本發明還涉及以此方式獲得的微藻分離蛋白。
背景技術：
：所屬領域技術人員熟知，小球藻是一種潛在的食物來源，因為它們富含蛋白質和其他必需營養素。它們被描述為包含45％的蛋白質、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纖維素和10％的礦物質和維生素。鑒于其豐度和氨基酸譜，微藻蛋白因此被認為是大豆蛋白或豌豆蛋白的替代性食物來源。蛋白部分也可以被開發為化妝品行業、或甚至醫藥行業中的功能劑。然而，由于在所述部分中存在不希望的化合物(例如葉綠素)而導致包含它們的食物組合物的顏色、味道和結構方面發生不希望的變化，所以在微藻蛋白的食品應用方面的發展尚不顯著。為了增加其在食品應用中的潛力，并且也為了增加其商業價值，必須在不影響它們的分子結構的前提下從微藻中提取這些蛋白。“軟”提取技術將因此需要分離具有高溶解度和良好技術和功能特性的蛋白質，但是微藻細胞壁的剛性，尤其綠色微藻的剛性，根本上與這一點矛盾，這是因為它破壞了細胞內蛋白質的提取和完整性。因此，與其相反，常規地“硬”的物理或化學條件被用來破壞微藻細胞壁。因此，許多研究提出了通過有機溶劑型或高壓勻漿類型進行提取的技術。然而，在這些技術選擇中，蛋白質的變性未認為是麻煩的，這是因為大多數的這些方法開發，是出于分析的目的，或意在提供用于酶消化的底物，從而產生水解蛋白。然而，保存細胞組分完整性的有效崩解方法不僅應最大化產率，而且應最大化提取的產物的質量。換言之，用于優化崩解壁的方法必須例如避免：-目標產物的化學污染，-使用過高的破裂能；后者可能導致感興趣的細胞內分子的不可逆變性或降解。此外，對于大規模生產而言，對于選擇的方法，重要的是可轉換值這一規模。最后，這一細胞崩解步驟的引入必須是容易的，并且必須對隨后的方法/處理步驟不具有負面影響。所有這些限制影響崩解方法的效率并且由于同樣原因影響其能量消耗。這就是為什么珠磨機技術是優選的，因為它被認為對于按其天然形式釋放細胞內蛋白質是有效的。在珠磨機中，將細胞與小球形顆粒一起以懸浮液狀態攪動。細胞的破碎是由珠間剪切力、碾磨以及與珠的碰撞引起的。例如，專利US5330913中給出了一種適合的珠磨機的描述。這些珠使細胞破裂以從中釋放細胞內容物。然后以“水包油”乳液形式獲得粒徑小于起源細胞的懸浮液。通常霧化此乳液并且消除水，然而留下包含由細胞碎片、間質可溶性化合物和油組成的異質混合物的干燥粉末。在使用這些細胞崩解技術時難以解決的是單獨地分離細胞內內容物(以便排除膜碎片、糖、纖維和脂肪)，并且尤其是保存蛋白負載的質量。在四爿藻屬的微藻的情況下，安雅施文茨法伊爾(AnjaSchwenzfeier)等人(生物資源技術(BioresourceTechnology)，2011，102，9121-9127)提出了保證分離蛋白質的溶解度和氨基酸譜質量的方法，其中污染物(例如染色物質)被除去，該方法包括以下步驟：-用珠磨機進行細胞崩解，-將磨碎的微藻懸浮液離心，-上清液的透析，-穿過離子交換樹脂，-洗脫物的透析，-脫色，然后-洗滌和再懸浮。然而，這種實驗室方法(用于處理24g的生物質)不能放大到工業規模，其中而將珠磨機方法用于回收完整生物質。此外，該方法不適合在其生物質中包含并非不顯著脂質含量的微藻(例如在原殼小球藻中，脂質含量大于15％)。的確，即使在細胞壁的這種“相對軟的”破裂之后，磨碎的細胞材料呈相對穩定的絡合物“水包油”乳液的形式。因此，而在此階段通常通過溶劑或機械地提取細胞組分，但是這有損害于其完整性。現有技術提出了第一解決方案，并且此外由本申請人公司測試了該第一解決方案，該方案包括將機械研磨與蒸發偶聯，以便嘗試將該乳液去穩定化，然后包括通過離心分離脂肪部分。然而，該分離步驟(堿性乳油化)的差的質量使得這種相分離方法的效率非常低。即使在此階段推薦添加乙醇(20％-30％/原始)改進了該乳液的去穩定化，然而它僅使能夠實現50％的級別的脫脂，甚至在低產率的情況下。此外，當該脂質部分與蛋白/多糖基質結合時，該機械途徑是特別難以實施或甚至不可能實施的。另一個解決方案提出使用中性溶劑。然而，它面臨巨大的限制(質量、安全性、法規等)。發明主題其結果是，對于提取并穩定化感興趣的微藻的細胞組分的技術(通過機械研磨釋放所述細胞組分)存在未滿足的需要。本申請人公司已經發現，這一需要可以通過如下方式滿足：通過提出從現有技術中已知的那些方法的替代方法，通過將用于機械研磨微藻細胞的方法與用于使通過選自由堿處理和酶處理組成的組中的處理產生的脂質部分變構的步驟，隨后是離心的步驟組合。然后通過微孔過濾將脫脂可溶性部分澄清，然后超濾，以獲得該分離蛋白。因此，本發明涉及一種用于從小球藻屬微藻生物質制備分離蛋白的方法，該方法包括以下步驟：-提供一種由發酵產生的微藻生物質，-洗滌該生物質，以便消除間質可溶性化合物，并且濃縮，-在臥式珠磨機類型系統中實施對經過洗滌并且濃縮的生物質的機械研磨，以獲得一種乳液，-將以此方式獲得的乳液變構，-三相分離，以便從包含脂質和細胞碎片的部分中分離可溶性部分，-尤其通過微孔過濾，回收以及任選的澄清以此方式獲得的可溶性部分，以便從中除去殘留不溶性物質，以便獲得可溶性分離蛋白，-在具有小于5kDa，優選在1kDa和5kDa之間的截止閾值的膜上對澄清的可溶性部分進行任選的超濾，以便獲得一種可溶性分離蛋白，-在pH7下進行任選的中和，-將所述分離蛋白蒸發、巴氏滅菌并霧化。微藻生物質的選擇優選地，小球藻屬微藻選自由普通小球藻、根腐小球藻和原殼小球藻組成的組，并且更具體地是原殼小球藻。在一個具體實施例中，該菌株為原殼小球藻(菌株UTEX250-美國得克薩斯大學奧斯汀分校藻類培養物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在另一個具體實施例中，該菌株為耐熱性小球藻(菌株UTEX1663-美國得克薩斯大學奧斯汀分校藻類培養物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在異養條件下并且在不存在光的情況下進行培養通常導致產生具有按干細胞的重量計，45％至70％的蛋白含量(通過測量氮含量N×6.25進行評估)的小球藻生物質。如將在下文示例，分兩個步驟進行這一培養：-在包含葡萄糖和酵母提取物的培養基中進行預培養，在28℃下，伴隨攪動，持續72h，然后-自身在葡萄糖和酵母提取物中持續多于36h，在28℃下，伴隨攪動并且在用氨水調節的pH6.5下，進行用于產生生物質的培養，這生成具有按干細胞的重量計，52％的級別的蛋白含量(用Nx6.25進行評估)的大約80g/l的生物質。然后通過固液分離，通過正面過濾或切向過濾、或通過另外為本領域普通技術人員已知的任一方式收集生物質。有利地，本申請人公司然后推薦洗滌并濃縮生物質，以便通過生物質的一系列的濃縮(通過離心)/稀釋來消除間質可溶性化合物。在工業規模上，有利地選擇通過分一個階段或兩個階段的離心，來進行順序稀釋和離心。出于本發明的目的，術語“間質可溶性化合物”旨在意指發酵培養基中的所有可溶性有機污染物，例如水溶性化合物，例如鹽、殘留葡萄糖、具有2或3的聚合度(或DP)的寡糖、或肽。然后將其間質可溶性化合物的以此方式純化的生物質優先調節至按重量計15％和30％之間的干物質，優選調節至20％和30％之間的干物質。對于本發明的方法的剩余部分，以此方式獲得的生物質可以被用作為，或被熱透化(通過高溫短時或HTST方法-同樣由本申請人公司開發并且在其迄今仍未公開的申請之一中加以保護)，以便從中釋放可溶性肽的內容物。可以通過隨后的以下步驟來提取此生物質的殘留蛋白。生物質研磨本申請人公司推薦使用(臥式)珠磨機技術。更具體地，有利地，可以根據由本申請人公司已經開發的并且在其迄今未審查的申請之一中加以保護的方法來實施該研磨，其中：-硅酸鋯珠的表觀密度在2kg/l和3.5kg/l之間，并且-研磨室的填充率大于或等于80％。按連續模式，例如通過串聯連續多遍來實施該研磨。選擇待研磨的微藻的密度在小于250g/l的水平。在研磨結束時，獲得一種乳液。乳液的變構及其組分的分離為了從中提取感興趣的肽的和多肽部分，乳液的組分的分離需要將由細胞研磨得到的乳液(脂質、蛋白-肽和多肽-以及細胞碎片的復雜混合物)變構/去穩定化。可以通過以下方式來促進該乳液的這種變構/去穩定化：-通過酶預消化，尤其是通過特異性蛋白酶，通過用極性溶劑進行處理和/或通過靶向乳液蛋白部分的受控堿處理，-抑或通過調節pH和溫度，通過用極性溶劑進行處理和/或通過靶向與乳液脂質部分的界面的酶消化，尤其是纖維素酶類型的酶消化。因此，在裝有低剪切攪拌模塊的攪拌式反應器中調節研磨的細胞材料，以便限制乳化，同時使得能夠進行促進所選擇的特定處理(設定pH，水解酶的作用等)的均勻混合。例如，在目的在于經由酶途徑(例如通過堿性蛋白酶)通過處理混合物中的蛋白部分來使乳液去穩定化的處理的情況下，將乳液的溫度和pH調節至針對所述蛋白酶的反應條件：-將溫度調節至大于30℃的值，優選為60℃的級別，并且-將pH調節至大于7的值，優選為8的級別，(或甚至任選地為10的級別，如果僅僅利用了pH的作用)。反應的持續時間在2h和8h之間。在裂解結束時，可以按大于5％(v/v)將乙醇作為針對乳液的去穩定劑添加至反應混合物中(在水包油乳液的情況下)。可以通過三相分離(例如通過離心)使以此方式去穩定化的乳液(部分地)分裂。因此，獲得了3個相：-上層脂質乳膏，-水性/中間的(＝“原始”可溶性物質)可溶性化合物(和殘留不溶性物質)相，以及-集中細胞碎片的球粒。可溶性部分基本上由主要的蛋白部分、可溶性糖、鹽和殘留脂質小球組成。膜分離為了釋放肽和多肽，本發明的方法接下來導致優選通過膜分級來分離感興趣的蛋白。因此，本申請人公司推薦分三個步驟進行該方法：-將以此方式獲得的可溶性部分通過微孔過濾進行回收和澄清，以便從中除去殘留不溶性物質，-在具有小于5kDa，優選在1kDa和5kDa之間的截止閾值的膜上對澄清的可溶性部分進行超濾，并且-在6和8之間，優選在7的pH值下，進行任選的中和。利用這些通路使可能純化其殘留的鹽和糖的可溶性肽和多肽。在pI下的沉淀可替代地，為了分離感興趣的肽和多肽，可以做出選擇來進行分三個步驟的方法：-通過調節介質的pH至4和5之間的值，在其pI下沉淀蛋白質，-離心或者微孔過濾，以便回收沉淀的蛋白，并且-在6和8之間，優選7的pH下，溶解于水中。應注意，盡管根據本發明的方法，后兩個步驟使得可能獲得具有按重量計大于80％，優選大于90％蛋白含量的分離蛋白，但是通過其實施方法，它們導致了本質上不同的組成。獲得呈粉末形式的分離物以此方式獲得的呈可溶形式的分離蛋白可以進行以下處理：-通過蒸發進行濃縮，-巴氏滅菌，并且最后-霧化。從以下實例將更清楚地理解本發明，所述實例旨在是說明性的，并且是非限制性的。實例實例1：通過分批補料發酵進行原殼小球藻的生產使用的藻種是原殼小球藻UTEX250。預培養：-在一個2l錐形瓶中的500ml的培養基；-該培養基的組成(以g/l計)：表1孵育在以下條件下進行：持續時間：72h；溫度：28℃；攪動：110rpm(伊孚森莫特頓(InforsMultitron)孵育器)。然后將預培養物轉移到30l賽多利斯(Sartorius)型發酵罐中。用于生物質生產的培養：該培養基如下：表2在接種后將發酵罐的初始體積(Vi)調節至17l。達到大約20l-25l的最終體積。用于進行發酵的參數如下：表3溫度28℃pH5.0-5.2，使用28％w/wNH3pO220％±5％(通過搖動來維持)搖動最小300rpm氣流速率15l/min當殘留葡萄糖濃度下降至低于10g/l時，則引入處于在大約800g/l的濃縮溶液形式的葡萄糖，以維持發酵罐中的葡萄糖含量在0與20g/l之間。結果在40h時獲得包含52％的蛋白的80g/l的生物質。實例2.研磨原殼小球藻生物質并且回收可溶性部分-通過處理肽和多肽部分，將乳液變構將根據實例1獲得的生物質洗滌并且通過離心濃縮，以便達到220g/l的干物質含量并且達到多于90％的純度(用生物質的干物質與總干物質的比率定義純度)。然后通過用硅酸鋯珠(0.6mm直徑，表觀密度2.4)的珠磨(臥式珠磨機)來將其研磨。然后在裝有海洋推進器和擋板的反應器中攪動研磨的生物質。溫度被調節為60℃，并且pH被氫氧化鉀調節到8。添加結合纖維素酶的堿性蛋白酶，其中這些反應條件被維持持續6h。然后在使可能獲得3個相的三相離心機上將乳液離心，這三個相是：上層脂質乳膏，水性/中間的(＝“原始”可溶性物質)可溶性化合物(和殘留不溶性物質)相，以及集中細胞碎片的球粒。通過微孔過濾來使原始可溶性物質的部分澄清。微孔過濾滲透物“P1”具有55％和70％之間的滴度的肽和蛋白(表示為總氨基酸)，并且然后在具有<5kDa截止閾值的膜上進行超濾。以此方式獲得的超濾滲余物“R2”包含80％以上具有大于或等于5kDa的分子量的肽。滲透物“P2”包含具有小于5kDa的分子量的肽和寡糖以及殘留的鹽。然后尤其可以在反滲透膜(具有93％的NaCl排斥程度)上過濾這一滲透物“P2”，以獲得：ο滲余物“R3”，包含具有小于5kDa的分子量的肽和DP2的寡糖，例如蔗糖；以及ο滲透物“R3”，包含DP1的寡糖、鹽、游離氨基酸和有機酸。然后將分離蛋白“R2”：-用氫氧化鉀中和至pH7，-通過蒸發濃縮至35％干物質(DM)，-巴氏滅菌，然后-霧化。實例3.研磨原殼小球藻生物質并且回收可溶性部分-通過處理脂質部分，將乳液變構根據如實例2中所述的相同順序，在裝有海洋推進器和擋板的反應器中攪動研磨的生物質。溫度被調節至50℃，而不調節pH(自然地在5和6之間)。添加在此pH和溫度范圍中具有最佳活性的纖維素酶，其中將這些反應條件維持6h的持續時間。在反應結束時，pH被調節至8，之后分離為3個相。操作的剩余部分如在實例2中所述。當前第1頁1 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