二磷酸和三磷酸前體藥物的制作方法

本發明涉及一種可用作前體藥物的化合物，特別是核苷二磷酸和三磷酸前體藥物，以及用于制備這種化合物的方法。

背景技術：

在治療諸如病毒感染性疾病時，例如皰疹或肝炎，或艾滋病等免疫缺陷疾病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome＝獲得性免疫缺陷綜合癥)，以及癌癥等時，可使用能滲入到DNA中的核苷類似物。滲入完成后，核苷類似物往往充當鏈終止劑，也就是說，在3′方向上不再發生伸長(J.Balzarini,P.Herdewijn,E.De Clercq；2′,3′-二脫氫-2′,3′-二脫氧胸苷和3′-疊氮基-2′,3′-二脫氧胸苷的細胞內代謝的差分模式，兩種有效的抗人類免疫缺陷病毒化合物；《生物化學雜志》1989,264,6127-6133)。然而，核苷類似物必須作為三磷酸(NTP)，使其可以滲入到DNA鏈中，以實現鏈延伸。

以單、二或三磷酸形式(NMP，NDP，NTP)，核苷類似物因其在生理條件下的電荷而可能無法穿透細胞膜。血腦屏障(BBB；blood brain barrier)過濾來治療影響腦部的疾病是不可能的。因此，核苷類似物必須在細胞中首先通過某些或多或少的特定激酶轉化，或者核苷類似物必須進行設計或改進，以使其能夠穿過細胞膜或血腦屏障。

為此，通常需要提高藥物的親脂性(例如R.J.Sawchuk,Z.Yang；有關分配、運輸和攝取抗HIV藥物到中樞神經系統的研究；先進的藥物控釋評測1999,39,5-31)。提高已知藥物的親脂性的一種方法是利用前藥系統。前體藥物或“Prodrugs”是一種活性物質前體，可通過掩蔽基團的分裂，將實際的活性成分釋放到所需的作用部位上。除了提高親脂性外，這類前藥的進一步條件是細胞外介質中具有足夠的穩定性以及釋放無毒掩模。

核苷單磷酸(NMP)的可活化酶前藥系統已經進行了描述(A.Pompon,I.Lefebvre,J.-L.Imbach,S.Khan,D.Farquhar；在細胞提取物和組織培養基中單-(戊酰氧基甲基)和雙-(戊酰氧基甲基)疊氮胸苷-5'-單磷酸酯的分解途徑-在線Isrp清潔HPLC技術的應用；《抗病毒化學和化療》，1994,5,91-98；I.Lefebvre,C.Perigaud,A.Pompon,A.-M.Aubertin,J.-L.Girardet,A.Kim,G.Gosselin,J.-L.Imbach；帶S酰基-2-乙硫基生物可逆性磷酸保護基的單核苷磷酸三酯衍生物：3'-疊氮基-2'，3'-二脫氧胸苷-5'-單磷酸的胞內遞送；《醫藥化學雜志》1995,38,3941-3950；W.Thomson,D.Nicholls,W.J.Irwin,J.S.Al-Mushadani,S.Freeman,A.Karpas,J.Petrik,N.Mahmood,A.J.Hay,AZT 5'-單磷酸的雙(4-酰氧基)和單(4-酰氧基)酯的合成、生物活化和抗HIV活性，《化學學會雜志》，Perkin Trans.,1993,1,1239-1245；Thomson,D.Nicholls,W.J.Irwin,J.S.Al-Mushadani,S.Freeman,A.Karpas,J.Petrik,N.Mahmood,A.J.Hay,AZT 5'-單磷酸的雙(4-酰氧基)和單(4-酰氧基)酯的合成、生物活化和抗HIV活性，《化學學會雜志》，Perkin Trans.,1993,1,1239-1245；A.Routledge,I.Walker,S.Freeman,A.Hay,N.Mahmood,4-酰氧基雙(核苷-5-基)磷酸酯的合成、生物活化和抗HIV活性；《核酸研究》，1995,14,1545-1558；C.Meier,環薩耳磷酸酯作為化學特洛伊木馬用于細胞內核苷酸糖基單磷酸酯遞送-化學與生物學的匯合；《歐洲有機化學雜志》2006,1081-1102)。但是使用NMP前藥的缺點在于，這可能會抑制或者完全禁止細胞中二磷酸酯和三磷酸酯必要的進一步磷酸化。例如，在核苷類似物中，會抑制疊氮胸苷(AZT)，一種已知的抗HIV藥物磷酸化為AZTDP(DP＝二磷酸)。此外，眾多的副作用也歸因于相應的單磷酸酯AZTMP(MP＝單磷酸)。

對于核苷二磷酸(NDP)和核苷三磷酸(NTP)的掩模化，至今仍沒有令人滿意的解決方案。這里的問題在于，與NMP不同的是，它不僅存在磷酸基團，還有一個或兩個高能磷酸酐，其必須以焦磷酸的形式進行不可逆的掩模化，而不會導致酐鍵的斷裂。在焦磷酸的去掩模化過程中，磷原子不得發生任何反應，否則可能導致焦磷酸根橋連的斷裂。這是NDP和NTP前藥本質區別于其NMP同源物質之處。這里，也可能在磷原子上發生水解反應。

在WO 2009/129798A2中，描述了對稱掩模的核苷二磷酸和三磷酸及其制備方法。這里的“對稱”是指用于末端磷酸電荷掩模化的掩模具有相同的結構。然而研究發現，通過化學或酶水解釋放的活性物質占所需二磷酸或三磷酸物質的百分比取決于在單掩模中間產物釋放時第一掩模的分裂速度。作為副產物，檢測到焦磷酸基團相應的水解產物，對于核苷二磷酸前藥，則是相應的核苷單磷酸，對于核苷三磷酸，則是相應的核苷二磷酸和核苷單磷酸。這最終導致所需目標化合物的非選擇性釋放。

Jessen等人2008，和Schulz等人，2014(H.J.Jessen,T.Schulz,J.Balzarini,C.Meier,核苷二磷酸的生物可逆性保護；應用化學英文國際版，2008,47,8719-8722；T.Schulz,J.Balzarini,C.Meier,DiPPro方法：親油性d4T二磷酸前藥的合成、水解和抗病毒活性；《ChemMedChem》雜志2014,9,762-75；另見Schulz,T.,2012，核苷二磷酸前藥的合成和研究，論文，漢堡大學)也描述了對稱掩模的核苷二磷酸。此外，在Schulz等人于2014年所撰寫的論文中也描述了具有酰氧基基團和β型氰乙基團的核苷二磷酸類似物的非對稱掩模化(1-[(2R,5S)-5-(羥甲基)-2,5-二氫呋喃-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮,司他夫定,d4T)。但是，β型氰乙基掩模只能進行化學和非酶性分裂，這是用作藥物所必需的。

技術實現要素：

本發明旨在提供進一步優化的二和/或三磷酸前藥，特別是核苷酸或核苷酸類似物前藥，并確保其根據現有技術水平沒有明顯的缺點。

出人意料的是，我們通過二和三磷酸化合物，特別是核苷二磷酸和核苷三磷酸及其類似物的合適的生物可逆性非對稱掩模解決了這個問題，并且這種掩模化只能在末端，也就是在β-或γ磷酸上進行，同時省略了對內烯烴磷酸的掩模化。本發明將顯著改善核苷二磷酸(NDP)和核苷三磷酸(NTP)及其類似物的生物可逆性掩模化。

為了實現上述任務，本發明首先提供了通式I的化合物

或者藥學上可接受的鹽，其中

R¹、R³、R⁵和R⁷彼此獨立地為H、鹵素、NO₂、CN、SO₃H取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈脂族或雜脂族基團，或者取代或未取代的芳香或雜芳香基團，

R²和R⁴彼此獨立地為H或Z-C(Y)-R_A，但是不同時為H，

R⁶和R⁸彼此獨立地為H、Z-C(Y)-R_B，但是不同時為H，

Z、Y彼此獨立地為O、S或HN，

R_A和R_B彼此不同，并且各自為取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈脂族或雜脂族基團，或者取代或未取代的芳香或雜芳香基團，

R⁹為核苷、核苷單磷酸、核苷類似物、核苷單磷酸類似物、O-R¹⁰、OP(O)(OH)-R¹⁰或OP(O)(OH)-O-R¹⁰，其中R¹⁰為取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈脂族或雜脂族基團，或者取代或未取代的芳香或雜芳香基團，

R¹²、R¹³、R¹⁴和R¹⁵彼此獨立地為H，取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈脂族或雜脂族基團，取代或未取代的芳香或雜芳香基團，和/或電子受體。

根據本發明所制備的化合物，芐基衍生物-掩模A和B

在苯環末端(終端)磷酸基團上由于不同的基團R，其區別在于：它們在細胞中通過選擇性的方式，例如通過酯酶進行酶分裂，從而釋放出所需的二磷酸或三磷酸化合物。為了實現所需的選擇性，掩模被設計為，其中一個是較不穩定的，也就是說以更高的速度分裂，這樣可以快速形成針對對磷酸酐的親核攻擊具有更高抵抗力的單掩模中間產物。第二個基團是親脂性的，從而保證必要的親脂性，以確保其吸收到細胞中。更大的分裂速度可以通過掩模更大的親水性(極性)等方式來實現。掩模的親水性或親脂性的調節是在本領域中眾所周知的，并可以通過常規實驗來確定。例如，可以通過烴基的大小和長度來影響掩模的親脂性，通過提供極性殘基來影響其親水性。例如，通過雜原子的滲入，也可影響掩模的穩定性。

本發明人發現，兩個掩模分裂的速度往往與其親脂性密切相關，并且，其中一個掩模的水解半衰期隨著親脂性的增加而增加。我們不希望受限于理論的束縛而推斷出，親脂性的增加主要可通過連接到較長的疏水性側鏈來實現，例如烷基鏈，然后會由于空間位阻通常可能較差地遭到親核試劑或酶的攻擊。但是，應該注意的是，所描述的掩模親脂性和穩定性之間的關系(水解半衰期)僅僅是選擇合適的掩模組合的一個指標。另外，更親脂性掩模可能在特定組合和個別情況下形成不穩定的掩模。技術人員可以通過常規實驗來確定。

本發明所述的化合物可以將核苷酸和核苷酸類似物以及具有羥基的其他有機化合物，例如糖或醇，在二磷酸和三磷酸的水平上引入到細胞中。因此，核苷三磷酸可以被直接引入細胞中，因此不再需要更多的細胞內磷酸化步驟。這樣不僅可改善通過細胞引入的核苷的實際使用，還可以避免產生副作用，例如由單磷酸引起的副作用。本發明所述的化合物既可以作為抗病毒藥物使用，也可以作為抗腫瘤藥物使用。它們特別適合用作治療由病毒引起的感染，特別是反轉錄病毒，例如HIV病毒、流感病毒、出血熱病毒和肝炎病毒等。這些化合物也可用于生化實驗的分析用途，因為磷酸化代謝物可在細胞內釋放。這樣就可以執行原本不可執行的實驗。非核苷醇也可以以其二(例如異戊二烯)或三磷酸的形式，輸送到細胞中并在那里釋放。

本發明所述的化合物在生理條件下通常為鹽。因此，下圖所示一個二磷酸化合物Ia(左)和一個三磷酸化合物Ib(右)，其中Kat⁺代表陽離子，例如銨，三乙基銨或四丁基銨，而R¹至R⁸以及R¹²至R¹⁵定義如上所述。Nucl代表核苷或核苷類似物。

“非對稱掩模二磷酸或三磷酸化合物”是指下列公式所述的化合物，

其中A和B代表不同的化學結構，而R⁹的定義如上所述。因而末端磷酸基團構成一個立體中心。化學結構A,B在生理條件下，中和(掩模)末端磷酸單鍵合氧原子上的負電荷。掩模本身在生理條件下也不會加載電荷。末端磷酸在二磷酸化合物中，是指β磷酸基團，在三磷酸化合物中，是指γ磷酸基團。特別地，“非對稱掩模二或三磷酸化合物”是指一種化合物，其中一個掩模，例如掩模A是更不穩定的，從而受到更快速的酶促分裂，而另一個掩模，例如掩模B，則是更親脂性的。

“可酶促分裂掩模”是指這樣一種掩模，它可借助存在于靶細胞中或者誘導型的酶發生分裂。該術語還包括這樣的情況，其中的掩模通過多個步驟被降解，例如級聯式，并且至少進行一次酶促降解步驟。例如，可以進行初始酶促攻擊，同時自發進行進一步的降解步驟。而相反地，“化學裂解掩模”是一種掩模，在靶細胞中的主導條件下，例如溫度、pH值、鹽度等方面，不會分裂或者至少基本上不分裂或者以極低的速度分裂。

“核苷”(有時也可寫做“Nucleosid”)在這里是指有機分子，其中包括糖殘基(糖成分)和有機堿(堿成分)，例如雜環有機堿，尤其是含氮雜環有機堿(核堿基)，它們通過糖苷鍵相連。糖殘基常常是戊糖，例如脫氧核糖或核糖，但是也可以是另一種糖，例如C_3-,C₄-或C₆糖。核堿基通常但不排他地，是嘌呤(R)或嘧啶(Y)。天然存在的嘌呤的實例是鳥嘌呤(G)和腺嘌呤(A)，天然存在的嘧啶的實例是胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。因此，核苷通常被理解為通式的化合物。

并且B是含氮雜環的有機堿，例如核堿基，而R²'和R³'彼此獨立地為H或OH。磷酸核苷，例如核苷單磷酸(NMP)、核苷二磷酸(NDP)和核苷三磷酸(NTP)，也被稱為核苷酸。磷酸、二磷酸(焦磷酸)或三磷酸基團通常被鏈接到核苷糖成分的5'-碳-原子。在本發明中，還包括磷酸基團與2'-或3'-OH基團結合的化合物。

“核苷類似物”(有時也可寫做“Nucleosidanalogon”)在這里是指一種有機化合物，在人體內不會天然存在，但是與在人體內天然存在的核苷結構類似，因此基本上可以由細胞和/或病毒酶按照天然核苷進行處理，例如磷酸化和滲入RNA或DNA鏈中。核苷類似物可以是核苷本身。但是也可能是具有上述性質的另一種化合物，例如由雜環基和無環殘基和/或一個非糖殘基組成的化合物，或者由碳環化合物和雜環基組成的化合物。對于碳環核苷類似物，糖成分中的環氧可以由碳(甲基或者取代的甲基基團)代替。在糖成分中，碳原子也可以用雜原子代替，或者3'-碳原子用硫代替。核苷類似物要么本身是上述意義的核苷，要么是結構和/或功能上類似的核苷。因為核苷類似物在嚴格意義上不是必須包含糖或堿成分，因此這里所指的是與堿成分類似的成分(堿類似物)或者與糖成分類似的成分(糖類似物)。如果這里是指糖成分或堿成分，那么應該包括核苷類似物相應的類似成分，除非另有所指。許多核苷類似物是本領域所公知的。已知的例子是AZT(3'-疊氮基-2',3'-雙脫氧胸苷、疊氮胸苷)、2',3'-雙脫氧肌苷(去羥肌苷)、2',3'-二脫氧胞苷(扎西他濱)、β-L-2’,3’-雙脫氧硫代胞苷(拉米夫定,3TC)、L-胸苷、2‘-甲基-(“上”)-2‘-羥基-(“下”)-尿苷/胞苷、2‘-甲基-(“上”)-2‘-氟-(“下”)-尿苷/胞苷(見US 7608600B1)、2-氨基-9-((2-羥乙氧基)甲基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(阿昔洛韋)。

這里的“核苷磷酸類似物”是指一種核苷磷酸的類似物，也就是核苷酸類似物，因此“核苷單磷酸類似物”是指一種核苷單磷酸的類似物。核苷單磷酸類似物的實例包括核苷膦酸酯，例如3-羥基-2-膦酰甲氧基丙基(HPMP)，2-膦酰甲氧基乙基(PME)，2',3'-二脫氫-2',3'-雙脫氧胸苷-膦酸酯(d4TP)(S)-9-(3-羥基-2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤(HPMPA)和9-(2-膦酰基甲氧基乙基)腺嘌呤(PMEA，阿德福韋)。核苷膦酸酯是本領域所公知的，代替核苷磷酸的P-O-鏈接，它具有一個C-P鏈接，并且可以包括一個核堿基，一個無環或環形脂族糖模擬分量和一個磷酰甲基CH₂P(O)(OH)₂基團(參見Pertusati等人2012年的論文：用于抗病毒治療的膦酸酯前藥的醫藥化學研究，《抗病毒化學和化療》雜志22:181-203,doi:10.3851/IMP2012)。磷酸化核苷類似物，例如具有改性核堿基的磷酸化的核苷，歸屬于“核苷磷酸類似物”或者“核苷酸類似物”術語下。

如果這里使用縮寫“Nucl”，那么它同時包括核苷和核苷類似物。除非另有明確說明，縮寫“NMP”，“NDP”和“NTP”不僅包括核苷單磷酸，核苷二磷酸和核苷三磷酸，還包括相應的類似物，也就是核苷單磷酸類似物，核苷二磷酸類似物和核苷三磷酸類似物。

“1-10”等范圍信息在這里應理解為每個中間值都已同時披露。如果某個信息只能涉及整數，例如碳原子數，則自然意味著只披露整數。該范圍中的任意較小范圍應同時披露，同時較小范圍還應理解為不包括該范圍極限值的范圍。

術語“C_n–C_m”或“C_n–m”，其中n和m分別是正整數，并且m大于n，它表示一個規定了一個化合物或一個殘基團的碳原子數量的范圍。該術語應明確包括范圍界限n到m之間的所有整數中間值，并且彼此獨立。因此術語“C_1–10”(n＝1,m＝10)可以表示1-10的化學物、基團或者殘基，即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子。因此“C_1–10”同時還可以包括“C_2–6”，即2、3、4、5或6個碳原子，或“C_1–4”，即1、2、3或4個碳原子，或“C_4–9”，即4、5、6、7、8或9個碳原子。因此，術語“C_1–20-烷基”可以表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個碳原子的烷基基團，并且包括n和m數值的所有組合，數值范圍是從n＝1到m＝20，例如“C_1–10-烷基”，即帶有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子的烷基，或“C_5–7-烷基”，即帶有5、6或7個碳原子的烷基。因此，術語“C_2–10-烯基”，“C_4–20-烯炔基”等類似。

術語“aliphatischer Rest”或“Aliphatrest”(脂族殘基)包括環狀或無環，直鏈或支鏈，飽和或不飽和的碳化合物殘基、芳基除外。術語“雜脂族殘基”表示脂族殘基，在其碳骨架中一個或多個碳原子被雜原子，如氧、硫、氮或磷等所取代。

術語“烷基”包括飽和的脂族(非芳族)基團，包括直鏈烷基團(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基)和支鏈烷基(如異丙基、叔丁基、異丁基)。該術語還包括O、N、S或P-烷基(例如，-O-甲基)，即經由氧氮、硫或磷原子鍵合而成的烷基團化合物。

術語“烯基”包括具有至少一個C-C雙鍵的不飽和脂族(非芳族)基團，包括直鏈和支鏈烯基團。該術語還包括O、N、S或P-烯基(例如，-O-丙烯基)，即經由氧、氮、硫或磷原子鍵合而成的烯基團化合物。

術語“炔基”包括具有至少一個C-C三鍵的不飽和脂族(非芳族)基團，包括直鏈和支鏈烯基團。該術語還包括O、N、S或P-炔基(例如，-O-丁炔基)，即經由氧、氮、硫或磷原子鍵合而成的炔基團化合物。

術語“烯炔基”包括具有至少一個C-C雙鍵和至少一個C-C三鍵的不飽和脂族(非芳族)基團，包括直鏈和支鏈烯炔基團。該術語還包括O、N、S或P-烯炔基團，即經由氧、氮、硫或磷原子鍵合而成的烯炔基團化合物。

術語“環烷基”包括脂環族基團，即環狀飽和脂族(非芳族)基團，例如環丙基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基。該術語還包括O、N、S或P-環烷基團，即經由氧、氮、硫或磷原子鍵合而成的環烷基團化合物。術語“環烯基”、“環炔基”和“環烯炔基”則相應表示符合上述定義的環形脂族(非芳族)烯基、炔基或烯炔基，其中在環或環系統的內部或外部可能存在雙鍵和/或三鍵。

術語“雜烷基”是指由其他原子(雜原子)代替烴骨架的一個或多個碳原子的烷基，例如氧、氮、硫或磷原子。該術語還包括O、N、S或P-雜烷基團，即經由氧、氮、硫或磷原子鍵合而成的雜烷基團化合物。術語“雜烷基”還包括由其他原子代替烴骨架的一個或多個碳原子的環烷基，例如氧、氮、硫或磷原子。術語“雜烯基”、“雜炔基”、“雜烯炔基”是指對應的烯基、炔基和烯炔基以及環烯基、環炔基和環烯炔基，其中由其他原子(雜原子)來代替烴骨架的一個或多個碳原子，例如氧、氮、硫或磷原子。例如，術語“C_1–20-雜烷基”是指帶有、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個碳原子和至少一個雜原子的烷基。這同樣適用于雜烯基、雜炔基和雜烯炔基。

“芳基”是指帶芳香性的基團，包括多節的芳香單環基團以及具有多個芳環的多環系統。芳基的實例包括苯、苯基和萘。該術語還包括O、N、S或P-芳基基團，即經由氧、氮、硫或磷原子鍵合而成的芳基基團化合物。術語“aromatischer Rest”或“Aromatenrest”(芳香族殘基)在這里可與“芳基”互換使用。

術語“雜芳基”是指其中的雜原子具有環結構，并且在環結構中由其他原子(雜原子)，例如氧、氮、硫或磷原子，來代替一個或多個碳原子的芳基基團。雜芳基的實例為吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、異噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、惡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶。該術語還包括多環芳基基團，例如二環和三環，例如苯并惡唑、苯并二惡唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亞甲、喹啉、異喹啉、吲哚、苯并呋喃、嘌呤或苯并呋喃。該術語還包括、O、N、S或P-雜芳基基團，即經由氧、氮、硫或磷原子鍵合而成的雜芳基基團化合物。術語“heteroaromatischer Rest”或“Heteroaromatenrest”(雜芳殘基)在這里可與“雜芳基”互換使用。

術語“鹵素”是指氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)和碘(I)，特別是氯(Cl)和氟(F)。

術語“取代的”是指存在一個或多個取代基，它們可以將烴骨架一個或多個碳原子或者碳骨架一個或多個雜原子代替為氫原子。這類取代基的實例包括氧代基、羥基、磷酸基、氰基、疊氮基和氨基，還包括鹵素(例如氟、氯)、烷基、環烷基、雜烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基。

術語“電子受體”是指會吸引電荷，從而在化合物中引起電荷轉移(即極化)的化合物、化合物殘基或功能性基團。電子受體或電子受體基團在本領域中是已知的，并且具有諸如負電感性或中介效應。電子受體基團的實例是OMe、MeSO₂、＝O、C(O)H、COOH、CN、SO₃H、酮、酯或酯基團、NO₂和鹵素(例如F、Cl)。Me代表甲基。

殘基R⁹在所有情況下都是經由氧原子鍵合，在核苷單磷酸或核苷單磷酸類似物的情況下，是經由磷酸或膦酸酯基的氧原子鍵合。為了避免誤解，應指出，OP(O)(OH)-R¹⁰和OP(O)(OH)O-R¹⁰根據下列公式

表示殘基，其中R¹⁰定義如上所述。為進一步避免誤解，應指出，核苷或核苷類似物是經由糖成分的氧原子，例如戊糖的C5原子，鍵合到相應的磷原子上。對于戊糖，鏈接最好是通過OH基在5'-碳原子上進行。鏈接也可以通過氧原子在2'-或3'碳原子上進行。O-R¹⁰在這里也被稱為“醇殘基”，其中任何有機碳化合物是指碳骨架上的一個氫原子被代替為一個羥基。醇的實例包括糖，如葡萄糖、果糖、甘露糖等，也包括其它化合物例如香葉醇。

在本發明的一種優選實施方案中，殘基R¹、R³、R⁵和R⁷在化合物中，根據上述公式I分別彼此獨立地為H、鹵素、NO₂、CN、SO₃H，或者取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈團C_1–20-脂族殘基或C_1–20-雜脂族殘基，或者取代或未取代的C_5–20-芳香族殘基或C_3–20-雜芳殘基，尤其是優選彼此獨立地為H，或者取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈C_1–10-脂族殘基或C_1–10-雜脂族殘基，或取代或未取代的C_5–12-芳香族殘基或C_3–12-雜芳殘基。

在本發明的另一種優選實施方案中，R¹、R³、R⁵和R⁷在化合物中，根據上述公式I分別彼此獨立地從基團中選擇，包括H、鹵素、NO₂、CN、SO₃H，取代或未取代的C_1–20-烷基、取代或未取代的C_2–20-烯基、取代或未取代的C_2–20-炔基、取代或未取代的C_4–20-烯炔基、取代或未取代的C_3–20-環烷基、取代或未取代的C_3–20-環烯基、取代或未取代的C_5–20-環炔基、取代或未取代的C_5–20-環烯炔基、取代或未取代的C_1–20-雜烷基、取代或未取代的C_2–20-雜烯基、取代或未取代的C_2–20-雜炔基、取代或未取代的C_4–20-雜烯炔基、取代或未取代的C_5–24-芳基、取代或未取代的C_3–24-雜芳基。

在其他優選方案中，R¹、R³、R⁵和R⁷在化合物中，根據上述公式I分別彼此獨立地從基團中選擇，包括H、鹵素、NO₂、CN、SO₃H，取代或未取代的C_1–10-烷基、取代或未取代的C_2–10-烯基、取代或未取代的C_2–10-炔基、取代或未取代的C_4–10-烯炔基、取代或未取代的C_3–10-環烷基、取代或未取代的C_3–10-環烯基、取代或未取代的C_5–10-環炔基、取代或未取代的C_5–10-環烯炔基、取代或未取代的C_1–10-雜烷基、取代或未取代的C_2–10-雜烯基、取代或未取代的C_2–10-雜炔基、取代或未取代的C_4–10-雜烯炔基、取代或未取代的C_5–12-芳基、取代或未取代的C_3–12-雜芳基。特別優選的是，R¹、R³、R⁵和R⁷全部是H。

R¹⁰優選地是取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈C_1–20-脂族殘基或C_1–20-雜脂族殘基，或者取代或未取代的C_5–20-芳香族殘基或C_3–20-雜芳殘基，尤其是優選彼此獨立地為H，或者取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈C_1–10-脂族殘基或C_1–10-雜脂族殘基，或者取代或未取代的C_5–12-芳香族殘基或C_3–12-雜芳殘基，最好是C_1–20-烷基或C_1–20-烯基或糖殘基。

殘基R¹²、R¹³、R¹⁴和R¹⁵優選地

i.分別彼此獨立地為H，取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈C_1–20-脂族殘基或C_1–20-雜脂族殘基，取代或未取代的C_5–20-芳香族殘基或C_3–20-雜芳殘基，和/或電子受體，或

ii.分別彼此獨立地為H，取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈C_1–10-脂族殘基或C_1–10-雜脂族殘基，取代或未取代的C_5–12-芳香族殘基或C_3–12-雜芳殘基，或

iii.分別彼此獨立地從基團中選擇，包括H、取代或未取代的C_1–20-烷基、取代或未取代的C_2–20-烯基、取代或未取代的C_2–20-炔基、取代或未取代的C_4–20-烯炔基、取代或未取代的C_3–20-環烷基、取代或未取代的C_3–20-環烯基、取代或未取代的C_5–20-環炔基、取代或未取代的C_5–20-環烯炔基、取代或未取代的C_1–20-雜烷基、取代或未取代的C_2–20-雜烯基、取代或未取代的C_2–20-雜炔基、取代或未取代的C_4–20-雜烯炔基、取代或未取代的C_5–24-芳基、取代或未取代的C_3–24-雜芳基，或

iv.分別彼此獨立地從基團中選擇，包括H、取代或未取代的C_1–10-烷基、取代或未取代的C_2–10-烯基、取代或未取代的C_2–10-炔基、取代或未取代的C_4–10-烯炔基、取代或未取代的C_3–10-環烷基、取代或未取代的C_3–10-環烯基、取代或未取代的C_5–10-環炔基、取代或未取代的C_5–10-環烯炔基、取代或未取代的C_1–10-雜烷基、取代或未取代的C_2–10-雜烯基、取代或未取代的C_2–10-雜炔基、取代或未取代的C_4–10-雜烯炔基、取代或未取代的C_5–12-芳基、取代或未取代的C_3–12-雜芳基，或

v.所有H，或

vi.電子受體或H，其條件是，R¹²和R¹⁴分別為H，而R¹³和R¹⁵分別是一個電子受體，或者R¹³和R¹⁵分別為H，而R¹²和R¹⁴分別是一個電子受體。

優選的是，本發明中兩個掩模“A”和“B”的區別僅體現在殘基R²和/或R⁴以及R⁶和/或R⁸中。剩余殘基，也就是殘基R¹、R³、R⁵和R⁷以及優選地，殘基R¹²、R¹³、R¹⁴和R¹⁵最好都是相同的，特別是所有H。更為優選的是，兩個掩模的區別僅體現在其殘基R²和R⁶或者其殘基R⁴和R⁸中，最好只體現在其殘基R²和R⁶中。

R²和R⁴彼此獨立地為H或Z-C(Y)-R_A，其中通過Z鍵合到苯基環上，并且Z和Y代表O、S或HN，條件是，并非兩個殘基R²和R⁴分別都是H。這同樣適用于殘基R⁶和R⁸。當Y＝O時，殘基R²、R⁴、R⁶和R⁸的下列結構是一個問題：

優選方案為殘基R²和R⁴中只有一個，最好是R²，且是Z-C(Y)-R_A，并且其他殘基，最好是R⁴，且是H，其中Z-C(Y)-R_A最好是Z-C(O)-R_A。同樣地，優選方案為殘基R⁶和R⁸中只有一個，最好是R⁶，且是Z-C(Y)-R_B，并且其他殘基，最好是R⁸，且是H，其中Z-C(Y)-R_B最好是Z-C(O)-R_B。

在根據本發明的化合物I的一種特別優選的實施方案中，殘基R²＝Z-C(O)-R_A，R⁶是Z-C(O)-R_B，而殘基R¹、R³、R⁴、R⁵、R⁷、R⁸、R¹²、R¹³、R¹⁴和R¹⁵分別是H，如依照公式Ic的下列化合物所示：

其中Z＝O、S或HN，最好是O，R⁹定義如上所述。

在根據本發明通式I的化合物中，殘基R_A和R_B最好分別彼此獨立地為取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈C_1–20-脂族殘基或C_1–20-雜脂族殘基，取代或未取代的C_5–20-芳香族殘基或C_3–20-雜芳殘基，條件是殘基R_A和R_B是不同的。

特別優選的是，殘基R_A和R_B分別彼此獨立地從基團中選擇，包括取代或未取代的C_1–20-烷基、取代或未取代的C_2–20-烯基、取代或未取代的C_2–20-炔基、取代或未取代的C_4–20-烯炔基、取代或未取代的C_3–20-環烷基、取代或未取代的C_3–20-環烯基、取代或未取代的C_5–20-環炔基、取代或未取代的C_5–20-環烯炔基、取代或未取代的C_1–20-雜烷基、取代或未取代的C_2–20-雜烯基、取代或未取代的C_2–20-雜炔基、取代或未取代的C_4–20-雜烯炔基、取代或未取代的C_5–24-芳基、取代或未取代的C_3–24-雜芳基、最好是C_1–20-烷基或C_1–20-烯基，條件是殘基R_A和R_B是不同的。特別優選地，殘基R_A和R _B選自取代或未取代的C_1–20-烷基、取代或未取代的C_2–20-烯基,條件是，殘基R_A和R _B是不同的。

優選地，應選擇合適的殘基R_B，使得R_B相對于R _A更親脂。相反，優選地，應選擇合適的殘基R_A使其更不穩定，即更容易酶促裂解。例如，R_A可以是C_1–5烷基，而R_B是C_7–20烷基。例如，R_A可以是甲基(Me)、丙基(Pr)或丁基(Bu)，而R_B可以是Ph-CF₃、Ph-Me、C₇H₁₅、C₉H₁₉、C₁₁H₂₃或5-OAc-Man(Ph＝苯基，Me＝甲基，OAc＝乙酰氧基，Man＝甘露糖)。

本發明中的前藥針對含水緩沖系統中的化學水解具有高度的穩定性以及明顯的酶促水解趨勢，從而釋放人類細胞提取物中的活性物質。因此，它們滿足用作藥物的重要先決條件，特別是作為抗病毒藥物，例如抗逆轉錄病毒藥物。例如，本發明的化合物適合用于藥物中，以治療HIV感染、流感、C型和B型肝炎或出血熱。

因此，本發明一方面，還涉及到一種藥物組合物，它包括符合本發明的化合物以及藥用載體。藥用載體在本領域中是已知的，其包括一個或多個液體、半固體或固體填充劑，稀釋劑或適合施用于哺乳動物(包括人類)的其他物質。

本發明中的術語“載體”是指用于簡化給藥可與活性成分組合使用的任何有機或無機、天然或合成材料。此類載體的例子包括但不限于有機或無機溶劑、淀粉、乳糖、甘露醇、甲基纖維素、滑石、明膠、瓊脂、磷酸鈣、硬脂酸鎂、動物和植物脂肪、高分子量脂肪酸或高分子量的聚合物。

術語“藥用”是指任何適用于哺乳動物，特別是人類的基本非毒性材料，其基本上不會影響活性成分的生物活性的有效性。這類材料可以包括藥用濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、或類似材料。藥用載體的非限制性實例包括碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、乙醇、甘油、水、緩沖溶液等。藥物組合物還可以包括助劑和/或稀釋劑。

另一方面，本發明還涉及一種藥物劑型，它包括根據本發明所述的化合物及其藥用載體。特別優選地，它是一種用于口服給藥的劑型，例如片劑或膠囊。

另外，本發明還涉及到一種用于制備通式(I)化合物

或藥用鹽的方法，其中

R¹、R³、R⁵和R⁷彼此獨立地為H、鹵素、NO₂、CN、SO₃H，或取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈脂族或雜脂族基團，或者取代或未取代的芳香或雜芳香基團，

R²和R⁴彼此獨立地為H或Z-C(Y)-R_A，但是不同時為H，

R⁶和R⁸彼此獨立地為H、Z-C(Y)-R_B，但是不同時為H，

Z、Y彼此獨立地為O、S或HN，

R_A和R_B彼此不同，并且各自為取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈脂族或雜脂族基團，或者取代或未取代的芳香或雜芳香基團，

R⁹為核苷、核苷單磷酸、核苷類似物、核苷單磷酸類似物、O-R¹⁰、OP(O)(OH)-R¹⁰或OP(O)(OH)-O-R¹⁰，其中R¹⁰為取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈脂族或雜脂族基團，或者取代或未取代的芳香或雜芳香基團，其中

R¹²、R¹³、R¹⁴和R¹⁵彼此獨立地為H、取代或未取代的環狀、無環、直鏈或支鏈脂族或雜脂族基團，取代或未取代的芳香或雜芳香基團，和/或電子受體，

包括下列步驟：

a₁)通式II_A化合物反應

其中R¹、R²、R³、R⁴、R¹²和R¹³定義如上所述，

其中：i)三氯化磷PCl₃和N,N-二異丙基胺，或ii)雙(N,N-二異丙基氨基)氯膦用于合成通式III的化合物

b₁)a)所獲得的公式III的化合物與通式II_B的化合物反應

其中R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R¹⁴和R¹⁵定義如上所述，

用于合成通式IV的化合物

c₁)b)所獲得的公式IV的化合物與通式V的化合物反應

其中R⁹定義如上所述。

在一個替代實施方案中，本發明的方法包括以下步驟：

a₂)通式II_A化合物反應

其中R¹、R²、R³、R⁴、R¹²和R¹³定義如上所述，

二苯基膦用于合成通式VI的化合物

b₂)a)所獲得的公式VI的化合物與通式II_B的化合物反應

其中R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R¹⁴和R¹⁵定義如上所述，

用于合成通式VII的化合物

c₂)b)所獲得的公式VII的化合物與i)通式V的化合物反應

或者ii)用磷酸或磷酸鹽和R⁹或包含R⁹的化合物，

其中R⁹定義如上所述。

合適的磷酸鹽的一個實例是四丁基磷酸銨。

本發明方法的替代實施方案特別有利，因為在合成核苷二磷酸和三磷酸或其類似物時，它無需使用通常難以制備的二磷酸或其類似物，而是使用相應的單磷酸，后者易于制備，并且部分可購買。在這種方案中，化合物依照公式VII要么直接與單磷酸酯化合物進行反應形成二磷酸化合物，或者首先用于相應的焦磷酸化合物的磷酸化，然后再與單磷酸化合物進行反應。因此可獲得二磷酸化合物，特別是三磷酸化合物，而無需使用二磷酸化合物。但是當然在這種方案中，盡管這不是優選的，也不排除使用二磷酸化合物來制備相應的三磷酸化合物。

殘基R¹至R¹⁵的優選實施方案已經在本發明的第一方面中做出了說明，也適用于本發明的方法方面，因此這里不再贅述。

附圖說明

為了更清楚起見，下文將結合附圖1和實施例對本發明進行詳細說明。其中：

圖1是本發明化合物一個實施例中的掩模細胞內裂解的示意圖。

具體實施方式

圖1是依照本發明一個實施例，核苷二磷酸前藥(NDP前藥)在細胞中釋放過程的示意圖。在NDP前藥中，末端磷酸羥基中兩個原本帶負電荷的氧原子(以粗體顯示)(這里是β型磷原子)是不對稱取代的，即通過兩個不同的掩模A和B(這里是不同的酰氧基衍生物)掩模化。殘基R_A和R_B的區別在于穩定性和親脂性。殘基R_A比殘基R_B具有更低的穩定性，殘基R_B比殘基R_A親脂性更強。在細胞中，相對不穩定的掩模A在通過細胞中的酯酶對酯基進行快速酶攻擊及隨后的自發降解后，被快速去除，從而實現單掩模的中間產物。對磷酸酐鍵合的親核攻擊(Nu^–＝親核)和裂解不發生，從而避免形成不良的單磷酸酯。掩模B通過與掩模A相同的機制裂解，但是速度要更慢，因此未掩模化的核苷二磷酸前藥最終在細胞中釋放。

實施例

用于制備本發明化合物I的方法的實施例的示意圖如下所示。第一個芐醇衍生物II_A與三氯化磷(PCl₃)發生反應，以制備化合物100，后者與N,N-二異丙基胺(NH(iPr)₂)反應形成相應的亞磷酰胺化合物III。化合物III與第二個芐醇衍生物II_B發生反應，以合成亞磷酰胺化合物IV。然后，它可以與單或二磷酸酯化合物V，例如核苷單磷酸或核苷單磷酸類似物(兩者這里簡稱為NMP)，或者核苷二磷酸或核苷二磷酸類似物(兩者這里簡稱為NDP)耦合，從而得到化合物I。本發明的NDP或NTP化合物(包括含有化合物的核苷類似物)這里也可簡稱為DiPPro核苷酸或TriPPPro核苷酸。

為了制備亞磷酰胺化合物III，芐醇衍生物II_A代替三氯化磷(PCl₃)和N,N-二異丙基胺，也可與雙(N,N-二異丙基氨基)氯膦并根據下列圖示發生反應。

用于制備本發明化合物I的方法的另一種替代實施例的示意圖如下所示。

第一個芐醇衍生物II_A與二苯基膦(DPP)發生反應，以制備化合物VI后者與第二個芐醇衍生物II_B發生反應，以合成膦酸酯化合物VII。然后，它可以與單或二磷酸酯化合物V，或者首先與磷酸或磷酸鹽，然后與化合物R⁹或包含R⁹的化合物，例如核苷單磷酸耦合，從而得到化合物I。在本發明方法該實施例的后一種方案中，特別有利的是，三磷酸化合物的合成可以通過相應的單磷酸，例如核苷單磷酸或類似物進行。

使用本發明方法制備的DiPPro和核苷酸的實例如下所示：

a)司他夫定(d4T)作為核苷類似物殘基(Ph＝苯基；Me＝甲基，OAc＝乙酰氧基)：

b)齊多夫定(AZT)作為核苷類似物殘基：

1.通過亞磷酰胺化合物制備非對稱掩模核苷二磷酸和核苷三磷酸化合物

為制備本發明所述的非對稱掩模核苷二磷酸或核苷三磷酸化合物(DiPPro-,TriPPPro核苷酸)，可以按照上述一般方法，首先制備相應的非對稱亞磷酰胺，然后再與所需的核苷酸(類似物)(核苷單或核苷二磷酸(類似物))耦合生成非對稱的NDP或NTP。通過這種方式可制備大量非對稱掩模的核苷二或核苷三磷酸化合物，且有非常良好的生產率。非對稱亞磷酰胺與相應的核苷單或二磷酸的耦合，通過酸活化反應進行優化，因此核苷二或核苷三磷酸化合物的許多組合通過定量轉化并按照很高的分離產率實現。

1.1亞磷酰胺的合成

1.1.1合成方式1

在氮氣氛下，1當量的三氯化磷和1當量的吡啶在大量的四氫呋喃中(THF，約20mL/gPCl₃)溶解，并冷卻至–78℃。在1.5小時內，在此溶液中逐滴注入1當量的苯酯II_Aa，也溶解于THF。滴完后，除去冷卻浴，并在室溫下(RT)攪拌反應混合物約20小時，直至通過DC不會檢測到苯基酯。然后在-10℃下逐滴注入6.1當量的N，N-二異丙基胺。在除去冷卻浴后，將反應混合物在室溫下攪拌。中間體化合物101完全轉化后，即24至48小時后，通過過濾去除形成的鹽，然后減壓并去除溶劑。無需進一步處理，用石油醚/三乙胺作為洗脫劑對產品IIIa在上進行純化。

1.1.2合成方式2

在氮氣氛圍下，將1當量的雙(N,N-二異丙基氨基)氯膦溶解到二乙醚或THF中(12mL/500mg)。在冰冷卻下，將由2.1當量的三乙胺和1.9當量的苯酯II_Aa組成的溶液緩慢滴入二乙醚或THF中(5ml)。然后除去冷卻浴，并在室溫下攪拌反應混合物。約1至2小時后，將所得的三乙基氯化銨進行過濾，然后減壓并去除溶劑。無需進一步處理，用石油醚/三乙胺作為洗脫劑對產品IIIa在上進行純化。

1.2亞磷酰胺的合成

在氮氣氛下，將1.5當量的亞磷酰胺IIIa首先與乙腈共蒸發，然后溶解為2mL/100mg的溶液。在冰冷卻下，將1當量的4-酰苯甲醇II_Ba溶液和1當量的0.25摩爾4.5-二氰基咪唑活化劑溶液滴入到乙腈中。在室溫下攪拌約30至60分鐘后，通過減壓除去溶劑并結束反應。將殘留物溶于石油醚/三乙胺(9:1)中并過濾。用石油醚/三乙胺作為洗脫劑對產品IVa在上進行純化。

1.3 DiPPro-,TriPPPro核苷酸的合成

反應在氮氣氛條件下進行。1當量的核苷單磷酸(NMP)或核苷二磷酸(NDP)的N(C₄H₉)₄⁺鹽溶解到乙腈中(約4mL/100g)并用1.5當量已預先共蒸發的亞磷酰胺IVa進行處理。亞磷酰胺IVa的活化通過逐步加入0.25摩爾4.5-二氰基咪唑活化劑溶液進行(乙腈)。首先，加入0.5當量，然后每隔5分鐘加入0.25當量，直至達到完全轉化(最多1.75當量)。氧化通過將1.5當量的5.5摩爾tBuOOH溶液加入正癸烷中進行。反相(RP)-色層分離法(“Puri Flash”)，其次是與NH₄⁺的離子交換，和多重RP色層分離法(Puri Flash)，提供DiPPro核苷酸或TriPPPro核苷酸Ic產率高達85％。

2.通過膦酸酯化合物制備非對稱掩模核苷二磷酸和核苷三磷酸化合物

2.1制備非對稱取代的膦酸酯化合物

為合成非對稱取代的膦酸酯化合物VIIa，在氮氣氛下將1當量的苯基酯II_Aa緩慢滴入吡啶中(約15mL/g IIA)，并將溶液冷卻到-5℃，并將1.3當量的二苯基膦(DPP)滴入吡啶中(約20mL/g DPP)。攪拌十分鐘后，加入1.6當量的苯基酯II_Ba，并將溶液在40℃下攪拌2小時。然后，在40℃下除去所有揮發性成分。此外，用甲苯對殘留物共蒸發兩次。用石油醚/乙酸乙酯/乙酸作為洗脫劑，通過色層分離法對產品VIIa進行純化。

所得的膦酸酯化合物VIIa可以與核苷單磷酸或類似物進行反應，以制備核苷二磷酸或核苷二磷酸類似物(DiPPro核苷酸(類似物))。

為制備核苷三磷酸(TriPPPro核苷酸)，首先應制備化合物VIIa的焦磷酸二芐衍生物，然后再制備核苷三磷酸。

2.2制備化合物VIIa的焦磷酸二芐衍生物

在氮氣氛條件下，將1當量的膦酸酯VIIa溶解到乙腈中(約10mL/g膦酸酯)，如有必要，略微加熱溶解，并用2當量的N-氯琥珀酰亞胺(NCS)處理。1小時后，立即將2.5當量的四正-丁基銨單磷酸溶液滴入乙腈中(約20mL/g磷酸鹽)。將溶液攪拌1小時，然后除去溶劑。將殘留物溶于二氯甲烷和冷的1M乙酸銨溶液中，并使用離心機進行相分離。將有機相用冷水再次洗滌，用硫酸鈉干燥、過濾，然后再除去溶劑。因此，所需的產物VIIIa具有非常高的純度。轉化率是定量的。

2.3制備TriPPPro核苷酸

反應在氮氣氛條件下進行。在0℃下，首先將5當量的三氟乙酸酐(TFAA)和8當量的三乙胺(TEA)混合到乙腈中(約20mL/g TFAA)。然后將1當量的焦磷酸二芐化合物VIIIa溶液加入乙腈中(約20mL/g焦磷酸二芐)。在0℃下靜置10分鐘后，通過高真空除去所有的揮發性成分。使殘留物懸浮在乙腈中(約20mL/g焦磷酸二芐)，然后用5當量的TEA和3當量的甲基咪唑處理。攪拌五分鐘后，將1當量的核苷單磷酸(NMP,Nucl＝核苷)的N(C₄H₉)₄⁺鹽溶解到乙腈中(約20mL/g NMP)，3小時后通過減壓除去溶劑并結束反應。通過反相(RP)-色層分離法(“Puri Flash”)，然后通過NH₄⁺離子交換，和多重RP色層分離法，可以分離TriPPPro核苷酸Ie₁，產率高達50％。

3.水解實驗

CEM/0細胞提取物的水解實驗提供了有關前藥核苷二磷酸酶促釋放的信息。其中，要將樣品在細胞提取物中溫育，并在不同的時間停止。水解樣品分析通過HPL色譜法進行。在掩模酰基部分的兩個不同基團上，更不穩定的那個會快速裂解(例如R＝CH₃:t_1/2＝約2min；R＝C₄H₉:t_1/2＝約45至60min)，從而形成更穩定的中間產物。接著，中間產物定量水解成二磷酸。d4TDP的形成通過共注射d4TDP溶液確認。

前藥的化學穩定性也可以在pH7.3的磷酸鹽緩沖液中進行測試。DiPPro或TriPPPro核苷酸溶液與磷酸鹽緩沖液(PBS)按照反應，然后進行HPL色譜法水解。實驗結果表明，所有的前藥相對其酶促穩定性，都具有顯著更高的化學穩定性(例如CH₃/C₉H₁₉-DiPPro-d4TDP的半衰期(前藥降解)：t_1/2(PBS)＝48小時，t_1/2(CEM/0)＝2分鐘)。由于穩定性較高，在磷酸鹽緩沖液中水解開始時還可觀察到核苷單磷酸的形成。由于選擇了非對稱掩模，更小穩定性的一個基團與更大親脂性的一個基團組合，因此可快速形成中間產物(即更穩定的)，包括在細胞提取物中，從而明顯偏好形成二磷酸。