₂。連接子–L–可以為脂肪族鏈，其中所述的脂肪族鏈可任選地包含插入其中的芳香族鏈，或者雜原子的數量在0至10之間擺動。

連接子L優選地包含2至40個碳原子(包含任選的側鏈的碳原子)，更優選地包含2至30個碳原子、更優選地包含2至20個碳原子、更優選地包含2至14個碳原子、更優選地包含2至12個碳原子、并且還更優選地包含2至10個碳原子。

氧原子(即，–O–L–NH₂中的氧)與NH₂-基團之間的最短的原子鏈優選地由2至14個原子組成、更優選地由2至12個原子組成、更優選地由2至10個原子組成、更優選地由2至8個原子組成。在最短鏈由2至6個原子組成的情況(其為異頭中心的氧與NH₂-基團之間的最短的可行連接)下，它們優選為碳原子。在最短的鏈由4至8個原子組成的情況下，所述的鏈可以包含選自O、N和S的1、2或3個雜原子。在最短的鏈由9至14個原子組成的情況下，所述的鏈可以包含選自O、N和S的1，2，3，4，5或6個雜原子。

還優選的是，連接子–L–或最短的鏈被完全或部分氟化。連接子–L–可以包含3元、4元、5元或6元飽和的碳環，或者5元部分飽和的(并且非芳香族的)碳環，或者4元、5元或6元飽和的氧雜環，或者4元、5元或6元飽和的氮雜環，或者6元芳香族碳環。

連接子–L–還可以包含酰胺(–NH–CO–，–CO–NH–)，和/或脲(–NH–CO–NH–)殘基，并且優選地僅一個酰胺或脲殘基。連接子還可以包含取代基；優選為2個取代基，例如R¹⁰和R¹¹；或者4個取代基，例如R¹⁰，R¹¹，R¹⁵和R¹⁴，其具有本發明定義的含義，并且其優選地選自：–F，–Cl，–CH₃，–C₂H₅，–C₃H₇，–C₅H₉，–C₆H₁₃，–OCH₃，–OC₂H₅，–CH₂F，–CHF₂，–CF₃，–C(O)–NH₂，–SCH₃，–SC₂H₅，–NHC(O)CH₃，–N(CH₃)₂,和–N(C₂H₅)₂。

在連接子–L–被氟化的情況下，超過2個取代基–F是優選的。

優選地，連接子–L–選自：–CH₂–，–(CH₂)₂–，–(CH₂)₃–，–(CH₂)₄–，–(CH₂)₅–，–(CH₂)₆–，–(CH₂)₇–，–(CH₂)₈–，–(CH₂)₉–，–(CH₂)₁₀–，–CF₂–，–(CF₂)₂–，–(CF₂)₃–，–(CF₂)₄–，–(CF₂)₅–，–(CF₂)₆–，–(CF₂)₇–，–(CF₂)₈–，–(CF₂)₉–，–(CF₂)₁₀–，–(CH₂)₂–O–(CH₂)₂–，–CH₂–O–(CH₂)₃–，–(CH₂)₃–O–CH₂–，–CH₂–O–(CH₂)₂–，–(CH₂)₂–O–CH₂–，–(CH₂)₃–O–(CH₂)₂–，–(CH₂)₂–O–(CH₂)₃–，–(CH₂)₄–O–CH₂–，–CH₂–O–(CH₂)₄–，–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–，–L^a–L^b–L^d–L^c–L^e–，–L^a–L^d–L^e–；

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CF₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–，–(CR¹⁰R¹¹)_o–；

–L^b–和–L^c–彼此獨立地選自：–O–，–NH–C(O)–NH–，–NH–C(S)–NH–，–NH–C(O)–，–C(O)–NH–，–NH–C(O)–O–，–NR⁹–，–NR¹⁸–，–SO₂–，

–L^d–表示–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CR¹²R¹³)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–，

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–，–(CR¹⁴R¹⁵)_p1–，–(CR¹⁴R¹⁵)_p1–O–(CR²¹R²²)_p2–，

R⁹和R¹⁸彼此獨立地選自：–CH₃，–C₂H₅，–C₃H₇和–C(O)CH₃；

R¹⁰，R¹¹，R¹²，R¹³，R¹⁴，R¹⁵，R¹⁶，R¹⁷，R¹⁹，R²⁰，R²¹和R²²彼此獨立地選自：–H，–F，–Cl，–CH₃，–C₂H₅，–C₃H₇，–C₅H₉，–C₆H₁₃，–OCH₃，–OC₂H₅，–CH₂F，–CHF₂，–CF₃，–C(O)–NH₂，–SCH₃，–SC₂H₅，–NHC(O)CH₃，–N(CH₃)₂和–N(C₂H₅)₂；

o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5，6，7，8，9和10中的整數。

本發明的糖帶有堿性和/或酸性取代基，并且它們可以與有機或無機酸或堿形成鹽。用于此類酸加成鹽形成的合適的酸的實例為鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，檸檬酸，草酸，丙二酸，水楊酸，對氨基水楊酸，蘋果酸，富馬酸，琥珀酸，抗壞血酸，馬來酸，磺酸，膦酸，高氯酸，硝酸，甲酸，丙酸，葡萄糖酸，乳酸，酒石酸，羥基馬來酸，丙酮酸，苯基乙酸，苯甲酸，對氨基苯甲酸，對羥基苯甲酸，甲磺酸，乙磺酸，亞硝酸，羥基乙磺酸，乙烯基磺酸，對甲苯磺酸，萘磺酸，磺胺酸，樟腦磺酸，china acid，扁桃酸，鄰甲基扁桃酸，氫-苯磺酸，苦味酸，己二酸，d-鄰甲苯基酒石酸，丙醇二酸，(鄰，間，對)-甲苯酸，萘胺磺酸，以及本領域技術人員公知的其他的礦物質酸或羧酸。這些鹽是通過將游離堿的形式與足量的所需的酸接觸來制備的，從而以傳統方式生產鹽。

合適的無機或有機堿的實例為例如NaOH，KOH，NH₄OH，氫氧化四烷基銨，賴氨酸或精氨酸等。可以使用本領域公知的方法以傳統方式制備鹽，例如通過使用選自上述一組中的堿的溶液處理通式(I)所示化合物的溶液。

碳水化合物化學領域的技術人員清楚的是，式(I)所示的糖不包含–O–O–鍵和/或通過它們的異構碳或C-1碳彼此連接或鍵合的糖片段(U_x，U_x+1，U_x+2，U_x+3)。本領域的技術人員還清楚的是，糖苷鍵的立體化學是針對通式中糖片段的異頭中心所指示的立體化學。因此，異頭中心對于糖片段U₁和U₅的立體化學為β，對于糖片段U₂和U₆的立體化學為β，對于糖片段U₃和U₇的立體化學為α，對于糖片段U₄的立體化學為α。

通式(I)的糖包含保護性免疫原性表位，并且在人類和/或動物宿主中能夠誘導針對肺炎鏈球菌血清型8細菌的保護性免疫應答。通式(I)所示的糖激發抗體，該抗體與肺炎鏈球菌血清型8莢膜多糖交叉反應，特異性識別肺炎鏈球菌血清型8細菌，并調理它們以便通過吞噬細胞殺死。

根據通式(I)所示的本發明的化合物具有以下優點，它們是純的合成的化合物，可以根據GMP規定容易地制造，而糖的分離的混合物(例如WO 9640225 A1中所公開)總是未完全表征的混合物，其具有改變的寡糖組成，該組成取決于分離來源，因此在符合GMP規定方面是成問題的。

因此，本發明的疫苗最優選地包含本發明公開的通式(I)或任何其他通式(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)中的單獨一種化合物，最優選與免疫原性載體(優選為載體蛋白質，更優選為CRM₁₉₇)結合的化合物10，18–22，55，57，60和62–89中唯一一種。因此，通式(I)或者任何其他的通式(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)所示的化合物可以用于制備成份確定的、良好表征的且純的疫苗，其包含唯一一種以合成方式合成的并且良好表征的三糖、四糖、五糖或六糖，它們優選地與免疫原性載體(優選為載體蛋白質，更優選為CRM₁₉₇)連接。結果，本發明的疫苗包含通式(I)或者任何其他通式(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)所示的僅一種以合成方式合成的化合物，其優選地與免疫原性載體(優選為載體蛋白質，并且更優選為CRM₁₉₇)連接。

與包含通過非選擇性切割肺炎鏈球菌血清型8的莢膜多糖而獲得的糖的分離(并且非合成的)混合物的疫苗相比，所述的疫苗產生較小的副作用和/或非保護性免疫應答。此外，本發明的疫苗比包含非選擇性切割的莢膜多糖的分離混合物的疫苗更容易地根據GMP規定制造，并且更容易地表征，這樣使得穩定性和純度控制更容易，并且雜質的種類和量的檢測也更容易。

優選的是，R^#殘基表示–COOH。

本發明的一個實施方案涉及通式(I)所示的糖：

V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L–NH₂

(I)

其中：

V*–表示H–U_x+1–U_x–，而x，L，U_x，U_x+1，U_x+2,U_x+3和R^#具有本發明定義的含義。

因此，本發明的一個實施方案涉及通式(II)所示的六糖，或者其藥物可接受的鹽：

H–U_x+1–U_x–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L–NH₂

(II)

其中：

x為選自1，2，3和4中的整數；

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

L表示連接子。

甚至更優選的是通式(II)所示的六糖，其中R^#表示–COOH。

因此，還優選通式(II-a)所示的六糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義；

以及通式(II-b)所示的糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義；

以及通式(II-c)所示的糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義；

以及通式(II-d)所示的糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義。

另一個優選的實施方案涉及通式(I)所示的糖：

V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L–NH₂

(I)

其中：

V*–表示H–U_x–，而x，L，U_x，U_x+1，U_x+2,U_x+3和R^#具有本發明定義的含義。

因此，另一個優選的實施方案涉及通式(III)所示的五糖，或者其藥物可接受的鹽：

H–U_x–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L–NH₂

(III)

其中：

x為選自1，2，3和4中的整數；

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

L表示連接子。

優選地，在通式(III)中，殘基R^#表示–COOH。

因此，優選通式(III-a)所示的五糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義；

以及通式(III-b)所示的糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義；

以及通式(III-c)所示的糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義；

以及通式(III-d)所示的糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義。

根據本發明的另一個優選的實施方案涉及通式(I)所示的糖：

V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L–NH₂

(I)

其中：

V*–表示H–，而x，L，U_x，U_x+1，U_x+2,U_x+3和R^#具有本發明定義的含義。

因此，根據本發明的另一個優選的實施方案涉及通式(IV)所示的四糖，或者其藥物可接受的鹽：

H–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L–NH₂

(IV)

其中：

x為選自1，2，3和4中的整數；

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

L表示連接子。

優選地，在通式(III)中，殘基R^#表示–COOH。

因此，優選通式(IV-a)所示的四糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義；

以及通式(IV-b)所示的糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義；

以及通式(IV-c)所示的糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義；

以及通式(IV-d)所示的糖

其中R^#和L具有本發明定義的含義。

特別優選的是通式(I)所示的糖，式(II)所示的六糖，式(III)所示的五糖，式(IV)所示的四糖，其包含保護性免疫原性表位：β-D-Glpc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Galp。因此，六糖(II-a)，(II-c)，(II-d)，五糖(III-a)，(III-c)，(III-d)和四糖(IV-a)，(IV-d)是特別優選的。包含保護性免疫原性表位的糖β-D-Glpc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Galp能夠提高選擇性地識別肺炎鏈球菌8型并調理它們以便通過吞噬細胞殺死的抗體的高效價。

甚至更優選的為通式(I)所示的糖，其中x表示3。

因此，優選通式(V)所示的糖，或其藥物可接受的鹽：

V*–U₆–U₅–U₄–U₃–O–L–NH₂

(V)

其中：

V*–表示H–，H–U₃–或H–U₄–U₃–；

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

L表示連接子。

通式(V)所示的糖展現出與人類抗血清肺炎鏈球菌血清型8莢膜多糖以及針對肺炎鏈球菌血清型8莢膜多糖產生的鼠科抗體發生特別強力的相互作用，已知該鼠科抗體保護小鼠免于感染肺炎鏈球菌8型肺炎球菌。此外，通式(V)所示的糖會激發與肺炎鏈球菌血清型8莢膜多糖發生交叉反應、特異性地識別肺炎鏈球菌血清型8細菌以及調理它們以便通過吞噬細胞殺死的抗體。

也優選通式(I)所示的糖，其中x表示2。因此，通式(VI)所示的糖，或者其藥物可接受的鹽也是優選的：

V*–U₅–U₄–U₃–U₂–O–L–NH₂

(VI)

其中：

V*–表示H–，H–U₂–或H–U₃–U₂–；

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

L表示連接子。

優選地，連接子–L–選自：–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–，–L^a–L^d–L^e–，其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^b–表示–O–；

–L^d–選自：–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–和–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–；

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；以及

o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5和6中的整數。

因此，通式(I)，(II)，(II-a)，(II-b)，(II-c)，(II-d)，(III)，(III-a)，(III-b)，(III-c)，(III-d)，(IV)，(IV-a)，(IV-b)，(IV-c)，(IV-d)，(V)或(VI)所示的糖是特別優選的，其中：

–L–選自：–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^d–L^e–；

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^b–表示–O–；

–L^d–選自：–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–和–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–；

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；以及

o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5和6中的整數。

甚至更優選的是通式(I)，(II)，(II-a)，(II-b)，(II-c)，(II-d)，(III)，(III-a)，(III-b)，(III-c)，(III-d)，(IV)，(IV-a)，(IV-b)，(IV-c)，(IV-d)，(V)或(VI)所示的糖，其中–L–表示–(CH₂)_o–，而o為選自2，3，4，5和6中的整數。

另外更優選的是通式(I-a)所示的糖，

V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–L^e–NH₂ (I-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

V*，x，o，p1，p2，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(II-e)所示的糖，

H–U_x+1–U_x–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–L^e–NH₂ (II-e)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

x，o，p1，p2，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(III-e)所示的糖，

H–U_x–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–L^e–NH₂ (III-e)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

x，o，p1，p2，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(IV-e)所示的糖，

H–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–L^e–NH₂ (IV-e)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

x，o，p1，p2，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(V-a)所示的糖，

V*–U₆–U₅–U₄–U₃–O–L^a–L^e–NH₂ (V-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

V*，o，p1，p2，U₆，U₅，U₄和U₃具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(VI-a)所示的糖，

V*–U₅–U₄–U₃–U₂–O–L^a–L^e–NH₂ (VI-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

V*，o，p1，p2，U₅，U₄，U₃和U₂具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(I-b)所示的糖，

V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–NH₂ (I-b)

其中：

–L^a–表示–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

V*，x，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(II-f)所示的糖，

H–U_x+1–U_x–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–NH₂ (II-f)

其中：

–L^a–表示–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

x，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(III-f)所示的糖，

H–U_x–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–NH₂ (III-f)

其中：

–L^a–表示–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

x，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(IV-f)所示的糖，

H–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–NH₂ (IV-f)

其中：

–L^a–表示–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

x，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(V-b)所示的糖，

V*–U₆–U₅–U₄–U₃–O–L^a–NH₂ (V-b)

其中：

–L^a–表示–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

V*，U₆，U₅，U₄和U₃具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(VI-b)所示的糖，

V*–U₅–U₄–U₃–U₂–O–L^a–NH₂ (VI-b)

其中：

–L^a–表示–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

V*，U₅，U₄，U₃和U₂具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(I-c)所示的糖，

V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–(CH₂)_o–NH₂ (I-c)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

V*，x，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(II-g)所示的糖，

H–U_x+1–U_x–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–(CH₂)_o–NH₂ (II-g)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

x，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(III-g)所示的糖，

H–U_x–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–(CH₂)_o–NH₂ (III-g)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

x，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(IV-g)所示的糖，

H–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–(CH₂)_o–NH₂ (IV-g)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

x，U_x，U_x+1，U_x+2和U_x+3具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(V-c)所示的糖，

V*–U₆–U₅–U₄–U₃–O–(CH₂)_o–NH₂ (V-c)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

V*，U₆，U₅，U₄和U₃具有本發明所定義的含義。

另外更優選的是通式(VI-c)所示的糖，

V*–U₅–U₄–U₃–U₂–O–(CH₂)_o–NH₂ (VI-c)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

V*，U₅，U₄，U₃和U₂具有本發明所定義的含義。

在另一個優選的實施方案中，根據本發明的糖選自：

α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(10),

β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(18),

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(19),

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(60),

5-氨基戊基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(20),

5-氨基戊基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(21),

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸(22),

α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(55),

α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(57),

5-氨基戊基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(63)；

5-氨基戊基吡喃半乳糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(64)；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(65)；

5-氨基戊基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸(66)；

5-氨基戊基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(67)；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(68)；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(69)；

5-氨基戊基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(70)；

3-氨基丙基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(71)；

5-氨基戊基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(72)；

3-氨基丙基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(73)；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸(74)；

4-氨基丁基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(75)；

6-氨基己基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(76)；

3-氨基丙基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(77)；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(78)；

4-氨基丁基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(79)；

3-氨基丙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(80)；

6-氨基己基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(81).

吃驚地，進一步發現通式(VII)所示的純糖包含保護性的免疫原性聚糖表位β-D-Glpc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Galp，并且能夠在人類和/或動物宿主中誘導針對肺炎鏈球菌血清型8細菌的保護性免疫應答。包含該保護性的免疫原性聚糖表位β-D-Glpc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Galp的通式(VII)所示的糖會激發抗體，該抗體與肺炎鏈球菌血清型8莢膜多糖有交聯反應性，特異性地識別肺炎鏈球菌血清型8細菌，并調理它們以便通過吞噬細胞殺死。

因此，本發明的另一個方面涉及通式(VII)所示的糖，或者其藥物可接受的鹽：

S*–U₅–U₄–U₃–S–O–L–NH₂

(VII)

其中：

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

–S–表示–S_a–或–S_b–；

–S_a–表示–(U₅)_n1–，–(U₅–U₄)_n2–或–(U₅–U₄–U₃)_n3–；

–S_b–表示–(U₂)_n1–，–(U₂–U₅)_n2–或–(U₂–U₅–U₄)_n3–；

S*–表示S*_a–或S*_b–；

S*_a–表示H–(U₃)_n4–或H–(U₄–U₃)_n5–；

S*_b–表示H–(U₂)_n4–，H–(U₃–U₂)_n5–或H–(U₄–U₃–U₂)_n6–；

n1，n2，n3，n4，n5和n6選自0和1；

L為連接子；

前提條件是：

如果–S–表示–S_a–，則S*–表示S*_a–；和

如果–S–表示–S_b–，則S*–表示S*_b–；和

如果n1＝1，則n6＝0；和

如果n2＝1，則n5＝n6＝0；和

如果n3＝1，則n4＝n5＝n6＝0；和

如果n4＝1，則n3＝0；和

如果n5＝1，則n2＝n3＝0；和

如果n6＝1，則n1＝n2＝n3＝0。

–L–定義為連接子，是片段–O–L–NH₂的一部分。因此，連接子–L–與氧原子以及NH₂-基團的氮原子結合。優選的是，連接子的至少2個碳原子處于氧原子和NH₂-基團之間，例如–O–C–C–NH₂。連接子–L–可以為脂肪族鏈，其中所述的脂肪族鏈可任選地包含插入其中的芳香族鏈，或者具有0至10個雜原子數。

連接子L優選地包含2至40個碳原子(包括可任選的側鏈的碳原子)，更優選地包含2至30個碳原子、更優選地包含2至20個碳原子、更優選地包含2至14個碳原子、更優選地包含2至12個碳原子、以及還要更優選地包含2至10個碳原子。

氧原子(即，–O–L–NH₂的氧)與NH₂-基團之間的最短原子鏈優選地由2至14個原子、更優選地由2至12個原子、更優選地由2至10個原子、更優選地由2至8個原子組成。在最短鏈由2至6個原子組成的情況(其為異頭中心的氧與NH₂-基團之間的最短的可行連接)下，它們優選為碳原子。在最短鏈由4至8個原子組成的情況下，所述的鏈可以包含選自O、N和S的1、2或3個雜原子。在最短鏈由9至14個原子組成的情況下，所述的鏈可以包含選自O、N和S的1，2，3，4，5或6個雜原子。

還優選的是連接子–L–或者最短鏈是完全或部分氟化的。連接子–L–可以包含3元、4元、5元或6元飽和的碳環，或者5元部分不飽和的(和非芳香族的)碳環，或者4元、5元或6元飽和的氧雜環，或者4元、5元或6元飽和的氮雜環，或者6元芳香族碳環。

連接子–L–還可以包含酰胺(–NH–CO–，–CO–NH–)，和/或脲(–NH–CO–NH–)殘基，并且優選地僅一個酰胺或脲殘基。連接子還可以包含取代基；優選為2個取代基，例如R¹⁰和R¹¹；或者4個取代基，例如R¹⁰，R¹¹，R¹⁵和R¹⁴，其具有本發明定義的含義，并且其優選地選自：–F，–Cl，–CH₃，–C₂H₅，–C₃H₇，–C₅H₉，–C₆H₁₃，–OCH₃，–OC₂H₅，–CH₂F，–CHF₂，–CF₃，–C(O)–NH₂，–SCH₃，–SC₂H₅，–NHC(O)CH₃，–N(CH₃)₂,和–N(C₂H₅)₂。

在連接子–L–被氟化的情況下，超過2個取代基–F是優選的。

優選地，連接子–L–選自：–CH₂–，–(CH₂)₂–，–(CH₂)₃–，–(CH₂)₄–，–(CH₂)₅–，–(CH₂)₆–，–(CH₂)₇–，–(CH₂)₈–，–(CH₂)₉–，–(CH₂)₁₀–，–CF₂–，–(CF₂)₂–，–(CF₂)₃–，–(CF₂)₄–，–(CF₂)₅–，–(CF₂)₆–，–(CF₂)₇–，–(CF₂)₈–，–(CF₂)₉–，–(CF₂)₁₀–，–(CH₂)₂–O–(CH₂)₂–，–CH₂–O–(CH₂)₃–，–(CH₂)₃–O–CH₂–，–CH₂–O–(CH₂)₂–，–(CH₂)₂–O–CH₂–，–(CH₂)₃–O–(CH₂)₂–，–(CH₂)₂–O–(CH₂)₃–，–(CH₂)₄–O–CH₂–，–CH₂–O–(CH₂)₄–，–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–，–L^a–L^b–L^d–L^c–L^e–，–L^a–L^d–L^e–；

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CF₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–，–(CR¹⁰R¹¹)_o–；

–L^b–和–L^c–彼此獨立地選自：–O–，–NH–C(O)–NH–，–NH–C(S)–NH–，–NH–C(O)–，–C(O)–NH–，–NH–C(O)–O–，–NR⁹–，–NR¹⁸–，–SO₂–，

–L^d–表示–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CR¹²R¹³)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–，

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–，–(CR¹⁴R¹⁵)_p1–，–(CR¹⁴R¹⁵)_p1–O–(CR²¹R²²)_p2–，

R⁹和R¹⁸彼此獨立地選自：–CH₃，–C₂H₅，–C₃H₇和–C(O)CH₃；

R¹⁰，R¹¹，R¹²，R¹³，R¹⁴，R¹⁵，R¹⁶，R¹⁷，R¹⁹，R²⁰，R²¹和R²²彼此獨立地選自：–H，–F，–Cl，–CH₃，–C₂H₅，–C₃H₇，–C₅H₉，–C₆H₁₃，–OCH₃，–OC₂H₅，–CH₂F，–CHF₂，–CF₃，–C(O)–NH₂，–SCH₃，–SC₂H₅，–NHC(O)CH₃，–N(CH₃)₂和–N(C₂H₅)₂；

o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5，6，7，8，9和10中的整數。

本發明的糖帶有堿性和/或酸性取代基，它們可以與有機或無機酸或堿形成鹽。

用于此類酸加成鹽形成的合適的酸的實例為鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，檸檬酸，草酸，丙二酸，水楊酸，對氨基水楊酸，蘋果酸，富馬酸，琥珀酸，抗壞血酸，馬來酸，磺酸，膦酸，高氯酸，硝酸，甲酸，丙酸，葡萄糖酸，乳酸，酒石酸，羥基馬來酸，丙酮酸，苯基乙酸，苯甲酸，對氨基苯甲酸，對羥基苯甲酸，甲磺酸，乙磺酸，亞硝酸，羥基乙磺酸，乙烯基磺酸，對甲苯磺酸，萘磺酸，磺胺酸，樟腦磺酸，china acid，扁桃酸，鄰甲基扁桃酸，氫-苯磺酸，苦味酸，己二酸，d-鄰甲苯基酒石酸，丙醇二酸，(鄰，間，對)-甲苯酸，萘胺磺酸，以及本領域技術人員公知的其他的礦物質酸或羧酸。這些鹽是通過將游離堿的形式與足量的所需的酸接觸、以傳統方式生產鹽來制備的。

合適的無機或有機堿的實例為例如NaOH，KOH，NH₄OH，氫氧化四烷銨，賴氨酸或精氨酸等。可以使用本領域公知的方法以傳統方式制備鹽，例如通過使用選自上述組中的堿的溶液處理通式(I)所示的化合物的溶液。

碳水化合物化學領域的技術人員清楚的是，式(VII)所示的糖不包含–O–O–鍵和/或通過它們的異構碳或C-1碳彼此連接或結合的糖片段(U₂，U₃，U₄，U₅)。本領域的技術人員還清楚的是，糖苷鍵的立體化學是針對通式中糖片段的異頭中心所指示的立體化學。因此，異頭中心的立體化學對于糖片段U₁和U₅而言為β，對于糖片段U₂和U₆而言為β，對于糖片段U₃和U₇而言為α，對于糖片段U₄而言為α。

優選的是通式(VII)所示的糖，其中–S–表示–Sa–，而S*–表示S*a–。因此，通式(VIII)所示的糖，或者其藥物可接受的鹽也優選的：

S_a*–U₅–U₄–U₃–S_a–O–L–NH₂

(VIII)

其中：

–S_a–表示–(U₅)_n1–，–(U₅–U₄)_n2–或–(U₅–U₄–U₃)_n3–；

S*_a–表示H–(U₃)_n4–或H–(U₄–U₃)_n5–；

n1，n2，n3，n4和n5選自0和1；

L為連接子；

前提條件是：

如果n2＝1，則n5＝0；和

如果n3＝1，則n4＝n5＝0；和

如果n4＝1，則n3＝0；和

如果n5＝1，則n2＝n3＝0。

特別優選的是通式(VII)所示的糖，其中–S–表示–S_b–；而S*–表示S*_b–。因此，通式(IX)所示的糖，或者其藥物可接受的鹽是優選的：

S_b*–U₅–U₄–U₃–S_b–O–L–NH₂

(IX)

其中：

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

–S_b–表示–(U₂)_n1–，–(U₂–U₅)_n2–或–(U₂–U₅–U₄)_n3–；

S*_b–表示H–(U₂)_n4–，H–(U₃–U₂)_n5–或H–(U₄–U₃–U₂)_n6–；

n1，n2，n3，n4，n5和n6選自0和1；

L為連接子；

前提條件是：

如果n1＝1，則n6＝0；和

如果n2＝1，則n5＝n6＝0；和

如果n3＝1，則n4＝n5＝n6＝0；和

如果n4＝1，則n3＝0；和

如果n5＝1，則n2＝n3＝0；和

如果n6＝1，則n1＝n2＝n3＝0。

優選地，連接子–L–選自：–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–，–L^a–L^d–L^e–；

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^b–表示–O–；

–L^d–選自：–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–和–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–；

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；以及

o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5和6中的整數。

因此，通式(VII)，(VIII)和(IX)所示的糖是特別優選的，

其中：

–L–選自：–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^d–L^e–；

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^b–表示–O–；

–L^d–選自：–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–和–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–；

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；以及

o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5和6中的整數。

甚至更優選的是通式(VII)，(VIII)或(IX)所示的糖，

其中：

–L–表示–(CH₂)_o–，而o為選自2，3，4，5和6中的整數。

同樣更優選的是通式(VII-a)所示的糖，

S*–U₅–U₄–U₃–S–O–L^a–L^e–NH₂ (VII-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

S*，S，o，p1，p2，U₅，U₄和U₃具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(VIII-a)所示的糖，

S_a*–U₅–U₄–U₃–S_a–O–L^a–L^e–NH₂ (VIII-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

S*，S，o，p1，p2，U₅，U₄和U₃具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(IX-a)所示的糖，

S_b*–U₅–U₄–U₃–S_b–O–L^a–L^e–NH₂ (IX-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

S*，S，o，p1，p2，U₅，U₄和U₃具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(VII-b)所示的糖，

S*–U₅–U₄–U₃–S–O–L^a–NH₂ (VII-b)

其中：

–L^a–表示–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

S*，S，U₅，U₄和U₃具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(VIII-b)所示的糖，

S_a*–U₅–U₄–U₃–S_a–O–L^a–NH₂ (VIII-b)

其中：

–L^a–表示–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

S_a*，S_a，U₅，U₄和U₃具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(IX-b)所示的糖，

S_b*–U₅–U₄–U₃–S_b–O–L^a–NH₂ (IX-b)

其中：

–L^a–表示–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

S_b*，S_b，U₅，U₄和U₃具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(VII-c)所示的糖，

S*–U₅–U₄–U₃–S–O–(CH₂)_o–NH₂ (VII-c)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

S*，S，U₅，U₄和U₃具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(VIII-c)所示的糖，

S_a*–U₅–U₄–U₃–S_a–O–(CH₂)_o–NH₂ (VIII-c)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

S_a*，S_a，U₅，U₄和U₃具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(IX-c)所示的糖，

S_b*–U₅–U₄–U₃–S_b–O–(CH₂)_o–NH₂ (IX-c)

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

S_b*，S_b，U₅，U₄和U₃具有本發明定義的含義。

在另一個優選的實施方案中，根據本發明的糖選自：

β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(60),

β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(18),

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(19),

β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(62),

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸(22),

α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(55),

α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(57).

4-氨基丁基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(82)；

3-氨基丙基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(83)；

3-氨基丙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(84)；

6-氨基己基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(85)；

3-氨基丙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(86)；

4-氨基丁基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(87)；

4-氨基丁基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(88)；

6-氨基己基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(89)。

化學合成

可以通過多種合成途徑來合成根據本發明的糖。

例如，根據本發明的糖可以由硫代糖苷構造模塊(building block)BB2(用于糖片段U₁，U₅，U₂和U₆的前體)，BB3(用于糖片段U₂和U₆的前體)，BB4(用于糖片段U₃和U₇的前體)，BB5(用于糖片段U₄的前體)和官能化的固體支持物BB1(Angew.Chem.Int.Ed.2013，52，5858.)(參見方案1)開始通過自動化的固相合成來組裝。

方案1中概括的合成工藝涉及：

-所需的寡糖的組裝，其包括：

通過使用NIS/TfOH活化，使用合適的硫代糖苷(BB2，BB3，BB4或BB5)糖基化，然后

通過使用Et₃N進行處理，除去臨時性保護性基團Fmoc；

-由所述的固體支持物上切割；以及

-除去永久性保護性基團。

方案1：通式(I)所示的糖的自動化固相合成

備選地，寡糖的溶液相合成可以用于獲取通式(I)所示的糖。為了加速合成工藝，諸如BB6和BB7之類的二糖構造模塊優選地用作延長單元。

技術人員能夠理解，為了獲取通式(I)所示的較高級的糖，方便的是使用較高級的延長單元，例如四糖BB8，其可以根據方案2由二糖BB6和BB7開始容易地獲得。因此，通過使用EtSH，p-TsOH進行處理，可以除去二糖BB7上的亞芐基縮醛基，從而提供中間體二醇，其進一步經過BAIB和Tempo的區域選擇性氧化，以及隨后對新形成的羧酸的酯化，得到仲醇BB9。醇BB9可以進一步經過與二糖BB6的糖基化反應，從而提供四糖BB8，其可以直接用作延長單元。方便地，在α–葡糖苷部分的C-4位置處的羥基基團可以被正交的Fmoc保護性基團保護，其中所述的保護性基團能夠被選擇性地去除以便進行預計的進一步糖基化反應。然而，如該α–葡糖苷部分在非還原下端構成了末端單糖，則將C-4位置處的羥基基團作為苯甲酸酯進行保護將加速所述的合成。

方案2：四糖重復單元BB8的合成。a.i.EtSH，p-TsOH；ii.BAIB，Tempo；iii.TMS-CHN₂；b.BB6，TMSOTf，Et₂O/DCM。

微陣列

如圖4所示，式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)，(IX-a)-(IX-c)所示的本發明的化合物，特別是糖10，18，19，20，21，22，55，57，60和62–89，與SP-8天然多糖共享表位。將合成的寡糖印制(print)在N-羥基琥珀酰亞胺官能化的載玻片上，并與針對天然Sp8細菌(8型抗血清，SSIDiagnostica，圖4(D))的兔抗血清或者接種的人類混合血清(“007sp”，National Institute for Biological Standards and Control，圖4(B)，(C))溫育。盡管兔抗血清表明所有被印制的四糖均被識別(圖4(D))，但是由接種的人類得到的抗血清僅識別化合物19，20，22和18(參見圖4(B)和(C))。觀察到在糖19和18、與由接種的人類得到的抗血清之間發生強力的相互作用。與SP-8天然多糖的溫育消除了上述結合(參見圖4(B)和(C))。這些數據證明四糖18、19和20與抗-SP8 CPS抗體的結合的特異性和交叉反應性。

微陣列分析還能夠評價mAb 28H11(保護性鼠科IgM)與糖19，20，21和22的結合(參見圖12)。MAb 28H11為針對天然肺炎鏈球菌8型CPS產生的鼠科IgM，其在多種背景下保護小鼠免于感染活的肺炎鏈球菌8型肺炎球菌(Yano and Pirofski(2011)，Clin.Vaccine Immunol.，18(1)，59-66)。聚糖微陣列分析表明mAb 28H11與對肺炎鏈球菌8型特異性的糖19有強力相互作用，如其以高達10μg/mL的水平消除天然肺炎鏈球菌8型CPS的結合所顯示的(參見圖12)。

糖綴合物

本發明的另一個方面涉及綴合物，其包含通過–O–L–NH₂基團的氮原子與免疫原性載體共價結合或共價連接的通式(I)所示的合成糖。換言之，本發明的另一個方面涉及通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)任意一項所述的糖，通過–O–L–NH₂基團的氮原子與免疫原性載體綴合。因此，包含通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)所示的合成糖通過–O–L–NH₂的綴合物還可以定義為通過使通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)的任意一項所示的糖與免疫原性載體反應而獲得的綴合物基團的氮原子與免疫原性載體共價結合或共價連接。所述的綴合物證明為可有效地作為疫苗用于接種以對抗與肺炎鏈球菌血清型8細菌有關的疾病。

本領域的技術人員已知糖類通常為TI-2(T細胞非依賴性-2)抗原和較差的免疫原。TI-2抗原為僅由成熟B細胞通過表面暴露的免疫球蛋白受體的交聯而識別的抗原。在不具有T細胞輔助的情況下，不產生免疫記憶，不會發生由IgM向其他IgG亞類的同種型轉換，也不發生B細胞親和性成熟。此外，由于糖與人類糖脂和糖蛋白的結構同源性，已知糖在人類中是較差的免疫原。由于糖較差的免疫原性，所以它們表現出使B細胞生產抗體以及形成記憶細胞(其是生產有效疫苗所必需的特征)的能力很差。

因此，為了生產有效的糖基疫苗，將通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)所示的糖與免疫原性載體綴合，從而提供與所述糖相比呈現增加的免疫原性的綴合物。

所述的綴合物由通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)所示的至少一種合成糖和免疫原性載體組成，其中所述的通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)所示的至少一種糖與所述的載體共價結合。

吃驚地發現，使用根據本發明的綴合物的免疫接種產生了高效價的對本發明糖的碳水化合物部分具有特異性的抗體。所述的抗體與天然SP-8多糖交叉反應，并呈現調理吞噬活性和殺菌活性，因此賦予了針對肺炎鏈球菌血清型8細菌的保護。由本發明的綴合物激發的單克隆抗體與肺炎鏈球菌血清型8細菌之間的相互作用是特異性的，因為未觀察到抗體同種型對照、或者與肺炎鏈球菌血清型1或3的結合(例如參見圖8、9和10)。

就此而言，術語“免疫原性載體”定義為這樣的結構，其與糖綴合，從而形成與糖本身相比呈現增加的免疫原性的綴合物。因此，通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)， (IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)所示的糖與免疫原性載體的綴合具有刺激針對通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)所示的糖的免疫應答的作用，但是不會誘導針對所述的免疫原性載體的免疫應答。

優選的免疫原性載體為具有免疫調節性質的載體蛋白質或鞘糖脂。對于本領域的技術人員而言，載體蛋白質為選自以下的蛋白質：白喉類毒素，突變的白喉類毒素，改性的白喉類毒素，突變且改性的白喉類毒素，破傷風類毒素，改性的破傷風類毒素，突變的破傷風類毒素，外膜蛋白(OMP)，牛血清白蛋白(BSA)，匙孔血藍蛋白(KLH)或霍亂類毒素(CT)。如本文所用，術語“類毒素”是指細菌毒素(通常為外毒素)，其毒性已通過化學(福爾馬林)或熱處理而滅活或抑制，而其他的性質(通常為免疫原性)得到保持。如本文所用，突變的類毒素為重組的細菌毒素，其已通過修改野生型氨基酸序列而被修改成減毒的或者甚至無毒的。此類突變可以為一個或多個氨基酸的取代。此類突變的類毒素在其表面上呈現與相互作用性分子的官能團Y能夠反應、從而形成改性的類毒素的官能團。所述的官能度是本領域的技術人員已知的，包括但不限于可以與活化的酯反應的賴氨酸殘基伯氨基官能度，在還原劑存在下的異氰酸酯基團或醛，可以通過碳二亞胺活化的谷氨酸或天冬氨酸殘基的羧酸酯官能度，或者半胱氨酸殘基的巰基官能度。

活化的酯包括但不限于N-(γ-馬來酰亞胺丁酰氧基)磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-GMBS)，琥珀酰亞胺(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)，琥珀酰亞胺-3-(溴代乙酰胺)丙酸酯(SBAP)，二琥珀酰亞胺戊二酸酯(DSG)，二琥珀酰亞胺己二酸酯(DSA)，2-吡啶基二硫基-四氧雜十四烷-N-羥基琥珀酰亞胺(PEG-4-SPDP)，雙-(4-硝基苯基)己二酸酯和雙-(4-硝基苯基)琥珀酸酯(參見圖1)。優選的活化的酯為二琥珀酰亞胺己二酸酯(DSA)，二琥珀酰亞胺戊二酸酯(DSG)，雙-(4-硝基苯基)己二酸酯和雙-(4-硝基苯基)琥珀酸酯。

載體蛋白質上的半胱氨酸殘基可以轉化成相應的脫氫丙氨酸，其可以進一步與合適的相互連接分子反應，從而提供在它們的表面上具有相互連接分子的官能團X的改性載體蛋白質。

特別優選的是本發明所述的本發明糖與無毒性的突變白喉毒素CRM₁₉₇綴合，從而呈現賴氨酸殘基的伯胺官能度作為官能度。

類似于野生型白喉毒素的CRM₁₉₇為535個氨基酸(58kD)的單一多肽鏈，其由2個亞基通過二硫橋連接，其具有谷氨酸取代為甘氨酸的單氨基酸取代。在大量經批準用于疾病的綴合物疫苗諸如Prevnar之類中，CRM₁₉₇被用作載體蛋白質。

因此，在本發明的一個優選的實施方案中，載體蛋白質在其表面上呈現賴氨酸殘基的伯氨基官能度，其能夠與相互連接分子的官能團Y反應，從而提供在其表面上具有相互連接分子的所述官能團X的修飾載體蛋白質，該官能團X能夠與連接子的末端氨基基團反應，使本發明的糖官能化。

相互連接分子的所述的官能團X選自：馬來酰亞胺；α-碘代乙酰基；α-溴代乙酰基；以及N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)，醛，亞氨酸酯，羧酸，烷基磺酸酯，磺酰氯，環氧化物，酸酐，碳酸酯(參見圖2)。

優選的是通式(X)所示的綴合物，

[V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L–NH–W]_m–CRM₁₉₇

(X)

其中：

m選自2至18；

–W–選自：

a表示1至10的整數；

b表示1至4的整數；以及

V*，U_x+3，U_x+2，U_x+1，U_x，x和L具有本發明所定義的含義。

優選地，連接子–L–選自：–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^d–L^e–；

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；–L^b–表示–O–；–L^d–選自：–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–和–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–；–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；以及o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5和6中的整數。

還優選的是–W–表示：

，并且a為選自2，3，4，5和6中的整數是特別優選的。

因此，通式(X)所示的綴合物是特別優選的，

其中：

連接子–L–選自：–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^d–L^e–；

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^b–表示–O–；

–L^d–選自：–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–和–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–；

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

特別優選通式(X)所示的綴合物，其中x表示3。因此，通式(XI)所示的綴合物是特別優選的，

[V*–U₆–U₅–U₄–U₃–O–L–NH–W]_m–CRM₁₉₇

(XI)

其中：

m選自2至18；

–W–選自：

a表示1至10的整數；

b表示1至4的整數；

V*–表示H–，H–U₃–或H–U₄–U₃–；

R^#表示–COOH或–CH₂OH；以及

L表示連接子。

優選地，在通式(XI)中，連接子–L–選自：–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^d–L^e–；–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；–L^b–表示–O–；–L^d–選自：–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–和–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–；–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

特別優選的是通式(X)或(XI)所示的綴合物，

其中：

連接子–L–表示–(CH₂)_o–；

o為選自2、3、4、5和6中的整數；

優選的是，m選自2至18，更優選5至15，甚至更優選8至12。

本發明的另一個方面涉及通式(XII)所示的綴合物，

[S*–U₅–U₄–U₃–S–O–L–NH–W]_m–CRM₁₉₇

(XII)

其中：

m由2至18構成；

–W–選自：

a表示1至10的整數；以及

b表示1至4的整數；

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

–S–表示–S_a–或–S_b–；

–S_a–表示–(U₅)_n1–，–(U₅–U₄)_n2–或–(U₅–U₄–U₃)_n3–；

–S_b–表示–(U₂)_n1–，–(U₂–U₅)_n2–或–(U₂–U₅–U₄)_n3–；

S*–表示S*_a–或S*_b–；

S*_a–表示H–(U₃)_n4–或H–(U₄–U₃)_n5–；

S*_b–表示H–(U₂)_n4–，H–(U₃–U₂)_n5–或H–(U₄–U₃–U₂)_n6–n1，n2，n3，n4，n5和n6選自0和1；

L為連接子；

前提條件是：

如果–S–表示–S_a–，則S*–表示S*_a–；和

如果–S–表示–S_b–，則S*–表示S*_b–；和

如果n1＝1，則n6＝0；和

如果n2＝1，則n5＝n6＝0；和

如果n3＝1，則n4＝n5＝n6＝0；和

如果n4＝1，則n3＝0；和

如果n5＝1，則n2＝n3＝0；和

如果n6＝1，則n1＝n2＝n3＝0。

另一個優選的綴合物為通式(XIII)所示的綴合物，

[S_b*–U₅–U₄–U₃–S_b–O–L–NH–W]_m–CRM₁₉₇

(XIII)

其中：

m由2至18構成；

–W–選自：

a表示1至10的整數；以及

b表示1至4的整數；

R^#表示–COOH或–CH₂OH；

–S_b–表示–(U₂)_n1–，–(U₂–U₅)_n2–或–(U₂–U₅–U₄)_n3–；

S*_b–表示H–(U₂)_n4–，H–(U₃–U₂)_n5–或H–(U₄–U₃–U₂)_n6–n1，n2，n3，n4，n5和n6選自0和1；

L為連接子；

前提條件是：

如果n1＝1，則n6＝0；和

如果n2＝1，則n5＝n6＝0；和

如果n3＝1，則n4＝n5＝n6＝0；和

如果n4＝1，則n3＝0；和

如果n5＝1，則n2＝n3＝0；和

如果n6＝1，則n1＝n2＝n3＝0。

優選地，連接子–L–選自：–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^d–L^e–；–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；–L^b–表示–O–；–L^d–選自：–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–和–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–；–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；以及o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5和6中的整數。

還優選的是，–W–表示

因此，通式(XII)或(XIII)所示的綴合物是特別優選的，

其中：

連接子–L–選自：–L^a–，–L^a–L^e–，–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^d–L^e–；

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^b–表示–O–；

–L^d–選自：–(CH₂)_q–，–(CF₂)_q–，–(CH₂–CH₂–O)_q–C₂H₄–和–(CH₂–CH₂–O)_q–CH₂–；

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–，–(CF₂)_p1–，–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

o，q，p1和p2彼此獨立地為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

特別優選的是通式(XII)或(XIII)所示的綴合物，

其中：

連接子–L–表示–(CH₂)_o–；

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

還要更優選的是通式(X-a)所示的綴合物，

[V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–L^e–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (X-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

V*，x，m，o，p1，p2，U_x，U_x+1，U_x+2，U_x+3和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(XI-a)所示的綴合物，

[V*–U₆–U₅–U₄–U₃–O–L^a–L^e–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (XI-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

V*，x，m，o，p1，p2，U₆，U₅，U₄，U₃和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(XII-a)所示的綴合物，

[S*–U₅–U₄–U₃–S–O–L^a–L^e–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (XII-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

S*，S，m，o，p1，p2，U₅，U₄，U₃和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(XIII-a)所示的綴合物，

[S_b*–U₅–U₄–U₃–S_b–O–L^a–L^e–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (XIII-a)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o–，–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–；

–L^e–選自：–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_p1–，–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

S_b*，S_b，m，o，p1，p2，U₅，U₄，U₃和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(X-b)所示的綴合物，

[V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–L^a–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (X-b)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

V*，x，m，U_x，U_x+1，U_x+2，U_x+3和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(XI-b)所示的綴合物，

[V*–U₆–U₅–U₄–U₃–O–L^a–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (XI-b)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

V*，x，m，U₆，U₅，U₄，U₃和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

還更優選的是通式(XII-b)所示的綴合物，

[S*–U₅–U₄–U₃–S–O–L^a–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (XII-b)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

S*，S，m，U₅，U₄，U₃和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

同樣更優選的是通式(XIII-b)所示的綴合物，

[S_b*–U₅–U₄–U₃–S_b–O–L^a–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (XIII-b)

其中：

–L^a–選自：–(CH₂)_o1–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–C₂H₄–，–(CH₂–CH₂–O)_o2–CH₂–；

o1為選自2，3，4，5和6中的整數；

o2為選自1，2，3，4，5和6中的整數；

S_b*，S_b，m，U₅，U₄，U₃和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

還更優選的是通式(X-c)所示的綴合物，

[V*–U_x+3–U_x+2–U_x+1–U_x–O–(CH₂)_o–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (X-c)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

V*，x，m，U_x，U_x+1，U_x+2，U_x+3和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

還更優選的是通式(XI-c)所示的綴合物，

[V*–U₆–U₅–U₄–U₃–O–(CH₂)_o–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (XI-c)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

V*，x，m，U₆，U₅，U₄，U₃和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

還更優選的是通式(XII-c)所示的綴合物，

[S*–U₅–U₄–U₃–S–O–(CH₂)_o–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (XII-c)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

S*，S，m，U₅，U₄，U₃和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

還更優選的是通式(XIII-c)所示的綴合物，

[S_b*–U₅–U₄–U₃–S_b–O–(CH₂)_o–NH–W]_m–CRM₁₉₇ (XIII-c)

其中：

o為選自2，3，4，5和6中的整數；

S_b*，S_b，m，U₅，U₄，U₃和CRM₁₉₇具有本發明定義的含義。

在另一個實施方案中，所述的免疫原性載體優選為具有免疫調節性質的鞘糖脂，更優選為(2S,3S,4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇。如本文所用，術語具有免疫調節性質的鞘糖脂是指能夠刺激免疫系統對靶抗原的應答、但是其本身不會賦予上文定義的免疫力的合適的鞘糖脂。

如本文所用的鞘糖脂為包含與鞘脂類形成α–連接的碳水化合物部分的化合物。優選地，該碳水化合物部分為吡喃己糖，最優選為α-D-吡喃半乳糖。對于本領域的技術人員而言，鞘脂類為一類脂質，其包含通過酰胺鍵與脂肪酸連接的C18氨基醇。C18氨基醇優選為被羥基基團單-、二-或多取代的。特別優選的是，C18氨基醇為植物鞘氨醇。脂肪酸優選為單羧酸，其具有碳數量為16至28、更優選為18至26的飽和烷基鏈。具有免疫調節性質的鞘糖脂包括但不限于(2S,3S,4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-二十六烷酰基氨基十八烷-3,4-二醇，其可以刺激自然殺傷細胞(NK)的活性，并通過自然殺傷T(NKT)細胞刺激細胞因子的產生，并且展現出有效的體內抗腫瘤活性(Proc.Natl Acad.Sci.USA，1998，95，5690)。

本發明的糖與具有免疫調節性質的鞘糖脂的綴合物具有熱穩定的優點。為了適于綴合，在具有免疫調節性質的鞘糖脂上引入官能度。所述的官能度傾向于與本發明的連接子的末端氨基基團直接反應，從而提供糖的綴合物，或者與相互連接性分子的官能團Y直接反應，從而提供具有免疫調節性質的改性鞘糖脂。

優選地，在具有免疫調節性質的鞘糖脂的碳水化合物部分的C6上引入所述的官能度。因此，具有免疫調節性質的鞘糖脂被官能度官能化，所述的官能度傾向于與糖的末端氨基基團或與相互連接分子的官能團Y反應。傾向于與氨基基團反應的官能度包括但不限于活化的酯，異氰酸酯基團，醛，環氧化物，亞氨酸酯，羧酸，烷基磺酸酯和磺酰氯。傾向于與相互連接性分子的官能團Y反應以提供具有免疫調節性質的改性鞘糖脂呈現相互連接分子的官能團X的官能度包括但不限于胺，醇，巰基，活化的酯，異氰酸酯基團，醛，環氧化物，乙烯基，亞氨酸酯，羧酸，烷基磺酸酯，磺酰氯，乙烯基基團，炔基基團和疊氮基團。

優選地，在具有免疫調節性質的鞘糖脂的碳水化合物部分的C-6位置處引入的官能度選自包括或包含以下部分的組：胺，巰硫醇，醇，羧酸，乙烯基，馬來酰亞胺，α-碘代乙酰基，α-溴代乙酰基，N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)，2-吡啶基二硫基。

相互連接分子的所述的官能團X選自包括或包含以下部分的組：馬來酰亞胺，α-碘代乙酰基，α-溴代乙酰基，N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)，醛，羧酸，環氧樹脂(epoxyde)，烷基磺酸酯，磺酰氯，酸酐，碳酸酯。

優選地，二(N-琥珀酰亞胺)己二酸酯或雙(4-硝基苯基)己二酸酯首先與具有伯氨基基團的合成糖反應。隨后，活化的糖與鞘糖脂縮合，所述的物質通過具有末端氨基官能度的相互連接分子在C-6位置處進行改性，從而得到所述綴合物(圖3(B))。

如本文所用，術語“相互連接分子”是指包含官能團X和官能團Y的雙官能分子，其中官能團X能夠與連接子–L–上的末端氨基基團反應，所述的官能團Y能夠與免疫原性載體上或固體支持物上存在的官能度反應。

發現通過–O–L–NH₂基團的氮原子與免疫原性載體共價連接或共價結合的通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)所示的糖，或者換言之，通過使通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)或(IX-a)-(IX-c)所示的糖與免疫原性載體反應獲得的綴合物，特別是通式(X)，(X-a)-(X-c)，(XI)，(XI-a)-(XI-c)，(XII)，(XII-a)-(XII-c)，(XIII)或(XIII-a)-(XIII-c)所示的綴合物能夠在人類和/或動物宿主中激發免疫應答，因此可以用于預防和/或治療與細菌有關的疾病，其中所述的細菌在它們的莢膜多糖中包含以下糖片段中的一種：

α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcAp-(1→4)-β-D-Glcp,

β-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcAp,

β-D-GlcAp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Galp，

α-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcAp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp.

優選地，在莢膜多糖中包含上文提及的糖片段之一的細菌為肺炎鏈球菌血清型8。與肺炎鏈球菌血清型8有關的疾病包括肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥，以及慢性支氣管炎、鼻竇炎、關節炎和結膜炎的急性加重。

藥物組合物

本發明的一個方面涉及藥物組合物，特別是疫苗，其包含至少一種根據本發明的合成糖和/或其藥物可接受的鹽和/或綴合物，以及至少一種藥物可接受的佐劑、冷凍保護劑、凍干保護劑、賦形劑和/或稀釋劑，其中所述的綴合物包含通過-O-L-NH₂基團的氮原子與免疫原性載體共價連接的根據本發明的糖。

在本發明的另一個方面中，所述的藥物組合物或疫苗進一步包含莢膜多糖和/或莢膜多糖片段和/或肺炎鏈球菌細菌的蛋白質綴合物中的至少一種，其中所述的肺炎鏈球菌細菌選自包括或包含以下物質的組：肺炎鏈球菌血清型4，6B，9V，14，18C，19F和23F，優選地血清型1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19F和23F，更優選地血清型1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，14，15B，17F，18C，19F，19A，20，22F，23F和33F。

所述的疫苗可以制備成懸液的形式或者可以為凍干的。懸液形式可以被冷凍儲存。在凍干形式下，優選加入一種或多種穩定劑。可以在任何年齡進行接種。疫苗可以通過皮下、噴霧、注射、口服、眼內、氣管內或鼻內給予。考慮諸如特定的抗原、佐劑(如果存在)、年齡、性別、體重、具體動物或人類宿主物種和狀況、以及給予途徑之類的因素，根據制藥和獸醫領域中普通技術人員公知的標準技術，可以測定給予人類或動物的本發明疫苗的量以及給予的方案。

本發明的另一個方面涉及在人類和/或動物宿主中誘導針對肺炎鏈球菌的免疫應答的方法，該方法包括將根據本發明的糖和/或其鹽和/或綴合物和/或其混合物或其藥物組合物給予所述的人類和/或動物宿主，其中所述的綴合物包含根據本發明的糖，該糖通過-O-L-NH₂基團的氮原子與免疫原性載體共價連接。根據本發明在人類和/或動物宿主中治療或預防由肺炎鏈球菌導致的疾病的方法包括將根據本發明的至少一種糖和/或其鹽和/或綴合物和/或其混合物或其藥物組合物給予所述的人類和/或動物宿主，其中所述的綴合物包含根據本發明的糖，該糖通過-O-L-NH₂基團的氮原子與免疫原性載體共價連接。

靜脈內和腸胃外給予是優選的。此類組合物可以與合適的載體、稀釋劑或賦形劑(例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等)混合。例如本發明的凍干的糖最終可以用液體成分再構成，從而得到適用于給予所述的人類和/或動物宿主的材料。再構成通常在使用時進行。因此，本發明的糖以及水包油乳液佐劑或佐劑的緩沖溶液可以分開保持在包裝的或分裝的疫苗試劑盒中，以備在使用時進行最終的配制。在包含2個容器的試劑盒中，一個容器包含用于再構成的液體，另一容器包含凍干的材料。鑒于穩定性的原因，本發明的凍干的成分可以包括穩定劑，例如乳糖、蔗糖和/或甘露醇、以及它們的混合物。使用蔗糖/甘露醇混合物可以加速干燥工藝。凍干的成分還可以包括氯化鈉。凍干材料中可溶性成分在再構成后保留在組合物中，因此最終的液體疫苗可以包含乳糖和/或蔗糖。

可以使用本領域已知的方法進行本發明的疫苗的配制。顯而易見的是，合適的載體和其他添加劑的選擇取決于具體的給予途徑以及具體劑型的性質。

本發明的疫苗組合物可以包含一種或多種佐劑。如本文所用，術語“佐劑”是指免疫學佐劑，即，在疫苗組合物中使用的材料，其可以通過增強對疫苗中所包含的給定抗原的免疫應答、但對其不具有抗原相關性，從而改良或增強所述的疫苗的效果。對于本領域的技術人員而言，免疫學佐劑的傳統公認的實例包括但不限于油乳液(例如弗氏佐劑)、皂苷、鋁鹽或鈣鹽(例如明礬)、非離子嵌段聚合物表面活性劑、α-半乳糖神經酰胺等。

本發明的疫苗可以包含輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、膠凝或粘性增強添加劑、防腐劑、風味劑、顏料等，這取決于給予途徑和所需的制劑。本發明的組合物可以包含殺菌劑，特別是以多劑量形式包裝時。諸如硫柳汞和2-苯氧基乙醇之類的殺菌劑通常應用于疫苗中，但是優選的是使用不含汞的防腐劑或者根本不含防腐劑。

此外，本發明的疫苗可以包含溫度保護劑，其實例包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。

本發明的藥物組合物方便地以液體制備物的形式提供，例如等滲水性溶液、懸液、乳液或可以緩沖至所選的pH的粘性組合物。用于液體配制物的藥物可接受的載體可以為水性或非水性溶液、懸液、乳液或油。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇和可注射的有機酯，例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性溶液、乳液或懸液，包括生理鹽水和緩沖介質。

再構成后的組合物的pH優選為6至8，更優選為6.5至7.5(例如大約7)。可以通過使用緩沖劑(例如Tris緩沖劑、乙酸鹽、谷氨酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，酒石酸鹽，磷酸鹽，檸檬酸鹽，碳酸鹽，甘氨酸鹽，組氨酸，甘氨酸，琥珀酸酯和三乙醇胺緩沖劑)保持本發明的組合物。因此，本發明的組合物優選地包含緩沖劑。等滲劑可以為離子等滲劑，例如鹽；或者非離子等滲劑，例如碳水化合物。離子型等滲劑的實例包括但不限于NaCl，CaCl₂，KCl和MgCl₂。非離子型等滲劑的實例包括但不限于山梨醇和甘油。

在本發明的一個優選的實施方案中，疫苗組合物可以配制成無菌的液體無熱原磷酸鹽緩沖生理鹽水，其具有或不具有防腐劑。

藥物可接受的防腐劑可以用于增加組合物的貨架期。芐基醇是合適的，但是還可以使用多種防腐劑，例如對羥苯甲酸酯，硫柳汞，氯丁醇或苯扎氯銨。防腐劑的合適的濃度為基于總重量的0.02％至2％，但是可以理解的是可以根據所選的試劑而改變。

本發明的藥物組合物可以配制成單劑量小瓶、多劑量小瓶或預填充的注射器。

進一步優選的，所述的藥物組合物配制成凍干物或液體緩沖溶液形式。

以合適的劑量水平以已知的方式在傳統的固體或液體載體或稀釋劑中，以及在傳統的制藥佐劑中制備本發明的疫苗或藥物組合物。優選的制備物或配制物為適用于口服應用的可給予形式。這些可給予的形式例如包括藥丸、片劑、薄膜片劑、包衣片劑、膠囊、粉末和儲庫。除了口服可給予形式以外的形式也是可行的。本發明的疫苗或藥物組合物可以通過任何合適的手段給予，包括但不限于吸入，通過上皮或粘膜皮膚襯里(口腔粘膜、直腸和陰道上皮襯里、鼻咽粘膜、腸粘膜)注射；口服、直腸、透皮、局部，真皮內、胃內、皮內、陰道內、血管內(intravasally)、鼻內、頰內、經皮(percutaneously)、舌下或藥物領域中可以利用的任何其他的手段。

本發明的疫苗或藥物組合物(包含通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)的任意一項所述的至少一種合成糖，優選地糖10，18，19，20，21，22，55，57，60和62或其藥物可接受的鹽，或者綴合物(其包含通過-O-L-NH₂基團的氮原子與免疫原性載體共價連接的通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)所示的糖)作為活性組分)通常與針對預計的給予形式(即，口服片劑、膠囊(固體填充的、半固體填充的或液體填充的)、用于構建的粉末、口服凝膠、酏劑、可分散的顆粒、糖漿、懸液等)而適當選擇的合適的載體材料混合給予，并且符合傳統的藥學實踐。例如，對于片劑或膠囊形式的口服給予而言，活性組分可以與任何口服非毒性的藥物可接受的惰性載體結合，其中所述的載體例如為乳糖、淀粉、蔗糖、纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、滑石、甘露醇、乙醇(液體形式)等。此外，當在理想的或需要時，合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑也可以引入至混合物中。粉末和片劑可以包含大約5％至大約95％的根據本發明的糖。

合適的粘合劑包括淀粉、明膠、天然糖、玉米甜味劑、天然和合成膠(例如阿拉伯樹膠)、海藻酸鈉、羧甲基-纖維素、聚乙二醇和蠟。在用于這些劑型中的可以提及的潤滑劑中，可以使用硼酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括淀粉、甲基纖維素、胍爾豆膠等。在適當的情況下，還可以包含甜味劑、風味劑和防腐劑。上文提及的一些術語將在下文中更詳細地討論，即崩解劑、稀釋劑、潤滑劑、粘合劑等。

此外，本發明的疫苗或藥物組合物可以配制成持續釋放形式，從而提供任意一種或多種成分或活性組分的速率控制的釋放，由此優化治療效果。適用于持續釋放的劑型包括分層的片劑，其包含具有不同崩解速率的多個層或受控釋放的聚合物基質，其浸漬有活性成分，成型為片劑形式或膠囊，其中含此類浸漬的或包囊的多孔聚合物基質。

液體形式的制備物包括溶液、懸液和乳液。對于腸胃外注射或者加入用于口服溶液、懸液和乳液的甜味劑和遮光劑而言，可以提及水或者水-丙二醇溶液作為實例。液體形式的制備物還可以包含用于鼻內給予的溶液。

適用于吸入的氣霧劑制備物可以包括粉末形式的溶液和固體，其可以與藥物可接受的載體組合，例如惰性壓縮氣體，例如氮氣。

為了制備栓劑，首先熔融低熔點蠟，例如脂肪酸甘油酯的混合物，例如可可油，并通過攪拌或類似的混合使活性組分均勻地分散于其中。然后，將熔融的均勻混合物倒入常規尺寸的模具中，使其冷卻并由此固化。

固體形式的制備物也被包含在內，該制備物目標在于在臨使用前轉化成用于口服或腸胃外給予的液體形式的制備物。此類液體形式包括溶液、懸液和乳液。

本發明的疫苗或藥物組合物還可以經皮傳遞，其中所述的疫苗或藥物組合物包含通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)的任意一項所述的至少一種合成糖，優選地糖10，18，19，20，21，22，55，57，60和62–89或其藥物可接受的鹽，或者綴合物，該綴合物包含通過-O-L-NH₂基團的氮原子與免疫原性載體共價連接或共價結合的糖。經皮組合物可以是乳膏、洗劑、氣霧劑和/或乳液的形式，并且可以包含在基質或貯庫類型(其為本領域用于此目的的常規形式)的經皮貼劑中。

術語膠囊是指由甲基纖維素、聚乙烯醇或變性明膠或淀粉制成的、用于保持或容納包含活性組分的組合物的特定容器或封閉空間。硬殼膠囊通常由相對高凝膠強度的主鏈與豬皮明膠的共混物制備。膠囊本身可以包含少量的染料、遮光劑、塑化劑和防腐劑。

片劑是指包含活性組分和合適的稀釋劑的壓制或模制的固體劑型。可以通過壓制混合物或顆粒來制備片劑，其中所述的顆粒是通過濕法制粒、干法制粒或本領域的技術人員公知的壓緊而獲得的。

口服凝膠是指分散或溶解于親水性半固體基質中的活性組分。

用于構建的粉末是指包含活性組分和合適的稀釋劑(其可以懸浮于水或果汁中)的粉末共混物。

合適的稀釋劑為通常構成組合物或劑型的主要部分的物質。合適的稀釋劑包括糖，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；衍生自小麥、玉米、稻米(corn rice)和馬鈴薯的淀粉；以及諸如微晶纖維素之類的纖維素。稀釋劑在組合物中的量可以為占總組合物的大約5重量％至大約95重量％，優選為大約25重量％至大約75重量％，更優選為大約30重量％至大約60重量％，以及最優選為大約40重量％至大約50重量％。

術語崩解劑是指加入至組合物中以幫助其分裂(崩解)并釋放藥劑的材料。合適的崩解劑包括淀粉；“冷水可溶性”改性淀粉，例如羧甲基淀粉鈉；天然和合成樹膠，例如槐豆樹膠、刺梧桐樹膠、瓜耳樹膠、黃芪膠和瓊脂；纖維素衍生物，例如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；微晶纖維素和交聯的微晶纖維素，例如交聯羧甲基纖維素鈉；藻酸鹽，例如海藻酸和藻酸鈉；粘土，例如斑脫土；以及泡騰混合物。崩解劑在組合物中的量可以為組合物的大約1重量％至大約40重量％，優選為組合物的2重量％至大約30重量％，更優選為組合物的大約3重量％至大約20重量％，最優選為大約5重量％至大約10重量％。

粘合劑表征為這樣的物質，其將粉末粘結或“膠合”在一起，并通過形成顆粒而使得它們具有粘性，由此在配制物中起到“粘合劑”的作用。粘合劑能增加稀釋劑或膨脹劑中已有的粘附強度。合適的粘合劑包括糖，例如蔗糖，衍生自小麥、玉米稻米和馬鈴薯的淀粉；天然樹膠，例如阿拉伯樹膠、明膠和黃芪膠；海藻的衍生物，例如海藻酸、海藻酸鈉和海藻酸鈣銨；纖維素材料，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基-甲基纖維素；聚乙烯吡咯烷酮；以及無機物，例如硅酸鋁鎂。粘合劑在組合物的量可以為組合物的大約1重量％至30重量％，優選為組合物的大約2重量％至大約20重量％，更優選為大約3重量％至大約10重量％，甚至更優選為大約3重量％至大約6重量％。

潤滑劑是指這樣的物質，其被加入至劑型中，在該劑型被壓制后，通過降低摩擦或磨損而使得片劑、顆粒等由模具或模頭上釋放。合適的潤滑劑包括金屬硬脂酸鹽，例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鉀；硬脂酸；高熔點蠟；以及水溶性潤滑劑，例如氯化鈉、苯甲酸鈉、乙酸鈉、油酸鈉、聚乙二醇和d'l-亮氨酸。潤滑劑通常在壓制前的最后步驟中加入，這是因為它們必須存在于顆粒的表面上，以及存在于顆粒與壓片機部分之間。潤滑劑在組合物中的量可以為組合物的大約0.05重量％至大約15重量％，優選為組合物的0.2重量％至大約5重量％，更優選為組合物的大約0.3重量％至大約3重量％，并且最優選為組合物的大約0.3重量％至大約1.5重量％。

助流劑為這樣的材料，其防止結塊，并改善顆粒的流動特征，使得流動平滑并均勻。合適的助流劑包括二氧化硅和滑石。助流劑在組合物中的量可以為組合物的大約0.01重量％至10重量％，優選為總組合物的0.1重量％至大約7重量％，更優選為大約0.2重量％至5重量％，并且最優選為大約0.5重量％至大約2重量％。

著色劑為向組合物或劑型提供顏色的賦形劑。此類賦形劑可以包括食品級染料以及吸附在合適的吸附劑(例如粘土或氧化鋁)上的食品級染料。著色劑的量可以為組合物的大約0.01重量％至10重量％，優選為大約0.05重量％至6重量％，更優選為組合物的大約0.1重量％至大約4重量％，并且最優選為大約0.1％至大約1％。

用于配制和給予本發明的疫苗的技術可以在"Remington's Pharmaceutical Sciences"Mack Publishing Co.，Easton PA.中找到。合適的疫苗組合物可以為此類糖在合適的液體藥物載體或任何其他的配制物中的溶液，其中所述的組合物包含通式(I)，(I-a)-(I-c)， (II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)的任意一項所示的至少一種糖，優選糖10，18，19，20，21，22，55，57，60和62–89，或者其藥物可接受的鹽，或者綴合物，該綴合物包含通過-O-L-NH₂基團的氮原子與免疫原性載體共價連接的糖，其中所述的配制物例如為片劑、藥丸、薄膜片劑、包衣片劑、糖衣丸、膠囊、粉末和儲庫、凝膠、漿料、糖漿、懸液、乳液等。

根據本發明的一種綴合物的治療有效劑量或者根據本發明的一種糖的治療有效劑量是指使得該化合物至少部分對疾病免疫的量。可以在細胞培養或試驗動物中通過標準的制藥學、藥理學和毒理學操作來測定此類化合物的毒性和治療效力。毒性與治療作用之間的劑量比為治療指數。所給予的組合物的實際的量取決于待治療的受試對象、受試對象的體重、痛苦的嚴重性、給予方式以及處方醫師的判斷。

抗體和免疫測定

本發明還涉及針對根據本發明的至少一種合成糖的抗體。該抗體由單克隆雜交瘤產生。所述的抗體可以用于診斷、預防和治療肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥，以及慢性支氣管炎、鼻竇炎、關節炎和結膜炎的急性加重。本發明的另一個實施方案涉及所述的抗體用于制造藥劑或裝置的用途，其中所述的藥劑或裝置用于診斷、預防和治療由肺炎鏈球菌、優選為由肺炎鏈球菌血清型8所導致的肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥，以及慢性支氣管炎、鼻竇炎、關節炎和結膜炎的急性加重。

如本文所用，術語“抗體”涵蓋了多克隆和單克隆抗體的制備物，以及包含雜交抗體、F(ab’)₂片段、F(ab)分子、單結構域抗體及其功能片段的制備物，其展示出親本抗體分子的免疫結合性質。

根據本發明的抗體可以為多克隆的或單克隆的。

通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)， (VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)的任意一項所示的糖，優選糖10，18，19，20，21，22，55，57，60或62-89，或者綴合物(其包含通過-O-L-NH₂基團的氮原子與免疫原性載體共價連接的一種上文所述的糖)，或者其抗體可以用于制備藥物組合物，特別是疫苗，從而用于治療或預防由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的疾病。本發明的糖或者針對并識別根據本發明的糖的抗體可以用于治療或預防由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的疾病。

另外，本發明涉及根據本發明的通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)所示的至少一種糖或者針對本發明的至少一種糖的至少一種抗體用于診斷由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥，以及慢性支氣管炎、鼻竇炎、關節炎和結膜炎的急性加重的免疫測定中的用途。

所述的測試包括例如可用于診斷由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的疾病的微陣列和ELISA。因此，本發明的另一個方面涉及式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)所示的任意一種糖用于診斷由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的疾病的用途。

通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)所示的任意一種糖或者此類糖的混合物可以固定在微陣列的表面上，或者任何其他的表面上，用于檢測肺炎鏈球菌血清型8的體外方法中。識別肺炎鏈球菌血清型8的方法包括使用本發明的至少一種糖。此外，通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)所示的合成糖或者此類糖的混合物可以用作免疫測定的分析標準。

因此，在用于檢測針對肺炎鏈球菌8型的抗體的免疫測定中，通式(I)，(I-a)-(I-c)，(II)，(II-a)-(II-g)，(III)，(III-a)-(III-g)，(IV)，(IV-a)-(IV-g)，(V)，(V-a)-(V-c)，(VI)，(VI-a)-(VI-c)，(VII)，(VII-a)-(VII-c)，(VIII)，(VIII-a)-(VIII-c)，(IX)和(IX-a)-(IX-c)所示的糖可以用作標志物。

因此，本發明的另一個方面涉及包含根據本發明的至少一種糖的固體支持物。

該固體支持物優選地是診斷裝置的一部分。所述的固體支持物和診斷裝置被用于診斷由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥，以及慢性支氣管炎、鼻竇炎、關節炎和結膜炎的急性加重，其中所述的根據本發明的至少一種糖優選地通過共價鍵合固定在所述的固體支持物上。

優選地，固體支持物選自載玻片、玻璃板、微滴板、微球或珠。

本發明的糖優選地使用相互連接分子而與固體支持物共價鍵合。

此外，本發明顯示本發明的糖可以用于免疫測定檢測由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥，以及慢性支氣管炎、鼻竇炎、關節炎和結膜炎的急性加重。此類測試包括例如用于診斷由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥，以及慢性支氣管炎、鼻竇炎、關節炎和結膜炎的急性加重的微陣列和ELISA。

因此，本發明的另一個方面涉及根據本發明的糖用于診斷由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥，以及慢性支氣管炎、鼻竇炎、關節炎和結膜炎的急性加重的用途。

對于測試系統的選擇有不同的可能性，其中根據本發明的糖被用于診斷由肺炎鏈球菌、優選地由肺炎鏈球菌血清型8引起的肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥，以及慢性支氣管炎、鼻竇炎、關節炎和結膜炎的急性加重。為本發明的診斷目的而實施的測試可以為免疫測定，例如固相酶免疫測定(EIA)、酶聯免疫吸附測試(ELISA)，特別是“間接的”ELISA或放射性免疫測定(RIA)。

優選地，根據本發明的糖通過相互連接分子與固體支持物共價連接。因此，根據本發明的糖可以直接或間接通過-O-L-NH₂基團的氮原子在固體支持物上共價連接(參見圖3(C))。

固體支持物優選地選自載玻片、微滴板、試管、微球、納米顆粒或珠粒。

特別優選的是固體支持物為載玻片或微滴板。微滴板或微板或微孔板為具有多個“孔”的平板，其中所述的孔用作小的試管。通常，可以使用具有6，24，96，384或者甚至1536個樣品孔的微滴板。微滴板可以由多種不同的材料生產，例如聚碳酸酯用于PCR用途的微滴板。最普通的是聚苯乙烯，其用于大部分的光學檢測微滴板。對于光學吸光度或發光檢測而言，通過加入二氧化鈦而可以為白色，或者對于熒光生物學測試而言，通過加入碳而為黑色。

附圖簡述

圖1：根據本發明的市售可得的相互連接分子。

圖2：根據本發明的相互連接分子的官能團X的實例。

圖3：與載體蛋白質綴合的(A)四糖的實例。與鞘糖脂綴合的(B)四糖的實例。與固體支持物綴合的(C)四糖的實例。四糖僅作為實例，并且可以替換為通式(I)所示的任意一種糖。

圖4：(A)糖符號。(B)使用市售可得的血清007sp的聚糖陣列分析：使用熒光標記的抗人IgM二級抗體(Alexa Fluor 488山羊抗人IgM，Invitrogen A21215)實施檢測。(C)使用市售可得的血清007sp的聚糖陣列分析：使用熒光標記的抗人IgG二級抗體(Alexa Fluor 647山羊抗人IgG，Invitrogen A21445)實施檢測。(D)使用SP-8特異性兔分型血清的聚糖陣列分析：使用熒光標記的抗兔IgG二級抗體(山羊抗兔IgG-FITC，abcam ab6717)實施檢測。

圖5：小鼠1160的免疫應答：(A)微陣列印跡圖案；(B)小鼠1160的免疫應答(時間框：第0天至第35天)：使用熒光標記的抗小鼠IgG二級抗體(兔抗小鼠IgG-FITC，F9137，Sigma)實施檢測。

圖6：抗SP-8單克隆抗體的生成：使用熒光標記的抗小鼠二級抗體(Alexa 635山羊抗小鼠IgG，Invitrogen A31574)實施檢測。

圖7：表面等離子體共振：單克隆抗體mAb 1H8特異性地識別合成糖18和天然Sp8多糖。

圖8：免疫熒光染色結果：使用綴合物59的免疫接種誘導了識別天然SP-8多糖和ST8細菌的免疫應答。使用FITC標記細菌，并將其與所示的一級抗體溫育。在與Alexa 635-標記的山羊抗小鼠IgG二級抗體(A31574，Invitrogen)溫育后觀察抗體的結合。(A)肺炎鏈球菌ST8，mAb 1H8；(B)肺炎鏈球菌ST8，mAb同種型對照(抗耶爾森氏鼠疫菌(Y.pestis)的LPS核心)；(C)肺炎鏈球菌ST1；mAb 1H8。

圖9：熒光標記的肺炎球菌的流式細胞術：(A)在使用mAb 1H8或同種型對照標記后的代表性流式細胞術結果；(B)使用mAbs 1H8或1F1進行的至少3個獨立標記試驗的累積結果。柱狀圖示出陽性結合的平均值±SD。***P<0.001；****P<0.0001。2種單克隆抗體1H8和1F1均與肺炎鏈球菌血清型8結合，但不與肺炎鏈球菌血清型1或3結合。單克隆抗體與肺炎鏈球菌8型肺炎球菌之間的相互作用是特異性的，因為不能觀察到抗體同種型對照的結合或者與肺炎鏈球菌血清型1或3的結合。

圖10：在mAb 1H8:mAb 1H8存在下(但不具有同種型抗體)，調理吞噬性殺死肺炎鏈球菌血清型8細菌會在所有檢測劑量下調理活細菌被吞噬細胞殺滅，其效力類似于由接種的人類(007sp，1:4稀釋)和兔ST8分型血清(1:4稀釋)得到的合并的血清。

圖11：(A)mAb 1H8和1F1與糖19，49，90，60，62，55和57結合的微陣列分析。柱狀圖示出對4個點的背景歸一化的熒光強度的平均值±SD。MFI，平均熒光強度：三糖62，四糖19，四糖60，五糖55和六糖57以相似的強度被mAbs 1H8和1F1識別，但更小的結構49和90不能被識別；(B)與預吸附SP8CPS(10μg/mL濃度)的mAb 1H8和1F1(100μg/mL)的結合的抑制。具有Welch’s校正的非參單尾t檢驗：**P<0.01；***P<0.001：mAbs 1H8和1F1與五糖55和六糖57的結合通過天然SP8多糖的抑制而被消除；(C)結構化合物90。

圖12：mAb 28H11(保護性鼠科IgM)與糖19，20，21和22的結合的微陣列分析。(A)在mAb 28H11的不同濃度下的結合。(B)通過加入天然肺炎鏈球菌8型CPS(10μg/mL)抑制mAb 28H11與化合物19的結合。

圖13：通過MALDI-MS對綴合物CRM₁₉₇-18，CRM₁₉₇-60和CRM₁₉₇-57的表征。

圖14：在兔中，針對綴合物CRM₁₉₇-18，CRM₁₉₇-60和CRM₁₉₇-57的免疫應答的評價。(A)-(D)針對肺炎鏈球菌8型-相關聚糖的免疫應答的聚糖微陣列分析(1:50稀釋)。(A)在第21天時血清的聚糖微陣列分析。使用綴合物免疫的所有的兔子均顯示針對肺炎鏈球菌8型CPS-相關的寡糖和ST8CPS的明顯的免疫應答。(B)兔針對四糖19的免疫應答的時間過程，其中所述的兔使用CRM₁₉₇-18或單獨地CRM₁₉₇免疫。(C)兔針對四糖60的免疫應答的時間過程，其中所述的兔使用CRM₁₉₇-60或單獨地CRM₁₉₇免疫。(D)兔針對六糖57的免疫應答的時間過程，其中所述的兔使用CRM₁₉₇-57或單獨地CRM₁₉₇免疫。(E)免疫的兔針對肺炎鏈球菌CPS的免疫應答的時間過程，其通過多糖ELISA來評估(1:50稀釋)。所述的值描述為比免疫前血清的值的倍數增加。(F)在第21天針對肺炎鏈球菌8型CPS的免疫應答的比較，其是通過多糖ELISA來評估的。進行統計學分析(單因素ANOVA，Bonferroni校正)，星號描述P值：n.s.無顯著性；*P<0.05；**P<0.005。G，在不同稀釋度下在第21天時針對肺炎鏈球菌8型CPS的免疫應答的比較，其是通過多糖ELISA來評估的。兔衍生的肺炎鏈球菌8型分型血清用作參照。

包含以下實施例以證明本發明的優選的實施方案。本領域的技術人員應該理解的是，以下實施例中公開的技術代表了本發明人發現的在本發明的實踐中良好地發揮作用的技術，因此可以被認為構成了用于其實踐的優選的模式。但是，本領域技術人員根據本發明公開內容可以理解，在特定的實施方案中可以進行許多改變，這些改變也被公開，并且在不脫離本發明的精神和范圍的條件下仍可獲得類似的或相似的結果。

基于本說明書，本發明的多個方面的其他修改和備選實施方案對于本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，本說明書應該解釋為僅是示意性的，是為了教導本領域技術人員實施本發明的一般方式。應該理解的是，本發明所示并描述的本發明的各形式被視為實施方案的實例。多種要素和多種材料可以取代本發明示出并描述的那些，多個部件和工藝可以逆轉，并且本發明的某些特征可以獨立利用，所有這些是本領域技術人員在獲得本發明描述的益處之后顯而易見的。如所附的權利要求書所述，在不脫離權利要求書中描述的本發明的精神和范圍的情況下可以對本發明所述的要素進行多種改變。

實施例

1.化學合成試驗

用于化學合成的一般信息

除非另外提及，否則所有市售可得的起始材料和試劑都以原樣使用。所有反應均是在氬氣氣氛下實施的。溶劑被干燥。在Freie Berlin，使用Agilent 6210 ESI-TOF質譜儀記錄高分辨質譜(HRMS)。

縮寫

在以下方案中使用的縮寫含義如下：Ac(乙酰基)，BAIB([雙(乙酰氧基)碘代]苯)，Bn(芐基)，t-Bu(叔丁基)，Bz(苯甲酰基)，Cbz(羧基芐基)，DCM(二氯甲烷)，DDQ(2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌)，Im(咪唑)，NAP(2-萘基甲基)，NIS(N-碘代琥珀酰亞胺)，Py/Pyr(吡啶)，TEMPO((2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基)氧基)，Tf(三氟甲磺酰基)，THF(四氫呋喃)，TMS(三甲基甲硅烷基)，TMSOTf(三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯)，p-Ts(對甲苯磺酰基)。

通過[2+2]糖基化方法合成糖

實施例1-1：化合物3的合成

將硫代糖苷供體底物1(6.0g，11.53mmol)和具有C-2連接子2的受體(在旋轉蒸發儀中使用甲苯進行共沸點干燥)接收于干燥的DCM(100mL)中，向其中加入5gMW干燥的MS，并在室溫下攪拌15min，然后冷卻至-10℃。然后，將NIS(3.83g，17.29mmol)和TfOH(0.15mL，1.73mmol)加入至RM(反應混合物)中，并在-10℃至-5℃下攪拌1hr。通過TLC監測反應結束。然后，使用10％Na₂S₂O₃水溶液(50mL)將RM猝滅，接著使用EtOAc(25ml X 3)萃取。然后使用鹽水(10ml) 洗滌合并的有機層，在無水Na₂SO₄上干燥，過濾并在真空下濃縮，從而得到淺黃色油狀化合物。使用處于己烷中的20-30％EtOAc在硅膠柱色譜上純化粗產物，從而得到斑點，該斑點在蒸發后產生所需的產物3，其為淺黃色透明粘性液體(7.60g，89％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.97(dd，J＝8.4，1.2Hz，4H)，7.59–6.90(m，21H)，5.91–5.71(m，1H)，5.62–5.41(m，2H)，5.22–4.95(m，2H)，4.80(d，J＝7.7Hz，0.5H)，4.67(d，J＝7.7Hz，0.5H)，4.56–4.22(m，3H)，4.10–3.52(m，5H)，3.50–3.33(m，2H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ＝165.7，165.4，156.35，156.2，137.9，136.9，133.4，133.2，129.9，129.5，129.3，129.1，128.7，128.5，128.4，128.3，128.1，127.8，127.4，127.2，126.2，101.9，101.6，78.9，72.6，72.1，69.1，68.7，67.4，67.2，66.7，51.7，46.9，45.8.

實施例1-2：化合物4的合成

在氬氣下將底物3(7.50g，10.08mmol)吸收到DCM(75mL)中，采用活化的MS 10min，然后冷卻至0℃。滴加三乙基硅烷(12.88mL，81.0mmol)，然后滴加TFA(4.66mL，60.5mmol)，并在rt下將RM攪拌16h，然后使用水(100mL)猝滅。使用DCM(30mL X 3)萃取水溶液，使用水(20mL X 3)、鹽水(20mL)充分洗滌合并的有機相，在無水Na₂SO₄上干燥，過濾，在真空下蒸發，從而得到無色粘性固體。使用處于己烷中的30％-100％EtOAc在硅膠柱色譜上純化粗產物，從而得到產物4，在真空下蒸發從而得到無色油(6.1g，81％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝8.04–7.84(m，4H)，7.60–6.87(m，21H)，5.55–5.36(m，2H)，5.22–4.90(m，2H)，4.77–4.53(m，3H)，4.51–4.30(m，2H)，4.06-3.93(m，2H)，3.87–3.53(m，4H)，3.46–3.20(m，3H).¹³C NMR(101 MHz，CDCl₃)δ＝167.3，165.5，138.0，137.7，133.6，130.1，129.9，128.6，128.5，128.1，127.9，127.8，127.4，101.3，101.2，76.7，74.7，73.9，71.6，71.5，71.2，70.0，69.0，67.4，67.2，51.7，46.8，45.8.

實施例1-3：化合物5的合成

將受體4(2.0g，2.68mmol)與活化的AWMS吸收于DCM(30mL)中，在r t下攪拌30min，然后冷卻至0℃。然后經過5min，加入TMSOTf(0.49μL，0.27mmol)，接著加入處于DCM(5mL)中的亞氨酸酯供體6(Carbohydrate Res 2008，344，439-447.)(2.20g，3.89mmol)，將反應混合物在0℃下攪拌30min。使用Et3N(1mL)猝滅RM，過濾，并在真空下除去溶劑。使用處于己烷中的EtOAc通過快速柱色譜純化粗產物，從而得到產物5(3.2g，98％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝8.13–6.88(m，35H)，5.67-5.52(m，1H)，5.46–5.31(m，1H)，5.20(s，1H)，5.16–4.89(m，3H)，4.68(t，J＝11.2Hz，1H)，4.55(d，J＝8.1Hz，1.5H)，4.47–4.24(m，3.5H)，4.20–3.89(m，1.5H)，3.89–3.19(m，9.5H)，3.13(td，J＝9.7，4.9Hz，1H)，2.63(t，J＝10.2Hz，1H)，0.63(s，9H)，-0.12(s，3H)，-0.19(s，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ＝165.4，165.36，164.7，138.2，137.1，133.4， 133.2，129.94，129.9，129.2，128.7，128.6，128.5，128.4，128.2，128.0，127.8，127.3，126.4，101.7，101.2，101.1，81.2，75.5，75.1，74.6，73.7，73.4，73.0，68.9，68.0，67.3，66.1，51.7，46.9，25.6，18.0，-4.1，-4.8.

實施例1-4：化合物7的合成

在0℃下將底物5(1.6g，1.317mmol)吸收于吡啶(10mL)中，并向其中加入HF-吡啶(3.56mL，39.5mmol)，在rt下攪拌24h。使用水洗滌RM，并使用DCM(20mL X 3)萃取。然后使用稀HCl(50mL X 2)、飽和NaHCO₃溶液(50mL)、鹽水(10mL)洗滌合并的有機相，在Na₂SO₄上干燥，過濾并在真空下濃縮，從而得到粗產物，使用處于己烷中的35-40％EtOAc通過硅膠柱色譜純化粗產物，從而得到白色泡沫7(1.3g，90％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝8.15–6.92(m，1H)，5.65–5.51(m，1H)，5.44-5.30(m，1H)，5.23(s，1H)，5.11-5.04(m，3H)，4.77–4.49(m，3H)，4.49–4.24(m，4H)，4.25–3.91(m，2H)，3.91–3.59(m，4H)，3.57–3.00(m，7H)，2.68(t，J＝10.3Hz,1H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ＝165.4，165.3，156.4，156.2，138.2，136.9，133.6，133.2，130.3，130.0，129.9，129.4，128.7，128.7，128.5，128.5，128.4，128.1，128.1，127.8，127.4，126.4，101.8，101.2，101.1，80.6，75.9，74.9，74.7， 73.7，73.5，72.6，72.0，71.9，68.9，67.9，67.4，67.2，66.0，51.7，46.9，45.9.

實施例1-5：化合物8的合成

將(2S,3R,4S,5R,6R)-6-((芐氧基)甲基)-2-(乙基硫基)-5-羥基四氫-2H-吡喃-3,4-二基二苯甲酸酯9(J Carbohydrate Chemistry 1993，12，309)(4.00g，7.654mmol，1.0eq.)和(4aR,6R,7R,8aR)-8-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-苯基-6-(2,2,2-三氯-1-亞氨基乙氧基)六氫吡喃[3,2-d][1,3]二噁英-7-基苯甲酸酯11(Carbohydrate Res，2008，344，439.)(6.28g，9.95mmol，1.3eq.)在DCM(140mL)中形成的混合物在氬氣氣氛下攪拌30min。冷卻反應混合物(-20℃)，并加入TMSOTf(0.16mL，0.880mmol，0.115eq.)。在攪拌45min后，通過Et₃N(1.0mL)加入猝滅反應混合物。在真空下濃縮有機溶液。

在硅膠(EtOAc/己烷，1/3，v/v)上通過快速色譜純化所得的深黃色的油，從而得到(2S,3R,5R,6R)-5-(((4aR,6S,7R,8S,8aR)-7-(苯甲酰基氧基)-8-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-苯基六氫吡喃苯基六氫吡喃[3,2-d][1,3]二噁英-6-基)氧基)-6-((芐氧基)甲基)-2-(乙基硫基)四氫-2H-吡喃-3,4-二基二苯甲酸酯8(6g，79％)的無色固體：R_f＝0.5(EtOAc/己烷，3/7，v/v)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝-0.19(s，3H)，-0.11(s，3H)，0.63(s，9H)，1.20(t，J＝7.4Hz，3H)，2.67(m，2H)，3.15(td，J＝9.7Hz，4.9Hz，2H)，3.28(t，J＝9.2Hz，1H)，3.53–3.37(m，1H)，3.74–3.55(m，1H)，3.79(t，J＝9.0Hz，1H)，4.19(t，J＝9.5Hz，1H)，4.37(d，J＝12.2Hz，1H)，4.57(d，J＝10.0Hz，1H)，4.59(dd，J＝15.1，9.0Hz，2H)，4.67(d，J＝12.2Hz，1H)， 5.12(dd，J＝8.9，8.2Hz，1H)，5.21(s，1H)，5.41(t，J＝9.8Hz，1H)，5.63(t，J＝9.3Hz，1H)，7.29–7.72(m，19H)，7.88–8.03(m，6H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ＝165.27，165.07，164.45，138.16，137.00，133.14，133.10，132.97，130.21，129.79，129.77，129.75，129.34，128.99，128.51，128.38，128.28，128.22，128.05，128.02，127.99，126.21，101.57，101.06，83.39，81.05，78.70，77.43，77.11，76.80，75.41，74.93，74.52，73.49，72.90，70.59，67.86，67.45，65.97，25.43，24.08，17.80，14.85，-4.20，-4.97.

實施例1-6：化合物12的合成

在0℃下將TBS底物8(2.0g，2.018mmol，1equiv.)接收于吡啶(10mL)中，并向其中加入70％HF-吡啶(5.45mL，60.5mmo，30equiv.)，在rt下攪拌36h。

使用水(50mL)洗滌RM，并使用DCM(50mL X 3)萃取。然后使用飽和NaHCO₃溶液(50mL)、鹽水(20mL)洗滌合并的有機相，在Na₂SO₄上干燥、過濾并在真空下濃縮，從而得到粗產物，使用35-40％EtOAc/己烷通過硅膠柱色譜純化粗產物，從而得到白色泡沫13(1.7g，96％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝8.08–7.85(m，6H)，7.69–7.28(m，19H)，5.62(t，J＝9.3Hz，1H)，5.41(t，J＝9.8Hz，1H)，5.22(s，1H)，5.08(dd，J＝9.2，7.9Hz，1H)，4.70(d， J＝7.8Hz，1H)，4.63(d，J＝12.1Hz，1H)，4.58(d，J＝10.0Hz，1H)，4.40(d，J＝12.1Hz，1H)，4.19(t，J＝9.5Hz，1H)，3.82(td，J＝9.2，3.6Hz，1H)，3.70(dd，J＝11.2，3.4Hz，1H)，3.63(dd，J＝10.6，5.0Hz，1H)，3.59–3.55(m，1H)，3.54–3.48(m，1H)，3.32(t，J＝9.3Hz，1H)，3.15(td，J＝9.7，5.0Hz，1H)，2.78–2.60(m，3H)，2.50(d，J＝3.6Hz，1H)，1.22(t，J＝7.5Hz，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ＝165.38，165.29，165.13，138.02，136.70，133.43，133.14，133.09，130.08，129.87，129.81，129.71，129.30，129.28，129.23，128.50，128.48，128.29，127.95，127.86，126.19，101.59，100.88，83.42，80.42，78.71，75.71，74.67，74.51，73.46，72.42，70.48，67.70，67.51，65.76，24.11，14.85.

在0℃下將底物13(1.6g，1.824mmol，1equiv.)接收于無水DCM(10mL)中，并向其中滴加吡啶(10mL)和BzCl(0.635mL，5.47mmol，3equiv.)，并將RM攪拌16h。

然后，在真空下蒸發RM，從而除去溶劑，接著再次接收于DCM(25mL)中，并使用NaHCO₃水溶液(5mL X 2)洗滌。然后，將有機層在Na₂SO₄上干燥，過濾并在真空下蒸發，接著，使用甲醇研磨所得的物質，經過過濾和真空下干燥得到灰白色固體(12)(1.5g，84％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃₃)δ7.95(ddd，J＝16.9，12.1，7.3Hz，8H)，7.60–7.12(m，22H)，5.66(t，J＝9.3Hz，1H)，5.58(t，J＝9.6Hz，1H)，5.43(t，J＝9.8Hz，1H)，5.36(dd，J＝9.5，7.9Hz，1H)，5.20(s，1H)，4.77(d，J＝7.9Hz，1H)，4.60(t，J＝10.3Hz，2H)，4.39(d，J＝12.1Hz，1H)，4.23(t，J＝9.5Hz，1H)，3.74–3.43(m，5H)，3.29(td，J＝9.7，4.9Hz，1H)，2.83–2.55(m，3H)，1.22(t，J＝7.4Hz，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ165.46，165.25，165.16，164.72，137.82，136.62，133.31，133.12，133.02，130.05，129.80，129.73，129.70，129.27，129.24，128.99，128.97，128.63，128.43，128.29，128.22，128.17， 128.10，127.98，126.03，101.12，83.39，78.65，78.29，75.85，74.44，73.44，72.43，71.96，70.47，67.71，67.31，66.16，24.04，14.84.

實施例1-7：2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3-二-O-苯甲酰基-6-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(14)的合成

在0℃下向醇13(400mg，0.36mmol)在吡啶(5.0mL)中形成的攪拌溶液中加入苯甲酰氯(63μL，0.55mmol)。將反應物緩慢溫暖至室溫，并在室溫下攪拌16h。加入額外的0.5equiv.BzCl，以驅動反應完成。將混合物在室溫下攪拌2h，使用水(30ml)猝滅，并使用EtOAc(50mL)稀釋。在分離后，使用0.1M HCl(20mL)洗滌有機級份，并使用EtOAc(30mL)再次萃取水性級份。使用飽和NaHCO₃(20mL)和鹽水(10mL)洗滌合并的有機級份，在Na₂SO₄上干燥并濃縮，從而得到中間體四苯甲酸酯的黃色油。

在室溫下向中間體四苯甲酸酯在CH₂Cl₂(6.5mL)中形成的攪拌溶液中加入乙硫醇(0.36mL，4.9mmol)和對甲苯磺酸(12mg，0.06mmol)。將混合物在室溫下攪拌2h，使用Et₃N(50μL)猝滅并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:10至1:8)純化殘余物，從而得到二醇14(389mg，0.349mmol)的白色泡沫。針對C₆₄H₆₁NO₁₇(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為1138.3837，實測值為1138.3850m/z。

實施例1-8：甲基(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)糖醛酸酯-(1→4)-2,3-二-O-苯甲酰基-6-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(15)的合成

在0℃下，向醇14(90mg，0.081mmol)在CH₂Cl₂(2.0mL)和水(0.8mL)中形成的攪拌溶液中加入TEMPO(2.5mg，0.016mmol)和BAIB(55mg，0.170mmol)。將反應物在0℃下攪拌20min，并溫至室溫。在室溫下將混合物攪拌2h，并使用EtOAc(20mL)和水(10mL)稀釋。在分離后，使用EtOAc(2x 10mL)萃取水性級份，在Na₂SO₄上干燥合并的有機級份并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為1:2至1:1，然后1:1+5％AcOH)純化殘余物，從而得到中間體羧酸，為白色泡沫。

在室溫下，向中間體羧酸在甲苯(1.6mL)和MeOH(0.8mL)中形成的攪拌溶液中加入TMS-重氮甲烷(0.04mL，0.081mmol)。將反應物在室溫下攪拌2h。另外加入0.25equiv.TMS-重氮甲烷以驅動反應完全。將混合物在室溫下攪拌1h，使用AcOH(0.1mL)猝滅，并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:1)純化殘余物，從而得到甲基酯15(73mg，0.064mmol，79％，經過2個步驟)的澄清的油。針對C₆₅H₆₁NO₁₈(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為1166.3786，實測值為1166.3762m/z。

實施例1-9：叔己基2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖苷(17)的合成

在0℃下，在活化的MS(-AW)上，向亞芐基縮醛16(J Carbohyd Chem 1996，15(2)，241)(1.68g，2.84mmol)在CH₂Cl₂(60mL)中形成的攪拌溶液中加入三乙基硅烷(2.72mL，17.06mmol)和三氟乙酸(1.81mL，17.06mmol)。將反應物緩慢溫至室溫，并在室溫下攪拌16h。使用Et₃N(2mL)猝滅反應物，通過硅藻土過濾并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為1:20至1:7)純化殘余物，從而得到醇17(1.46g，2.46mmol，87％)的澄清的油。針對C₃₅H₄₈O₆Si(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為615.3117，實測值為615.3104m/z。

實施例1-10：叔己基4-O-苯甲酰基-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖苷(44)的合成

將硫糖苷43(J.Org.Chem.2012，77(1)，291)(667mg，1.11mmol)和醇17(550mg，0.93mmol)與無水甲苯(3x10mL)共同蒸發，并在高度真空下保持30min。將混合物溶解于Et₂O(14mL)和CH₂Cl₂(2.8mL)中，并在室溫下在活化的分子篩(-AW)上攪拌30min。將所述的溶液冷卻至-20℃并使用NIS(250mg，1.11mmol)和三氟甲磺酸(16μL，0.19mmol)處理。將混合物攪拌1h并緩慢溫暖至-10℃。使用Et₃N(0.05mL)猝滅反應，使用CH₂Cl₂(20mL)稀釋，通過硅藻土過濾并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:8至1:6)純化殘余物，從而得到二糖44(553mg，0,490mmol，53％)以及相應的β-異頭物(231mg，0.205mmol，22％)。對于7的分析數據：澄清的油。針對C₆₉H₈₀O₁₂Si(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為1151.5316，實測值為1151.5293m/z。

實施例1-11：4-O-苯甲酰基-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-αβ-D-吡喃半乳糖基三氟-(N-苯基)乙酰亞胺酸酯(45)的合成

在0℃下將甲硅烷基醚44(470mg，0.416mmol)在THF(8.3mL) 中形成的攪拌溶液中加入乙酸(0.24mL，4.19mmol)和TBAF(在THF中形成的1.0M溶液，4.2mL，4.20mmol)。將反應物緩慢溫暖至室溫，并在室溫下攪拌2h。加入乙酸(0.24mL，4.19mmol)和TBAF(在THF中形成的1.0M溶液，4.2mL，4.20mmol)，并將反應物在室溫下攪拌16h。使用Et₂O(50mL)稀釋混合物，使用水(3x30mL)洗滌，使用Et₂O(2x20mL)再次萃取水相。Na₂SO₄上干燥合并的有機級份，并濃縮。通過硅膠柱的短塞過濾殘余物(EtOAc/己烷為1:3至1:1)，從而得到中間體乳醇混合物的澄清的油。

在室溫下，向乳醇混合物在CH₂Cl₂(7.8mL)中形成的攪拌溶液中加入碳酸銫(318mg，0.975mmol)和F₃CC(NPh)Cl(202mg，0.975mmol)。將混合物在室溫下攪拌2.5h，使用己烷(0.5％(v/v)Et₃N，(10mL)稀釋，并通過硅藻土過濾。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1+0.5％Et₃N至1:3+0.5％Et₃N)純化殘余物，從而得到亞氨酸酯混合物45(404mg，0.349mmol，84％，經過2個步驟)的澄清的油。針對C₆₉H₆₆F₃NO₁₂(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為1180.4434，實測值為1180.4458m/z。

實施例1-12：4-O-苯甲酰基-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-甲基[2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]糖醛酸酯-(1→4)-2,3-二-O-苯甲酰基-6-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(46)的合成

將醇15(100mg，87μmol)和亞氨酸酯45(121mg，105μmol)與無水甲苯(3x10mL)共同蒸發，并在高度真空下保持30min。將混合物溶解于Et₂O(3.3mL)和CH₂Cl₂(1.1mL)中，并在室溫下在活化的分子篩(-AW)上攪拌30min。將所述的溶液冷卻至-20℃并使用TMSOTf(3.2μL，17μmol)處理。將混合物攪拌1h并緩慢溫暖至0℃。使用飽和NaHCO₃水溶液(10mL)猝滅反應，使用CH₂Cl₂(3x20mL)萃取，并將合并的有機級份在Na₂SO₄上干燥并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷/甲苯為1:3:3至1:2:2)純化殘余物，從而得到四糖46(130mg，62μmol，71％)的澄清的油。針對C₁₂₆H₁₂₁NO₂₉(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為2134.7921，實測值為2134.7879m/z。

實施例1-13：α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(10)的合成

在0℃下向酯46(56mg，26μmol)在THF(5mL)和MeOH(1mL)中形成的攪拌溶液中加入過氧化氫(6％水性溶液，265μL，530μmol)和LiOH(1M水性溶液，265μL，132mol)。將反應物攪拌1h并溫暖至室溫。將反應物保持在室溫下，并且在2h后使用過氧化氫(6％水溶液，265μL，530μmol)和LiOH(1M水溶液，265μL，132mol)處理。在2h后，加入NaOH(15％水性溶液，1mL)，并將混合物在室溫下攪拌72h。在減壓下蒸發溶劑，并將殘余物與甲苯(2x5mL)共同蒸發，再溶解于MeOH(5mL)中。在室溫下使用甲醇鈉(143mg，2.65mmol)處理溶液，并在室溫下攪拌96h。蒸發溶劑并將殘余物溶解于水(5mL)中。在0℃下使用0.5M NaHSO₄水溶液中和溶液，并使用EtOAc(5x5mL)萃取。在Na₂SO₄上干燥合并的有機級份并濃縮，從而得到中間體酸的白色泡沫。

在室溫下，將處于MeOH(2mL)中的中間體酸加入至Pd/C(50mg)在MeOH(1mL)，水(0.1mL)和AcOH(5滴)中形成的懸液中。在H₂氣氛下將反應物攪拌48h，過濾并濃縮。通過固相萃取(Chromabond C18，Macherey-Nagel)純化殘余物，并冷凍干燥從而得到四糖10(乙酸鹽，13.6mg，18μmol，69％，經過3個步驟)的白色固體。針對C₂₆H₄₅NO₂₂ (M+Na)⁺的HRMS(MALDI)計算值為746.2330，實測值為746.2323m/z。

實施例1-14：4-O-苯甲酰基-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(47)的合成

將亞氨酸酯45(200mg，0.173mmol)和醇2(74mg，0.259mmol)與無水甲苯(2x5mL)共同蒸發，并在高度真空下保持30min。將混合物溶解于Et₂O(2.8mL)和CH₂Cl₂(0.7mL)中，并在室溫下在活化的分子篩(-AW)上攪拌30min。將溶液冷卻至-40℃，并使用TMSOTf(6.2μL，35μmol)處理。將混合物在-40℃下攪拌10min，然后緩慢溫暖至-10℃。使用飽和NaHCO₃水溶液(5mL)猝滅反應，使用CH₂Cl₂(3x20mL)萃取，并在Na₂SO₄上干燥合并的有機級份并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:6至1:4)純化殘余物，從而得到氨基甲酸酯47(160mg，0.128mmol，74％)，以及相應的β-異頭物(32mg，0.026mmol，15％)。對于47的分析數據：澄清的油。針對C₇₈H₇₉NO₁₄(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為1276.5398，實測值為1276.5405m/z。

實施例1-15：2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(48)的合成

在0℃下向酯47(126mg，0.100mmol)在THF(5mL)和MeOH(5 mL)中形成的攪拌溶液中加入甲醇鈉(0.5M處于MeOH中，1mL，0.500mmol)。將反應物緩慢溫暖至室溫，并在室溫下保持24h。加入甲醇鈉(0.5M處于MeOH中，1mL，0.500mmol)，并將反應物溫暖至37℃。將混合物在37℃下攪拌7h，使用Amberlite IR120(H⁺型)中和，過濾并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:6至1:4)純化殘余物，從而得到醇48(98mg，85μmol，85％)的澄清的油。針對C₇₁H₇₅NO₁₃(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為1172.5136，實測值為1172.5103m/z。

實施例1-16：α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(49)的合成

在室溫下，將處于EtOAc(1mL)中的芐基醚48加入至由Pd/C(30mg)在MeOH(3mL)，水(0.5mL)和AcOH(3滴)中形成的懸液中。將反應物在H₂氣氛下攪拌24h，過濾并濃縮，從而得到二糖49(2.9mg，18μmol，87％)的白色固體。針對C₁₄H₂₇NO₁₁(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為408.1481，實測值為408.1499m/z。

實施例1-17：2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3-二-O-苯甲酰基-6-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(50)的合成

將醇48(47mg，41μmol)和硫糖苷12(60mg，61μmol)與無水甲苯(2x5mL)共同蒸發并在高度真空下保持30min。將混合物溶解于CH₂Cl₂(2mL)中，并在室溫下在活化的分子篩(-AW)上攪拌30min。將溶液冷卻至-10℃，并使用NIS(13.8mg，61μmol)和三氟甲磺酸(1μL，11μmol)處理。將混合物在-10℃下保持1h，并緩慢溫暖至0℃。使用Et₃N(50μL)猝滅反應物，過濾并濃縮，從而得到中間體亞芐基縮醛的黃色的油。

在室溫下向由中間體亞芐基縮醛在CH₂Cl₂(2mL)中形成的攪拌溶液中加入乙硫醇(0.3mL，4.06mmol)和對甲苯磺酸(10mg，0.053mmol)。在室溫下將混合物攪拌1h，使用Et₃N(20μL)猝滅并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:3至1:2)純化殘余物，從而得到二醇50(78mg，39μmol，96％)的澄清的油。針對C₁₁₈H₁₁₇NO₂₇(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為2002.7710，實測值為2002.7731m/z。

實施例1-18：2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-2,3-二-O-苯甲酰基-6-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(51)的合成

在0℃下向由醇50(45mg，23μmol，73％)在CH₂Cl₂(2mL)和水(0.8mL)中形成的強力攪拌的溶液中加入TEMPO(3種晶體)和BAIB(15.4mg，48μmol)。將反應物在0℃下攪拌20min，并緩慢溫暖至室溫。在1h后，加入TEMPO(2種晶體)和BAIB(10mg，31μmol)，并將混合物在室溫下攪拌2h。使用CH₂Cl₂(5mL)稀釋反應物，并使用10％Na₂S₂O₃水溶液(5mL)猝滅。在分離后，使用EtOAc(2x10mL)萃取水相，在Na₂SO₄上干燥合并的有機級份，并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:2至8:1，然后使用EtOAc/己烷1:1+1％AcOH)2次純化殘余物，并與庚烷反復共同蒸發，從而得到酸51(33mg，17μmol，74％)的澄清的油。針對C₁₁₈H₁₁₅NO₂₈(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為2016.7503，實測值為2016.7558m/z。

實施例1-19：β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(18)的合成

在0℃下，向酯51(45mg，23μmol)在THF(4mL)和MeOH(0.5mL)中形成的攪拌溶液中加入NaOH(1M水溶液，1mL)。將反應物緩慢溫暖至室溫，并在室溫下攪拌16h。在0℃下使用0.5M NaHSO₄水溶液中和，并使用EtOAc(5x5mL)萃取。在Na₂SO₄上干燥合并的有機級份，并濃縮，從而得到中間體醇的白色泡沫。

在室溫下，將處于MeOH(3mL)中的中間體醇加入至由Pd/C(20mg)在MeOH(6mL)，水(6滴)和AcOH(3滴)中形成的懸液中。在H₂氣氛下，將反應物攪拌96h，過濾并濃縮。由于反應沒有進行完全，所以使殘余物再次經歷相同的條件，并在室溫下攪拌72h。過濾并濃縮反應物，通過固相萃取(Chromabond C18，Macherey-Nagel)純化殘余物，并冷凍干燥，從而得到四糖18(11.3mg，16μmol，68％，經過2個步驟)的白色固體。針對C₂₆H₄₅NO₂₂(M+Na)⁺的HRMS(MALDI)計算值為746.2330，實測值為746.2416m/z。

實施例1-20：甲基[2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]糖醛酸酯-(1→4)-2,3-二-O-苯甲酰基-6-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基) 乙醇(52)的合成

在室溫下，向羧酸51(100mg，50μmol)在DMF(2.5mL)中形成的攪拌溶液中加入Cs₂CO₃(24.5mg，75μmol)和碘代甲烷(10.7mg，75μmol)，并在室溫下攪拌反應物。2h后，加入碘代甲烷(10.7mg，75μmol)，并將混合物在室溫下再攪拌2h。使用飽和NH₄Cl(5mL)水溶液猝滅反應，使用EtOAc(4x10mL)萃取，在Na₂SO₄上干燥合并的有機萃取物，并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至2:3)純化殘余物，從而得到甲基酯52(81mg，40μmol，80％)的白色泡沫。針對C119H117NO28(M+Na)+的HRMS(MALDI)計算值為2030.7659，實測值為2030.7660m/z。

實施例1-21：2,3,4,6-四-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-甲基[2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]糖醛酸酯-(1→4)-2,3-二-O-苯甲酰基-6-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(53)的合成

將醇52(14mg，7μmol)和硫糖苷54(J Org Chem 1990，55，2860.)(16.3mg，28μmol)與無水甲苯(3x10mL)共同蒸發，并在高度真空下保持30min。將混合物溶解于Et₂O(1.05mL)和CH₂Cl₂(0.35mL)中，并在室溫下在活化的分子篩(-AW)上攪拌30min。將溶液冷卻至-20℃，并使用NIS(6.3mg，28μmol)和TMSOTf(1μL，5.5μmol)處理。將混合物攪拌1h，并緩慢溫暖至0℃。使用飽和NaHCO₃(10mL)水溶液和10％(w/v)Na₂SO₃(5mL)的1:1(v/v)混合物猝滅反應，并使用CH₂Cl₂(4x10mL)萃取。將合并的有機級份在Na₂SO₄上干燥并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:4至1:3)純化殘余物，從而得到五糖53(12.5mg，4.9μmol，71％)的澄清的油。針對C₁₂₆H₁₂₁NO₂₉(M+Na)⁺的HRMS(MALDI)計算值為2553.0066，實測值為2553.0066m/z。

實施例1-22：α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(55)的合成

在0℃下，向酯53(26mg，10.3μmol)在THF(1mL)和MeOH(1mL)中形成的攪拌溶液中加入過氧化氫(6％(v/v)水性溶液，397μmol)和LiOH(0.5M水溶液，113μmol)的1:1(v/v)混合物(450μL)。將反應物溫暖至室溫，并在室溫下攪拌1h。使用NaOH(0.5M水溶液，1mL)處理反應物，并在室溫下攪拌16h。在減壓下蒸發溶劑，將殘余物與甲苯(2x5mL)共同蒸發，并溶解于MeOH(1mL)中。在室溫下使用NaOMe(0.5M處于MeOH中，1mL)處理所述的溶液，并在室溫下攪拌16h。使用水(0.5mL)和CH₂Cl₂(0.5mL)稀釋反應物，在0℃下使用Amberlite IR-120(H⁺形式)中和，過濾并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:4至1:2至1:2+1％(v/v)AcOH to 1:1+1％(v/v)AcOH)純化殘余物，從而得到中間體羧酸的澄清的油。

使用氬氣吹掃處于CH₂Cl₂/tBuOH/水(1:16:8，1mL)中的中間體羧酸，并在0℃下使用碳載Pd(OH)₂(20％(w/w)加載量，20mg)在相同的溶劑混合物(0.5mL)中形成的懸液進行處理。使用氫氣吹掃懸液，在氫氣氣氛下攪拌16h，過濾并濃縮。由于反應未進行完全，所以使殘余物再次經歷相同的條件，并在室溫下攪拌24h。過濾混合物并濃縮，通過固相萃取(Chromabond C18，Macherey-Nagel)純化殘余物并冷凍干燥，從而得到戊糖55(8.1mg，9.1μmol，88％，經過2個步驟)的白色固體。針對C₃₂H₅₅NO₂₇(M+Na)⁺的HRMS(MALDI)計算值為884.2883，實測值為884.2942m/z。¹H NMR(400MHz，D₂O)δ5.48(d，J＝3.5Hz，1H)，5.02(d，J＝3.2Hz，1H)，4.88(d，J＝3.9Hz，1H)，4.51(m，2H)，4.20(d，J＝9.9Hz，1H)，4.04(m，1H)，4.02–3.52(m，26H)，3.43–3.19(m，4H).

實施例1-23：4-O-苯甲酰基-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-甲基[2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]糖醛酸酯-(1→4)-2,3-二-O-苯甲酰基-6-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(56)的合成

將醇52(50mg，25μmol)和亞氨酸酯45(72.1mg，62μmol)與無水甲苯(3x10mL)共同蒸發，并在高度真空下保持30min。將混合物溶解于Et₂O(2mL)和CH₂Cl₂(0.67mL)中，并在室溫下在活化的分子篩(-AW)上攪拌30min。將溶液冷卻至-20℃，并使用TMSOTf(2μL，11μmol)進行處理。將混合物攪拌1h并緩慢溫暖至0℃。使用飽和NaHCO₃(10mL)水溶液猝滅反應，并使用CH₂Cl₂(4x10mL)萃取。在Na₂SO₄上干燥合并的有機級份，并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:3至3:7至1:2)純化殘余物，從而得到六糖56(51mg，17μmol，69％)的澄清的油。針對C₁₈₀H₁₇₇NO₃₉(M+2Na)²⁺的HRMS(MALDI)計算值為1511.0847，實測值為1511.0576m/z。

實施例1-24：α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(57)的合成

在0℃下，向酯56(22mg，7.4μmol)在THF(1mL)和MeOH(1mL)中形成的攪拌溶液中加入過氧化氫(6％(v/v)水溶液，295μmol)和LiOH(0.5M水溶液，74μmol)的1:1(v/v)混合物(296μL)。將反應物溫暖至室溫，并在2h和4h后分別使用另外的294μL相同的LiOOH溶液進行處理。在室溫下將混合物攪拌16h并使用NaOH(1M水溶液，0.5mL)和MeOH(0.5mL)處理。在室溫下將反應物攪拌20h，使用10％Na₂SO₃水溶液(0.8mL)猝滅并在減壓下濃縮。將殘余物溶解于水(4mL)中，使用NaHSO₄(0.5M水溶液)中和，并使用EtOAc(4x10mL)萃取。將合并的有機級份在Na₂SO₄上干燥并濃縮。使用NaOMe(處于MeOH中的0.5M溶液，1mL)處理殘余物，溫暖至40℃并在40℃下攪拌5h。將反應物冷卻至室溫，在室溫下再攪拌16h并使用水(0.5mL)處理。使用Amberlite IR-120(H⁺形式)中和混合物，過濾并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1:0至1:4+2％(v/v)AcOH至1:1+2％(v/v)AcOH)純化殘余物，從而得到中間體羧酸的澄清的油。

使用氬氣吹掃處于CH₂Cl₂/tBuOH/水(1.5:16:8，3mL)中的中間體羧酸，并在0℃下使用碳載Pd(OH)₂(20％(w/w)加載量，30mg)在相同的溶劑混合物(1mL)中形成的懸液處理。使用氫氣吹掃懸液，在氫氣氣氛下攪拌18h，過濾并濃縮。通過固相萃取(Chromabond C18，Macherey-Nagel)純化殘余物，并冷凍干燥，從而得到六糖57(7mg，6.7μmol，86％，經過3個步驟)的白色固體。針對C₃₈H₆₅NO₃₂(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為1070.3387，實測值為1070.3391m/z。

實施例1-25：β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(60)的合成

在室溫下，向酯50(20mg，10.1μmol)在THF(1mL)和MeOH(0.33mL)中形成的攪拌溶液中加入NaOMe(處于MeOH中的0.5M溶液，0.5mL)。將反應物溫暖至40℃，并在40℃下攪拌5h。將混合物冷卻至室溫，并在室溫下攪拌16h。使用Amberlite IR-120(H⁺形式)中和反應物，過濾并濃縮。通過尺寸排阻色譜(Sephadex LH-20，CH₂Cl₂/MeOH 2:1)純化殘余物，從而得到中間體己醇的白色泡沫。

使用氬氣吹掃處于CH₂Cl₂/tBuOH/水(1:16:8，1mL)中的中間體己醇，并在0℃下使用碳載Pd(OH)₂(20％(w/w)加載量，20mg)在相同的溶劑混合物(1mL)中形成的懸液處理。使用氫氣吹掃懸液，在氫氣氣氛下攪拌18h，過濾并濃縮。通過固相萃取(Chromabond C18，Macherey-Nagel)純化殘余物，并冷凍干燥，從而得到四糖60(6.8mg，9.0μmol，89％，經過2個步驟)的白色固體。針對C₂₆H₄₇NO₂₁(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為732.2538實測值為732.2504m/z。

實施例1-26：2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-N-芐基-N-芐氧基羰基氨基)乙醇(61)的合成

將醇48(15mg，13μmol)和硫糖苷1(20.4mg，39μmol)與無水甲苯(2x5mL)共同蒸發，并在高度真空下保持10min。將混合物溶解于CH₂Cl₂(1.3mL)中，并在室溫下在活化的分子篩(-AW)上攪拌30min。將溶液冷卻至-20℃，并使用NIS(8.8mg，39μmol)和TfOH(1μL，11μmol)進行處理。將混合物在-20℃下攪拌1h并緩慢溫暖至0℃。使用飽和NaHCO₃水溶液(10mL)和10％(w/v)Na₂SO₃(5mL)的1:1(v/v)混合物猝滅反應，并使用CH₂Cl₂(4x10mL)萃取。將合并的有機萃取物在Na₂SO₄上干燥并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為1:5至1:4至1:3)純化殘余物，從而給予中間體亞芐基縮醛的黃色油。

在室溫下，向中間體亞芐基縮醛在CH₂Cl₂(2mL)中形成的攪拌溶液中加入乙硫醇(0.2mL，2.8mmol)和對甲苯磺酸(6mg，32μmol)。將混合物在室溫下攪拌1h，使用Et₃N(100μL)猝滅，并濃縮。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為0:1至1:3至2:3)純化殘余物，從而得到二醇61(14.7mg，9.7μmol，75％)的澄清的油。針對C₂₆H₄₇NO₂₁(M+Na)⁺的HRMS(MALDI)計算值為1542.6188，實測值為1542.6145m/z。

實施例1-27：β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2-氨基)乙醇(62)的合成

在室溫下，向酯61(26mg，17μmol)在CH₂Cl₂(1mL)和MeOH(1mL)中形成的攪拌溶液中加入NaOMe(處于MeOH中的0.5M溶液，0.5mL)。將反應物在室溫下攪拌2h，在0℃下使用Amberlite IR-120(H⁺形式)中和，過濾并中和。通過快速柱色譜(EtOAc/己烷為1:3至2:1)純化殘余物，從而得到中間體四醇的白色泡沫。

使用氬氣吹掃處于CH₂Cl₂/tBuOH/水(1:6:2，5mL)中的中間體四醇，并在0℃下使用碳載Pd(OH)₂(20％(w/w)加載量，30mg)在相同的溶劑混合物(1mL)中形成的懸液處理。使用氫氣吹掃懸液，在氫氣氣氛下攪拌24h，過濾并濃縮。由于反應未進行完全，所以使殘余物再次經歷相同的條件，并在室溫下攪拌48h。將混合物過濾并濃縮，通過固相萃取(Chromabond C18，Macherey-Nagel)純化殘余物，并冷凍干燥，從而得到三糖62(7.3mg，13μmol，79％，經過2個步驟)的白色固體。針對C₂₆H₄₇NO₂₁(M+Na)⁺的HRMS(ESI)計算值為570.2010，實測值為570.2000m/z。

通過逐步自動化的糖基化作用而合成糖

實施例1-28：葡萄糖構造模塊32的合成

(2-甲基-5-叔丁基苯基)2-O-苯甲酰基-3-O-芐基-4,6-O-亞苯甲基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖(30)

將(2-甲基-5-叔丁基苯基)2,4,6-三-O-乙酰基-3-O-芐基-1-硫代-β-D吡喃葡萄糖(29)溶解于MeOH中，加入NaOMe(1.0eq)，將反應混合物過夜攪拌。使用IR-120-H⁺amberlite樹脂中和混合物，過濾，濃縮并與甲苯共同蒸發。將粗品三醇溶解于DMF中。加入苯甲醛二甲基縮醛(2.0eq)和催化量的對甲苯磺酸，將混合物在80℃下攪拌2h。在混合物冷卻至室溫后，加入飽和NaHCO₃水溶液。在相分離后，使用乙酸乙酯3次萃取有機相。使用鹽水洗滌合并的有機層，在MgSO₄上干燥，過濾并濃縮。將粗品溶解于DCM中，冷卻至0℃并加入Bz₂O(2.0eq)，DMAP(0.5eq)和三乙胺(4.0eq)。在完全轉化后，使用飽和NaHCO₃水溶液猝滅反應，并使用鹽水洗滌合并的有機層，在MgSO₄上干燥，過濾并濃縮。在硅膠上通過快速柱色譜純化殘余物，從而提供化合物(88％經過3個步驟)。Rf:0.25(己烷:EtOAc＝9:1).[α]D＝68.96(c＝3.18，CHCl₃).)；IR(thinfilm，chloroform):υ＝2962，1729，1265，1093cm-1；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.01(ddd，J＝5.8，5.3，0.8Hz，2H，HAr)，7.60(ddd，J＝7.1，2.6，1.3Hz，1H，HAr)，7.51(ddd，J＝6.0，5.6，2.3Hz，3H，HAr)，7.49–7.43(m，2H，HAr)，7.43–7.35(m，3H，HAr)，7.19(dt，J＝6.3，3.1Hz，1H，HAr)，7.13(dd，J＝6.7，4.0Hz，3H，HAr)，7.10–7.04(m，3H，HAr)，5.63(s，1HCHO2Ph)，5.42–5.32(m，1H，H-2)，4.82(d，J＝11.9Hz，1H，CHHPh)， 4.81(d，J＝10.2Hz，1H，H-1)，4.69(d，J＝12.0Hz，1H，CHHPh)，4.39(dd，J＝10.5，5.0Hz，1H，H-6')，3.94–3.86(m，3H，H-3，H-4，H-6)，3.56(dt，J＝14.6，4.9Hz，1H，H-5)，2.19(s，3H)，1.27(s，9H).13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ165.23(C＝O)，149.66，137.84，137.28，137.03，133.34，132.37，130.07，130.04，129.93，129.90，129.19，128.51，128.43，128.29，128.22，127.71，126.13，125.38(Ar)，101.44(CHO₂Ph)，88.03(C-1)，81.64(C-3)，79.43(C-4)，74.36(CH2Ph)，72.25(C-2)，70.66(C-5)，68.81(C-6)，34.56(CqtBu硫代)，31.36(tBu)，20.36(CH3硫代)；針對C₃₈H₄₀O₆SNa的MSESI+-HRMSm/z[M+Na]+計算值為647.2462，實測值為647。

(2-甲基-5-叔丁基苯基)2-O-苯甲酰基-3,6-二-O-芐基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖(31)

將化合物1的溶液與甲苯共同蒸發，并在氬氣氣氛下溶解于DCM(6.5mL)中。加入三乙基硅烷(0.62mL，3.88mmol)和三氟乙酸酐(0.27mL，1.94mmol)，并將溶液冷卻至0℃。滴加三氟乙酸(0.30mL，3.88mmol)，并攪拌反應物，而且使其溫暖至室溫。在起始材料完全轉化后，使用DCM稀釋溶液，并使用飽和NaHCO₃水溶液猝滅。將合并的有機層在MgSO₄上干燥，并在真空下除去溶劑。在硅膠上通過快速柱色譜純化殘余物(己烷/乙酸乙酯為9:1至7:3)，從而提供白色泡沫(92％)。針對C₃₈H₄₂O₆SNa的MSESI+-HRMSm/z[M+Na]+計算值為649.2600，實測值為649.2585。

(2-甲基-5-叔丁基苯基)2-O-苯甲酰基-3,6-二-O-芐基-4-O-芴基甲氧基羰基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(32)

在氬氣氣氛下將化合物31溶解于DCM(6.5mL)中。在0℃下向溶液中加入9-芴基甲基氯甲酸酯(8.3g，31.9mmol)和吡啶(3.44mL，42.5mmol)。在起始材料完全轉化后，使用DCM稀釋溶液，并使用1MHCl水溶液和飽和NaHCO₃水溶液萃取。將合并的有機相在MgSO₄上干燥，并在真空下除去溶劑。通過硅膠快速柱色譜純化粗產物，從而得到題述化合物，針對C₅₃H₅₂O₈SNa的MS ESI+-HRMS m/z[M+Na]+計算值為871.3281，實測值為871.3311。

實施例1-29：葡萄糖構造模塊35的合成

(2-甲基-5-叔丁基苯基)2,3-二-O-芐基-4,6-O-亞苯甲基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(34)

在氬氣氣氛下，將(2-甲基-5-叔丁基苯基)4,6-O-苯亞甲基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(33)溶解于DCM(6.5mL)中。在0℃下，將芐基溴和NaH加入至溶液中。在起始材料完全轉化后，使用甲醇猝滅反應混合物，并使用醚稀釋，再使用飽和NH₄Cl萃取。將合并的有機相在MgSO₄上干燥，并在真空下除去溶劑。通過硅膠快速柱色譜純化粗產物，從而得到題述化合物。針對C₃₈H₄₂O₅SNa的MS ESI+-HRMS m/z[M+Na]+計算值為633.2651，實測值為633.2644。

(2-甲基-5-叔丁基苯基)6-O-乙酰基-2,3-二-O-芐基-4-O-芴基甲氧基羰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(35)

向(2-甲基-5-叔丁基苯基)2,3-二-O-芐基-4,6-O-亞苯甲基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(34)在中形成的溶液中加入TFA和水。在結束后，使用己烷倒出粗品，從而除去副產物。所得的粗品用于下一步反應。在-15℃下，向粗品的溶液中加入乙酸，2-氯-1-甲基吡啶碘化物和DABCO。在起始材料完全轉化后，使用DCM稀釋溶液，使用1M HCl水溶液和飽和NaHCO₃水溶液萃取。將合并的有機相在MgSO₄上干燥，并在真空下除去溶劑。通過硅膠快速柱色譜純化粗產物，從而得到題述化合物。在氬氣氣氛下，將粗品溶解于DCM(6.5mL)中。在0℃下，將9-芴基甲基氯甲酸酯(8.3g，31.9mmol)和吡啶(3.44mL，42.5mmol)加入至溶液中。在起始材料完全轉化后，使用DCM稀釋溶液，使用1M HCl水溶液和飽和NaHCO₃水溶液萃取。將合并的有機相在MgSO₄上干燥，并在真空下除去溶劑。通過硅膠快速柱色譜純化粗產物，從而得到題述化合物。針對C₄₈H₅₀O₈SNa的MS ESI+-HRMS m/z[M+Na]+計算值為809.3124，實測值為809.3137。

實施例1-30：(2-甲基-5-叔丁基苯基)3,6-二-O-乙酰基-2,4-二-O-芐基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(37)的合成

使(2-甲基-5-叔丁基苯基)4,6-O-亞苯甲基-2-O-芐基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(36)(Tetrahedron Letter，1999，40，6523)與甲苯共同蒸發，并在Ar氣氛下溶解于DCM(170mL)中。加入BH₃在THF(108mL，108mmol)中形成的1M溶液，并將溶液冷卻至0℃。在10min后，加入三氟甲磺酸三甲硅烷酯(1.66mL，9.2mmol)并攪拌反應物。在結束后，使用DCM稀釋溶液，并使用飽和NaHCO₃水溶液滴猝滅。在MgSO₄上干燥有機相，并在真空下除去溶劑。粗產物未經進一步純化而直接用于下一步驟。

向粗品在DCM中形成的溶液中加入乙酸酐(8.3g，31.9mmol)和吡啶(3.44mL，42.5mmol)。在起始材料完全轉化后，使用DCM稀釋溶液，使用飽和NaHCO₃水溶液萃取。將合并的有機相在MgSO₄上干燥，并在真空下除去溶劑。通過硅膠快速柱色譜純化粗產物，從而提供題述化合物(37)。針對C₃₅H₄₂O₇SNa的MS ESI+-HRMS m/z[M+Na]+計算值為629.2546，實測值為629.2522。

實施例1-31：被保護的半乳糖構造模塊的合成

將乙基2,3-二-O-芐基-4,6-O-亞苯甲基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(38)與甲苯共同蒸發，并在Ar氣氛下溶解于DCM(6.5mL)中。加入三乙基硅烷(0.62mL，3.88mmol)和三氟乙酸酐(0.27mL，1.94mmol)，并將溶液冷卻至0℃。滴加三氟乙酸(0.30mL，3.88mmol)，并攪拌反應物，而且使其溫暖至室溫。在起始材料完全轉化后，使用DCM稀釋溶液，并使用飽和NaHCO₃水溶液猝滅。將合并的有機層在MgSO₄上干燥，并在真空下除去溶劑。在硅膠上通過柱色譜純化殘余物(己烷/乙酸乙酯為9:1至7:3)，從而得到白色泡沫(94％)。[Christopher E.Martin，Markus W.Weishaupt，and Peter H.Seeberger，Chem.Commun.，2011，47，10260–10262.]

在氬氣氣氛下，將乙基2,3,6-三-O-芐基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷溶解于DCM(6.5mL)中。在0℃下將乙酸酐(8.3g，31.9mmol)和吡啶(3.44mL，42.5mmol)加入到溶液中。在起始材料完全轉化后，使用DCM稀釋溶液，并使用1M HCl水溶液和飽和NaHCO₃水溶液萃取。將合并的有機相在MgSO₄上干燥，并在真空下除去溶劑。通過硅膠快速柱色譜純化粗產物，從而得到題述化合物(40)。(Chem.Commun.，2011，47，10260)

乙基2,3,6-三-O-芐基-4-O-芴基甲氧基羰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(41)

在0℃下，向化合物39的溶液中加入9-芴基甲基氯甲酸酯(8.3g，31.9mmol)和吡啶(3.44mL，42.5mmol)。在起始材料完全轉化后，使用DCM稀釋溶液，并使用1M HCl水溶液和飽和NaHCO₃水溶液萃取。將合并的有機相在MgSO₄上干燥，并在真空下除去溶劑。通過硅膠快速柱色譜純化粗產物，從而提供題述化合物。針對C₄₄H₄₄O₇SNa的MS ESI+-HRMS m/z[M+Na]+計算值為739.2705，實測值為739.2673。

實施例1-32：葡糖醛酸構造模塊42的制備

根據Angew.Chem.Int.Ed.2013，52，5858中所述的過程合成甲基(2-甲基-5-叔丁基-苯基)-2-O-苯甲酰基-3-O-芐基-4-O-芴基甲氧基羰基-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯(42)。

實施例1-33：官能化的固體支持物的合成

根據Angew.Chem.Int.Ed.2013，52，5858中所述的過程合成官能化樹脂。

實施例1-34：一般過程1：自動化模式

原液的制備

活化劑溶液：將N-碘代琥珀酰亞胺(1.48g，6.66mmol)和TfOH(60μL，0.66mmol)溶解于DCM(20mL)和二烷(20mL)的混合物中。

Fmoc脫保護溶液：制備20％三乙胺在DMF(v/v)中的溶液。

硫代糖苷構造模塊溶液：將0.25mmol構造模塊溶解于2ml DCM中。

模式1：糖基化：將樹脂在2mL DCM中溶脹，并將反應器的溫度調節至T1。為了進行糖基化反應，排放DCM并將構造模塊的溶液(5eq處于1.0mL DCM中)遞送至反應器中。在達到設定溫度后，通過加入活化劑(5eq處于1.0mL溶液中)開始反應。在溫度T1下進行糖基化5min，并且在T2進行糖基化45min。將該過程重復2次。

在反應完全后，排放溶液并使用DCM洗滌樹脂(6次，每次使用2mL，時間25s)。將該過程再重復2次。

模式2：Fmoc脫保護：使用DMF洗滌樹脂(6次)，在2mL DMF 中溶脹，并將反應器的溫度調節至25℃。為了Fmoc脫保護，排放DMF，并將20％三乙胺處于DMF中的2mL溶液遞送至反應器中。在5min后，將反應溶液收集于寡糖合成儀的級份收集器中，并將20％三乙胺處于DMF中的2mL溶液傳遞至樹脂中。將該過程重復3次。為了下一步的糖基化，使用DMF，THF，DCM(每種物質洗滌6次)洗滌樹脂。為了Fmoc定量，合并反應溶液，并取得100μL等分液。使用20％三乙胺處于DMF中的溶液將等分液稀釋至5mL，并測定在λ＝294nm下的UV吸光率。

由固體支持物上的切割(Angew.Chem.Int.Ed.2013，52，5858–5861)：

連續的光切割流反應器-一般過程：流反應器設備由弧長27.9cm且功率450W的中壓Hg燈(Hanovia)構成，其被石英玻璃冷卻系統中的UV過濾器(Pyrex，在305nm下透射率為50％)包圍，其中所述的冷卻系統與制冷機連接，以保持反應溫度為25℃。氟化的乙烯丙烯(FEP)管(內徑：0.03英寸；容積：12mL)纏繞冷卻系統。注射器泵與FEP管線連接，用于通過反應器的入口沖洗溶劑和樹脂。通過玻璃料過濾固體支持物，并合并產物溶液，然后在真空下除去溶劑。UV燈定位于盒中，其另外通過風扇冷卻。

為了完成自動化合成工藝，使用DCM洗滌樹脂(6次)，在2mL DCM中溶脹，并轉移至一次性注射器(20mL)中。為了制備光反應器，使用15mL MeOH洗滌FEP管，然后使用流速4mL·min-1以15mL DCM洗滌。為了切割，將樹脂由一次性注射器(20mL)緩慢注射至反應器中，并使用15mL DCM(流速：500μL·min-1)推送通過所述的管線。為了洗掉剩余的樹脂，使用20mL DCM(流速：500μL·min-1)洗滌所述的管線。離開反應器的懸液被導入過濾器中，其中樹脂被濾出，并使用DCM洗滌。使用15mL DCM在流速4mL·min-1下再平衡所述的管線。整個過程實施2次。在真空下蒸發所得的溶液，并通過HPLC純化粗產物(柱：Luna二氧化硅柱；流速：5mL·min-1)。

一般過程2：完全脫保護(Global Deprotection)

在0℃下，向純化的糖在THF和MeOH(1.2ml，v/v＝4:1)的混合物中形成的溶液中加入1M LiOH-35％H₂O₂(150uL，v/v＝2:1)。將反應物溫暖至室溫，并保持。4hr后，加入1M KOH(0.5mL)，并攪拌混合物。在結束后，使用IR-120-H⁺安伯來特樹脂中和混合物，過濾并濃縮。將粗品溶解于MeOH，乙酸乙酯和乙酸(5mL:0.75mL:0.25mL)中，然后加入Pd/C(20mg)。在氬氣氣氛下，將混合物鼓泡30min，然后在H₂氣氛下鼓泡12hr，然后過濾并濃縮。通過HPLC(Hyper-carbon)純化殘余物，并冷凍干燥，從而得到糖(甲酸鹽)的白色固體。

運行自動化的一般過程：

將實施例1-33(65mg；加載量0.385mmol/g；0.025mmol)的官能化樹脂加載于合成儀的反應器中，并在2mL DCM中溶脹。為了開始合成順序，使用DMF、THF、然后使用DCM(3次，每次使用2mL，時間為25s)連續地洗滌樹脂。實施用于各個構造模塊的模式1和用于Fmoc脫保護的模式2，從而生產各個糖結構。

HPLC上的純化

在合成所需的化合物后，將樹脂由固體支持物上切割下來。通過半制備型HPLC純化粗產物(柱:Luna-Silica(21×250mm；5μm)；流速:5mL/min；洗脫劑:己烷/乙酸乙酯；梯度:20％(5min)→60％(在45min內)→100％(在5min內)；檢測:210和280nm)，從而提供目標寡糖。

在所需的化合物完全脫保護后，通過半制備型HPLC純化粗產物(柱:Luna-Hyper-Carbon(21×250mm；5μm)；流速:5mL/min；洗脫劑:0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈溶液；梯度:10％(5min)→40％(在30min內)→100％(在5min內)；檢測:ELSD)，從而提供目標寡糖。

實施例1-34：N-芐氧基羰基-5-氨基-戊基甲基2-O-苯甲酰基-3-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-2-O-苯甲酰基-3,6-二-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-6-O-乙酰基-2,3-二-O-芐基 -α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖苷(19a)的合成

根據反應順序制備四糖21a：

8％得自樹脂，針對C₁₁₀H₁₁₇NO₂₇Na的MS ESI+-HRMS m/z[M+Na]+計算值為1906.7711，實測值為1906.7590。

實施例1-35：5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷(19)的制備

四糖19a經過一般的脫保護過程，從而提供四糖19:36％；針對C₂₉H₅₂NO₂₂的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為766.2975，實測值為766.2988。

實施例1-36：N-芐氧基羰基-5-氨基-戊基4-O-乙酰基-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-甲基2-O-苯甲酰基-3-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-2-O-苯甲酰基-3,6-二-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-6-O-乙酰基-2,3-二-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖苷(20a)的合成

根據以下反應順序制備四糖20a：

16％得自樹脂，針對C₁₁₂H₁₁₉NO₂₈Na的MS ESI+-HRMS m/z[M+Na]⁺計算值為1948.7816，實測值為1948.7796。

實施例1-37：5-氨基戊基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷(20)的制備

四糖20a經過一般的脫保護過程，從而提供四糖20:40％；針對C₂₉H₅₂NO₂₂的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為766.2975，實測值為766.2964。

實施例1-38：N-芐氧基羰基-5-氨基-戊基3,6-二-O-乙酰基-2,4-二-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-甲基2-O-苯甲酰基-3-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯-(1→4)-2-O-苯甲酰基-3,6-二-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖苷(21a)的制備

20％得自樹脂，針對C₁₁₂H₁₁₉NO₂₈Na的MS ESI+-HRMS m/z[M+Na]+計算值為1948.7816，實測值為1950.7906。

實施例1-39：5-氨基戊基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(21)的制備

四糖21a經過一般的脫保護過程，從而提供四糖21:42％；針對C₂₉H₅₂NO₂₂的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為766.2975，實測值為766.2977。

實施例1-40：N-芐氧基羰基-5-氨基-戊基2-O-苯甲酰基-3,6-二-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-6-O-乙酰基-3,4-二-O-芐基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-甲基2-O-苯甲酰基-3-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯(22a)的合成

根據以下反應順序合成四糖22a：

21％得自樹脂，針對C₁₁₀H₁₁₇NO₂₇Na的MS ESI+-HRMS m/z[M+Na]⁺計算值為1906.7711，實測值為1906.7624。

實施例1-41：5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸(22)的合成

四糖22a經過一般的脫保護過程，從而提供四糖22:52％；針對C₂₉H₅₂NO₂₂的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為766.2975，實測值為766.2988。

根據實施例1-28至1-34所述過程的本發明糖的其他實例：

針對C₄₁H₇₁NO₃₂的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為1090.3959；

5-氨基戊基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基 -(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷；

針對C₄₂H₇₃NO₃₂的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為1104.4116；

5-氨基戊基吡喃半乳糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₄₁H₆₉NO₃₃的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為1104.3752；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₄₁H₆₉NO₃₃的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為1104.3752；

5-氨基戊基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸；

針對C₄₂H₇₅NO₃₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為1090.4323；

5-氨基戊基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷；

針對C₄₁H₇₃NO₃₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為1076,4167；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₄₁H₇₃NO₃₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為1076,4167；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₄₂H₇₅NO₃₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為1090.4323；

5-氨基戊基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(70)；

針對C₃₃H₅₇NO₂₇的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為890.3118；

3-氨基丙基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷；

針對C₃₄H₅₉NO₂₇的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為914.3274；

5-氨基戊基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₃₃H₅₇NO₂₇的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為890.3118；

3-氨基丙基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₃₅H₅₉NO₂₈的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]⁺計算值為942.3224；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸；

針對C₃₄H₆₁NO₂₆的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為890.3482；

4-氨基丁基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷；

針對C₃₆H₆₅NO₂₆的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為928.3795；

6-氨基己基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₃₃H₅₉NO₂₆的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為886.3325；

3-氨基丙基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₃₅H₆₃NO₂₆的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為914.3638；

5-氨基戊基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₂₈H₅₁NO₂₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為738.2954；

4-氨基丁基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基 -(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₂₇H₄₉NO₂₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為724.2797；

3-氨基丙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₂₉H₅₃NO₂₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為752.3110；

6-氨基己基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₄₀H₇₁NO₃₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為1062.4010；

4-氨基丁基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷；

針對C₃₉H₆₉NO₃₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為1048.3854；

3-氨基丙基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₃₉H₆₉NO₃₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為1048.3854；

3-氨基丙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基 -(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₃₆H₆₅NO₂₆的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為928.3795；

6-氨基己基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₃₃H₅₉NO₂₆的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為886.3325；

3-氨基丙基α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖苷；

針對C₃₄H₆₁NO₂₆的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為900.3482；

4-氨基丁基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₂₈H5₁NO₂₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為738.2954；

4-氨基丁基β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

針對C₃₀H₅₅NO₂₁的MS ESI+-HRMS m/z[M+H]+計算值為766.3267；

6-氨基己基α-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖苷.

生物學試驗

實施例2-1：使用CodeLink NHS載玻片的微陣列合成

使用自動壓電陣列機器(Scienion，Berlin，Germany)使所示的聚糖在CodeLink NHS載玻片上形成斑點，并在室溫下溫育24h(1％w/v處于PBS中)。在室溫下，使載玻片在封閉緩沖劑(100mM乙醇胺處于50mM NaPi中，pH>9)中溫育30min，每次都使用水和乙醇洗滌，洗滌3次，并干燥。然后，在37℃下，使用處于磷酸鹽緩沖的生理鹽水中的1％(w/v)牛血清白蛋白將載玻片封閉1h，使用水洗滌3次，并干燥。

實施例2-2：使用根據實施例2-1中所述的過程合成的微陣列進行結合試驗

通過以下過程實施結合試驗：在天然SP8多糖存在或缺乏下，將使用通式(I)所示的糖涂敷的微陣列載玻片與所示稀釋度的兔抗-SP8分型血清或人類肺炎球菌參照血清007SP(使用疫苗免疫的287個人的合并血清，其中所述的疫苗購自National Institute for Biological Standards and Control)溫育，并使用熒光標記的抗兔(山羊抗體IgG-FITC，abcam ab6717)或抗人二級抗體(Alexa Fluor 488山羊抗人IgM，Invitrogen A21215；Alexa Fluor 647山羊抗人IgG，Invitrogen A21445)。

實施例2-3：使用二琥珀酰亞胺已二酸酯使合成四糖10和18與CRM₁₉₇綴合

在室溫下，向二琥珀酰亞胺己二酸酯(10mg，29μmol)和三乙胺(10μL，72μmol)在無水DMSO(150μL)中形成的攪拌溶液中滴加四糖10或18(大約2mg，2.8μmol)在無水DMSO(150μL)中形成的懸液。在室溫下，在氬氣氣氛下將反應物攪拌2h，并使用100mM磷酸鈉緩沖液pH 7.4(NaPi，200μL)處理。使用氯仿(10mL)萃取混合物，并通過離心進行相分離(2min，1800g，室溫)。棄去有機相，并2次重復萃取步驟。在1.5mL反應管中通過離心使水性層澄清(1min，14500g，室溫)，并加入至CRM₁₉₇(1mg，17.3nmol)在NaPi(1mL)中的攪拌溶液中。將混合物在室溫下攪拌16h，并使用離心過濾器(10kDa MWCO，Millipore，Darmstadt，Germany)透析。通過MALDI-MS表征綴合物：

綴合物58：大約67000m/z(平均引入10.7個四糖分子)

綴合物59：大約66000m/z(平均引入9.6個四糖分子)

實施例2-4：免疫過程

使用實施例2.3中獲得的總體積為100μL的CRM-Sp8綴合物(相當于4μg合成聚糖)(使用弗氏佐劑(Sigma-Aldrich，St.Louis，US)，明礬(Alhydrogel，Brenntag)或未使用佐劑配制)在第0、14和28天皮下注射免疫小鼠(6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，Charles River)。通過聚糖陣列監測免疫應答。在接受使用弗氏佐劑配制的所述綴合物的小鼠#1160中，綴合物59誘導了寡糖特異性免疫應答。重要的是，在由小鼠#1160得到的免疫血清中觀察到針對天然Sp8多糖的有效的免疫應答(參見圖5)。

實施例2-5：單克隆抗體的生成

根據制造商的指示，使用BM-Condimed H1(Roche，Penzberg，Germany)制備單克隆抗體。在融合后，使用有限的稀釋法生成單一的克隆，隨后進行2輪的亞克隆。通過聚糖陣列和ELISA監測抗體的生產。最終分離33個克隆，其生產識別四糖19和Sp8天然多糖的mAb。

克隆子1H8和1F1在無血清培養基中擴展。使用Protein G Antibody Purification試劑盒(Pro-Chem，Littleton，USA)由細胞培養物上清液純化MAb 1H8(參見圖6)。使用HiLoad 16/60Superdex柱(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)，并使用PBS作為緩沖劑通過凝膠過濾色譜來純化MAb 1F1。

實施例2-6：酶聯免疫吸附測試(ELISA)

使用高度結合性聚苯乙烯96孔板(Corning，Corning，US)進行ELISA。在4℃下，使用處于PBS中的濃度為10μg/mL的天然Sp8多糖(SSI Diagnostica，Kopenhagen)涂敷板達20h。在37℃下，使用處于PBS中的10％(v/v)胎牛血清封閉板，并使用包含0.1％(v/v)Tween 20的PBS(PBS-T)洗滌1次。施加抗Sp8mAbs(50μL)的細胞培養物上清液。將板在37℃下溫育1h，使用PBS-T洗滌3次，并使用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二級抗體(山羊抗小鼠IgGHRP綴合物，dianova，Hamburg，Germany)處理。將板用PBS-T洗滌3次，并根據制造商的指示使用TMB底物(BD Biosciences，San Jose，US)測量HRP活性。如ELISA評估的那樣，由#1160生成的單克隆抗體特異性地識別合成糖19和天然Sp8多糖。

實施例2-7：表面等離子體共振技術

在Biacore T100儀器(GE Healthcare)上實施表面等離子體共振技術。通過使用the Mouse Antibody Capture Kit and Amine Coupling Kit(GE Healthcare)固定來進行分析。固定大約10000個應答單位(RU)的捕獲抗體。在參照細胞(大約10000RU)中，將市售可得的小鼠IgG(編號026502，Invitrogen，Carlsbad，US)作為仿制品固定。每次運行前，使用50μg/mL的mAb濃度捕獲大約800RU的mAb 1H8。分別使用PBS作為運行緩沖劑、流速為30μL/min并且結合時間為60s而解離時間為120s來進行運行。以濃度為10μg/mL使用多糖，并且以20μM處于PBS中的濃度使用多糖18。單克隆抗體mAb 1H8特異性地識別合成糖18和天然Sp8多糖(參見圖7)。

實施例2-8：UV滅活的肺炎鏈球菌的免疫熒光

在室溫下，通過在PBS中使用254nm輻照10min將肺炎鏈球菌血清型8(ATCC 6308)或血清型1(ATCC 6301)(大約4x10⁸cfu/mL)滅活。通過離心收獲細胞，使用PBS洗滌1次，并在包含0.5％(w/v)酵母提取物和20％(v/v)甘油的Todd Hewitt Broth中冷凍。就免疫熒光而言，將細菌(8x10⁸cfu ST8或4x10⁸cfu ST1)解凍，通過離心收獲(16800g，15min，r.t.)，并在緩沖劑A(50mM NaHCO₃，100mM NaCl，pH 7.5)中洗滌1次。將細胞再次懸浮于緩沖劑A(1mL)中，并使用異硫氰酸熒光素(FITC，Sigma-Aldrich)溶液(10mg/mL于DMSO中)處理至最終濃度為0.1mg/mL。在37℃下將細菌在黑暗中標記1h，通過離心收獲，并使用處于PBS(1mL)中的0.25％(w/v)BSA洗滌2次。使用裝配有LSM 700共聚焦激光掃描顯微鏡的Axio Imager.M2系統(CarlZeiss Microscopy GmbH，Jena，Germany)，通過熒光顯微術監測標記。將細胞懸浮于PBS中的1％(w/v)BSA(1mL用于ST8，0.5mL用于ST1)中，并將懸液分配成2個等分液。使用針對鼠疫耶爾辛桿菌(Yersinia pestis)脂多糖核心三糖的mAb 1H8或mAb 1E12(IgG1)作為同種型對照來處理懸液，至最終mAb濃度為10μg/mL。在4℃下，將細菌在攪拌下在黑暗中溫育16h，并使用處于PBS(0.5mL)中的1％(w/v)BSA洗滌。將細胞懸浮于山羊抗小鼠IgG-Alexa635綴合物(200μL于PBS中的1％(w/v)BSA中，1:100稀釋，Invitrogen)，在室溫下在黑暗中溫育1.5h，并使用處于PBS中的1％(w/v)BSA和PBS(分別為0.5mL)洗滌。通過熒光顯微鏡觀察熒光標記的細菌，并使用Zen 2011軟件(Carl Zeiss Microscopy GmbH)處理圖像。如圖8所示，使用綴合物59免疫會誘導形成識別天然SP-8多糖和ST8細菌的抗體。

實施例2-9：通過流式細胞術評估mAbs 1H8和1F1與肺炎鏈球菌血清型8細菌的結合

如上文所述(參見實施例2.8)，將肺炎鏈球菌血清型8(ATCC 6308)，血清型1(ATCC 6301)或血清型3(PN36，NCTC7978)進行UV滅活、FITC標記，并使用熒光二級抗體(抗小鼠IgG-Alexa635綴合物或抗小鼠IgM-Alexa680綴合物，Invitrogen)處理。使用FACSCanto I I流式細胞儀(BD Pharmingen，Heidelberg，Germany)實施流式細胞術，并使用FlowJo軟件(Tree Star Inc.，Ashland，OR，USA)分析。單克隆抗體1H8和1F1與肺炎鏈球菌血清型8結合，但不結合肺炎鏈球菌血清型1或3(參見圖9)。由于未觀察到抗體同種型對照或者與肺炎鏈球菌血清型1或3的結合，所以單克隆抗體與ST8肺炎球菌之間的相互作用具有特異性。

實施例2-10：調理吞噬性殺滅測試

如Romero-Steiner et al.，Clin.Diagn.Lab.Immunol.，1997，4中所述進行調理吞噬性殺滅測試。簡言之，如所報告(Romero-Steiner et al.，1997)，使用N,N-二甲基甲酰胺使HL-60細胞分化1周，使用OPKA緩沖劑(Hanks緩沖劑，具有0.1％(w/v)明膠)洗滌2次，并且在使用前直接在相同的緩沖液中稀釋成密度為10⁷細胞/mL。使細菌在37℃/5％CO₂下在生長培養基(Todd-Hewitt肉湯+0.5％(w/v)酵母提取物)中生長至對數階段(OD0.2-0.3)，在冷凍培養基(具有15％(v/v)甘油的生長培養基)中稀釋成密度為大約10⁶細胞/mL，并且在-80℃下在0.5mL等分液中冷凍。使用OPKA緩沖劑稀釋細菌，并等分(每份20μL，1000個細胞)于96孔板中。使用合適的抗體或抗血清(1:4)稀釋液處理細菌懸液，并在37℃下溫育15min。加入補體來源(幼兔補體，CedarLane，10μL)和分化的HL-60細胞懸液(40μL，吞噬細胞/細菌比例為400:1)，并將懸液在37℃下在搖動(220rpm)下溫育45min。在3個重復中實施調理吞噬作用。將每個孔的10％內含物平鋪于Columbia Agar平板上，并在37℃/5％CO₂下溫育10-12h后計數集落。對照孔缺乏抗體或補體來源。

針對合成肺炎鏈球菌血清型8四糖18而產生的單克隆抗體1H8在所有檢驗濃度下在補體和分化的HL-60細胞作為對照血清存在下展現出相似的調理吞噬性殺滅能力(分別為兔肺炎鏈球菌8型分型血清(1:4稀釋)和人類抗血清007sp(1:4稀釋))，但是同種型對照mAb沒有這樣的能力(參見圖10)。

實施例2-11：使用單克隆抗體mAbs 1H8和1F1的聚糖陣列分析

實施以下結合試驗：在SP8莢膜多糖存在或缺乏下，并包含化合物19，49，90，60，62，55和57，溫育如實施例2.1所示合成的微陣列載玻片。

如圖11所示，三糖62、四糖19、四糖60、五糖55和六糖57能夠以相似的強度被mAbs 1H8和1F1識別，但是較小的結構49和90不能被識別。

如圖11所示，通過使用天然SP8多糖進行抑制，消除了mAbs 1H8和1F1與五糖55和六糖57的結合，由此證明了這些糖具有與天然多糖重疊的表位。

實施例2-12：通過微陣列評估mAb 28H11與本發明的糖的結合

如上文所示制造聚糖陣列(實施例2-1和2-2)，不同之處在于使用針對天然Sp多糖產生的鼠科單克隆抗體28H11(IgM)(Yano and Pirofski(2011)，Clin.Vaccine Immunol.，18(1)，59-66)以不同的稀釋度、在加入或未加入10μg/mL肺炎鏈球菌8型CPS的條件下進行結合。驢抗小鼠IgM Alexa594綴合物(dianova，Hamburg，Germany)用作用于檢測的二級抗體。

MAb 28H11(針對天然肺炎鏈球菌8型CPS產生的鼠科IgM)得到良好表征，能夠保護小鼠免于在各種背景下被活的肺炎鏈球菌8型肺炎球菌感染(Yano and Pirofski(2011)，Clin.Vaccine Immunol.，18(1)，59-66)。聚糖微陣列分析表明mAb 28H11與對肺炎鏈球菌8型具有特異性的糖19之間有有效的相互作用，如通過高達10μg/mL的天然肺炎鏈球菌8型CPS才消除結合所表明的(參見圖12)。

實施例2-13：使用雙(4-硝基苯基)己二酸酯使寡糖與CRM₁₉₇的綴合

向寡糖(下文指定的量；通常為0.2μmol)在無水DMSO和無水吡啶(100-200μL)的1:3(v/v)混合物中的攪拌溶液加入雙(4-硝基苯基)己二酸酯(相對于糖的量為12當量；通常為2.4μmol)和三乙胺(10μL)。在氬氣氣氛下，在室溫下將反應物攪拌2h。將混合物驟冷并凍干。使用氯仿(4x0.5mL)和二氯甲烷(4x0.5mL)研磨殘余物，使用DMSO作為溶劑轉移至新的反應管中，并再次冷凍干燥。使用離心過濾器(10kDa MWCO，Millipore，Darmstadt，Germany)針對0.1M磷酸鈉緩沖劑pH 8.0將CRM₁₉₇(3mg，52nmol)進行2次透析，濃縮至大約300μL并加入至活化的寡糖中。將混合物在室溫下攪拌16h并針對水透析4次(參見上文)。取等分物用于表征，并針對磷酸鹽緩沖的生理鹽水透析混合物3次。通過MALDI-TOF MS(參見圖13)，SDS-PAGE和Wes tern印跡表征糖綴合物。

所使用的寡糖的確切的量

四糖18:2.6μmol(1.9mg)

四糖60:2.1μmol(1.5mg)

六糖57:1.9μmol(2.0mg)

綴合物CRM₁₉₇-18：大約65503m/z(平均引入8.8個四糖分子)

綴合物CRM₁₉₇-60：大約68281m/z(平均引入12.9個四糖分子)

綴合物CRM₁₉₇-57：大約63535m/z(平均引入4.6個六糖分子)

實施例2-14：在兔中評價針對實施例2-13所示的綴合物的免疫應答

在第0天和第14天，使用糖綴合物CRM197-18，CRM197-60或CRM197-57(10μg聚糖/劑量)或CRM₁₉₇(100μg)在多個位點皮下免疫兔(n＝3/組)。在第0天、14天和21天收集血清。圖15概括了免疫研究的結果。

使用綴合物免疫的所有兔均顯示針對肺炎鏈球菌8型CPS-相關的寡糖和肺炎鏈球菌8型CPS的顯著的免疫應答。因此，所有的綴合物在兔中均誘導針對肺炎鏈球菌細菌的免疫力。