經修飾的抗原結合多肽構建體及其用途的制作方法

本專利申請要求提交于2014年5月28日的美國臨時申請No.62/003,663和提交于2015年4月28日的美國臨時申請No.62/154,055的優先權，這些專利申請以引用的方式整體并入本文用于所有目的。本專利申請涉及提交于2013年11月28日的PCT/CA2013/050914、提交于2012年11月28日的美國臨時申請No.61/730,906、提交于2013年2月6日的美國臨時申請No.61/761,641、提交于2013年5月2日的美國臨時申請No.61/818,874和提交于2013年8月23日的美國臨時申請No.61/869,200，這些專利申請中的每一個的全部公開內容據此以引用的方式整體并入用于所有目的。序列表本專利申請包含以ASCII格式的電子版本提交的序列表，并且據此以引用的方式整體并入。所述ASCII副本創建于2015年5月29日，命名為97993-945204(000110PC)_SL.txt，大小為27,012字節。背景雙特異性抗體能夠結合至兩個不同的表位。該表位可在相同的抗原上，或每個表位可在不同的抗原上。雙特異性抗體的該特征使其成為用于各種治療應用的引人注目的工具，其中該抗體具有在疾病治療中靶向或募集超過一個分子的治療有益效果。形成雙特異性抗體的一種方法將涉及兩條獨特的抗體重鏈和兩條獨特的抗體輕鏈的同時表達。正確形成類似于野生型的雙特異性抗體形式仍然是挑戰，因為抗體重鏈涉及以相對混雜的方式結合抗體輕鏈。作為該混雜配對的結果，兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈的同時表達自然地導致重鏈-輕鏈配對混雜。該錯配仍然是制備雙特異性治療劑的主要挑戰，其中均一配對是良好工藝和生物學效力的基本要求。多種雙特異性抗體制備方法已有所描述，其中特定的抗體輕鏈或片段與特定的抗體重鏈或片段配對。解決該問題的各種方法的評述可見于Klein等，(2012)mAbs4：6，1-11。國際專利申請No.PCT/EP2011/056388(WO2011/131746)描述了用于制備異源二聚體蛋白的體外方法，其中將不對稱突變引入兩個單特異性起始蛋白的CH3區，以便在還原條件下孵育時驅動兩個單特異性IgG4或IgG4樣抗體之間的定向“Fab臂”或“半分子”交換。Schaefer等(RocheDiagnosticsGmbH)描述了在不使用人工接頭的情況下將來源于兩種現有抗體的兩條重鏈和兩條輕鏈組裝到人二價雙特異性IgG抗體的方法(PNAS(2011)108(27)：11187-11192)。該方法涉及交換雙特異性抗體的一半的抗原結合片段(Fab)內的重鏈和輕鏈結構域。Strop等(Rinat-PfizerInc.)描述了通過單獨表達和純化兩種所關注的抗體，然后在指定的氧化還原條件下將它們混合在一起來制備穩定雙特異性抗體的方法(J.Mol.Biol.(2012)420：204-19)。Zhu等(Genentech)工程改造了雙抗體構建體(由完全缺乏恒定結構域的可變結構域抗體片段構成)的VL/VH界面中的突變，并制備了異源二聚體雙抗體(ProteinScience(1997)6：781-788)。相似地，Igawa等(Chugai)也工程改造了單鏈雙抗體的VL/VH界面中的突變以有助于雙抗體的選擇性表達和抑制雙抗體的構造異構化(ProteinEngineering，Design&Selection(2010)23：667-677)。美國專利公開No.2009/0182127(NovoNordisk，Inc.)描述了通過修飾輕鏈-重鏈對的Fc界面和CH1：CL界面處的氨基酸殘基來制備雙特異性抗體，該修飾降低了一對的輕鏈與另一對的重鏈相互作用的能力。美國專利公開No.2014/0370020(Chugai)描述了通過用帶電氨基酸置換CH1和CL區之間的界面上存在的氨基酸來調節抗體這些區之間的締合。概述本文描述了包含至少第一異源二聚體和第二異源二聚體的分離的抗原結合多肽構建體，該第一異源二聚體包含第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)；并且第二異源二聚體包含第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)，其中第一異源二聚體的H1或L1序列中的至少一個不同于第二異源二聚體的對應H2或L2序列，并且其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域)；L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL)；并且H1、H2、L1和L2中的至少一個包含至少一個恒定結構域和/或至少一個可變結構域的至少一個氨基酸修飾，其中與L2相比H1優先地與L1配對，且與L1相比H2優先地與L2配對。在一些方面，該構建體還包含異源二聚體Fc，該Fc包含至少兩個CH3序列，其中該Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯到第一異源二聚體和第二異源二聚體，其中二聚化CH3序列具有約68℃或更高的熔融溫度(Tm)(如差示掃描量熱法(DSC)所測定)，并且其中該構建體是雙特異性的。在一些方面，至少一個氨基酸修飾選自表格或實施例所示的至少一個氨基酸修飾。在一些方面，當H1、H2、L1和L2在細胞或哺乳動物細胞中共表達時，或當H1、H2、L1和L2在無細胞表達系統中共表達時，或當H1、H2、L1和L2共生成時，或當H1、H2、L1和L2經由氧化還原生成方法共生成時，與L2相比H1優先地與L1配對，且與L1相比H2優先地與L2配對。在一些方面，H1、H2、L1和L2中的至少一個包含VH和/或VL結構域的至少一個氨基酸修飾和CH1和/或CL結構域的至少一個氨基酸修飾，使得與L2相比H1優先地與L1配對，和/或與L1相比H2優先地與L2配對。在一些方面，如果H1包含CH1結構域中的至少一個氨基酸修飾，則L1和L2中的至少一個包含CL結構域中的至少一個氨基酸修飾；和/或如果H1包含VH結構域中的至少一個氨基酸修飾，則L1和L2中的至少一個包含VL結構域中的至少一個氨基酸修飾。在一些方面，H1、L1、H2和/或L2包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸突變。在一些方面，H1、H2、L1和L2中的至少一個包含至少一個恒定結構域和/或至少一個可變結構域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸修飾。在一些方面，當L1和L2二者與H1和H2中的至少一個共表達時，H1-L1和H2-L2異源二聚體對中的至少一個的相對配對與各自對應的H1-L2或H2-L1異源二聚體對之比大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且其中經修飾的H1-L1或H2-L2異源二聚體對的相對配對大于無至少一個氨基酸修飾的對應的H1-L1或H2-L2異源二聚體對中觀察到的各自相對配對。在一些方面，第一和第二異源二聚體中的至少一個的以熔融溫度(Tm)計量的熱穩定性(如DSF所測定)在無至少一個氨基酸修飾的對應的異源二聚體的Tm的約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃之內。在一些方面，每個包含至少一個氨基酸修飾的異源二聚體的以熔融溫度(Tm)計量的熱穩定性(如DSF所測定)在無至少一個氨基酸修飾的對應的異源二聚體的Tm的約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃之內。在一些實施方案中，每個包含至少一個氨基酸修飾的異源二聚體的以熔融溫度(Tm)計量的熱穩定性(如DSF所測定)在無至少一個氨基酸修飾的對應的異源二聚體的Tm的約0、1、2或3℃之內。在一些方面，每個異源二聚體對其結合的抗原的親和力在各自未經修飾的異源二聚體對相同的抗原的親和力的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍內(如表面等離振子共振(SPR)或FACS所測定)。在一些方面，H1和L1中的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L2相比當H1與L1非配對時產生更大的氨基酸空間互補。在一些方面，H2和L2的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L1相比當H2與L2配對時產生更大的氨基酸空間互補。在一些方面，H1和L1中的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L2相比當H1與L1配對時產生更大的帶電氨基酸之間的靜電互補。在一些方面，H2和L2中的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L1相比當H2與L2配對時產生更大的帶電氨基酸之間的靜電互補。在一些方面，至少一個氨基酸修飾是表格或實施例中的至少一個所示的一組突變。在一些方面，該構建體還包含Fc，該Fc包含至少兩個CH3序列，其中該Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯到第一異源二聚體和第二異源二聚體。在一些方面，該Fc是人Fc、人IgG1Fc、人IgAFc、人IgGFc、人IgDFc、人IgEFc、人IgMFc、人IgG2Fc、人IgG3Fc或人IgG4Fc。在一些方面，該Fc是異源二聚體Fc。在一些方面，該Fc包含CH3序列中的至少一個中的一個或多個修飾。在一些方面，該二聚化CH3序列具有約68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高的熔融溫度(Tm)(如DSC所測定)。在一些方面，在制備時，該Fc是以大于約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的純度形成的異源二聚體；或其中在表達時或在通過單個細胞表達時，該Fc是以大于約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的純度形成的異源二聚體。在一些方面，該Fc包含CH3序列中的至少一個中的一個或多個修飾，該修飾有助于形成穩定性相當于野生型同源二聚體Fc的異源二聚體Fc。在一些方面，該Fc還包含至少一個CH2序列。在一些方面，該Fc的CH2序列包含一個或多個修飾。在一些方面，該Fc包含有助于Fc-γ受體的選擇性結合的一個或多個修飾。在一些實施方案中，該Fc包含：i)具有第一Fc多肽中的修飾L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T366L_K392M_T394W的異源二聚體IgG1Fc；ii)具有第一Fc多肽中的修飾L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T366L_K392L_T394W的異源二聚體IgG1Fc；iii)具有第一Fc多肽中的修飾T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T350V_T366L_K392L_T394W的異源二聚體IgG1Fc；iv)具有第一Fc多肽中的修飾T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T350V_T366L_K392M_T394W的異源二聚體IgG1Fc；或v)具有第一Fc多肽中的修飾T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T350V_T366L_N390R_K392M_T394W的異源二聚體IgG1Fc。在一些方面，該Fc通過一個或多個接頭偶聯到異源二聚體，或其中該Fc通過一個或多個接頭偶聯到H1和H2。在一些方面，所述一個或多個接頭是一個或多個多肽接頭。在一些方面，所述一個或多個接頭包含一個或多個抗體鉸鏈區。在一些方面，所述一個或多個接頭包含一個或多個IgG1鉸鏈區。在一些方面，所述一個或多個接頭包含一個或多個修飾。在一些方面，所述一個或多個接頭的一個或多個修飾有助于Fc-γ受體的選擇性結合。在一些方面，至少一個氨基酸修飾為至少一個氨基酸突變，或其中至少一個氨基酸修飾是至少一個氨基酸置換。在一些方面，H1、H2、L1和L2中的每一個的序列來源于人序列。在一些方面，構建體是多特異性的或雙特異性的。在一些方面，構建體是多價的或二價的。在一些方面，本文所述的異源二聚體優先地配對形成雙特異性抗體。例如，在一些實施方案中，重鏈多肽序列H1和H2包含全長重鏈序列，該全長重鏈序列包含重鏈恒定結構域(CH1結構域)、CH2結構域和CH3結構域。在一些實施方案中，雙特異性抗體(例如，H1-L1：H2-L2)中正確配對的重鏈和輕鏈的百分比大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。本文還描述了包含編碼本文所述的構建體或重鏈或輕鏈的至少一個序列的分離的多核苷酸或分離的多核苷酸組。在一些方面，該多核苷酸或多核苷酸組是cDNA。本文還描述了包含本文所述的多核苷酸或多核苷酸組中的一個或多個的載體或載體組。在一些方面，該載體或載體組選自質粒、多順反子載體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體、表達載體和重組表達載體。本文還描述了包含本文所述的多核苷酸或多核苷酸組或本文所述的載體或載體組的分離的細胞。在一些方面，該細胞是雜交瘤、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或HEK293細胞。本文還描述了包含本文所述的構建體和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在一些方面，該組合物還包含一種或多種選自緩沖液、抗氧化劑、低分子量分子、藥物、蛋白質、氨基酸、糖類、脂質、螯合劑、穩定劑和賦形劑的物質。本文還描述了將本文所述的構建體或本文所述的藥物組合物用于治療受試者中的疾病或病癥或癌癥或血管疾病或用于藥物制造中的用途。本文還描述了治療患有疾病或病癥或癌癥或血管疾病的受試者的方法，其包括向受試者施用本文所述的構建體或本文所述的組合物。本文還描述了從宿主細胞培養物獲得本文所述的構建體的方法，該方法包括以下步驟：(a)獲得包含至少一種宿主細胞的宿主細胞培養物，該宿主細胞包含一種或多種編碼該構建體的核酸序列；以及(b)從該宿主細胞培養物回收該構建體。本文還描述了獲得本文所述的構建體的方法，其包括以下步驟：(a)獲得H1、L1、H2或L2；(b)允許與L2相比H1優先地與L1配對，且與L1相比H2優先地與L2配對；以及(c)獲得該構建體。本文還描述了制備本文所述的構建體的方法，其包括：獲得編碼至少一種構建體的多核苷酸或多核苷酸組；確定用于引入至少一種宿主細胞的多核苷酸或多核苷酸組中的每一個的最佳比率，其中該最佳比率通過評估與在H1、L1、H2或L2表達時形成的錯配的H1-L2和H2-L1異源二聚體對相比在H1、L1、H2或L2表達時形成的H1-L1和H2-L2異源二聚體對相對于的量來確定；選擇優選的最佳比率，其中用所述優選的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸組的轉染至少一種宿主細胞導致所述構建體表達；用最佳比率的多核苷酸或多核苷酸組轉染至少一種宿主細胞；以及培養至少一種宿主細胞以表達該構建體。在一些方面，最佳比率的選擇通過在瞬時轉染系統中轉染來評估。在一些方面，用優選的最佳比率的多核苷酸或多核苷酸組轉染至少一種宿主細胞導致構建體最佳表達。在一些方面，該構建體包含Fc，該Fc包含至少兩個CH3序列，其中該Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯到第一異源二聚體和第二異源二聚體。在一些方面，該Fc是異源二聚體，任選地包含一個或多個氨基酸修飾。本文還描述了存儲數據集的計算機可讀存儲介質，該數據集包含表示第一異源二聚體和第二異源二聚體中的互補突變的數據，該第一異源二聚體包含第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)；且該第二異源二聚體包含第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域)；其中L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域)，并且其中互補突變的數據集包含表示表格或實施例中列出的那些突變或那些突變的子集的數據；以及用于確定與L2相比H1優先地與L1配對和/或與L1相比H2優先地與L2配對的可能性的計算機可執行代碼。本文還描述了用于確定優先配對的計算機實施的方法，其包括：獲得數據集，該數據集包含表示第一異源二聚體和第二異源二聚體中的互補突變的數據，該第一異源二聚體包含第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)；且該第二異源二聚體包含第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域)；其中L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域)，并且其中互補突變的數據集包含表示表格或實施例中列出的那些突變或那些突變的子集的數據；以及通過計算機處理器確定與L2相比H1優先地與L1配對和/或與L1相比H2優先地與L2配對的可能性。在一些方面，該方法還包括制備本文所述的構建體。本文還描述了制備雙特異性抗原結合多肽構建體的方法，所述雙特異性構建體包含第一異源二聚體和第二異源二聚體，該第一異源二聚體包含來自第一單特異性抗原結合多肽的第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)；且第二異源二聚體包含來自第二單特異性抗原結合多肽的第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域)；其中L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域)，該方法包括：將來自本文所述的數據集的一個或多個互補突變引入第一異源二聚體和/或第二異源二聚體；以及使第一異源二聚體和第二異源二聚體在至少一種宿主細胞中共表達，以制備包含雙特異性構建體的表達產物。在一些方面，該方法還包括確定該表達產物相對于其他多肽產物中雙特異性構建體的量，以選擇優選的互補突變子集。在一些方面，該雙特異性構建體相較于其他多肽產物，以大于70％(例如，大于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的純度生成。在一些方面，該數據集是本文所述的數據集。在一些方面，該方法還包括將另外的氨基酸修飾添加至H1、H2、L1或L2中的至少一個，以提高雙特異性構建體相較于其他多肽產物的純度的步驟。在一些方面，該構建體包含Fc，該Fc包含至少兩個CH3序列，其中該Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯到第一異源二聚體和第二異源二聚體。在一些方面，該Fc是異源二聚體，任選地包含一個或多個氨基酸修飾。在一些方面，該抗原結合多肽是抗體、Fab或scFv。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含L124、K145、D146、Q179和S186處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。例如，在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自L124R、L124E、K145M、K145T、D146N、Q179E、Q179K、S186R和S186K的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含選自Q124E、S131R、S131K、V133G、Q160E、S176R、S176D、T178D、T178E和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自L124E、K145M、K145T和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自S131R、S131K、V133G和S176R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、V133G、Q160E、S176D、T178D、T178E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L124E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾S131K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和S186R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179和S186處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含Q124、V133、Q160、S176、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自L124E、L124R、L143E、L143D、K145T、K145M、D146N、Q179K、S186R和S186K的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1和/或L2包含選自Q124K、Q124E、V133G、Q160K、S176R、S176D、T178E、T178K、T178R、T178D和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自L124E、L143E、L143D、K145T和K145M或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q124K、V133G、Q160K、S176R、T178K和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、V133G、S176D、T178E、T178D和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L124E、L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾Q124K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178E。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L124E、L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾Q124K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和S186R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含Q39、L45、L124、L143、F122和H172處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、V133、N137、S174、S176和T178處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自Q39E、Q39R、L45P、F122C、L124E、L124R、L143F、H172T和H172R的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1和/或L2包含選自Q38R、Q38E、P44F、Q124C、S131T、S131E、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K、S176D、T178Y和T178D的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自Q39E、L45P、F122C、L124E、L143F、H172T和H172R或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q38R、P44F、Q124C、S131T、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K和T178Y或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自Q39R、L124R和H172R或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q38E、S131E、V133G、S176D和T178D或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾Q39E和L124E；L1包含氨基酸修飾Q38R、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾Q39R和L124R；并且L2包含氨基酸修飾Q38E、V133G和S176D。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L45P和L124E；L1包含氨基酸修飾P44F、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L124E和L143F；L1包含氨基酸修飾V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾F122C和L124E；L1包含氨基酸修飾Q124C、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R；并且L2包含氨基酸修飾V133G和S176D。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L124E和H172T；L1包含氨基酸修飾V133G、N137K、S174R和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和H172R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含L124、A125、H172和K228處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含S121、V133、N137、S174、S176和T178處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自L124E、L124R、A125S、A125R、H172R、H172T和K228D的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自S121K、V133G、N137K、S174R、S176K、S176R、S176D和T178D的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自L124E、A125S、H172R和K228D或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自S121K、V133G和S176R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124R、A125R和H172T或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自V133G、N137K、S174R、S176D和T178D或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L124E和K228D；L1包含氨基酸修飾S121K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和A125R；并且L2包含氨基酸修飾V133G和S176D。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L124E和H172R；L1包含氨基酸修飾V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和H172T；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S174R和S176D。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含L124、A139和V190處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含F116、V133、L135和S176處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自L124E、L124R、A139W、A139G和V190A的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1和/或L2包含選自F116A、V133G、L135V、L135W、S176R和S176D的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自L124E和A139W或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自F116A、V133G、L135V和S176R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124R、A139G和V190A或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自V133G、L135W和S176D或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L124E和A139W；L1包含氨基酸修飾F116A、V133G、L135V和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R、A139G和V190A；并且L2包含氨基酸修飾V133G、L135W和S176D。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含Q39、L45、K145、H172、Q179和S186處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、Q160、T180和C214處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自Q39E、Q39R、L45P、K145T、H172R、Q179E和S186R的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1和/或L2包含選自Q38R、Q38E、P44F、Q124E、S131K、Q160E、T180E和C214S的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自Q39E、L45P、K145T、H172R和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q38R、P44F和S131K或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自Q39R、H172R和S186R或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q38E、Q124E、Q160E、T180E和C214S或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾Q39E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q38R和S131K；H2包含氨基酸修飾Q39R和S186R；并且L2包含氨基酸修飾Q38E、Q124E、Q160E和T180E。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L45P、K145T、H172R和Q179E；L1包含氨基酸修飾P44F和S131K；H2包含氨基酸修飾H172R和S186R；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、Q160E和T180E。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和V190處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含F116、Q124、L135、Q160、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自A139W、A139G、L143E、K145T、Q179E、Q179K和V190A的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1和/或L2包含選自F116A、Q124R、Q124E、L135V、L135W、Q160E、T178R和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自A139W、L143E、K145T和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自F116A、Q124R、L135V和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自A139G、Q179K和V190A或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、L135W、Q160E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾A139W、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾F116A、Q124R、L135V和T178R；H2包含氨基酸修飾Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、L135W、Q160E和T180E。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含Q39、L143、K145、D146、H172和Q179處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含Q38、Q124、Q160、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自Q39E、Q39R、L143E、K145T、D146G、H172R、Q179E和Q179K的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1和/或L2包含選自Q38R、Q38E、Q124R、Q124E、Q160K、Q160E、T178R和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自Q39E、L143E、K145T、H172R和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q38R、Q124R、Q160K和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自Q39R、H172R和Q179K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q38E、Q124E、D146G、Q160E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾Q39E、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q38R、Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修飾Q39R、H172R和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q38E、Q124E、Q160E和T180E。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含L45、L143、K145、D146、H172和Q179處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、N137、Q160、S174、T178、T180和C214處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自L45P、L143E、K145T、D146G、H172R、H172T、Q179E和Q179K的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自Q38E、P44F、Q124R、Q124E、N137K、Q160K、Q160E、S174R、T178R、T180E和C214S的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自L45P、L143E、K145T、H172R和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自P44F、Q124R、Q160K和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自D146G、H172R、H172T和Q179K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q38E、Q124E、N137K、Q160E、S174R、T180E和C214S或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L45P、L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾P44F、Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修飾D146G和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q38E、Q124E、Q160E和T180E。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L143E、K145T和H172R；L1包含氨基酸修飾Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修飾H172T和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、Q160E、N137K、S174R和T180E。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含L124、L143、K145和Q179處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含Q124、S131、V133、S176、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自L124W、L124A、L143E、L143F、K145T、Q179E和Q179K的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1和/或L2包含選自Q124R、Q124K、Q124E、S131K、V133A、V133W、S176T、T178R、T178L、T178E和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自L124W、L143E、K145T和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q124R、Q124K、S131K、V133A、S176T、T178R和T178L或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124A、L143F和Q179K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、V133W、S176T、T178L、T178E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L124W、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q124R、V133A、S176T和T178R；H2包含氨基酸修飾L124A、L143F和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、V133W、S176T、T178L和T180E。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和S186處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含F116、Q124、V133、Q160、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自A139C、L143E、L143D、L143R、L143K、K145T、Q179E、Q179D、Q179R、Q179K、S186K、S186R的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1和/或L2包含選自F116C、Q124R、Q124K、Q124E、V133E、V133D、Q160K、Q160E、T178R、T178K、T178E和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自A139C、L143E、L143D、K145T、Q179E和Q179D或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自F116C、Q124R、Q124K、Q160K、T178R和T178K或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L143R、L143K、Q179R、Q179K、S186K和S186R或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、V133E、V133D、Q160E、T178E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾A139C、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾F116C、Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、Q160E和T180E。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾S186K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、Q160E和T178E。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾L143R；并且L2包含氨基酸修飾Q124E和V133E。在該構建體的一些實施方案中，H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179、S186和S188處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2包含選自L124A、L143A、L143R、L143E、L143K、K145T、D146G、Q179R、Q179E、Q179K、S186R、S186K和S188L的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1和/或L2包含選自Q124R、Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160K、Q160M、S176L、T178R、T178E、T178F、T178Y和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自L143E、K145T、Q179E和S188L或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q124R、Q160K和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124A、L143A、L143R、L143K、D146G、Q179R、Q179K、S186R和S186K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160M、S176L、T178E、T178F、T178Y和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L143E、K145T、Q179E和S188L；L1包含氨基酸修飾Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾S186K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、S176L和T180E。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L143E、K145T、Q179E和S188L；L1包含氨基酸修飾Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾S186K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、S131T、T178Y和T180E。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修飾S186K；并且L2包含氨基酸修飾S131E。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾Q124R；H2包含氨基酸修飾L143R；并且L2包含氨基酸修飾Q124E和V133E。在該構建體的一些實施方案中，H1包含F122和C233處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且L1包含Q124和C214處的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自F122C和C233S的至少一個或一組氨基酸修飾；并且L1包含選自Q124C和C214S的至少一個或一組氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1包含選自F122C和C233S或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q124C和C214S或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含野生型或未經修飾的氨基酸序列；并且L2包含野生型或未經修飾的氨基酸序列。在一些實施方案中，H1包含氨基酸修飾F122C和C233S；L1包含氨基酸修飾Q124C和C214S；H2包含野生型或未經修飾的氨基酸序列；并且L2包含野生型或未經修飾的氨基酸序列。在一些實施方案中，該構建體包含選自本文的表格的SMCA設計9561-9095_1、9561-9095_2、9121-9373_1、9121-9373_2、9116-9349_1、9116-9349_2、9134-9521_1、9134-9521_2、9286-9402_1、9286-9402_2、9667-9830_1、9667-9830_2、9696-9848_1、9696-9848_2、9060-9756_1、9060-9756_2、9682-9740_1、9682-9740_2、9049-9759_1、9049-9759_2、9820-9823_1和9820-9823_2的氨基酸修飾。在一些實施方案中，該構建體包含選自本文的表格的SMCA設計9327-6054_1、9815-9825_1、9815-9825_2、9587-9735_1、9587-9735_2、3522_1、3522_2、3519_1和3519_2的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1和/或H2不包含位置Q179處的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1不包含氨基酸修飾Q179E和/或H2不包含氨基酸修飾Q179K。在一些實施方案中，L1不包含位置S131處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L1不包含氨基酸修飾S131K。在一些實施方案中，L2不包含位置T180處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L2不包含氨基酸修飾T180E。在一些實施方案中，該構建體不包含這樣的氨基酸修飾組合，其中H1包含Q179E，L1包含S131K，H2包含Q179K，并且L2包含T180E。在一些實施方案中，H1不包含位置Q39和/或Q179處的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1不包含氨基酸修飾Q39E和/或Q179E。在一些實施方案中，L1不包含位置Q160處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L1不包含氨基酸修飾Q160K。在一些實施方案中，H2不包含位置Q179處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，H2不包含氨基酸修飾Q179K。在一些實施方案中，L2不包含位置Q38、Q160和/或T180處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L2不包含氨基酸修飾Q38E、Q160E和/或T180E。在一些實施方案中，該構建體不包含這樣的氨基酸修飾組合，其中H1包含Q39E和/或Q179E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含Q38E、Q160E和/或T180E。例如，在一些實施方案中，該構建體不包含這樣的氨基酸修飾組合，其中：(i)H1包含Q179E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含Q160E和T180E；(ii)H1包含Q39E和Q179E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含Q38E、Q160E和T180E；或(iii)H1包含Q39E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含Q38E、Q160E和T180E。在一些實施方案中，H1不包含位置Q179處的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1不包含氨基酸修飾Q179K或Q179E。在一些實施方案中，L1不包含位置Q160和/或T180處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L1不包含氨基酸修飾Q160E、Q160K和/或T180E。在一些實施方案中，H2不包含位置Q179處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，H2不包含氨基酸修飾Q179K或Q179E。在一些實施方案中，L2不包含位置Q160和/或T180處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L2不包含氨基酸修飾Q160K、Q160E和/或T180E。在一些實施方案中，該構建體不包含這樣的氨基酸修飾組合，其中H1包含Q179K或Q179E，L1包含Q160E、Q160K和/或T180E，H2包含Q179K或Q179E，并且L2包含Q160K、Q160E和/或T180E。在一些實施方案中，H1和/或H2不包含位置Q179處的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1不包含氨基酸修飾Q179K和/或H2不包含氨基酸修飾Q179E。在一些實施方案中，L1不包含位置T180處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L1不包含氨基酸修飾T180E。在一些實施方案中，L2不包含位置S131處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L2不包含氨基酸修飾S131K。在一些實施方案中，該構建體不包含這樣的氨基酸修飾組合，其中H1包含Q179K，L1包含T180E，H2包含Q179E，并且L2包含S131K。在一些實施方案中，H1不包含位置Q179處的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1不包含氨基酸修飾Q179E。在一些實施方案中，L1不包含位置Q160處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L1不包含氨基酸修飾Q160K。在一些實施方案中，H2不包含位置Q179處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，H2不包含氨基酸修飾Q179K。在一些實施方案中，L2不包含位置T180處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L2不包含氨基酸修飾T180E。在一些實施方案中，該構建體不包含這樣的氨基酸修飾組合，其中H1包含Q179E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含T180E。在一些實施方案中，H1不包含位置A139處的氨基酸修飾。在一些實施方案中，H1不包含氨基酸修飾A139C。在一些實施方案中，L1不包含位置F116處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，L1不包含氨基酸修飾F116C。在一些實施方案中，該構建體不包含這樣的氨基酸修飾組合，其中H1包含A139C，并且L1包含F116C。在一些實施方案中，該構建體不包含重鏈和輕鏈之間的天然二硫鍵。例如，在一些實施方案中，L1和/或L2的位置214處的半胱氨酸被修飾為另一個氨基酸。在一些實施方案中，L1和/或L2包含氨基酸修飾C214S。在一些實施方案中，H1和/或H2的位置233處的半胱氨酸被修飾為另一個氨基酸。在一個實施方案中，H1和/或H2包含氨基酸修飾C233S。本文所述的實施方案適用于Fab形式和全抗體形式的構建體。附圖簡述圖1示出了D3H44重鏈和輕鏈氨基酸序列與典型人生殖系序列的可變區、恒定區和J區片段比對(圖中注釋：*序列同一性)。圖1A示出了人VH生殖系亞群(每個家族顯示一個代表性序列)。序列同一性基于D3H44與VH3和IGHJ3*02的比對。圖1B示出了人κVL生殖系亞群(每個家族顯示一個代表性序列)。序列同一性基于D3H44與VKI和IGKJ1*01的比對。圖1C示出了人λVL生殖系亞群(每個家族顯示一個代表性序列)。序列同一性基于D3H44與VL1和IGLJ1*01的比對。圖1D示出了人CH1等位基因序列。圖1E示出了人κ和λ等位基因序列。圖2示出了用于鑒定關鍵界面殘基和用于利用優先的重鏈-輕鏈配對進行設計的計算建模的流程圖。圖3示出了H1、L1、H2、L2鏈的示例性組，它們設計為使得與L2相比H1優先地與L1配對，且與L1相比H2優先地與L2配對。提供了可變區重鏈和輕鏈界面的3D晶體結構的動畫表示。引入界面的突變實現了優先地分別形成專性對H1-L1和H2-L2的靜電和空間互補。另一方面，不正確的配對中存在不利的空間和靜電錯配，這將導致錯配對的配對傾向減小以及穩定性降低。圖4示出了形成雙特異性Mab(單克隆抗體)的工程改造要求和重鏈-輕鏈對定量所需的分析要求的高水平示意性概覽圖。高純度(即，H-L締合很少錯配或無錯配)工程改造雙特異性Mab的設計要求可通過合理地工程改造(通過引入特定的氨基酸突變)兩條獨特的重鏈與其獨特的同源輕鏈的優先配對實現。該過程已示意性地示出；此處H1被工程改造為優先地與L1而非L2配對。同樣，H2被工程改造為優先地與L2而非L1配對。雙特異性Mab設計的實驗篩選要求分析能夠同時定量H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1。這些分析要求可通過每個雙特異性Fab臂可獨立地工程改造的假設簡化。在這種情況下，該分析只需定量H1-L1∶H1-L2或H2-L2∶H2-L1即可，無需同時對二者進行定量。圖5提供了如何測定重鏈和輕鏈的標簽和優先配對的示意圖。在該示意圖中，圓圈表示其中轉染了3個構建體的細胞。表達產物從細胞分泌，使上清液(SPNT)流過檢測設備(在這種情況下SPR芯片)。根據融合至競爭重鏈配對的兩條輕鏈的兩個不同標簽的檢測水平，可進行重鏈與兩條輕鏈的優先配對的定量估計。圖6示出了箱線圖，其示出每個簇的配對：錯配的Fab異源二聚體的平均LCCA性能值為至少86∶14。圖7示出了A)WTFab異源二聚體以及B)代表性設計的Fab異源二聚體的代表性UPLC-SEC圖譜(LCCA設計9735、9737和9740的H1L1Fab部件)。圖8示出了兩條不同的輕鏈與兩條不同的重鏈在細胞中共表達時，預期的可能重鏈締合產物。優先配對使用SMCA(單克隆抗體競爭分析)評估。圖9示出了a)D3H44/曲妥單抗、b)D3H44/西妥昔單抗(cetuximab)和c)曲妥單抗/西妥昔單抗雙特異性系統中的偏愛性/鏈利用偏好性。不同種類的鏈利用評估通過LC-MS觀察。x-軸表示H1∶H2∶L1∶L2DNA比率，Y-軸示出了不同轉染實驗中每條鏈的對應百分比。在平衡系統中，所有H和L鏈具有25％。在所有雙特異性系統中觀察一條輕鏈利用的偏愛性。圖10示出了WT異源二聚體以及工程改造的異源二聚體抗體的代表性UPLC-SEC圖譜。圖10a和10b分別涉及D3H44/曲妥單抗WT和9060-9756_1。圖10c和10d分別涉及D3H44/西妥昔單抗WT和9820-9823_1。圖10e和10f分別涉及曲妥單抗/西妥昔單抗WT和9696-9848_1。圖11示出了正確配對的Fab部件與所有利用相同的重鏈、錯配的Fab部件的變化百分比(H1∶L1與所有H1種類相對于野生型競爭D3H44/曲妥單抗和D3H44/西妥昔單抗；H2∶L2與所有H2種類相對于野生型的變化競爭曲妥單抗/西妥昔單抗)以及所需的雙特異性抗體相對于野生型競爭每個簇的工程改造雙特異性抗體樣品的變化百分比的箱線圖。示出了每個系統的正確配對的Fab部件與所有利用相同的重鏈與簇、錯配的Fab部件的變化百分比，其中a)D3H44/曲妥單抗、c)D3H44/西妥昔單抗和e)曲妥單抗/西妥昔單抗。示出了每個系統的所需的雙特異性抗體相對于野生型與簇的變化百分比，其中b)D3H44/曲妥單抗、d)D3H44/西妥昔單抗和f)曲妥單抗/西妥昔單抗。在所有雙特異性系統中，正確配對的Fab部件與所有利用相同的重鏈與簇、錯配的Fab部件的變化百分比示于圖11g中，所需的雙特異性抗體相對于野生型與簇的變化百分比示于圖11h中。注意到，所報告的值還包括工程改造的雙特異性抗體樣品的預計變化，其中對應的野生型構建體不通過SMCA評估。圖12示出了使用本文提供的專性突變對文庫制備雙特異性抗體的方法。詳述本文提供了抗原結合多肽構建體(也稱為異源二聚體對)，該構建體可包含第一異源二聚體和第二異源二聚體，其中每個異源二聚體包含免疫球蛋白重鏈或其片段和免疫球蛋白輕鏈。兩個異源二聚體可包含免疫球蛋白重鏈恒定結構域1(CH1)中的一個或多個氨基酸修飾和免疫球蛋白輕鏈恒定結構域(CL)中的一個或多個氨基酸修飾；免疫球蛋白重鏈可變結構域(VH)中的一個或多個氨基酸修飾和免疫球蛋白輕鏈可變結構域(VL)中的一個或多個氨基酸修飾；或前述氨基酸修飾與重鏈和輕鏈的恒定和可變結構域二者的組合。經修飾的氨基酸通常是輕鏈和重鏈之間的界面的一部分，并且經修飾以生成每個重鏈和所需的輕鏈之間的優先配對，使得第一異源二聚體的重鏈優先地與一條輕鏈而非另一條輕鏈配對。同樣，第二異源二聚體的重鏈可優先地與第二輕鏈而非第一輕鏈配對。如上文所述，本文所述的氨基酸修飾的特定組合有助于重鏈與特定的輕鏈的優先配對，從而使雙特異性單克隆抗體(Mab)以可忽略或有限的錯配表達，并且使從不需要的或錯配的產物純化所需的異源二聚體的需要最小化。異源二聚體可表現出相當于不包括氨基酸修飾的異源二聚體的熱穩定性，也可顯示出相當于不包括氨基酸修飾的異源二聚體的抗原結合親和力。第一和第二異源二聚體的設計可用于生成靶向兩個不同的治療靶標或靶向相同抗原中的兩個不同表位(重疊或非重疊)的雙特異性抗體。本文還提供了異源二聚體對的制備方法。定義除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語具有與要求保護的主題所屬領域的技術人員通常所理解的相同含義。如果本文的術語有多個定義，則以本部分為準。當引用URL或其他此類標識符或地址時，應當理解此類標識符可改變，互聯網上的具體信息是不斷變化的，但等同的信息可通過搜索互聯網獲得。此類信息引用證實了其可用性和公開傳播。應當理解，上述一般描述和以下具體實施方式僅僅是示例性和解釋性的，并且不限于要求保護的任何主題。在本專利申請中，除非另外特別指明，單數的使用也包括復數。在本發明的具體實施方式中，任何濃度范圍、百分比范圍、比率范圍或整數范圍應理解為包括所列范圍內的任何整數值，以及(如適用)它們的分數(例如整數的十分之一和百分之一)，除非另外指明。如本文所用，“約”意指指示范圍、值、序列或結構的±10％，除非另外指明。應當理解，如本文所用，術語“一個”和“一種”是指所列組分中的“一個或多個”，除非上下文另外指明或要求。替代詞(例如，“或”)的使用應理解為意指替代形式的一者、兩者或它們的任何組合。如本文所用，術語“包括”和“包含”可作為同義詞使用。此外，應當理解，本專利申請公開了來源于本文所述的結構和取代基的各種組合單個單鏈多肽或免疫球蛋白構建體，以達到似乎每個單鏈多肽或異源二聚體單獨示出的程度。因此，形成單個單鏈多肽或異源二聚體的具體組分的選擇在本公開的范圍內本文所用的小標題僅用于組織目的，并且不應理解為限制所述的主題。本專利申請引用的所有文檔或文檔的部分，包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍、手冊和論述據此明確地全文以引用方式并入用于任何目的。應當理解，本文所述的方法和組合物不限于本文所述的具體方法、方案、細胞系、構建體和試劑，因此可以是變化的。還應當理解，本文所用的術語僅用于描述具體實施方式的目的，并且不旨在限制本文所述的方法和組合物的范圍，該范圍僅通過所附權利要求進行限制。本文提及的所有公開和專利全文以引用方式并入本文用于描述和公開目的，例如公開中描述的構建體和方法可結合本文所述的方法、組合物和化合物使用。本文討論的公開單獨提供，以在本專利申請的提交日期之前進行公開。本文不應理解為根據前述發明或出于任何其他原因，允許本文所述的發明人提前了解此類公開內容。在本專利申請中，氨基酸名稱和原子名稱(例如N、O、C等)的使用如ProteinDataBank(PDB)(www.pdb.org)所定義，這些名稱基于IUPAC命名法(IUPACNomenclatureandSymbolismforAminoAcidsandPeptides(氨基酸和肽的IUPAC命名法和符號(殘基名稱、原子名稱等))，Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)及其修正版Eur.J.Biochem.，152，1(1985))。術語“氨基酸殘基”主要旨在表示由20種天然存在的氨基酸，即丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或I)、賴氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、纈氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)殘基組成的組中包含的氨基酸殘基。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。即涉及多肽的描述同樣適用于肽的描述和蛋白質的描述，反之亦然。該術語適用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一個或多個氨基酸殘基是非天然編碼的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，該術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，包括其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接的全長蛋白質。術語“核苷酸序列”或“核酸序列”旨在表示兩個或更多個核苷酸分子的連續片段。核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成或合成來源的或它們的任何組合。“細胞”、“宿主細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”在本文中可互換使用，并且所有此類術語應理解為包括細胞生長或培養產生的子代。“轉化”和“轉染”可互換使用，是指將核酸序列引入細胞的過程。術語“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以類似于天然存在的氨基酸的方式發揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然編碼的氨基酸是20種常見的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)以及吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學結構的化合物，即碳結合至氫、羧基基團、氨基基團和R基，諸如、高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。此類類似物具有經修飾的R基(諸如，正亮氨酸)或經修飾的肽主鏈，但保持與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸的引用包括例如天然存在的蛋白質性L-氨基酸；經化學修飾的氨基酸D-氨基酸，諸如氨基酸變體和衍生物；天然存在的非蛋白質性氨基酸，諸如丙氨酸、鳥氨酸等；以及具有本領域已知是氨基酸特征的性質的化學合成的化合物。非天然存在的氨基酸的實例包括但不限于-甲基氨基酸(例如甲基丙氨酸)、D-氨基酸、組氨酸樣氨基酸(例如，2-氨基-組氨酸、羥基-組氨酸、高組氨酸)、側鏈中具有另外的亞甲基的氨基酸(“高”氨基酸)以及其中側鏈中的羧酸官能團被磺酸基團(例如，磺基丙氨酸)取代的氨基酸。將非天然的氨基酸(包括合成的非天然氨基酸、置換的氨基酸或一種或多種D-氨基酸)以多種不同方式摻入本發明的蛋白質可為有利的。含D-氨基酸肽等表現出比含L-氨基酸肽的對應物體外或體內穩定性增加。因此，當期望或需要更大的細胞內穩定性時，摻入D-氨基酸的肽等的構建可為特別有用的。更具體地講，D-肽等是耐內源性肽酶和蛋白酶的，從而當期望此類性質時，提供了改善的分子生物利用率并延長了體內壽命。另外，對于II類主要組織相容性復合物限制的呈現至輔助T細胞，D-肽等不能有效加工，因此，在整個生物體中不可能引起體液免疫應答。氨基酸在本文中通過IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的熟知的三字母符號或通過一字母符號表示。同樣，核苷酸可通過廣泛接受的單字母密碼表示。“經保守修飾的變體”適用于氨基酸和核酸序列二者。就特定的核酸序列而言，“經保守修飾的變體”是指這樣的核酸：其編碼相同的或基本上相同的氨基酸序列，或其中該核酸不編碼氨基酸序列，基本上相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，許多功能相同的核酸編碼任何指定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼丙氨酸氨基酸。因此，在其中密碼子指定的丙氨酸的每個位置，可將密碼子改為任何對應的所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。此類核酸變型是“沉默變型”，是經保守修飾的變型的一個種類。本文編碼多肽的每個核酸序列還描述了核酸的每個可能的沉默變型。本領域的普通技術人員將認識到，核酸中的每個密碼子(除AUG和TGG外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)均可修飾得到功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每個沉默變型暗含在每個所述序列中。就氨基酸序列而言，本領域的普通技術人員將認識到，核酸、肽、多肽或蛋白質序列的單個置換、缺失或增加(其改變、增加或刪除編碼序列中的單個氨基酸或少量氨基酸)是“經保守修飾的變體”，其中該變化導致氨基酸的缺失、氨基酸的增加或將氨基酸置換為化學上類似的氨基酸。保守置換表提供了功能上類似的氨基酸，該表是本領域的普通技術人員已知的。此類經保守修飾的變體還包括且不排除本發明的多態性變體、種類間同系物和等位基因。保守置換表提供了功能上類似的氨基酸，該表是本領域的普通技術人員已知的。以下八個組中的每個均包含作為彼此的保守置換的氨基酸：丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；精氨酸(R)、賴氨酸(K)；異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；以及半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如，Creighton，Proteins：StructuresandMolecularProperties(WHFreeman&Co.；第2版(1993年12月)。在兩個或多個核酸或多肽序列的語境中，術語“相同的”或百分比“同一性”是指相同的兩個或更多個序列或子序列。當在比較窗口或指定的區上進行最大對應的比較和對齊時，如果序列的氨基酸殘基或核苷酸的百分比相同，則該序列是“基本上相同的”(即，與指定的區具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，如使用以下序列比較算法中的一者(或本領域的普通技術人員可用的其他算法)或通過手動對齊和目視檢查所測定。該定義也涉及測試序列的互補序列。同一性可存在于長度為至少約50個氨基酸或核苷酸的區，或長度為75-100個氨基酸或核苷酸的區，或在不指定的情況下，在整個多核苷酸或多肽序列上。編碼本發明的多肽(包括來自除人之外的物種的同系物)的多核苷酸可通過包括以下步驟的方法獲得：在嚴格雜交條件下使用具有本發明的多核苷酸序列或其片段的標記探針篩選文庫，以及分離全長cDNA和包含所述多核苷酸序列的基因組克隆。此類雜交技術是技術人員熟知的。如果多肽的衍生物或變體的氨基酸序列與初始肽的100個氨基酸序列具有至少50％同一性，則該衍生物或變體被認為與肽共有“同源性”或與肽是“同源的”。在某些實施方案中，該衍生物或變體與氨基酸殘基的數量與衍生物相同的肽或肽的片段至少75％相同。在某些實施方案中，該衍生物或變體與氨基酸殘基的數量與衍生物相同的肽或肽的片段至少85％相同。在某些實施方案中，該衍生物的氨基酸序列與氨基酸殘基的數量與衍生物相同的肽或肽的片段至少90％相同。在一些實施方案中，該衍生物的氨基酸序列與氨基酸殘基的數量與衍生物相同的肽或肽的片段至少95％相同。在某些實施方案中，該衍生物或變體與氨基酸殘基的數量與衍生物相同的肽或肽的片段至少99％相同。如本文所用，“分離的”多肽或構建體意指從其天然細胞培養環境的組分鑒定和分離和/或回收的構建體或多肽。其天然環境的污染組分是通常妨礙異源多聚體的診斷或治療用途的物質，并且可包括酶、激素和其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在某些實施方案中，如本文所用，本文所述的“分離的”抗原結合多肽構建體包括異源二聚體對或“分離的”異源二聚體對，包括從其天然細胞培養環境的組分鑒定和分離和/或回收的異源二聚體或異源二聚體對。其天然環境的污染組分是妨礙異源二聚體或抗原結合多肽構建體的診斷或治療用途的物質，并且可包括酶、激素和其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。異源二聚體和抗原結合多肽構建體和異源二聚體對通常純化至基本上均一。短語“基本上均一的”、“基本上均一的形式”和“基本上均一”用于表示基本上不含來源于不期望的多肽組合(例如同源二聚體)的副產物的產物。在該語境中，所關注的種類是包含H1和L1(H1-L1)或H2和L2(H2-L2)的異源二聚體。污染物包括包含H1和L2(H1-L2)或H2和L1(H2-L1)的異源二聚體或包含H1和L1或H2和L2(無論Fab部分是正確配對的還是錯配的)。就純度而言，基本上均一意指副產物的量不超過10％，例如混合物中存在的所有種類的總LC-MS強度小于5％、小于1％或小于0.5％，其中該百分比反映了質譜分析的結果。短語“選擇性(或特異性)雜交至”是指當該序列存在于復合混合物(包括但不限于總細胞或文庫DNA或RNA)中時，在嚴格雜交條件下分子僅與特定的核苷酸序列結合、成對或雜交。抗體
技術領域：
：的技術人員理解的術語，每個均具有本領域賦予的含義，除非在本文中明確地具有不同的定義。已知抗體具有可變區、鉸鏈區和恒定結構域。免疫球蛋白結構和功能在例如Harlow等編，Antibodies：ALaboratoryManual，第14章(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，1988)中有所評述。如本文所用，術語“抗體”和“免疫球蛋白”或“抗原結合多肽構建體”可互換使用。“抗原結合多肽構建體”是指基本上由一個或多個免疫球蛋白基因，或它們的一個或多個片段編碼的多肽，該多肽特異性地結合分析物(抗原)。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區基因，以及無數的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被歸類為κ或λ。重鏈被歸類為γ、μ、α、δ或ε，繼而分別定義免疫球蛋白同種型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。另外，抗體可屬于多個亞型之一，例如，IgG可屬于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類。示例性免疫球蛋白(抗體)結構單元由兩對多肽鏈構成，每對具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。術語“輕鏈”包括具有足夠的可變區序列以賦予結合特異性的全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區結構域VL和恒定區結構域CL。輕鏈的可變區結構域位于多肽的氨基末端。輕鏈包括κ鏈和λ鏈。術語“重鏈”包括具有足夠的可變區序列以賦予結合特異性的全長重鏈及其片段。全長重鏈包括可變區結構域VH和三個恒定區結構域CH1、CH2和CH3。VH結構域位于多肽的氨基末端，CH結構域位于羧基末端，其中CH3最靠近多肽的羧基末端。重鏈可屬于任何同種型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞類)、IgA(包括IgA1和IgA2亞類)、IgM和IgE。術語“可變區”或“可變結構域”是指抗體的一部分輕鏈和/或重鏈，通常負責抗原識別，通常包括大約重鏈(VH)中的氨基末端120至130個氨基酸和輕鏈(VL)中的約100至110個氨基末端氨基酸。“互補決定區”或“CDR”是有助于抗原結合特異性和親和力的氨基酸序列。“框架”區(FR)可有助于維持CDR的適當構象，以促進抗原結合區和抗原之間的結合。在結構上，框架區可位于CDR之間的抗體。可變區通常表現出相同的相對保守框架區(FR)的通式結構，該框架區通過三個高變區CDR連接。每對的兩條鏈的CDR通常通過框架區對齊，該框架區可允許與特定表位結合。從N-末端至C-末端，輕鏈和重鏈可變區二者通常包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4結構域。每個結構域的氨基酸分配通常根據KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1987and1991))的定義進行，除非另外指明。在某些實施方案中，抗原結合多肽構建體包含連接至治療多肽的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的至少一個免疫球蛋白結構域。在一些實施方案中，本文提供的抗原結合多肽構建體中包括的免疫球蛋白結構域來自基于免疫球蛋白的構建體，諸如雙抗體或單體。在某些實施方案中，本文所述的抗原結合多肽構建體包含來自重鏈抗體諸如羊駝抗體的至少一個免疫球蛋白結構域。在某些實施方案中，本文提供的抗原結合多肽構建體包含來自哺乳動物抗體諸如牛抗體、人抗體、羊駝抗體(單結構域和非單結構域)、嚙齒類抗體、人源化抗體、非人源化抗體、小鼠抗體或任何嵌合抗體的至少一個免疫球蛋白結構域。在某些實施方案中，本文提供的抗原結合多肽構建體包含來自合成文庫生成的抗體的至少一個免疫球蛋白結構域。“雙特異性”、“雙重特異性”或“雙功能”抗原結合蛋白或抗體是具有兩個不同的抗原結合位點的雜交抗原結合蛋白。雙特異性抗原結合蛋白和抗體是一種多特異性抗原結合蛋白抗體種類。雙特異性抗原結合蛋白或抗體的兩個結合位點將結合兩個不同的表位，該表位可存在于相同或不同的分子靶標。“多特異性抗原結合蛋白”或“多特異性抗體”是靶向超過一個抗原或表位的抗體。“二價抗原結合蛋白”或“二價抗體”包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同的抗原特異性。二價抗原結合蛋白和二價抗體可以是雙特異性的，參見下文。在某些實施方案中，除“多特異性”或“多功能”抗體之外的二價抗體通常被理解為每個結合位點是相同的。術語“優先配對”在本文中用于描述第一多肽與第二多肽的配對方式，例如抗原結合多肽構建體和本文所述的異源二聚體對中的免疫球蛋白重鏈與免疫球蛋白輕鏈。因此，“優先配對”是指在第一和第二多肽之間發生配對的同時存在一種或多種另外的不同多肽時，第一多肽與第二多肽的優選配對。通常優先配對的發生是第一和第二多肽中的一者或二者的修飾(例如，氨基酸修飾)的結果。通常，優先配對產生第一和第二多肽配對，是配對發生后存在的最豐富的二聚體。本領域已知，如果免疫球蛋白重鏈(H1)與兩條不同的免疫球蛋白輕鏈(L1和L2)共表達，將在統計學上等幾率地與兩條輕鏈配對，產生H1與L1配對和H1與L2配對的大約50∶50混合物。在該語境中，當H1與L1和L2二者共表達時，如果H1-L1重鏈-輕鏈異源二聚體的量大于H1-L2異源二聚體的量，“優先配對”將發生在例如H1和L1之間。因此，在這種情況下，與L2相比H1優先地與L1配對。然而，在從兩個起始抗體系統生成野生型雙特異性抗體的語境中，本領域還已知，在一些情況下，當一個抗體系統的輕鏈優先地與兩個抗體系統的重鏈配對時，存在固有偏愛性。因此，當在雙特異性抗原結合構建體的語境中確定設計強度時，與野生型系統中的配對程度相比，評估該設計的配對程度可為必要的。因此，在一個實施方案中，如果所需的雙特異性抗體的量大于在野生型系統中獲得的所需的雙特異性抗體的量，則設計被認為顯示出優先配對。在另一個實施方案中，如果在抗體的較弱臂中，配對的量大于野生型系統中存在的量，則設計被認為顯示出優先配對。抗體重鏈與抗體輕鏈配對，并且在一個或多個“界面”彼此會合或接觸。“界面”包括第一多肽的一個或多個“接觸”氨基酸殘基，所述殘基與第二多肽的一個或多個“接觸”氨基酸殘基相互作用。例如，界面存在于二聚化CH3結構域的CH3多肽序列之間、重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間以及重鏈的VH結構域和輕鏈的VL結構域之間。“界面”可來源于IgG抗體，例如來源于人IgG1抗體。如本文所用，術語“氨基酸修飾”包括但不限于氨基酸突變、插入、缺失、置換、化學修飾、物理修飾和重排。抗原結合多肽構建體和異源二聚體對本文所述的抗原結合多肽構建體可包含第一異源二聚體和第二異源二聚體；每個異源二聚體通過免疫球蛋白重鏈與免疫球蛋白輕鏈的配對獲得。免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定和可變結構域的結構和組織是本領域熟知的。免疫球蛋白重鏈通常包含一個可變(VH)結構域和三個恒定結構域CH1、CH2和CH3。免疫球蛋白輕鏈通常包含一個可變(VL)結構域和一個恒定(CL)結構域。可對這些典型的形式作出各種修飾。本文所述的抗原結合多肽構建體和異源二聚體對可包含第一異源二聚體和第二異源二聚體，每個異源二聚體包含具有至少VH和CH1結構域的免疫球蛋白/抗體重鏈或其片段，以及具有VL結構域和CL結構域的免疫球蛋白/抗體輕鏈。在一個實施方案中，異源二聚體對和抗原結合多肽構建體的兩個異源二聚體包含全長免疫球蛋白重鏈。在另一個實施方案中，異源二聚體對或抗原結合多肽構建體的兩個異源二聚體包含免疫球蛋白重鏈(包括至少VH和CH1結構域)的片段。在一個實施方案中，異源二聚體對的兩個異源二聚體包含免疫球蛋白重鏈(包含至少VH和CH1結構域)的氨基末端片段。在另一個實施方案中，異源二聚體對的兩個異源二聚體包含免疫球蛋白重鏈(包含至少VH和CH1結構域)的羧基末端片段。異源二聚體對的每個異源二聚體可特異性結合至抗原或表位。在一個實施方案中，每個異源二聚體的免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈源自已知抗體例如治療抗體的一個或多個修飾或由其工程化。治療抗體是用于在患有或傾向于患有疾病或病癥的哺乳動物中治療疾病或病癥的抗體。每個異源二聚體來源的合適的治療抗體包括但不限于阿巴伏單抗(abagovomab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、aurograb、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝利木單抗(belimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、布雷奴單抗(briakinumab)、卡那單抗(canakinumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、聚乙二醇化塞妥珠單抗(certolizumabpegol)、西妥昔單抗、達利珠單抗(daclizumab)、地諾單抗(denosumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、加利昔單抗(galiximab)、吉妥珠單抗奧加米星(gemtuzumabozogamicin)、戈里木單抗(golimumab)、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、英夫利昔單抗(infliximab)、依匹木單抗(ipilimumab)、魯昔單抗(lumiliximab)、美泊利單抗(mepolizumab)、莫維珠單抗(motavizumab)、莫羅單抗(muromonab)、mycograb、那他珠單抗(natalizumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧馬佐單抗(omalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、雷尼珠單抗(ranibizumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、特普利珠單抗(teplizumab)、托西珠單抗(tocilizumab/atlizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥單抗(trastuzumab)、普羅昔銨(ProxiniumTM)、RencarexTM、優特克單抗(ustekinumab)和扎魯目單抗(zalutumumab)。在一個實施方案中，每個異源二聚體的免疫球蛋白重鏈和/或免疫球蛋白輕鏈源自結合分子的抗體的一個或多個修飾或由其工程化，該分子包括但不限于以下蛋白質列表，以及屬于以下蛋白質列表的亞基、結構域、基序和表位：腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體化激素；高血糖素；凝血因子諸如因子VII、因子VIIIC、因子IX、組織因子(TF)和溫韋伯氏因子；抗凝血因子諸如蛋白C；心房利尿鈉因子；肺表面活性劑；血纖維蛋白溶酶原活化劑，諸如尿激酶或人尿或組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑(t-PA)；鈴蟾素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(活化時調節的正常T細胞表達和分泌因子)；人巨噬細胞炎癥蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白諸如人血清白蛋白；繆勒管抑制物質；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白質，諸如β-內酰胺酶；DNA酶；IgE；胞毒T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)，諸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體，諸如例如EGFR、VEGFR；干擾素諸如α干擾素(α-IFN)、β干擾素(β-IFN)和γ干擾素(γ-IFN)；蛋白A或D；類風濕因子；神經營養因子諸如骨源性神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經生長因子；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子諸如AFGF和PFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)諸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(大腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80和CD147；促紅細胞生成素；骨生成誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素諸如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，諸如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-13；TNF-α，超氧物歧化酶；T-細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如例如AIDS包膜的一部分，例如gp120；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；細胞粘附分子諸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM，a4/p7整合素和(Xv/p3整合素包括或其亞基，整合素α亞基諸如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整合素β亞基諸如CD29、CD18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整合素亞基組合包括但不限于αVβ3、αVβ5和α4β7；細胞凋亡途徑的成員；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mp1受體；CTLA-4；蛋白C；Eph受體諸如EphA2、EphA4、EphB2等；人白細胞抗原(HLA)諸如HLA-DR；補體蛋白諸如補體受體CR1、C1Rq和其他補體因子諸如C3和C5；糖蛋白受體諸如GpIb.α.、GPIIb/IIIa和CD200；以及任何上述列出的多肽的片段。在一個實施方案中，每個異源二聚體的免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈源自特異性結合癌癥抗原的抗體的一個或多個修飾或由其工程化，該抗體包括但不限于ALK受體(多效生長因子受體)、多效生長因子、KS1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸性磷酸；前列腺特異性抗原(PSA)；黑素瘤相關抗原p97；黑素瘤抗原gp75；高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)；前列腺特異性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多態性上皮粘蛋白抗原；人乳脂肪球抗原；結腸直腸腫瘤相關抗原諸如：CEA、TAG-72、C017-1A、GICA19-9、CTA-1和LEA；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD19；人B-淋巴瘤抗原-CD20；CD33；黑素瘤特異性抗原諸如神經節苷脂GD2、神經節苷脂GD3、神經節苷脂GM2和神經節苷脂GM3；腫瘤特異性移植型細胞表面抗原(TSTA)；病毒引起的腫瘤抗原，包括DNA腫瘤病毒的T-抗原和RNA腫瘤病毒的包膜抗原；癌胚抗原甲胎蛋白諸如結腸的CEA、514癌胚滋養層糖蛋白和膀胱腫瘤癌胚抗原；分化抗原諸如人肺癌抗原L6和L20；纖維肉瘤的抗原；人白血病T細胞抗原-Gp37；擬糖蛋白；神經鞘脂類；乳腺癌抗原諸如EGFR(表皮生長因子受體)；NY-BR-16；NY-BR-16和HER2抗原(p185HER2)；多態性上皮粘蛋白(PEM)；惡性人淋巴細胞抗原-APO-1；分化抗原，諸如存在于胎兒紅細胞的I抗原；存在于成人紅細胞的原內胚層I抗原；植入前胚胎；存在于胃腺癌的I(Ma)；存在于乳腺上皮的M18、M39；存在于骨髓細胞的SSEA-1；VEP8；VEP9；Myl；Va4-D5；存在于結腸直腸癌的D156-22；TRA-1-85(血型H)；存在于睪丸和卵巢癌的SCP-1；存在于結腸腺癌的C14；存在于肺腺癌的F3；存在于胃癌的AH6；Y半抗原；存在于胚胎癌性細胞的Ley；TL5(血型A)；存在于A431細胞的EGF受體；存在于胰腺癌的E1系列(血型B)；存在于胚胎癌性細胞的FC10.2；胃腺癌抗原；存在于腺癌的CO-514(血型Lea)；存在于腺癌的NS-10；CO-43(血型Leb)；存在于A431細胞的EGF受體的G49；存在于結腸腺癌的MH2(血型ALeb/Ley)；存在于結腸癌癥的19.9；胃癌粘蛋白；存在于骨髓細胞的T5A7；存在于黑素瘤的R24；存在于胚胎癌性細胞的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1∶22∶25∶8以及存在于4至8細胞期胚胎的SSEA-3和SSEA-4；皮膚T細胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；SialyTn(STn)抗原；結腸癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12valiantA；腺癌抗原ART1；副腫瘤相關大腦-睪丸癌抗原(腫瘤性神經抗原MA2；副腫瘤神經元抗原)；神經腫瘤腹側抗原2(NOVA2)；肝細胞癌抗原基因520；腫瘤相關抗原CO-029；腫瘤相關抗原MAGE-C1(癌癥/睪丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4-a、MAGE-4-b和MAGE-X2；癌癥-睪丸抗原(NY-EOS-1)以及任何上述列出的多肽的片段。人抗體可歸類為同種型，包括IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。在一個實施方案中，Fc來源于IgG同種型。在另一個實施方案中，Fc來源于IgA同種型。在另一個實施方案中，Fc來源于IgE同種型。在另一個實施方案中，Fc來源于IgM同種型。在另一個實施方案中，Fc來源于IgD同種型。人IgG抗體也可分為亞類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，在一些實施方案中，設想了Fc可來源于抗體的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類。異源二聚體對的每個異源二聚體可特異性結合至抗原或表位。在一個實施方案中，異源二聚體對的每個異源二聚體結合相同的表位。在另一個實施方案中，異源二聚體對的第一異源二聚體特異性結合一個抗原上的表位，異源二聚體對的第二異源二聚體特異性結合相同抗原上不同的表位。在另一個實施方案中，異源二聚體對的第一異源二聚體特異性結合第一抗原上的表位，異源二聚體對的第二異源二聚體特異性結合不同于第一抗原的第二抗原上的表位。例如，在一個實施方案中，第一異源二聚體特異性結合組織因子，而第二異源二聚體特異性結合抗原Her2(ErbB2)，反之亦然。在可供選擇的實施方案中，第一異源二聚體特異性結合組織因子，而第二異源二聚體特異性結合EGFR，反之亦然。在另一個實施方案中，第一異源二聚體特異性結合EGFR，而第二異源二聚體特異性結合抗原Her2，反之亦然。在另一個實施方案中，第一異源二聚體特異性結合上述分子或癌癥抗原。在另一個實施方案中，第二異源二聚體特異性結合上述分子或癌癥抗原。如上所述，在一些實施方案中，每個異源二聚體的免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈源自已知治療抗體或結合各種靶標分子或癌癥抗原的抗體的一個或多個修飾或由其工程化。許多此類分子的氨基酸和核苷酸序列是易得的(參見例如GenBank：AJ308087.1(人源化抗人組織因子抗體D3H44輕鏈可變區和CL結構域)；GenBank：AJ308086.1(人源化抗人組織因子抗體D3H44重鏈可變區和CH1結構域)；GenBank：HC359025.1(帕妥珠單抗Fab輕鏈基因模塊)；GenBank：HC359024.1(帕妥珠單抗Fab重鏈基因模塊)；GenBank：GM685465.1(抗體曲妥單抗(＝賀癌平(Herceptin))-野生型；輕鏈)；GenBank：GM685463.1(抗體曲妥單抗(＝賀癌平)-野生型；重鏈)；GenBank：GM685466.1(抗體曲妥單抗(＝賀癌平)-GC優化的輕鏈)；以及GenBank：GM685464.1(抗體曲妥單抗(＝賀癌平)-GC優化的重鏈))。本文所述的每個GenBank編號的序列可得自NCBI網站，最后更新2012年11月28日，并且各自以引用的方式整體并入用于所有目的。西妥昔單抗的氨基酸和核苷酸序列也是本領域已知的，參見例如由CanadianInstitutesofHealthResearch.AlbertaInnovates-HealthSolutions和TheMetabolomicsInnovationCentre(TMIC)提供支持的DrugBank網站，登錄號DB00002。在一些方面，分離的抗原結合多肽構建體包含與本文公開的表格或登錄號示出的氨基酸序列或其片段具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，分離的抗原結合多肽構建體包含與本文公開的表格或登錄號示出的核苷酸序列或其片段具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸編碼的氨基酸序列。免疫球蛋白重鏈和輕鏈的氨基酸修飾異源二聚體對的異源二聚體中的至少一個可包含免疫球蛋白重鏈和/或免疫球蛋白輕鏈的一個或多個氨基酸修飾，使得第一異源二聚體的重鏈優先地與輕鏈中的一者而非其他輕鏈配對。同樣，第二異源二聚體的重鏈可優先地與第二輕鏈而非第一輕鏈配對。所述一條重鏈與兩條輕鏈中的一者優先配對可基于包含一條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈的設計集(稱為LCCA設計集)，其中當免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，免疫球蛋白重鏈優先地與兩條免疫球蛋白輕鏈中的一者而非另一者配對。因此，LCCA設計集可包含一條免疫球蛋白重鏈、第一免疫球蛋白輕鏈和第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，一個或多個氨基酸修飾包含一個或多個氨基酸置換。在一個實施方案中，LCCA設計集中示出的優先配對通過修飾作為輕鏈和重鏈之間的界面的一部分的一個或多個氨基酸來建立。在一個實施方案中，LCCA設計集中示出的優先配對通過修飾免疫球蛋白重鏈的CH1結構域、第一免疫球蛋白輕鏈的CL結構域以及第二免疫球蛋白輕鏈的CL結構域中的至少一個中的一個或多個氨基酸來建立。在一個實施方案中，一個或多個氨基酸修飾被限制于可變(VH、VL)和恒定(CH1、CL)結構域的保守框架殘基，如殘基的Kabat編號所示。例如，Almagro[FrontiersInBioscience(2008)13：1619-1633]根據Kabat、Chotia和IMGT編號方案提供了框架殘基的定義。在一個實施方案中，異源二聚體中的至少一個包含引入彼此互補的免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的一個或多個突變。重鏈和輕鏈界面處的互補可在空間和疏水接觸、靜電/電荷相互作用或多種相互作用的組合的基礎上實現。蛋白質表面之間的互補在文獻中以鎖鑰配合、鈕入扣、凸起和凹槽、供體和受體等進行了廣泛描述，這些均暗示了兩個相互作用表面之間的結構和化學匹配的性質。在一個實施方案中，異源二聚體中的至少一個包含一個或多個突變，其中引入免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的突變，在界面處的輕鏈和重鏈之間引入新的氫鍵。在一個實施方案中，異源二聚體中的至少一個包含一個或多個突變，其中引入免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的突變，在界面處的輕鏈和重鏈之間引入新的鹽橋。合適的LCCA設計集的非限制性實例在實施例、表格和附圖中有所描述。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少一個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中無任何氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在另一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少一個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在另一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少一個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在另一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少一個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中無氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中無氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中無氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中無氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中無氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少三個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少三個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中無氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少三個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少三個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少三個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含CH1結構域中具有至少三個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、CL結構域中具有至少四個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及CL結構域中具有至少三個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集中示出的優先配對通過修飾免疫球蛋白重鏈的VH結構域、第一免疫球蛋白輕鏈的VL結構域以及第二免疫球蛋白輕鏈的VL結構域中的至少一個中的一個或多個氨基酸來建立。合適的LCCA設計集的非限制性實例如下列表格和實施例所示。在一個實施方案中，LCCA設計集包含VH結構域中無氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、VL結構域中無氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及VL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含VH結構域中無氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、VL結構域中無氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及VL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含VH結構域中具有至少一個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、VL結構域中無氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及VL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含VH結構域中具有至少一個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、VL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及VL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含VH結構域中具有至少一個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、VL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及VL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含VH結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、VL結構域中無氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及VL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含VH結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、VL結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及VL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，LCCA設計集包含VH結構域中具有至少兩個氨基酸修飾的免疫球蛋白重鏈、VL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第一免疫球蛋白輕鏈以及VL結構域中具有至少一個氨基酸修飾的第二免疫球蛋白輕鏈。在一個實施方案中，可組合LCCA設計集以提供包含兩個不同的免疫球蛋白重鏈(H1和H2)和兩個不同的免疫球蛋白輕鏈(L1和L2)的組合，其中當H1、H2、L1和L2共表達時，H1優先地與L1配對，H2優先地與L2配對。在一些實施方案中，本文所述的氨基酸修飾處于雙特異性抗體構建體的語境中。例如，本文所述的設計集可摻入到全長免疫球蛋白重鏈，使得該全長重鏈優先地與免疫球蛋白輕鏈配對。在一些實施方案中，全長免疫球蛋白重鏈包含有助于在Fc區中二聚化的氨基酸修飾，如實施例所述。本文所述的特定氨基酸修飾轉移至其他抗體的可轉移性：雖然上述免疫球蛋白重鏈和輕鏈的特定氨基酸修飾結合D3H44抗組織因子胞外結構域抗體曲妥單抗和西妥昔單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈進行了描述，但就下文而言，本文設想和示出(參見實施例、附圖和表格)這些氨基酸修飾可轉移至其他免疫球蛋白重鏈和輕鏈，產生一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈中的一者優先配對的類似方式。在免疫球蛋白重鏈和輕鏈之間的界面中VH∶VL和CH1∶CL界面殘基是相對較保守的(Padlan等，1986，Mol.Immunol.23(9)：951-960)。該序列保守性是進化約束的結果，增加了在輕鏈和重鏈的組合配對期間形成功能活化的抗體結合結構域的可能性。由于該序列保守性，允許上述D3H44特定實例中的序列修飾(其驅動優先配對)轉移至其他重鏈和輕鏈對異源二聚體，就優先配對而言獲得大約等同的結果，因為該區在抗體中顯示出高度序列保守性；另外，當出現序列差異時，這些差異通常位于CH1∶CL界面的遠側。特別是對于CH1和CL結構域來說，情況就是這樣。然而，就CDR(互補決定區)環殘基(和長度)，特別是CDR-H3而言，抗原結合位點處存在一些序列波動。因此，在一個實施方案中，本文所述的異源二聚體對包含這樣的異源二聚體：其中當抗原結合位點的氨基酸序列與D3H44抗體的顯著不同時，至少一個異源二聚體包含位于CDR環的遠側的VH和/或VL結構域中的一個或多個氨基酸修飾。在另一個實施方案中，本文所述的異源二聚體對包含這樣的異源二聚體：其中當抗原結合位點的氨基酸序列與D3H44抗體的基本上相同時，至少一個異源二聚體包含位于CDR環的近側或遠側的VH和/或VL結構域中的一個或多個氨基酸修飾。在一個實施方案中，本文所述的氨基酸修飾可根據人或人源化IgG1/κ轉移至抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈。此類IgG1/κ鏈的非限制性實例包括奧法木單抗(對于人)或曲妥單抗、帕妥珠單抗或貝伐單抗(對于人源化)。在另一個實施方案中，本文所述的氨基酸修飾可利用常用的VH和VL亞群轉移至抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈。此類抗體的非限制性實例包括帕妥珠單抗。在一個實施方案中，本文所述的氨基酸修飾可轉移至框架接近生殖系的抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈。此類抗體的實例包括奧奴珠單抗(Obinutuzumab)。在一個實施方案中，本文所述的氨基酸修飾可轉移至VH∶VL結構域間角接近所觀察的重鏈和輕鏈對的平均值的抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈。該類型抗體的實例包括但不限于帕妥珠單抗。在另一個實施方案中，本文所述的氨基酸修飾可轉移至具有典型CL和CH1結構域的抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈。此類抗體的合適實例包括但不限于曲妥單抗。在一些實施方案中，本文所述的氨基酸修飾的某些子集用于上文提供的抗原結合構建體中的可變結構域。實施例、附圖和表格顯示，氨基酸修飾(例如，在包含可變區和恒定區的一個或多個Fab片段內)可轉移至其他免疫球蛋白重鏈和輕鏈，產生一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈中的一者優先配對的類似方式。優先配對如上所述，本文所述的抗原結合構建體/異源二聚體對的至少一個異源二聚體可包含其免疫球蛋白重鏈和/或免疫球蛋白輕鏈的一個或多個氨基酸修飾，使得一個異源二聚體的重鏈例如H1優先地與一條輕鏈例如L1而非另一條輕鏈L2配對，另一個異源二聚體的重鏈H2優先地與輕鏈L2而非輕鏈L1配對。換句話講，所需的優先配對被認為在H1和L1之間以及H2和L2之間。相對于對應的H1/L1對與不含一個或多個氨基酸修飾的H2/L2對的各自配對，當H1與L1和L2組合時，如果H1-L1異源二聚體的產率大于錯配的H1-L2異源二聚體的產率，則認為在例如H1和L1之間發生優先配對。同樣，相對于對應的H1-L1對與不含一個或多個氨基酸修飾的H2-L2對的各自配對，當H2與L1和L2組合時，如果H2-L2異源二聚體的產率大于錯配的H2-L1異源二聚體的產率，則認為在H2和L2之間發生優先配對。在該語境中，包含H1和L1(H1-L1)或H2和L2(H2-L2)的異源二聚體在本文中稱為優先配對的、正確配對的、專性配對的或所需的異源二聚體，而包含H1和L2(H1-L2)或H2和L1(H2-L1)的異源二聚體在本文中稱為錯配的異源二聚體。兩條重鏈和兩條輕鏈對應的突變集意味著實現H1-L1和H2-L2的選擇性配對，該突變集稱為設計集。因此，在一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體的相對產率大于55％。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體的相對產率大于60％。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體的相對產率大于70％。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體的相對產率大于80％。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體的相對產率大于90％。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體的相對產率大于95％。在上述實例中，當H1與L1和L2共表達時，如果所需的H1-L1異源二聚體的量大于錯配的H1-L2異源二聚體的量，則認為在H1-L1之間發生優先配對。相似地，當H2與L1和L2共表達時，如果所需的H2-L2異源二聚體的量大于錯配的H2-L2異源二聚體的量，則認為在H2-L2之間發生優先配對。因此，在一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體與錯配的異源二聚體的比率大于1.25∶1。在一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體與錯配的異源二聚體的比率大于1.5∶1。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體與錯配的異源二聚體的比率大于2∶1。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體與錯配的異源二聚體的比率大于3∶1。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體與錯配的異源二聚體的比率大于5∶1。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體與錯配的異源二聚體的比率大于10∶1。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體與錯配的異源二聚體的比率大于25∶1。在另一個實施方案中，當異源二聚體的一條免疫球蛋白重鏈與兩條免疫球蛋白輕鏈共表達時，所需的異源二聚體與錯配的異源二聚體的比率大于50∶1。在一些實施方案中，本文所述的異源二聚體優先地配對形成雙特異性抗體。在一些實施方案中，該構建體包含優先地配對形成選自D3H44/曲妥單抗、D3H44/西妥昔單抗和曲妥單抗/西妥昔單抗的雙特異性抗體的異源二聚體。在一些實施方案中，雙特異性抗體包含表28a-28c中描述的氨基酸修飾。在一些實施方案中，兩個全長重鏈構建體與兩個獨特的輕鏈構建體共表達，得到十種可能的抗體種類：H1-L1∶H1-L1、H1-L2∶H1-L2、H1-L1∶H1-L2、H2-L1∶H2-L1、H2-L2∶H2-L2、H2-L1∶H2-L2、H1-L1∶H2-L1、H1-L2∶H2-L2、H1-L2∶H2-L1和H1-L1∶H2-L2。H1-L1∶H2-L2種類被視為正確配對的雙特異性抗體種類。在一些實施方案中，選擇DNA比率以得到最大量的正確配對的雙特異性抗體種類。例如，在一些實施方案中，H1∶H2∶L1∶L2的比率為15∶15∶53∶17。在一些實施方案中，H1∶H2∶L1∶L2的比率為15∶15∶17∶53。在一些實施方案中，正確配對的雙特異性種類相對于所有種類的百分比為至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(參見例如，表29a-29c和30a-30c)。在一些實施方案中，正確配對的雙特異性種類的百分比大于對應的不含表28a-28c中描述的氨基酸修飾的野生型H1、H2、L1和L2共表達獲得的正確配對的雙特異性種類的百分比。在一些實施方案中，與不含表28a-28c中描述的氨基酸修飾野生型H1、H2、L1和L2共表達獲得的正確配對的雙特異性種類的百分比相比，正確配對的雙特異性種類的百分比降低至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或75％。異源二聚體的熱穩定性除有助于優先配對之外，選擇氨基酸置換以使得突變不會使Fab異源二聚體變得不穩定。因此，在大多數情況下，Fab異源二聚體的穩定性測量值非常接近野生型Fab(例如，在野生型Fab的3℃內)。因此，在一些實施方案中，本文所述的異源二聚體對的每個異源二聚體具有的熱穩定性相當于包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、但不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體。在一個實施方案中，熱穩定性通過熔融溫度或Tm的測定。因此，在一個實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約10℃內。因此，在一個實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約5℃內。在另一個實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約3℃內。在另一個實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約2℃內。在另一個實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約1.5℃內。在另一個實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約1℃內。在另一個實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約0.5℃內。在另一個實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約0.25℃內。此外，在一些實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性相對于包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體出乎意料地改善(即，增加)。因此，在一個實施方案中，本文描述的異源二聚體的熱穩定性與包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體相比增加約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.5、5.0℃或更多。異源二聚體對抗原的親和力在一個實施方案中，異源二聚體對的每個異源二聚體對其各自抗原的親和力相同或相當于包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、但不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體。在一個實施方案中，異源二聚體對的異源二聚體對其各自抗原的親和力在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約50倍內。在一個實施方案中，異源二聚體對的異源二聚體對其各自抗原的親和力在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約25倍內。在一個實施方案中，異源二聚體對的異源二聚體對其各自抗原的親和力在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約10倍內。在另一個實施方案中，異源二聚體對的異源二聚體對其各自抗原的親和力在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約5倍內。在另一個實施方案中，異源二聚體對的異源二聚體對其各自抗原的親和力在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約2.5倍內。在另一個實施方案中，異源二聚體對的異源二聚體對其各自抗原的親和力在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約2倍內。在另一個實施方案中，異源二聚體對的異源二聚體對其各自抗原的親和力在包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體的約1.5倍內。在另一個實施方案中，異源二聚體對的異源二聚體對其各自抗原的親和力與包含相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL結構域的氨基酸修飾的異源二聚體大約相同。另外的任選修飾在一個實施方案中，本文所述的異源二聚體對的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可進一步修飾(即，通過各種類型分子的共價連接)，以使得共價連接不妨礙重鏈和輕鏈之間的優先配對，或影響異源二聚體結合其抗原的能力，或影響其穩定性。此類修飾包括例如但不限于糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護/封端基團衍生化、蛋白酶切割、連接至細胞配體或其他蛋白質等。可通過已知的技術進行任何多種化學修飾，包括但不限于特異性化學切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代謝合成等。在另一個實施方案中，本文所述的異源二聚體對的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可綴合(直接或間接)至修飾給定的生物學應答的治療劑或藥物部分。治療劑或藥物部分不應解釋為限于經典的化療劑。例如，藥物部分可以是具有所需的生物學活性的蛋白質或多肽。此類蛋白質可包括例如毒素諸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、豹蛙抗瘤酶(Onconase)(或另一種胞毒RNA酶)、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質諸如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織血纖維蛋白溶酶原活化劑、細胞凋亡劑例如TNF-α、TNF-β、AIMI(參見國際專利公開No.WO97/33899)、AIMII(參見國際專利公開No.WO97/34911)、Fas配體(Takahashi等，1994，J.Immunol.，6：1567)和VEGI(參見國際專利公開No.WO99/23105)；血栓生成劑或抗血栓生成劑例如血管抑素或內皮抑素；或生物學應答調節劑諸如例如淋巴因子(例如，白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”))或生長因子(例如，生長激素(“GH”))。此外，在替代實施方案中，抗體可綴合至治療部分，諸如用于綴合放射性金屬離子的放射性物質或大環螯合劑(參見上文放射性物質的實例)。在某些實施方案中，大環螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N，N′，N″，N″-四乙酸(DOTA)，它可通過接頭分子連接至抗體。此類接頭分子是本領域熟知的，并且在Denardo等，1998，ClinCancerRes.4：2483；Peterson等，1999，Bioconjug.Chem.10：553；以及Zimmerman等，1999，Nucl.Med.Biol.26：943中有所描述。在一些實施方案中，異源二聚體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈以包含標簽的融合蛋白表達，該標簽有利于純化和/或測試等。如本文所述，“標簽”是任何添加的氨基酸系列，可存在于蛋白質的C-末端、N-末端或內部，以便有助于蛋白質的鑒定或純化。合適的標簽包括但不限于本領域技術人員已知的用于純化和/或測試的標簽，諸如白蛋白結合結構域(ABD)、His標簽、FLAG標簽、谷胱甘肽-s-轉移酶、血凝素(HA)和麥芽糖結合蛋白。此類標記蛋白也可工程改造為包含切割位點，諸如凝血酶、腸激酶或因子X切割位點，以便于在純化之前、期間或之后移除標簽。在一些實施方案中，形成鏈間二硫鍵的輕鏈(位置214，Kabat編號)和重鏈(位置233，Kabat編號)的Fab結構域底部的一個或多個半胱氨酸殘基可修飾為絲氨酸或丙氨酸或非半胱氨酸或不同的氨基酸。設想可對免疫球蛋白重鏈作出另外的氨基酸修飾，以提高優先配對水平和/或異源二聚體對的熱穩定性。例如，可對免疫球蛋白重鏈Fc結構域作出另外的氨基酸修飾，以驅動異源二聚體對相對于同源二聚體對之間的優先配對。此類氨基酸修飾是本領域已知的，并且包括例如美國專利公開No.2012/0149876描述的那些修飾。或者，也可利用驅動異源二聚體對相對于同源二聚體對之間的優先配對的替代策略，諸如例如，“鈕入扣”、具有離子相互作用的帶電殘基以及鏈交換工程改造結構域(SEED)技術。后面的策略在本領域中有所描述，并且在Klein等，出處同上中有所評述。Fc結構域的進一步討論如下。Fc結構域在其中抗原結合多肽構建體包含全長免疫球蛋白重鏈的實施方案中，構建體將包含Fc。在一些方面，該Fc包含至少一個或兩個CH3結構域序列。在一些方面，當抗原結合多肽構建體包含異源二聚體(僅包含重鏈的Fab區)時，該Fc通過或不通過一個或多個接頭連接至第一異源二聚體和/或第二異源二聚體。在一些方面，該Fc是人Fc。在一些方面，該Fc是人IgG或IgG1Fc。在一些方面，該Fc是異源二聚體Fc。在一些方面，該Fc包含至少一個或兩個CH2結構域序列。在一些方面，該Fc包含CH3結構域序列中的至少一個中的一個或多個修飾。在一些方面，該Fc包含CH2結構域序列中的至少一個中的一個或多個修飾。在一些方面，Fc是單條多肽。在一些方面，Fc是多條肽，例如兩條多肽。在一些方面，該Fc包含CH3序列中的至少一個的一個或多個修飾。在一些方面，該Fc包含CH2序列中的至少一個中的一個或多個修飾。在一些方面，Fc是單條多肽。在一些方面，Fc是多條肽，例如兩條多肽。在一些方面，Fc是提交于2011年11月4日的專利申請PCT/CA2011/001238或提交于2012年11月2日的PCT/CA2012/050780中描述的Fc，每個專利申請的全部公開內容據此以引用的方式整體并入用于所有目的。在一些方面，本文所述的構建體包含這樣的異源二聚體Fc：其包含經不對稱修飾的修飾CH3結構域。異源二聚體Fc可包含兩條重鏈恒定結構域多肽：第一重鏈多肽和第二重鏈多肽，它們可互換使用，前提條件是Fc包含一條第一重鏈多肽和一條第二重鏈多肽。一般來講，第一重鏈多肽包含第一CH3序列，第二重鏈多肽包含第二CH3序列。當兩個CH3序列二聚化時，包含以不對稱方式引入一個或多個氨基酸修飾的兩個CH3序列通常產生異源二聚體Fc而非同源二聚體。如本文所用，“不對稱氨基酸修飾”是指其中第一CH3序列上的特定位置處的氨基酸不同于相同位置處第二CH3序列上的氨基酸的任何修飾，并且第一和第二CH3序列優先地配對形成異源二聚體而非同源二聚體。此異源二聚化可以是僅修飾每個序列上相同的對應氨基酸位置處兩個氨基酸中的一者；或修飾第一和第二CH3序列中的每個的相同的對應位置處每個序列上的兩個氨基酸的結果。異源二聚體Fc的第一和第二CH3序列可包含一個或超過一個不對稱氨基酸修飾。表X提供了全長人IgG1重鏈的氨基酸231至447對應的人IgG1Fc序列的氨基酸序列。CH3序列包含全長人IgG1重鏈的氨基酸341-447。通常Fc可包括能夠二聚化的兩個鄰接的重鏈序列(A和B)。在一些方面，Fc的一個或兩個序列包括以下位置處的一個或多個突變或修飾：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390(使用EU編號)。在一些方面，Fc包括表X示出的突變體序列。在一些方面，Fc包括變體1A-B的突變。在一些方面，Fc包括變體2A-B的突變。在一些方面，Fc包括變體3A-B的突變。在一些方面，Fc包括變體4A-B的突變。在一些方面，Fc包括變體5A-B的突變。第一和第二CH3序列可包含本文結合全長人IgG1重鏈的氨基酸231至447所述的氨基酸突變。在一個實施方案中，異源二聚體Fc包含經修飾的CH3結構域，其中第一CH3序列具有位置F405和Y407處的氨基酸修飾，并且第二CH3序列具有位置T394處的氨基酸修飾。在一個實施方案中，異源二聚體Fc包含經修飾的CH3結構域，其中第一CH3序列具有選自L351Y、F405A和Y407V的一個或多個氨基酸修飾，第二CH3序列具有選自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的一個或多個氨基酸修飾。在一個實施方案中，異源二聚體Fc包含經修飾的CH3結構域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407處的氨基酸修飾，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394處的氨基酸修飾，第一或第二CH3序列中的一者還包含位置Q347處的氨基酸修飾，其他CH3序列還包含位置K360處的氨基酸修飾。在另一個實施方案中，異源二聚體Fc包含經修飾的CH3結構域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407處的氨基酸修飾，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394處的氨基酸修飾，第一或第二CH3序列中的一者還包含位置Q347處的氨基酸修飾，其他CH3序列還包含位置K360處的氨基酸修飾，所述CH3序列中的一者或兩者還包含氨基酸修飾T350V。在一個實施方案中，異源二聚體Fc包含經修飾的CH3結構域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407處的氨基酸修飾，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394處的氨基酸修飾，所述第一和第二CH3序列中的一者還包含氨基酸修飾D399R或D399K，其他CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一個或多個。在另一個實施方案中，異源二聚體Fc包含經修飾的CH3結構域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407處的氨基酸修飾，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394處的氨基酸修飾，所述第一和第二CH3序列中的一者還包含氨基酸修飾D399R或D399K，其他CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一個或多個，所述CH3序列中的一者或二者還包含氨基酸修飾T350V。在一個實施方案中，異源二聚體Fc包含經修飾的CH3結構域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407處的氨基酸修飾，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394處的氨基酸修飾，其中所述CH3序列中的一者或兩者還包含氨基酸修飾T350V。在一個實施方案中，異源二聚體Fc包括包含以下氨基酸修飾的經修飾的CH3結構域，其中“A”表示第一CH3序列的氨基酸修飾，“B”表示第二CH3序列的氨基酸修飾：A：L351Y_F405A_Y407V、B：T366L_K392M_T394W、A：L351Y_F405A_Y407V、B：T366L_K392L_T394W、A：T350V_L351Y_F405A_Y407V、B：T350V_T366L_K392L_T394W、A：T350V_L351Y_F405A_Y407V、B：T350V_T366L_K392M_T394W、A：T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和/或B：T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。一個或多個不對稱氨基酸修飾可有助于異源二聚體Fc的形成，其中異源二聚體CH3結構域具有相當于野生型同源二聚體CH3結構域的穩定性。在一個實施方案中，一個或多個不對稱氨基酸修飾有助于異源二聚體Fc結構域的形成，其中異源二聚體Fc結構域具有相當于野生型同源二聚體Fc結構域的穩定性。在一個實施方案中，一個或多個不對稱氨基酸修飾有助于異源二聚體Fc結構域的形成，其中異源二聚體Fc結構域具有在差示掃描量熱研究中通過熔融溫度(Tm)觀察的穩定性，并且其中熔融溫度在所觀察的對應的對稱野生型同源二聚體Fc結構域的4℃內。在一些方面，Fc包含CH3序列中的至少一個中的一個或多個修飾，該修飾有助于形成穩定性相當于野生型同源二聚體Fc的異源二聚體Fc。在一個實施方案中，CH3結構域的穩定性可通過例如利用差示掃描量熱法(DSC)測定CH3結構域的熔融溫度來評估。因此，在另外的實施方案中，CH3結構域具有約68℃或更高的熔融溫度。在另一個實施方案中，CH3結構域具有約70℃或更高的熔融溫度。在另一個實施方案中，CH3結構域具有約72℃或更高的熔融溫度。在另一個實施方案中，CH3結構域具有約73℃或更高的熔融溫度。在另一個實施方案中，CH3結構域具有約75℃或更高的熔融溫度。在另一個實施方案中，CH3結構域具有約78℃或更高的熔融溫度。在一些方面，二聚化CH3序列具有約68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高的熔融溫度(Tm)。在一些實施方案中，與表達產物中的同源二聚體Fc相比，包含經修飾的CH3序列的異源二聚體Fc可以至少約75％的純度形成。在另一個實施方案中，異源二聚體Fc以大于約80％的純度形成。在另一個實施方案中，異源二聚體Fc以大于約85％的純度形成。在另一個實施方案中，異源二聚體Fc以大于約90％的純度形成。在另一個實施方案中，異源二聚體Fc以大于約95％的純度形成。在另一個實施方案中，異源二聚體Fc以大于約97％的純度形成。在一些方面，Fc在表達時是以大于約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的純度形成的異源二聚體。在一些方面，Fc在通過單個細胞表達時是以大于約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的純度形成的異源二聚體。修飾單體Fc多肽以便有助于異源二聚體Fc形成的另外的方法在國際專利公開No.WO96/027011(紐入扣)、Gunasekaran等(GunasekaranK.etal.(2010)JBiolChem.285，19637-46，electrostaticdesigntoachieveselectiveheterodimerization)、Davis等(Davis，JH.etal.(2010)ProtEngDesSel；23(4)：195-202，strandexchangeengineereddomain(SEED)technology)和Labrijn等[EfficientgenerationofstablebispecificIgG1bycontrolledFab-armexchange.LabrijnAF，MeestersJI，deGoeijBE，vandenBremerET，NeijssenJ，vanKampenMD，StrumaneK，VerploegenS，KunduA，GramerMJ，vanBerkelPH，vandeWinkelJG，SchuurmanJ，ParrenPW.ProcNatlAcadSciUSA.2013Mar26；110(13)：5145-50]中有所描述。在一些實施方案中，本文所述的分離的構建體包括結合抗原的抗原結合構建體；以及相對于不包括相同的Fc多肽的抗原結合構建體，具有優良的生物物理學性質如穩定性，并且易于制備的二聚體Fc多肽構建體。Fc的重鏈序列中的許多突變在本領域中已知可選擇性改變抗體Fc對不同的Fcγ受體的親和力。在一些方面，該Fc包含有助于Fc-γ受體的選擇性結合的一個或多個修飾。CH2結構域是表X示出的序列的氨基酸231-340。示例性突變如下：S298A/E333A/K334A，S298A/E333A/K334A/K326A(LuY、VernesJM、ChiangN等，JImmunolMethods.，2011年2月28日，365(1-2)：132-41)；F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(StavenhagenJB、GorlatovS、TuaillonN等，CancerRes.，2007年9月15日，67(18)：8882-90；NordstromJL、GorlatovS、ZhangW等，BreastCancerRes.，2011年11月30日，13(6)：R123)；F243L(StewartR、ThomG、LevensM等，ProteinEngDesSel.，2011年9月，24(9)：671-8.)、S298A/E333A/K334A(ShieldsRL、NamenukAK、HongK等，JBiolChem.，2001年3月2日、276(9)：6591-604)；S239D/I332E/A330L、S239D/I332E(LazarGA、DangW、KarkiS等，ProcNatlAcadSciUSA.，2006年3月14日、103(11)：4005-10)；S239D/S267E、S267E/L328F(ChuSY、VostiarI、KarkiS等，MolImmunol.，2008年9月，45(15)：3926-33)；S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D以及WO2011/120134和WO2011/120135列出的其他突變，這些突變以引用的方式并入本文。TherapeuticAntibodyEngineering(byWilliamR.StrohlandLilaM.Strohl，WoodheadPublishingseriesinBiomedicineNo11，ISBN1907568379，2012年10月)第283頁列出了突變。在一些實施方案中，CH2結構域包含一個或多個不對稱氨基酸修飾。在一些實施方案中，CH2結構域包含有助于FcγR的選擇性結合的一個或多個不對稱氨基酸修飾。在一些實施方案中，CH2結構域允許本文所述的分離的構建體的分離和純化。FcRn結合和PK參數如本領域已知，FcRn的結合使內吞的抗體從核內體循環回血流(Raghavan等，1996，AnnuRevCellDevBiol12：181-220；Ghetie等，2000，AnnuRevImmunol18：739-766)。該過程與腎過濾排除(由于全長分子的分子量較大)結合，得到在一至三周范圍內的有利抗體血清半衰期。Fc結合到FcRn還在抗體轉運中發揮關鍵作用。因此，在一個實施方案中，本發明的構建體能夠結合FcRn。改善效應子功能的另外的修飾。在一些實施方案中，可修飾本文所述的構建體，以改善其效應子功能。此類修飾是本領域已知的，包括去鹽藻糖基化，或工程改造抗體的Fc部分對活化的受體的親和力主要是FCGR3a對ADCC和C1q對CDC。下表Y匯總了文獻中報道的用于效應子功能工程改造的各種設計。因此，在一個實施方案中，本文所述的構建體可包括包含一個或多個氨基酸修飾的二聚體Fc，所述氨基酸修飾如上表所述賦予改善的效應子功能。在另一個實施方案中，構建體可去鹽藻糖基化，以改善效應子功能。接頭本文所述的構建體可包括本文所述的一個或多個異源二聚體，該異源二聚體可操作地偶聯到本文所述的Fc。在一些方面，Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯到所述一個或多個異源二聚體。在一些方面，Fc直接偶聯到所述一個或多個異源二聚體。在一些方面，Fc通過一個或多個接頭偶聯到所述一個或多個異源二聚體。在一些方面，Fc通過接頭偶聯到每個異源二聚體的重鏈。在一些方面，所述一個或多個接頭是一個或多個多肽接頭。在一些方面，所述一個或多個接頭包含一個或多個抗體鉸鏈區。在一些方面，所述一個或多個接頭包含一個或多個IgG1鉸鏈區。異源二聚體對的制備方法如上所述，本文所述的異源二聚體對可包含第一異源二聚體和第二異源二聚體，每個異源二聚體包含具有至少VH和CH1結構域的免疫球蛋白重鏈或其片段，以及具有VL結構域和CL結構域的免疫球蛋白輕鏈。異源二聚體的免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈可易于使用本領域已知的重組DNA技術制備。標準技術諸如例如SambrookandRussell，MolecularCloning：ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，第3版，2001)；Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，第2版，1989)；ShortProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等，JohnWileyandSons，NewYork，第4版，1999)；以及GlickandPasternak，MolecularBiotechnology：PrinciplesandApplicationsofRecombinantDNA(ASMPress，Washington，D.C.，第2版，1998)描述的那些技術可用于重組核酸方法、核酸合成、細胞培養、轉基因摻入和重組蛋白質表達。或者，本文所述的異源二聚體和異源二聚體對可以是化學合成的。衍生異源二聚體的抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的核酸和氨基酸序列是本領域已知的，或可易于使用核酸和/或蛋白質測序方法測定。將本文所述的標簽基因融合至免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的方法是本領域已知的，并且這些方法中的一些在下文和實施例中有所描述。例如，在宿主細胞中表達和共表達免疫球蛋白重鏈和輕鏈的方法是本領域熟知的。此外，使用重組DNA技術標記重鏈和/或輕鏈的方法也是本領域熟知的。適用于重鏈和輕鏈表達的表達載體和宿主細胞也是本領域熟知的，如下文所述。雙特異性抗體制備方法不依賴于僅使用表達全部四條鏈的單克隆或瞬時細胞系，該方法是本領域已知的(Gramer等，(2013)mAbs5，962；Strop等，(2012)JMolBiol420，204.)。這些方法僅依賴在涉及雙特異性抗體形成(氧化還原生成)的兩對輕鏈和重鏈的氧化還原條件下進行的生成后臂交換。在該方法中，H1∶L1和H2∶L2對可在兩種不同的細胞系中表達，以獨立地生成兩個Fab臂。隨后，在選擇氧化還原條件下混合兩個Fab臂，以實現兩條獨特的重鏈H1和H2的再締合，以形成包含L1∶H1∶H2∶L2鏈的雙特異性抗體。可設想使用本文所述的設計文庫/數據集利用氧化還原生成方法或該方法的改進形式來制備雙特異性抗體。某些實施方案中，利用無細胞蛋白質表達系統，而不使用活細胞來共表達多肽(例如，重鏈和輕鏈多肽)。相反，將DNA轉錄為RNA并將RNA翻譯為蛋白質所需的所有組分(例如核糖體、tRNA、酶、輔因子、氨基酸)以溶液提供，供體外使用。在某些實施方案中，體外表達需要(1)編碼重鏈和輕鏈多肽的遺傳模板(mRNA或DNA)以及(2)包含必要的轉錄和翻譯分子機器的反應溶液。在某些實施方案中，細胞提取物基本上提供了反應溶液的組分，例如：用于mRNA轉錄的RNA聚合酶、用于多肽翻譯的核糖體、tRNA、氨基酸、酶輔因子、能量源和蛋白質正確折疊的關鍵細胞組分。無細胞蛋白質表達系統可使用來源于細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、人細胞的裂解物或它們的組合制備。此類細胞裂解物可提供翻譯所需的酶和結構單元的正確組合物和比例。在一些實施方案中，移除細胞膜，僅留下細胞的胞質溶膠和細胞器組分。許多無細胞蛋白質表達系統是本領域已知的，如Carlson等，(2012)Biotechnol.Adv.30：1185-1194所評述。例如，無細胞蛋白質表達系統可基于原核或真核細胞獲取。原核無細胞表達系統的實例包括來自大腸桿菌(E.coli.)的那些。真核無細胞蛋白質表達系統可基于例如兔網狀細胞、小麥胚芽和昆蟲細胞的提取物獲取。此類原核和真核無細胞蛋白質表達系統可從諸如Roche、Invitrogen、Qiagen和Novagen的公司商購獲得。本領域的技術人員可易于選擇可生成能夠彼此配對的多肽(例如，重鏈和輕鏈多肽)的合適無細胞蛋白質表達系統。另外，無細胞蛋白質表達系統也可補充分子伴侶(例如BiP)和異構酶(例如，二硫鍵異構酶)，以提高IgG折疊的效率。在一些實施方案中，利用無細胞表達系統共表達來自DNA模板(轉錄和翻譯)或mRNA模板(僅翻譯)的重鏈和輕鏈多肽。載體和宿主細胞重鏈和輕鏈的重組表達需要構建包含編碼重鏈或輕鏈(例如，抗體或融合蛋白)的多核苷酸的表達載體。一旦獲得編碼重鏈或輕鏈的多核苷酸，用于生成重鏈或輕鏈的載體可使用本領域熟知的技術通過重組DNA技術生成。因此，本文描述了通過表達包含編碼重鏈或輕鏈的核苷酸序列的多核苷酸來制備蛋白質的方法。本領域的技術人員熟知的方法可用于構建包含重鏈或輕鏈編碼序列和適當的轉錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術、合成技術和體內遺傳重組。因此，本發明提供包含可操作地連接至啟動子的編碼重鏈或輕鏈的核苷酸序列的可復制載體。通過常規技術將表達載體轉移至宿主細胞，然后通過常規技術培養轉染細胞，以生成用于本發明的方法的經修飾的重鏈或輕鏈。在具體的實施方案中，在宿主細胞中共表達該方法所用的重鏈和輕鏈，以表達整個免疫球蛋白分子，如下文所詳述。許多宿主表達載體系統可用于表達經修飾的重鏈和輕鏈。此類宿主表達系統表示可生成和隨后純化所關注的編碼序列的工具，還表示在轉化或轉染適當的核苷酸編碼序列時，可原位表達經修飾的重鏈和輕鏈的細胞。這些宿主表達系統包括但不限于微生物，諸如轉化有包含經修飾的重鏈和輕鏈編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體的細菌(例如，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(B.subtilis))；轉化有包含經修飾的重鏈和輕鏈編碼序列的重組酵母表達載體的酵母(例如，酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia))；轉染有包含經修飾的重鏈和輕鏈編碼序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)的昆蟲細胞系統；轉染有包含經修飾的重鏈和輕鏈編碼序列重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)或轉化有包含經修飾的重鏈和輕鏈編碼序列重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)的植物細胞系統；或具有包含來源于哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或來源于哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)的重組表達構建體的哺乳動物細胞系統(例如，COS、CHO、BHK、HEK-293、NSO和3T3細胞)。在某些實施方案中，將細菌細胞諸如大腸桿菌或真核細胞用于表達經修飾的重鏈和輕鏈，該重鏈和輕鏈是重組抗體或融合蛋白分子。例如，哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO))，結合載體(諸如來自人細胞巨化病毒的主要立即早期基因啟動子元件)是抗體的有效表達系統(Foecking等，1986，Gene45：101；和Cockett等，1990，Bio/Technology8：2)。在具體實施方案中，編碼每個異源二聚體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的核苷酸序列的表達由組成型啟動子、誘導型啟動子或組織特異性啟動子調控。在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多基于病毒的表達系統。在其中腺病毒用作表達載體的情況下，所關注的經修飾的重鏈和輕鏈編碼序列可連接至腺病毒轉錄/翻譯控制復合物，例如晚期啟動子和三聯前導序列。然后該嵌合基因可通過體外或體內重組插入腺病毒基因組。插入病毒基因組的非必需區(例如，區域E1或E3)將產生存活的并且能夠在感染的宿主中表達經修飾的重鏈和輕鏈的重組病毒(例如，參見Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：355-359)。特定的起始信號也可以是插入的抗體編碼序列的有效翻譯必須的。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰的序列。此外，起始密碼子必須與所需的編碼序列的閱讀框同相，以確保整個插入序列的翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可具有許多來源，天然和合成均可。表達的效率可通過包括適當的轉錄增強子元件、轉錄終止子等來提高(參見例如，Bittner等，1987，MethodsinEnzymol.153：516-544)。異源二聚體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的表達可通過本領域已知的任何啟動子或增強子元件控制。可用于控制編碼經修飾的重鏈和輕鏈(例如，抗體或融合蛋白)的基因表達的啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(BernoistandChambon，1981，Nature290：304-310)、勞氏肉瘤病毒的3′長末端重復序列中包含的啟動子(Yamamoto等，1980，Cell22：787-797)、皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.1441-1445)、金屬硫蛋白基因的調控序列(Brinster等，1982，Nature296：39-42)、四環素(Tet)啟動子(Gossen等，1995，Proc.Nat.Acad.Sci.USA89：5547-5551)；原核細胞表達載體諸如β-內酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)或tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25；還可參見″Usefulproteinsfromrecombinantbacteria″inScientificAmerican，1980，242：74-94)；包含胭脂堿合成酶啟動子區的植物表達載體(Herrera-Estrella等，Nature303：209-213)或花椰菜花葉病毒35SRNA啟動子(Gardner等，1981，Nucl.AcidsRes.9：2871)以及光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動子(Herrera-Estrella等，1984，Nature310：115-120)；酵母或其他真菌的啟動子元件諸如Gal4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子以及以下表現出組織特異性并且用于轉基因動物的動物轉錄控制區：在胰腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等，1984，Cell38：639-646；Ornitz等，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology7：425-515)；在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因控制區(Hanahan，1985，Nature315：115-122)、在淋巴細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等，1984，Cell38：647-658；Adames等，1985，Nature318：533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)、在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制區(Leder等，1986，Cell45：485-495)、在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(Pinkert等，1987，GenesandDevel.1：268-276)、在肝臟中有活性的α-胎兒球蛋白基因控制區(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等，1987，Science235：53-58)；在肝臟中有活性的α-1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等，1987，GenesandDevel.1：161-171)、在骨髓細胞中有活性的β-球蛋白基因控制區(Mogram等，1985，Nature315：338-340；Kollias等，1986，Cell46：89-94)；在大腦中的少突膠質細胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(Readhead等，1987，Cell48：703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani，1985，Nature314：283-286)；在神經元細胞中有活性的神經元特異性烯醇化酶(NSE)(Morelli等，1999，Gen.Virol.80：571-83)；在神經元細胞中有活性的腦源性神經營養因子(BDNF)基因控制區(Tabuchi等，1998，Biochem.Biophysic.Res.Com.253：818-823)；在星形細胞中有活性的膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子(Gomes等，1999，BrazJMedBiolRes32(5)：619-631；Morelli等，1999，Gen.Virol.80：571-83)以及在下丘腦有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(Mason等，1986，Science234：1372-1378)。此外，可選擇調節插入序列的表達或以所需的特定方式修飾和加工基因產物的宿主細胞株。可在存在某些誘導物的情況下提高從某些啟動子的表達；因此，可控制基因工程的融合蛋白的表達。此外，不同的宿主細胞具有用于翻譯和翻譯后加工和修飾(例如，蛋白質的糖基化、磷酸化)的特征和特定機制。可選擇適當的細胞系或宿主系統來確保所表達的外源蛋白質的所需修飾和加工。例如，在細菌系統中表達將生成未糖基化的產物，在酵母中的表達將生成糖基化的產物。可使用具有基因產物的初級轉錄物的適當加工(例如，糖基化和磷酸化)的細胞機器的真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK-293、3T3、WI38、NSO，尤其是神經元細胞系，諸如例如SK-N-AS、SK-N-FI、SK-N-DZ人神經母細胞瘤(Sugimoto等，1984，J.Natl.CancerInst.73：51-57)、SK-N-SH人神經母細胞瘤(Biochim.Biophys.Acta，1982，704：450-460)、Daoy人小腦髓母細胞瘤(He等，1992，CancerRes.52：1144-1148)、DBTRG-05MG膠質母細胞瘤細胞(Kruse等，1992，InVitroCell.Dev.Biol.28A：609-614)、IMR-32人神經母細胞瘤(CancerRes.，1970，30：2110-2118)、1321N1人星形細胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977，74：4816)、MOG-G-CCM人星形細胞瘤(Br.J.Cancer，1984，49：269)、U87MG人膠質母細胞瘤-星形細胞瘤(ActaPathol.Microbiol.Scand.，1968，74：465-486)、A172人膠質母細胞瘤(Olopade等，1992，CancerRes.52：2523-2529)、C6大鼠膠質瘤細胞(Benda等，1968，Science161：370-371)、Neuro-2a小鼠神經母細胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1970，65：129-136)、NB41A3小鼠神經母細胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1962，48：1184-1190)、SCP綿羊脈絡叢(Bolin等，1994，J.Virol.Methods48：211-221)、G355-5、PG-4貓正常星形細胞(Haapala等，1985，J.Virol.53：827-833)、Mpf雪貂大腦(Trowbridge等，1982，InVitro18：952-960)和正常細胞系，諸如例如CTXTNA2大鼠正常大腦皮質(Radany等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6467-6471)，諸如例如CRL7030和Hs578Bst。此外，不同的載體/宿主表達系統可以不同的程度影響加工反應。就重組蛋白質的長期、高產率生成而言，穩定表達通常是優選的。例如，可工程改造穩定表達本發明的經修飾的重鏈和輕鏈(例如，抗體或融合蛋白)的細胞系。宿主細胞可轉化適當的表達控制元件(例如，啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)和選擇性標記控制的DNA，而不使用包含病毒復制起點的表達載體。在引入外源DNA后，允許工程改造的細胞在富集培養基中生長1-2天，然后切換到選擇培養基。重組質粒中的選擇性標記賦予選擇抗性，允許細胞將質粒穩定整合進染色體并生長形成灶，繼而可克隆該灶并擴大至細胞系。可使用許多選擇系統，包括但不限于可分別用于tk-、hgprt-或aprt-細胞的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell11：223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(Szybalska&Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：2026)和腺嘌呤磷酸核苷轉移酶(Lowy等，1980，Cell22：817)基因。另外，抗代謝物抗性可用作dhfr(賦予甲氨蝶呤抗性)(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA77：3567；O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1527)；gpt(賦予霉酚酸抗性)(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：2072)；neo(賦予氨基糖苷G-418抗性)(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.150：1)；和hygro(賦予潮霉素抗性)(Santerre等，1984，Gene30：147)基因選擇的基礎。重鏈和輕鏈的共表達本文所述的異源二聚體對的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可在哺乳動物細胞中共表達，如上文所述。在一個實施方案中，一條重鏈與兩條不同的輕鏈以上述LCCA設計集共表達，其中重鏈優先地與兩條輕鏈中的一者配對。在另一個實施方案中，兩條獨特的重鏈與兩條獨特的輕鏈共表達，其中每條重鏈優先地與一條輕鏈配對。異源二聚體對的測試如上所述，本文所述的異源二聚體對的至少一個異源二聚體可包括其免疫球蛋白重鏈和/或免疫球蛋白輕鏈的一個或多個氨基酸修飾，使得當異源二聚體對的兩條獨特的重鏈和兩條獨特的輕鏈在哺乳動物細胞中共表達時，第一異源二聚體的重鏈優先地與一條輕鏈而非另一條配對。同樣，第二異源二聚體的重鏈優先地與第二輕鏈而非第一輕鏈配對。可以例如使用下文描述的方法評估優先配對的程度。可以如下文所述測試異源二聚體對的每個異源二聚體與其各自抗原的親和力。還可如下文所述測試異源二聚體對的每個異源二聚體的熱穩定性。優先配對的測定方法LCCA在一個實施方案中，免疫球蛋白重鏈和輕鏈之間的優先配對通過進行輕鏈競爭分析(LCCA)來測定。提交于2013年10月3日的共同擁有的專利申請PCT/US2013/063306描述了LCCA的各種實施方案，該專利申請以引用的方式整體并入本文用于所有目的。該方法允許在共表達的蛋白質混合物中進行重鏈與特定的輕鏈配對的定量分析，并且可用于確定當重鏈和輕鏈共表達時，一條特定的免疫球蛋白重鏈是否與兩條免疫球蛋白輕鏈中的一者選擇性締合。該方法簡述如下：使至少一條重鏈和兩條不同的輕鏈以使得重鏈是限制配對反應物的比率在細胞中共表達；任選地從細胞分離分泌蛋白；從其余的分泌蛋白分離結合重鏈的免疫球蛋白輕鏈多肽，以生成分離的重鏈配對級分；測定分離的重鏈級分中每條不同的輕鏈的量；以及分析分離的重鏈級分中每條不同的輕鏈的相對量，以確定至少一條重鏈與一條輕鏈選擇性配對的能力。該方法提供了合理的通量，是穩定(即，對操作，諸如使用者或流速的微小變化不靈敏)和準確的。該方法提供了可測定蛋白質序列的小變化的效果的靈敏分析。大表面區域的混雜蛋白質-蛋白質；結構域-結構域；鏈-鏈相互作用通常需要多個突變(更換)，以引入選擇性。蛋白質產物不需要分離和純化，這允許了更有效的篩選。關于該方法的實施方案的另外詳情在實施例中有所描述。優先配對的替代測定方法檢測優先配對的替代方法包括使用LC-MS(液相色譜-質譜)定量包括每條輕鏈的相對異源二聚體群體，使用其分子量的差異鑒定每種不同的種類。抗原活性分析也可用于定量包含每條輕鏈的相對異源二聚體群體，由此測定的結合程度(相對于對照)可用于估計每種各自的異源二聚體群體。另外的方法諸如SMCA在實施例、附圖和表格中有所描述。熱穩定性異源二聚體的熱穩定性可根據本領域已知的方法測定。每個異源二聚體的熔融溫度是其熱穩定性的表征。異源二聚體的解鏈溫度可使用諸如差示掃描量熱法的技術測定(Chen等，(2003)PharmRes20：1952-60；Ghirlando等，(1999)ImmunolLett68：47-52)。或者，異源二聚體的熱穩定性可使用圓二向色性測定(Murray等，(2002)J.ChromatogrSci40：343-9)。抗原的親和力異源二聚體與各自抗原的結合親和力以及相互作用的解離速率可根據本領域熟知的方法通過競爭性結合分析測定。競爭性結合分析的一個實例是放射性免疫分析，包括在未標記抗原的量增加的情況下孵育標記抗原(例如，3H或125I與所關注的分子例如本發明的異源二聚體)，以及檢測結合至標記配體的分子。本發明的異源二聚體與抗原的親和力以及解離速率可從Scatchard分析的飽和數據測定。本文所述的異源二聚體的動力學參數也可使用本領域已知的基于表面等離振子共振(SPR)的分析(例如，BIAcore動力學分析)測定。基于SPR的技術的評述，參見Mullet等，2000，Methods22：77-91；Dong等，2002，ReviewinMol.Biotech.，82：303-23；Fivash等，1998，CurrentOpinioninBiotechnology9：97-101；Rich等，2000，CurrentOpinioninBiotechnology11：54-61。另外，本發明的方法設想了美國專利No.6,373,577、6,289,286、5,322,798、5,341,215、6,268,125中描述的任何SPR儀器以及用于測定蛋白質-蛋白質相互作用的基于SPR的方法。如本領域已知，FACS也可用于測定親和力。使用雙特異性抗體突變設計集的文庫由Mab1和Mab2生成雙特異性抗體。在一個實施方案中，描述了雙特異性抗體突變設計集，旨在從兩種典型抗體Mab1和Mab2(分別由抗原結合片段Fab1和Fab2構成)選擇性形成雙特異性抗體。該設計集由Fab1、Fab2和Fc分別對應的同源突變構成。在一個實施方案中，設計集文庫以表5、表12或表15至17中的任一者中包括的設計集表示。在存在競爭Fab2的輕鏈和重鏈的情況下，將突變引入Fab1的輕鏈和重鏈的界面，以實現兩條專性鏈之間的選擇配對。選擇配對在界面處的某些熱點框架殘基之間的空間、疏水或靜電互補的基礎上，通過在兩條專性輕鏈和重鏈中引入有利的互補突變實現，同時涉及這些突變殘基與非專性鏈對的不利的界面相互作用。在每個設計集中，在存在競爭Fab1的輕鏈和重鏈的情況下，也可將選擇配對突變引入Fab2的輕鏈和重鏈的界面，以實現這兩條專性鏈之間的選擇配對。該突變旨在減少Fab1的輕鏈與Fab2的重鏈(反之亦然)的錯配。將突變引入Fc界面，以實現重鏈的選擇配對，從而形成包含兩條不同的重鏈的不對稱抗體分子。抗體的輕鏈和重鏈的某些界面殘基位置處的工程改造通常可導致有害影響，諸如該抗體的抗原結合親和力、穩定性、溶解度、聚集傾向等喪失。許多相關性質可受到影響，諸如kon和koff速率、熔融溫度(Tm)、應力狀態如酸、堿、氧化、凍/融、攪拌、壓力等的穩定性。這通常受到所關注的抗體的互補決定區(CDR)的影響。假設不同抗體的CDR通常是不相同的，則突變設計集對上述性質的影響在所有抗體中可以不是相同的。此處提供了創建相對于其他含污染物的不正確配對的抗體樣結構，具有顯著純度的雙特異性抗體，從而得到任何兩個可用抗體Mab1和Mab2的方法。在引入每個突變設計集的同源突變后，使Mab1和Mab2的輕鏈和重鏈共表達，分析篩選所表達的抗體產物，以估計優選的雙特異性抗體，相對于在蛋白質產物中表達的其他Mab樣種類的純度。在一些實施方案中，分析篩選工序可基于LC-MS技術。在一些實施方案中，分析篩選工序可基于根據電荷分離諸如毛細管等電聚焦(cIEF)技術，或色譜技術。基于SMCA工序的篩選技術的實例提供于實施例9中。在一些實施方案中，雙特異性抗體的顯著純度定義為在所表達的蛋白質產物中大于所有獲得的Mab樣種類的70％。在一些實施方案中，雙特異性抗體的顯著純度定義為在所表達的蛋白質產物中大于所有獲得的Mab樣種類的90％。制備和選擇雙特異性Mab設計集，得到Mab1和Mab2的工序如圖12示意性地示出。藥物組合物本發明還提供包含本文所述的異源二聚體或異源二聚體對的藥物組合物。此類組合物包含治療有效量的異源二聚體或異源二聚體對和藥學上可接受的載體。在具體實施方式中，術語“藥學上可接受的”意指由聯邦監管機構或州政府批準或在美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他熟知的藥典列出用于動物，更具體地講人。術語“載體”是指與治療一起施用的稀釋劑、輔劑、賦形劑或媒介物。此類藥用載體可以是無菌液體，諸如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝蔴油等等。當藥物組合物靜脈內施用時，水是優選的載體。鹽水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液體載體，尤其是注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要，組合物還可包含微量潤濕或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可采取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋制劑等等的形式。組合物可配制為具有傳統基料和載體諸如甘油三酯的栓劑。口服制劑可包括標準載體，諸如藥品等級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥用載體的實例如由E.W.Martin所述得“Remington′sPharmaceuticalSciences″。此類組合物將包含治療有效量的化合物(優選地純的形式)以及適當量的載體，以得到適當施用于患者的形式。該制劑應適合施用模式。在某些實施方案中，包含異源二聚體或異源二聚體對的組合物根據常規工序配制為適于靜脈內施用于人類的藥物組合物。通常，靜脈內施用的組合物是溶于無菌等滲水性緩沖液的溶液。在必要時，組合物還可包括增溶劑和局部麻醉劑諸如利多卡因(lignocaine)，以緩解注射部位的疼痛。一般來講，成分以單位劑型單獨或混合在一起提供，該單位劑型例如密封容器中的凍干粉末或無水濃縮物，該密封容器諸如標明活化劑的量的安瓿瓶或小袋。當組合物通過輸注施用時，可使用包含藥品等級無菌水或鹽水的輸液瓶配藥。當組合物通過注射施用時，可提供注射用無菌水或鹽水的安瓿瓶，以使得成分可在施用前混合。在某些實施方案中，本文所述的組合物可配制為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括與陰離子形成的那些藥學上可接受的鹽，諸如來源于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些陰離子，以及與陽離子形成的那些藥學上可接受的鹽，諸如來源于鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些陽離子。本文所述的組合物的量將有效地用于異常表達相關的疾病或病癥的治療、抑制和預防和/或治療蛋白的活性，所述量可通過標準臨床技術測定。此外，體外分析可任選地用于幫助鑒定最佳劑量范圍。用于制劑的精確劑量還依賴于給藥途徑和疾病或病癥的嚴重性，并且應根據執業醫生的判斷和每個患者的情況決定。有效劑量從來源于體外或動物模型測試系統的劑量反應曲線推斷。異源二聚體對的使用如上所述，本文所述的異源二聚體對可包含第一異源二聚體和第二異源二聚體，其中每個異源二聚體的免疫球蛋白重鏈和/或免疫球蛋白輕鏈包含已知治療抗體或結合分子的已知抗體的一個或多個修飾。因此，設想包含這些抗體的修飾的異源二聚體可用于治療或預防與可使用已知治療抗體或已知抗體相同的疾病、病癥或感染。在另一個實施方案中，本文所述的異源二聚體對也可有利地與本領域已知的其他治療劑組合用于治療或預防癌癥、自身免疫疾病、炎性病癥或感染性疾病。在具體實施方案中，本文所述的異源二聚體對可與單克隆或嵌合抗體、淋巴因子或造血生長因子(諸如例如，IL-2、IL-3和IL-7)組合使用，例如用于增加與分子相互作用的效應子細胞的數量或活性，以及增加免疫應答。本文所述的異源二聚體對也可有利地與一種或多種藥物，諸如例如抗癌劑、抗炎劑或抗病毒劑組合用于治療疾病、病癥或感染。試劑盒本發明另外提供包括一種或多種異源二聚體對的試劑盒。該試劑盒的單個組分可包裝在單獨的容器中，并且此類容器還附有監管藥物或生物產品的制造、使用或銷售的政府機構的規定的注意事項，表明已獲得制造、使用或銷售機構的批準。該試劑盒可任選地包含概述異源二聚體對的使用方法或施用方案的說明或指導。當該試劑盒的一種或多種組分以溶液例如水溶液或無菌水溶液提供時，容器意指本身可為可將溶液施用于或施加到受試者以及與試劑盒的其他組分混合的吸入器、注射器、吸管、滴眼管或其他此類類似設備。該試劑盒的組分也可以干燥或凍干形式提供，并且該試劑盒可另外包含用于凍干組分復原的合適溶劑。無論容器的數量或類型如何，本發明的試劑盒還可包括幫助將組合物施用于受試者的儀器。此類儀器可以是吸入器、噴鼻設備、注射器、吸管、手術鉗、量匙、滴眼管或類似的醫療核準遞送工具。計算機實施在一個實施方案中，計算機包括連接到芯片集的至少一個處理器。連接到芯片集的還有存儲器、存儲設備、鍵盤、圖形適配器、指點設備和網絡適配器。顯示器連接到圖形適配器。在一個實施方案中，芯片集的功能由存儲控制中心和I/O控制中心提供。在另一個實施方案中，存儲器直接連接到處理器而非芯片集。存儲設備是能夠保持數據的任何設備，如硬盤驅動器、光盤只讀存儲器(CD-ROM)、DVD或固態存儲設備。存儲器保持處理器使用的指令和數據。指點設備可以是鼠標、軌跡球或其他類型的指點設備，并且與鍵盤組合用于將數據輸入計算機系統。圖形適配器在顯示器上顯示圖像和其他信息。網絡適配器將計算機系統連接至局域網或廣域網。如本領域已知，計算機可具有與上文描述不同的和/或其他部件。此外，計算機可缺乏某些部件。此外，存儲設備可以是計算機本地的和/或遠程的(諸如包括在存儲區域網絡(SAN)內)。如本領域已知，計算機能夠執行計算機程序模塊，以提供本文所述的功能。如本文所用，術語“模塊”是指用于提供指定的功能的計算機程序邏輯。因此，模塊可以硬件、固件和/或軟件實施。在一個實施方案中，程序模塊存儲于存儲設備上，加載到存儲器并由處理器執行。應當理解，本文所述的實例和實施方案僅為了進行示意性的說明，并且據其進行的各種修改或變化將對本領域的技術人員作出提示，并且包括在本專利申請的精神和范圍以及所附權利要求的范圍內。實施例下文是執行本發明的具體實施方案的實例。這些實施例的提供僅為了進行示意性的說明，不旨在以任何方式限制本發明的范圍。已作出努力來確保關于所用的數字(例如，量、溫度等)的準確性，當然應允許存在一些實驗誤差和偏差。除非另外指明，本發明的實施將利用本領域內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術和藥理學常規方法。此類技術在文獻中充分解釋。參見例如，T.E.Creighton，Proteins：StructuresandMolecularProperties(W.H.FreemanandCompany，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(WorthPublishers，Inc.，最新版)；Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual(第2版，1989)；MethodsInEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan編，AcademicPress，Inc.)；Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版(Easton，Pennsylvania：MackPublishingCompany，1990)；Carey和Sundberg，AdvancedOrganicChemistry，第3版(PlenumPress)，第A和B卷(1992)。實施例1：分子建模和計算機引導的Fab界面工程改造將結構和計算分子建模引導的方法用于生成重鏈和輕鏈突變設計的文庫，該文庫可在其他抗體(Ab)或其片段的范圍中篩選，以鑒定在所關注的抗體中表現出所需特異性的突變。工程改造優先的重鏈(H)-輕鏈(L)配對的設計策略包括首先鑒定代表性Fab(即D3H44)。如表1所示，該Fab的關鍵標準為：Fab是人/人源化的，具有常用的VH和VL亞群，并且包含最小框架區突變。此外，結構考慮為：VH∶VL結構域間角應接近所觀察的抗體的平均值。在選擇FabD3H44后，使用雙向方法進行Fab界面的計算機模擬分析，以鑒定和理解對重鏈和輕鏈之間相互作用重要的殘基。第一方法涉及Fab可變和恒定界面之間的序列保守性的全局分析，該方法通過已知抗體的序列和結構比對進行。各種抗體亞群的恒定和可變結構域序列的比對如圖1所示。圖1A示出了代表性人VH生殖系亞群的比對。圖1B示出了代表性人κVL生殖系亞群的比對。圖1C示出了代表性人λVL生殖系亞群的比對。圖1D示出了人CH1等位基因序列的比對。圖1E示出了人κ和λ等位基因序列的比對。第二方法涉及使用許多分子建模工具進行D3H44晶體結構界面的分析，如圖2所示(例如ResidueContactsTM)。這些分析的結果是鑒定用于工程改造優先的H-L配對的熱點位置列表。該分析確定的熱點位置列于表2中。這些位置和氨基酸主要是框架殘基(除CDR3環中的少數位置之外)，并且在λL鏈中也是基本上保守的。母體D3H44序列的氨基酸和Kabat編號提供于表3a-3b中。然后，在3D晶體結構中熱點位置以及鄰近所關注的熱點位置處的可能突變通過計算機模擬誘變和ZymepackTM堆積/建模模擬和鑒定。ZymepackTM是給出輸入結構和一組突變，根據所提供的突變改變輸入結構中的殘基類型，并生成近似于突變蛋白的物理結構的新結構的軟件包。另外，Zymepack通過計算許多定量度量評估突變蛋白的性質。這些度量包括空間和靜電互補的測定值，該測定值與突變蛋白的穩定性、結合親和力或異源二聚體特異性相關。圖3提供了可變結構域中重鏈和輕鏈界面處的熱點位置子集，并且顯示了如何將突變引入這些界面位置處，以促進專性鏈的選擇配對，同時排斥不正確鏈對的形成。使用包括ZymepackTM的計算方法對空間互補進行建模，并且根據能量因素，諸如范德華堆積、空穴效果和疏水基團的緊密接觸進行計算。相似地，對靜電相互作用能量進行建模，并且根據電荷之間的庫侖相互作用、氫鍵和去溶劑化效應進行評估。模擬通過引入所關注的突變獲得的優選的重鏈和輕鏈對模型(諸如H1∶L1(或H2∶L2))和不正確對模型(諸如H1∶L2(和H2∶L1))二者，以計算相對空間和靜電得分。這允許確定特定的突變集是否導致有利的能量，即相對于不正確(非專性)對，優選的(專性)重鏈-輕鏈對，具有更大的空間和/或靜電互補。計算空間和靜電能量是輕鏈和重鏈配對相關的自由能的分量。因此，更大的空間和靜電互補是相對于非專性對的配對，專性對的配對相關的自由能變化更大的表征。更大的空間或靜電互補產生專性重鏈和輕鏈的優先(選擇性)配對(相對于非專性對)。實施例2：設計的選擇和描述實施例1描述的方法用于設計表現出選擇性或優先配對的重鏈-輕鏈異源二聚體對(例如H1-L1和H2-L2)。異源二聚體成對設計，稱為“設計”或“設計集”，且包括促進優先配對的H1、L1、H2或L2鏈上的一組置換(表5)。設計集以“LCCA設計”初始測試(表4)，其中一條重鏈與兩條輕鏈共表達，以評估相對配對。使用Kabat編號系統結合表3a、3b鑒定氨基酸置換。將國際專利申請No.PCT/CA2013/050914的表30描述的設計文庫用作鑒定表4所示的一些LCCA設計和表5所示的設計集的起始點。表4和表5中的一些設計是新的獨立設計。表6示出了核心設計，以及相關的唯一標識符。大部分設計僅跨越恒定區，少數設計還包括可變區的修飾。這些設計的提出旨在進一步驅動配對特異性，同時還有利于其他抗體系統的可轉移性。對于衍生設計，將國際專利申請No.PCT/CA2013/050914的表30描述的設計文庫用作起始點，該設計通過結構相似性成簇，并且根據配對特異性的強度、對抗原結合的作用以及通過差示掃描量熱法(DSC)測定的穩定性排序。然后組合(參見表7中的實例)和/或優化(參見表8和表9中的實例)設計得到衍生設計。對于組合，設計中的至少一個表現出高配對特異性，其他設計表現出一系列有利的配對特異性。所有被選為組合和/或優化的設計表現出對抗原結合無作用/最小作用，以及對熔融溫度(Tm)無作用/最小作用。單獨(在表5的設計類型列下被歸類為獨立)以及結合衍生設計(在表5的設計類型列下被歸類為獨立/組合；還可參見表10中的實例)測試獨立的設計。設計被堆積成D3H44的分子模型并計算度量(如實施例1所述)。然后根據風險(對穩定性以及免疫原性的可能影響)和影響(考慮驅動配對特異性的建議強度)選擇最優設計。這些最優設計如表5所示。實施例3：編碼D3H44IgG重鏈和D3H44IgG輕鏈的Fab構建體的制備。抗組織因子抗體D3H44的野生型Fab重鏈和輕鏈如下所述制備。D3H44Fab輕鏈(AJ308087.1)和重鏈(AJ308086.1)序列取自GenBank(表3c)，基因合成并對哺乳動物表達進行密碼子優化。輕鏈載體插入序列由5’-EcoRI切割位點-HLA-A信號肽-HA或FLAG標簽-輕鏈Ig克隆-“TGA終止”-BamH1切割位點-3’構成，連接至pTT5載體(DurocherY等，Nucl.AcidsRes.2002；30，No.2e9)。對所得的載體+插入序列測序，以確認閱讀框和編碼DNA的序列正確。同樣，重鏈載體插入序列由5’-EcoR1切割位點-HLA-A信號肽-重鏈克隆(在T238終止；參見表3a)-ABD2-His6標簽-TGA終止-BamH1切割位點-3’構成，連接至pTT5載體(ABD；白蛋白結合結構域)。同樣對所得的載體+插入序列測序，以確認閱讀框和編碼DNA的序列正確。各種包含設計集的氨基酸置換的FabD3H44構建體通過基因合成或定點誘變生成(BramanJ，PapworthC&GreenerA.，MethodsMol.Biol.(1996)57：31-44)。分別在C-和N-末端標記重鏈和輕鏈，以便有利于通過競爭分析-SPR篩選評估優先配對。ABD2-His6重鏈標簽特異性允許H-L復合物捕獲在抗-his標簽SPR芯片表面，而FLAG和HA輕鏈標簽允許定量相對L1和L2群體。實施例4：包含D3H44IgG輕鏈和/或重鏈的恒定結構域修飾或恒定和可變結構域修飾組合的Fab異源二聚體的優先配對評估。包含根據表12的LCCA設計集的氨基酸修飾的Fab形式的編碼D3H44IgG重鏈和輕鏈的構建體如實施例3所述制備。在LCCA設計集(H1，L1，L2)的范圍中，構建體優先配對形成所需的H1-L1異源二聚體的能力使用輕鏈競爭分析(LCCA)測定。LCCA定量一條重鏈與至少兩條獨特的輕鏈的相對配對，并且可匯總如下。一條D3H44重鏈Fab構建體與兩條獨特的D3H44輕鏈Fab構建體共表達，相對輕鏈配對特異性(例如H1-L1∶H1-L2)以競爭分析-SPR篩選測定，重復進行。通過減少L1(設計為優先地與H鏈配對)相對于L2的量(例如L1∶L2＝1∶3，以重量計)，同時保持有限量的重鏈(即H1∶L1+L2為1∶3)，使LCCA篩選比率失真，以鑒定強驅動。所形成的每個異源二聚體的量(即H1-L1和H1-L2)如下所述測定：通過his-標簽下拉使重鏈結合至SPR芯片，然后使用這些標簽特異性的抗體檢測每個輕鏈標簽(HA或FLAG)的量。隨后，通過輕鏈競爭分析檢驗選擇異源二聚體命中，據此L1∶L2DNA比率在轉染期間以1∶3和1∶9變化，同時保持有限量的重鏈。還注意到，在D3H44系統中，輕鏈標簽(HA或FLAG)不影響LCCA配對(參見國際專利申請No.PCT/CA2013/050914的實施例10)。分析設計的示意性表示如圖4所示。圖5示出了如何標記重鏈和輕鏈以及如何評估優先配對。LCCA的實驗詳情在下文提供。轉染方法包含一條重鏈和兩條輕鏈構建體的LCCA設計如實施例3所述制備，如下所述轉染至CHO-3E7細胞。CHO-3E7細胞以1.7-2x106個細胞/ml的密度在37℃下、補充有4mM谷氨酰胺和0.1％KoliphorP188(Sigma#K4894)的FreeStyleTMF17培養基(Invitrogencat#A-1383501)中培養。使用PEI-pro(Polyplustransfection#115-375)、以1∶2.5的DNA∶PEI比率，對2ml的總體積轉染總共2μgDNA。在二十四小時后加入DNA-PEI混合物，將細胞轉移至32℃。在第7天通過非還原SDS-PAGE分析，然后用考馬斯藍染色觀察條帶，以測試上清液的表達。H∶L比率如表11所示。競爭分析SPR方法在LCCA設計中，D3H44輕鏈與D3H44重鏈優先配對的程度使用位于每條輕鏈的N-末端的獨特的表位標簽的基于SPR的讀數評估。表面等離振子共振(SPR)供應商。GLC傳感器芯片、BioradProteOn胺耦合試劑盒(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺(sNHS)和乙醇胺)和10mM乙酸鈉緩沖液購自Bio-RadLaboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)。4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA)和NaCl購自Sigma-Aldrich(Oakville，ON)。10％Tween20溶液購自Teknova(Hollister，CA)。SPR互物傳感分析。所有表面等離振子共振分析使用BioRadProteOnXPR36儀器(Bio-RadLaboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))和PBST運行緩沖液(PBSTeknovaInc，含0.05％Tween20)在25℃的溫度下進行。抗五His捕獲表面使用GLM傳感器芯片生成，該傳感器芯片通過1∶5稀釋的標準BioRadsNHS/EDC溶液以100μL/min沿分析物(水平)方向注射140s活化。在活化后，立即以25μL/min的流速沿分析物(垂直)方向注射25μg/mL溶于10mMNaOAcpH4.5的抗五His抗體(QiagenInc.)溶液，直到固定大約3000個共振單位(RU)。其余的活化組通過以100μL/min沿分析物方向注射1M乙醇胺140s猝滅，這還確保生成用于空白參照的模擬活化中間點。篩選結合抗FLAG(SigmaInc.)和抗HA(RocheInc.)單克隆抗體的異源二聚體以兩步進行：沿配體方向使異源二聚體間接捕獲在抗五His表面上，然后沿分析物方向注射抗FLAG和抗HA。首先，以100μL/min沿配體方向注射PBST一次30s，用于穩定基線。對于每次異源二聚體捕獲，在PBST中將細胞培養基中未純化的異源二聚體稀釋至4％。以25μL/min的流速沿單個配體通道同時注射一至五個異源二聚體或對照(即包含100％HA-輕鏈或100％FLAG-輕鏈的對照)240s，在抗五His表面上得到大約300至400RU的飽和異源二聚體捕獲。如果需要，第一配體通道留空，用作空白對照。在該異源二聚體捕獲步驟后，立即沿分析物方向進行兩次緩沖液注射以穩定基線，然后5nM抗FLAG和5nM抗HA各自以50μL/min注射120s兩次，其中解離階段180s，得到一組含每個捕獲的異源二聚體的緩沖液參照的結合傳感圖。在最后剩余的分析物通道上注射異源二聚體結合的組織因子(TF)抗原作為活性對照。異源二聚體通過100μL/min脈沖0.85％磷酸18s再生，以準備下一次注射循環的抗五His表面。將傳感圖進行比對并使用緩沖液空白注射和中間點進行雙重參照，使用ProteOnManager軟件v3.0分析所得的傳感圖。結果LCCA結果如表12、13a和14a所示。注意到，在表13和14中，“唯一標識符”可以不與表5準確對應，因為兩個組成LCCA的唯一標識符可沿任何一個方向((集#H1L1L2-集#H2L2L1)或(集#H2L2L1-集#H1L1L2))。每個LCCA設計的優先配對的評估如表12的最后3列所示。相同的數據還包括在表13a和14a的第5、6和8或10、11和13列的設計對范圍中。給每個獨特的H1、L1和L2突變(LCCA設計)組分配獨特編號或‘集#’(例如9567或9087)。當數據以H1L1H2L2形式(Fab對形式或設計集)呈現時，從而此類設計集以包括兩個組成LCCA的集編號(例如9567-9087)的“唯一標識符”表示。注意到，大部分LCCA實驗對包含位于恒定結構域中的鏈間Fab二硫鍵(H/C233-L/C214，Kabat編號)的構建體進行。在表13(a和b)和14(a和b)中，為加亮顯示特別設計相對于優先配對的成功，兩個互補LCCA集(H1、L1、L2和H2、L2、L1)以Fab對的形式表示。標簽的存在(L鏈：HA和FLAG，H鏈：ABD2-His6)不影響D3H44WT的預期～50％∶50％中性配對。在表中，所報告的LCCA數據是比率形式的中值(H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1)(歸一化為1∶1的L1∶L2DNA比率)。此外，LCCA數據歸一化為100％，因為據觀察一些變體的L1和L2的總量顯著不同于100％。據信該總輕鏈百分比的不一致部分是由于在初始異源二聚體捕獲于SPR芯片上期間出現可變非特異性結合。由于LCCA實驗以2個不同的L1∶L2DNA比率(L1∶L2分別為1∶3和1∶9)進行，兩個LCCA歸一化比率列于表中。注意到，一些LCCA實驗的LCCA數據未報告，因為所獲得的實驗數據未滿足納入標準(例如捕獲于SPR芯片上的Fab小于100，或L1和L2的LCCA總量落在60至140的范圍之外)。表12列出了數據已獲得的所有LCCA設計(530個)。考慮到兩個L1∶L2DNA比率為1∶3和1∶9，在530個LCCA設計中，這些LCCA設計中的490個(92.5％)具有至少60％的正確配對(L1∶L2DNA比率歸一化為1∶1)。其余的LCCA設計包括主要為中性的LCCA設計(32/530或6.0％)以及少量產生不一致結果的LCCA設計(8/530或1.5％)。表12所示的設計主要為靜電的(基于利用氫鍵或電荷-電荷相互作用的特異性驅動)，一些設計還包括空間互補和/或鏈間共價二硫鍵。一些設計還包括用于在不存在天然鏈間二硫鍵(通過H/C233-L/C214形成)的情況下形成新二硫鍵的突變。對于設計集的兩個異源二聚體，表13(a和b)和14(a和b)列出了提供LCCA數據的447個設計。表13a和14a示出，實施例1描述的計算機模擬設計方法在許多不同組的設計及其變型中實現了H1-L1而非H1-L2以及H2-L2而非H2-L1的優先配對。表13(a和b)列出了配對：錯配的Fab異源二聚體的平均LCCA性能(對于H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1，歸一化為1∶1的L1∶L2比率的中值平均值)為至少86∶14的那些設計，而表14(a和b)列出了配對：錯配的Fab異源二聚體的平均LCCA性能小于86∶14的那些設計。每個LCCA的性能歸一化為100％以及1∶1的L1∶L2DNA比率(如上文該實施例所述)，并且由標量值((ln(r1/f1)或ln(r2/f2))(其中r1和r2分別對應于實驗比率下H1L1∶H1L2和H2L2∶H2L1的中值，f1和f2對應于各自的實驗比率)以及配對：錯配的Fab異源二聚體的比率描述。每個設計還具有相關平均LCCA性能標量值(0.5(ln(r1/f1)+ln(r2/f2)))，該值還歸一化為100％以及1∶1的L1∶L2DNA比率(如上文該實施例所述)。此外，示出了設計的每個LCCA的標量范圍(LCCA1和LCCA2分別對應于H1L1∶H1L2和H2L2∶H2L1實驗)。在447個Mab設計中，354個(79.2％)表現出至少86∶14的LCCA性能平均值(表13a和b)。表13(a和b)內的設計還根據設計的相似性表征為13個簇。每個簇內的設計按照平均LCCA性能標量值從最高到最低排列。此外，表13a內的LCCA數據還在圖7中圖解表示。圖7示出了箱線圖，其示出每個簇的配對：錯配的Fab異源二聚體的平均LCCA性能值為至少86∶14。每個箱的底部表示第一四分位(Q1)，它是最小值和中值之間的中值平均LCCA性能值，使得小于第1四分位的值表示最小的25％的數據。箱內部的水平條表示第二四分位，它是簇的中值平均LCCA性能值。每個箱的頂部表示第三四分位(Q3)，它是最大值和中值之間的中值平均LCCA性能值，使得大于第3四分位的值表示最大的25％的數據。四分位距是Q3和Q1之間的差值。在兩個方向垂直延伸的箱須表示在Q1-(1.5*IQR)或Q3+(1.5*IQR)內的那些值的數據范圍。覆蓋箱須的水平條表示該范圍內的最大和最小值。存在于箱線圖和箱須外部的數據被鑒定為異常值，適度異常值以點表示(與Q1或Q3的差異為1.5*IQR至3*IQR)，極限異常值以加號表示(與Q1或Q3的差異大于3*IQR)。實施例5：生物物理學表征的放大放大(通常至20m1)唯一標識符組(表5)所示的正確配對的異源二聚體，并且如下所述純化以測試熱穩定性和抗原結合。每個異源二聚體的重鏈和輕鏈在20mlCHO-3E7細胞培養物中表達。CHO-3E7細胞以1.7-2x106個細胞/ml的密度在37℃下、補充有4mM谷氨酰胺和0.1％KoliphorP188(Sigma#K4894)的FreeStyleTMF17培養基(Invitrogencat#A-1383501)中培養。使用PEI-pro(Polypluscat#115-375)、以1∶2.5的DNA∶PEI比率，對20ml的總體積轉染總共20μgDNA。在二十四小時后加入DNA-PEI混合物，將細胞轉移至32℃。在轉染7天后離心細胞，通過高通量鎳親和層析純化從上清液純化異源二聚體，如下文所述。上清液在平衡緩沖液(無鈣、鎂和酚紅(HyCloneTM#SH30028.02)的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS))中稀釋至20-25％細胞培養上清液，然后與Ni-NTA樹脂(ThermoScientific#PT-88222)(也預先用平衡緩沖液平衡)一起攪拌孵育12小時。然后通過離心收集樹脂，轉移至96孔燒結板，用平衡緩沖液洗滌三次，并使用洗脫緩沖液(Sigma-Aldrich#H5413)洗脫。在純化后，通過非還原高通量蛋白質表達(HighThroughputProteinExpress)分析、使用CaliperLabChipGXII(PerkinElmer#760499)評估異源二聚體表達。工序根據HTProteinExpressLabChipUserGuide(HT蛋白質表達LabChip用戶指南)第2版LabChipGXIIUserManual(LabChipGXII用戶手冊)進行，并作出以下修改。將2μl或5μl異源二聚體樣品(濃度范圍5-2000ng/μl)以及7μlHT蛋白質表達樣品緩沖液(HTProteinExpressSampleBuffer)(PerkinElmer#760328)加入96孔板(BioRad#HSP9601)中單獨的孔。然后使異源二聚體樣品在70℃下變性15min。LabChip儀器使用HT蛋白質表達芯片(HTProteinExpressChip)(PerkinElmer#760499)和Ab-200分析設置運行。在使用后，用MilliQ水清洗芯片，并保存在4℃。實施例6：通過DSF進行Fab異源二聚體的熱穩定性測定。為評估熱穩定性，使用差示掃描熒光(DSF)作為從野生型、未經修飾的重鏈-輕鏈對篩選所有正確配對的異源二聚體的高通量方法。異源二聚體如實施例5所述制備。熱穩定性的測定使用DSF如下所述測定所有異源二聚體對的熱穩定性。每個異源二聚體如實施例5所述純化，并且在DPBS(HyCloneCat#SH30028.02)中稀釋至0.5mg/mL。對于大部分樣品，SyproOrange凝膠染色的工作儲液(LifeTechnologiesCat#S-6650)通過將4μLSyproOrange凝膠染色稀釋至2mlDPBS來制備。DSF樣品通過將14μL0.5mg/mL蛋白質加入60μL稀釋的SyproOrange凝膠染色工作儲液來制備。然而，對于小于0.5mg/mL的蛋白質，每個DSF樣品通過將14μL未稀釋的蛋白質加入60μLSyproOrange染料工作儲液(即在DPBS中稀釋至1∶1500)來制備。然后使用Rotor-Gene6000qPCR儀器(QiaGenInc)對20μl等分試樣重復進行DSF分析。從30℃至94℃間隔1℃掃描每個樣品，每個步驟之間平衡10秒，開始時等待時間30秒。使用470nM的激發濾光器和610nM的發射濾光器，增益為9。使用變性曲線的一階導數的最大值作為Tm，通過Rotor-Gene6000軟件分析數據。使用以下不改變測定Tm值的方案修改類似地制備和分析其余的DSF樣品：1)通過將1μLSyproOrange凝膠染色稀釋至2mlDPBS來制備工作儲液，2)分析30μl等分試樣以及3)使用10的增益。DSF結果如表12、13b和14b所示。在LCCA設計的范圍中H1∶L1Fab的熱穩定性(與野生型相比DSF值和DSF值的變化)如表12的第3和4列所示。相同的DSF值也包括在表13b和14b的第7和8列的設計對范圍中。對于其中進行重復的每個Fab異源二聚體，所報告的Tm值為中值。Fab異源二聚體Tm值相對于野生型Fab異源二聚體(包含HA標簽的野生型Fab構建體，中值Tm為81.0℃)的Tm值的比較在H1L1_dTm_dsf列中報告。注意到，對于缺乏天然鏈間二硫鍵(在H鏈C233和L鏈C214之間)的新Fab異源二聚體，不評估未確定為缺乏天然鏈間二硫鍵的對應的野生型Fab的H1L1_dTm_dsf值。還注意到，由于相應實驗的品質(例如低產率、低強度、部分封閉的峰以及Fab異源二聚體的重復序列之間的波動大于1℃)，未報告一些Fab異源二聚體的Tm值(Fab異源二聚體的17/230或7.4％)。對于這些Fab異源二聚體的一些，報告類似的Fab異源二聚體的Tm值對應的預計Tm值，所述類似的Fab異源二聚體的不同之處僅為存在/不存在或鑒定到連接的L鏈標簽(HA或FLAG)。對于預計Tm值，對應的野生型Tm值(81.2℃)是從所有野生型Fab異源二聚體構建體(即包含HA標簽或FLAG標簽的Fab構建體)獲得的中值。HA或FLAG標簽不會顯著影響野生型Fab異源二聚體的Tm值。總之，與WT相比，Fab異源二聚體表現出類似的Tm值。在包含天然鏈間二硫鍵以及可獲得DSF數據的Fab異源二聚體中，93％(195/209)的Fab異源二聚體相對于WT表現出降低3℃或更少。此外，受影響最大的Fab異源二聚體相對于WT表現出降低6.5℃。表12列出了Tm降序排列的LCCA設計。此外，鑒定了Fab異源二聚體的穩定性基本上改善的十三個氨基酸置換(參見表34)。在包括穩定突變的Fab異源二聚體與不同之處為不存在穩定突變的類似Fab異源二聚體的比較之后，鑒定穩定突變。重鏈穩定突變包括A125R、H172R、L143F、Q179D、Q179E、Q39R、S188L和V190F。輕鏈穩定突變包括Q124E、Q124R、Q160F、S176L和T180E。總之，穩定突變增加穩定性0.4℃至2.1℃。重鏈穩定突變A125R、H172R、L143F、Q179D、Q179E、Q39R、S188L和V190F分別增加穩定性0.4℃至0.6℃、0.4℃至2.1℃、0.4℃、0.5℃至0.6℃、0.5℃至0.8℃、1.1℃至1.6℃、0.4℃至1.2℃和1℃。輕鏈穩定突變Q124E、Q124R、Q160F、S176L和T180E分別增加穩定性0.4℃至0.5℃、0.8℃至0.9℃、0.6℃、0.4℃至1.0℃和0.5℃。實施例7：Fab異源二聚體抗原親和力測定。評估Fab異源二聚體結合組織因子的能力，以確定氨基酸置換是否對異源二聚體結合抗原的能力具有影響。每個Fab異源二聚體對組織因子的親和力如下所述通過SPR測定。SPR供應商。GLC傳感器芯片、BioradProteOn胺耦合試劑盒(EDC、sNHS和乙醇胺)和10mM乙酸鈉緩沖液購自Bio-RadLaboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)。含0.05％Tween20(PBST)的PBS運行緩沖液購自TeknocaInc.(Hollister，CA)。Fab異源二聚體的分批。純化的Fab異源二聚體分3批A、B和C測試。批次A和B保存在4℃大約1個月，然后進行SPR分析，而批次C的純化的Fab異源二聚體保存在4℃大約2個月，然后進行SPR分析。批次C的Fab異源二聚體在表12中以對應的KD值之后的“+”表示。所有表面等離振子共振分析使用BioRadProteOnXPR36儀器(Bio-RadLaboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))和PBST運行緩沖液在25℃的溫度下進行。抗五His捕獲表面使用GLC傳感器芯片生成，該傳感器芯片通過1∶5稀釋的標準BioRadsNHS/EDC溶液以100μL/min沿分析物(水平)方向注射140s活化。在活化后，立即以25μL/min的流速沿分析物(垂直)方向注射25μg/mL溶于10mMNaOAcpH4.5的抗五His抗體(QiagenInc.)溶液，直到固定大約3000個共振單位(RU)。其余的活化組通過以100μL/min沿分析物方向注射1M乙醇胺140s猝滅，這還確保生成用于空白參照的模擬活化中間點。篩選結合TF抗原的Fab異源二聚體以兩步進行：沿配體方向使Fab異源二聚體間接捕獲在抗五His抗體表面上，然后沿分析物方向同時注射5個濃度的純化的抗原和一次緩沖液空白雙重參照。首先，以100uL/min沿配體方向注射緩沖液一次30s，以穩定基線。一至五個變體或對照以3.4μg/ml的濃度溶于PBST，將它們以25μL/min的流速沿單個配體通道同時注射240s。對于批次A和B，這在抗五His表面上得到大約1000RU的平均捕獲，對于批次C，在抗五His表面上得到大約600RU的平均捕獲。如果需要，第一配體通道留空，用作空白對照。在該捕獲步驟后，立即沿分析物方向進行兩次緩沖液注射，每次100μL/min30s，以穩定基線，然后以50μL/min同時注射60nM、20nM、6.7nM、2.2nM和0.74nM抗原(TF)以及緩沖液空白120s，其中解離階段600s。捕獲抗體表面通過100μL/min脈沖0.85％磷酸持續18s，18s兩次再生，以準備下一次注射循環。將傳感圖進行比對并使用緩沖液空白注射和中間點進行雙重參照，使用ProteOnManager軟件v3.1分析所得的傳感圖。雙重參照傳感圖擬合至1∶1結合模型。每個抗原的Rmax值歸一化為每個變體的抗體捕獲水平，并與100％對照比較。Fab異源二聚體樣品的抗原親和力(KD)值在表12、13b和14b中報告。在LCCA設計的范圍中H1∶L1Fab的KD值(KD、KD值的范圍以及與野生型相比KD值中值的變化)分別如表12的第5、6和7列所示。在表13b和14b的第3列(H1-L1Fab異源二聚體的KD)、第4列(與野生型相比H1-L1Fab異源二聚體的KD的變化)、第5列(H2-L2Fab異源二聚體的KD)和第6列(與野生型相比H2-L2Fab異源二聚體的KD的變化)中，相同的KD值也包括在設計對的范圍中。僅測定表現出至少100RU的Fab異源二聚體捕獲的Fab異源二聚體樣品的KD值。參照野生型KD(0.157nM)反映了其中輕鏈包含FLAG標簽的野生型Fab異源二聚體的中值。野生型Fab異源二聚體(包含FLAG或HA標簽)表現出類似的KD值，使得觀察到最大值和最小值之間存在2.6倍差異。在表12、13b和14b中，示出了相對于野生型抗原結合親和力的KD差值，該差值使用-(log(KD)設計-log(KD)野生型)計算，使得正值表示與野生型相比，Fab異源二聚體對抗原結合親和力的KD值減小，而負值表示KD值增加。注意到，一些Fab異源二聚體缺乏測定KD值。在這些情況的一些中，評估Fab異源二聚體，但SPR實驗顯示Fab異源二聚體捕獲減少(即小于100RU)，因此不可能準確測定KD值。對于表現出與其他Fab異源二聚體相似的那些Fab異源二聚體(即不同之處僅為存在/不存在或鑒定到連接的L鏈標簽(HA或FLAG))，提供類似的Fab異源二聚體的KD值對應的預計KD值(如表12、13b和14b所示)。對應的預計野生型KD值(0.15nM)是從所有野生型Fab異源二聚體構建體(即包含HA標簽或FLAG標簽的Fab構建體)獲得的中值。總之，結果顯示，正確配對的異源二聚體(從設計的角度)表現出類似于野生型的抗原結合親和力(在參照野生型親和力的大約2.3倍內)。實施例8.野生型標記的D3H44異源二聚體和優先配對的異源二聚體的超效液相色譜尺寸排阻色譜(UPLC-SEC)圖譜。根據本領域已知和實施例5所描述類似的方法表達和純化重鏈上具有C-末端ABD2-His6標簽、輕鏈上具有N-末端標簽(一個構建體中具有FLAG，另一個構建體中具有HA)的野生型D3H44異源二聚體(一條重鏈和一條輕鏈)。如實施例5所述，通過His標簽親和純化單獨放大和純化優先或正確配對的異源二聚體。UPLC-SEC使用WatersBEH200SEC色譜柱(2.5mL、4.6x150mm、不銹鋼、1.7μm顆粒)進行，該色譜柱設定為30℃并且安裝在具有PDA檢測器的WatersAcquityUPLC系統上。運行時間包括7min，HycloneDPBS/改良-鈣-鎂運行緩沖液(部件No.SH30028.02)的每次注射總體積2.8mL，0.4ml/min。通過200-400nm范圍內的UV吸光度監測洗脫，并提取280nm下的色譜圖。使用Empower3軟件進行峰積分。圖6示出了代表性WTFab異源二聚體對(L鏈上包含FLAG標簽)以及代表性(LCCA設計9735、9737和9740的H1L1Fab部件)設計Fab異源二聚體對的UPLC-SEC圖譜。一般來講，與WT相比，設計Fab異源二聚體對表現出類似的UPLC-SEC圖譜。實施例9：在包含雙特異性抗體形式的恒定結構域或恒定結構域和可變結構域修飾的共表達集中，異源二聚體的優先配對評估評估異源二聚體設計，以確定它們是否還允許雙特異性抗體形式的優先配對。在該實例中，為促進獨特的重鏈的異源二聚化，對每個異源二聚體的全長重鏈的Fc區進行不對稱修飾，使得一條重鏈包含突變T350V、L351Y、F405A和Y407V，另一條重鏈包含突變T350V、T366L、K392L和T394W(EU編號)。構建體的制備：在以下雙特異性抗體的范圍中測試異源二聚體設計：a)D3H44/曲妥單抗、b)D3H44/西妥昔單抗和c)曲妥單抗/西妥昔單抗。注意到，D3H44是人抗體，曲妥單抗是人源化抗體，西妥昔單抗是由人IgG1和小鼠Fv區構成的嵌合抗體。根據設計，編碼包含氨基酸修飾的D3H44、曲妥單抗和西妥昔單抗IgG重鏈和輕鏈的構建體如下所述制備。D3H44、曲妥單抗和西妥昔單抗的重鏈和輕鏈的基本DNA序列如表3C所示。D3H44、曲妥單抗和西妥昔單抗輕鏈序列如實施例3所述制備，不同的是一些序列缺乏標簽，而另一些序列包含FLAG或HA標簽。D3H44、曲妥單抗和西妥昔單抗重鏈序列如實施例3所述制備，不同的是全長重鏈通過所附編碼鉸鏈-CH2-CH3結構域的IgG1*01DNA序列創建，并且修飾為促進Fab重鏈的CH1結構域的C-末端上的異源二聚化。值得注意的是，移除典型C-末端重鏈賴氨酸殘基，以防止由于C-末端賴氨酸剪切而導致的LC-MS信號不均一(LawrenceW.DickJr.等，Biotechnol.Bioeng.(2008)100：1132-43)。分析形式(SMCA)如下文所述評估異源二聚體共表達集設計優先配對形成雙特異性抗體的能力。該分析基于四條鏈(一個抗體的H1和L1鏈，另一個抗體的H2和L2鏈)的共表達，并使用質譜(LC-MS)檢測正確形成的雙特異性抗體的存在。圖8提供了描述四條起始多肽鏈以及在不存在異源二聚體對的重鏈和輕鏈之間的優先配對的情況下，這些起始多肽鏈的共表達獲得的可能產物的示意圖。兩個全長重鏈構建體與兩個獨特的輕鏈構建體共表達，得到十種可能的抗體種類：H1-L1∶H1-L1、H1-L2∶H1-L2、H1-L1∶H1-L2、H2-L1∶H2-L1、H2-L2∶H2-L2、H2-L1∶H2-L2、H1-L1∶H2-L1、H1-L2∶H2-L2、H1-L2∶H2-L1和H1-L1∶H2-L2。H1-L1∶H2-L2種類是正確配對的雙特異性抗體(參見圖8)。在pA純化和去糖基化后使用LC-MS測定優選種類H1-L1∶H2-L2相對于其他種類的量的相對配對特異性。如果可能，使鏈保留未標記，得到彼此不同為至少50Da的所有Mab和半抗體種類。當質量差排除該可能性時，將N-末端標簽(HA或FLAG)添加至輕鏈，以提供足夠的種類間質量區分。該分析涉及雙特異性抗體的表達和篩選步驟，稱為SMCA。質譜方法在蛋白A純化和非變性去糖基化后使用質譜評估共表達集中D3H44輕鏈與D3H44重鏈的優先配對程度。由于D3H44/曲妥單抗異源二聚體僅包含FcN-連接聚糖，所以僅用一種酶N-糖苷酶F(PNGase-F)處理該系統。純化的樣品如下所述用PNGaseF去糖基化：0.2UPNGaseF/μg抗體溶于50mMTris-HClpH7.0，在37℃下孵育過夜，最終蛋白質濃度0.5mg/mL。對于D3H44/西妥昔單抗和曲妥單抗/西妥昔單抗系統，由于西妥昔單抗的Fab區中具有另外的N-連接聚糖，所以用N-糖苷酶F加上多種外切糖苷酶處理該系統。通常，將四種酶混合物用于該用途：N-糖苷酶F、β-半乳糖苷酶(Prozyme)、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NewEnglandBiolabs)和神經氨酸苷酶。N-糖苷酶F移除FcN-連接聚糖，而外切糖苷酶將FabN-連接聚糖修剪為均一的核心結構M3F(GlcNAc2Man3Fuc1)。如下所述，使用四種酶混合物使純化的樣品去糖基化：0.2UPNGaseF/μg抗體、0.002Uα-神經氨酸苷酶/μg抗體、0.0001Uβ-半乳糖苷酶/μg抗體和0.2Uβ-N-乙酰氨基葡糖苷酶/μg抗體溶于50mMTris-HClpH7.0，在37℃下孵育過夜，最終蛋白質濃度0.5mg/mL。然而，在一些情況下，三種酶處理(N-糖苷酶F、β-半乳糖苷酶和神經氨酸苷酶)是優選的，以避免LC-MS分析中樣品組分的質量重疊。在這些情況下，Fab聚糖被還原為稍大的結構G0F(Man3GlcNAc2Fuc1GlcNAc2)。使用三種酶混合物，利用如四種酶混合物所述相同的濃度和條件使純化的樣品去糖基化。在去糖基化后，將樣品保存在4℃下，然后進行LC-MS分析。去糖基化的蛋白質樣品使用Agilent1100HPLC系統(通過IonMaxelectrospray離子源(ThermoFisher)連接到LTQ-OrbitrapXL質譜儀(ThermoFisherScientific))通過完整LC-MS進行分析。將樣品(5μg)注射到2.1x30mmPorosR2反相柱(AppliedBiosystems)，并使用以下梯度條件解析：0-3min：20％溶劑B；3-6min：20-90％溶劑B；6-7min：90-20％溶劑B；7-9min：20％溶劑B。溶劑A為脫氣0.1％甲酸水溶液，溶劑B為脫氣乙腈。流速為3mL/min。在柱后分流，將100μL引入電噴界面。將柱加熱至82.5℃，在柱前將溶劑加熱至80℃，以改善蛋白質峰形。使用ThermoFisherScientific’sLTQPositiveIonESI校正溶液(咖啡因、MRFA和Ultramark1621)校正LTQ-OrbitrapXL，并使用10mg/mLCsI溶液調諧。錐孔電壓(源碎裂設置)為40V，FT分辨率為7,500，掃描范圍為m/z400-4,000。LTQ-OrbitrapXL調諧用于大型蛋白(＞50kDa)的最佳檢測。使用儀器控制和數據分析軟件MassLynx(Waters)的MaxEnt1模塊將包含全抗體(m/z2000-3800)和半抗體(m/z1400-2000)。簡而言之，首先在Xcalibur(ThermoScientific)的譜查看模塊QualBrower中打開原始蛋白質LC-MS數據，并使用Waters提供的文件轉換程序Databridge轉換為MassLynx兼容格式。在MassLynx的譜模塊中查看轉換的蛋白質譜，并使用MaxEnt1反卷積。直接從所得的分子量圖譜測定每個樣品中不同抗體種類的豐度。SMCA分析的代表性設計從簇1至12選擇總共25個具有高平均LCCA性能值的代表性設計，用于以SMCA形式測試。使用類似的驅動同時還共有類似的突變的，根據占據類似空間的對應設計集選擇代表性設計。從每個簇選擇至少一個代表性設計。一些簇以一個代表性設計表示(即簇1、5、7、8、10)。其余的簇具有超過一個代表性設計，因為這些簇很大(即簇2)或由小簇構成(即簇3、4、6、9、11和12)。雖然每個簇內的設計共有序列相似性，但簇內的小簇的差異為至少一組驅動突變。對于包含小簇的簇，從每個小簇選擇另外的代表性設計。每個簇的氨基酸置換列于表15至27中，并標明每個簇/小簇的對應的代表性氨基酸置換。對于簇1，僅選擇一個設計(9134-9521)來表示簇，因為這些設計利用占據類似空間的類似靜電驅動(參見表15)。對于該簇的所有成員，H1設計為允許帶負電的置換(L124E和Q179E)與L1帶正電的置換(S176R和S131K或S131R)形成鹽橋。H2設計為允許帶正電的置換(L124R和Q179K或S186K)與L2帶負電的置換(S176D和T178D或T178E和/或T180E)形成鹽橋。H1L2和H2L1的錯配是排斥的，主要原因是靜電排斥。對于簇2，選擇兩個代表性設計(9279-9518和9286-9402)來表示大簇(參見表16)。該簇內的設計利用占據類似空間的類似靜電驅動。對于該簇的所有成員，H1設計為允許帶負電的置換(L124E和L143E或L143D)與L1帶正電的置換(S176R和(Q124K和/或T178K)或(Q124K和Q160K)的組合)形成鹽橋。H2設計為允許帶正電的置換(L124R和Q179K或S186K或S186R)與L2帶負電的置換(S176D和T178D或T178E和/或T180E)形成鹽橋。H1L2和H2L1的錯配是排斥的，主要原因是靜電排斥。對于簇3，選擇五個代表性設計(9338-9748、9815-9825、6054-9327、9066-9335和9121-9373)來表示五個小簇中的每個(參見表17)。該簇的所有成員利用H1(L124E)、L1(S176R)、H2(L124R)和L2(S176D)上的類似靜電驅動，其允許在優先配對的異源二聚體中形成鹽橋，而錯配對是排斥的，主要原因是靜電排斥。為表示主要利用那些恒定區驅動的那些設計，選擇6054-9327設計來表示該小簇。除這些靜電相互作用之外，一個小簇還包括可變區空間驅動(H1L45P和L1P44F)，因此選擇包括該可變區驅動的代表性設計來表示該小簇(9338-9748)。另一個小簇還包括兩個Fab異源二聚體中的可變區靜電驅動(H1Q39E、L1Q38R、H2Q39R、L2Q38E)，因此選擇包括該可變區驅動的代表性設計來表示該小簇(9815-9825)。此外，由一個成員從而一個代表性設計(9066-9335)構成的一個小簇包括H1F122C和L1Q124C之間的工程改造二硫鍵。以9121-9373表示的其余小簇主要利用具有另外的置換(H1中的H172T和L1中的S174R)的恒定區驅動來稍微修改H1L1恒定區驅動的相互作用，同時還探測HC2中H172R的效應。對于簇4，選擇兩個代表性設計(9168-9342和9118-6098)來表示兩個小簇中的每個(參見表18)。該簇的所有成員利用H1(L124E)、L1(S176R或S176K)、H2(L124R)和L2(S176D)上的類似靜電驅動，該驅動允許在優先配對的異源二聚體中形成鹽橋，而錯配對是排斥的，主要原因是靜電排斥。以9118-6098表示的一個小簇主要將共有的靜電驅動用于優先配對，而以9168-9342表示的其他小簇還利用允許形成另外的鹽橋的H1(K228D)和L1(S121K)的置換。以唯一標識符9116-9349表示的簇5僅由1個成員構成(參見表19)。該設計利用H1(L124E)、L1(S176R)、H2(L124R)和L2(S176D)上的兩個靜電驅動，以及H1(A139W)、L1(F116A_V133G_L135V)、H2(A139G_V190A)和L2(V133G_L135W)上的空間驅動。因此，對于優先配對的異源二聚體，帶電置換允許形成鹽橋。對于錯配的Fab異源二聚體，由于靜電排斥以及另外的空間效應，其形成是排斥的。對于簇6，選擇兩個代表性設計來表示兩個小簇中的每個(參見表20)。該簇的所有成員利用恒定區中的類似靜電驅動(H1上的Q179E、L1上的S131K、H2上的S186R以及L2上的Q124E、Q160E和T180E)，該驅動允許在優先配對的異源二聚體中形成鹽橋，而錯配對是排斥的，主要原因是靜電排斥。此外，該小簇還由不同的可變區驅動構成。以唯一標識符9814-9828表示的一個小簇利用可變區中的靜電驅動(H1上的Q39E、L1上的Q38R、H2上的Q39R和L2上的Q38E)。其他小簇利用由H1中的L45P和L1中的P44F構成的可變區空間驅動。因此，對于該小簇，由于引入的空間效應，錯配對也是排斥的。注意到，該小簇以來源于唯一標識符9745-9075的設計表示，該設計的不同之處僅為不存在L2上的Q38E。對于簇7，僅選擇一個設計(9060-9756)來表示簇，因為這些設計利用類似的靜電和空間驅動(參見表21)。共有的靜電驅動包括H1上的L143E和Q179E、L1上的Q124R、H2上的Q179K以及L2上的Q124E、Q160E和T180E。共有的空間驅動包括H1上的A139W、L1上的F116A_L135V以及L2上的L135W。因此，對于優先配對的異源二聚體，Fab區中的帶電置換允許形成鹽橋。對于錯配的異源二聚體，由于靜電排斥以及另外的空間效應，其形成是排斥的。對于簇8，僅選擇一個設計(9820-9823)來表示簇，因為這些設計利用類似的靜電驅動(參見表22)。在可變區中，利用H1上的Q39E、L1上的Q38R、H2上的Q39R以及L2上的Q38E。在恒定區中，利用H1上的L143E、L1上的Q124R、Q160K和T178R、H2上的Q179K以及L2上的Q124E、Q160E和T180E。對于優先配對的異源二聚體，Fab區中的帶電置換允許形成鹽橋，而對于錯配的異源二聚體，主要由于靜電排斥，其形成是排斥的。對于簇9，選擇兩個代表性設計來表示兩個小簇中的每個(參見表23)。該簇的所有成員利用恒定區中的類似靜電驅動(H1上的L143E、L1上的Q124R、H2上的Q179K以及L2上的Q124E、Q160E和T180E)，該驅動允許在優先配對的異源二聚體中形成鹽橋，而錯配對是排斥的，主要原因是靜電排斥。此外，小簇的不同之處為存在/不存在可變區驅動(H1上的L45P和L1上的P44F)。因此，對于包含可變區驅動的小簇，由于引入的空間效應，錯配對也是排斥的。包括可變區驅動的該小簇的代表性設計來源于唯一標識符9751-9065，該設計的不同之處僅為不存在L2上的Q38E。缺乏可變區置換的小簇的代表性設計是9611-9077。對于簇10，僅選擇一個設計(9561-9095)來表示簇，因為這些設計利用占據類似空間的類似靜電和空間驅動(參見表24)。共有的靜電驅動包括H1上的L143E和Q179E、L1上類似位置的Q124R、Q124K或S131K、H2上的Q179K以及L2上的Q124E和T180E。共有的空間驅動包括H1上的L124W、L1上的V133A以及L2上的V133W。因此，對于優先配對的異源二聚體，Fab區中的帶電置換允許形成鹽橋。對于錯配的異源二聚體，由于靜電排斥以及另外的空間效應，其形成是排斥的。對于簇11，選擇三個設計(9049-9759、9682-9740和9667-9830)來表示三個小簇中的每個(參見表25)。該簇的所有成員利用靜電置換來驅動異源二聚體的優先配對。因此，對于優先配對的異源二聚體，Fab區中的帶電置換允許形成鹽橋。對于錯配的異源二聚體，主要由于靜電排斥，其形成是排斥的。對于以唯一標識符9667-9830表示的小簇，共有置換包括H1上的帶負電的置換(L143E或L143D和Q179E或Q179D)、L1上的帶正電的置換(T178R或T178K)、H2上的帶正電的置換(S186K或S186R或Q179K或Q179R)以及L2上的帶負電的置換(Q124E)。以該小簇的單個成員(唯一標識符9049-9759)表示的另一個小簇還包含用于形成工程改造的二硫鍵的置換。以唯一標識符9682-9740表示的其余的簇利用與另外兩個小簇類似的H1和L1的驅動；然而，利用不同的恒定區H2和L2驅動。H2利用L143R或L143K，而除Q124E置換(與另外兩個小簇共有)之外，L2利用V133E或V133D。對于簇12，選擇四個設計(9696-9848、9986-9978、9692-9846和9587-9735)來表示四個小簇中的每個(參見表26)。該簇的所有成員利用靜電置換來驅動異源二聚體的優先配對。一些成員還利用空間驅動。以唯一標識符9696-9848表示的小簇利用靜電和空間驅動二者。該小簇內的共有靜電置換由H1上的L143E、L1上的Q124R和T178R、H2上類似位置的S186K或S186R或Q179K或Q179R以及L2上的Q124E和T180E構成。該小簇內共有空間置換由H1上的S188L和L2上的S176L或V133Y或V133W構成；對于利用L2上的V133Y或V133W的設計，L143A或L124A也存在于H2上，以容納大體積突變。對于以唯一標識符9692-9846表示的小簇，與以唯一標識符9696-9848表示的小簇相比，利用類似的靜電驅動；對于一些成員，利用類似位置的置換T178E，而非L2上的T180E。此外，該小簇的子集還利用類似位置的置換T178Y或T178F，而非L2上的S176L的類似空間驅動。以唯一標識符9986-9978表示的小簇僅利用靜電驅動來驅動優先配對。類似的共有置換用于H1、L1和H2；然而，利用不同的L2置換(S131E)。以唯一標識符9587-9735表示的其余的小簇利用H1和L1上的類似靜電驅動(不同的是L1上的T178R不用于該小簇內的所有成員)；然而，不同的靜電驅動用于H2(L143R或L143K)和L2(Q124E和V133E或Q124E和V133D)。該小簇內的兩個成員還利用類似的空間驅動，該空間驅動由H1上的S188L和L2上的S176L構成。總之，對于優先配對的異源二聚體，Fab區中的帶電置換允許形成鹽橋。對于錯配的異源二聚體，由于靜電排斥，其形成是排斥的。此外，對于同樣利用空間驅動的設計，由于空間效應，其形成也是排斥的。簇13由一個成員9122-9371構成(參見表27)。該設計利用H1F122C和L1Q124C之間的工程改造二硫鍵，作為異源二聚體的優先配對的共價驅動。此外，由于該設計還缺乏天然鏈間二硫鍵，二硫鍵的形成通過非還原和還原SDS-PAGE凝膠確認。該設計未以SMCA形式測試；然而，在存在天然鏈間二硫鍵的情況下，與另外的恒定區驅動(簇3，代表性設計9066-9335)組合測試工程改造的二硫鍵。轉染方法如下文所述，將包含兩條重鏈和兩條輕鏈構建體的共表達集轉染至CHO-3E7細胞。CHO-3E7細胞以1.7-2x106個細胞/ml的密度在37℃下、補充有4mM谷氨酰胺和0.1％PluronicF-68(Invitrogencat#24040-032)的FreeStyle(TM)F17培養基(Invitrogencat#A-1383501)中培養。使用PEI-pro(Polypluscat#115-010)、以1∶2.5的DNA∶PEI比率，對50ml的總體積轉染總共50ugDNA。在二十四小時后加入DNA-PEI混合物，將細胞轉移至32℃并孵育7天，然后收集。通過離心收集培養基并使用Steriflip0.2μM過濾器真空過濾。然后如下文所述使用蛋白AMabSelectSuRe樹脂(GEHealthcare#17-5438-02)純化過濾的培養基。將過濾的培養基施加到此前使用PBS平衡的柱(HycloneDPBS/改良，無鈣，無鎂，#SH-300028.02)。然后使用PBS洗滌異源二聚體抗體種類，并在Amiconultra15離心過濾器Ultracel10K(Millipore#SCGP00525)中使用100mM檸檬酸鹽pH3.6洗脫。然后使用PBS交換緩沖液，并通過卡尺評估樣品，然后進行去糖基化和LC-MS。為評估野生型雙特異性抗體系統(其中一個系統的輕鏈優先地結合兩個抗體系統的重鏈)中固有的雙特異性系統偏愛性，在CHO表達中測試一組H1∶H2∶L1∶L2DNA比率。這些比率嘗試補償兩個不同抗體的重鏈和輕鏈之間的表達水平的天然差異和/或內在配對偏愛性。對于所有雙特異性抗體系統，觀察所有測試比率之間的偏愛性(圖9)。對于D3H44/曲妥單抗系統，觀察對曲妥單抗的偏愛性，即D3H44重鏈優先地與曲妥單抗輕鏈配對(參見圖9a)。對于D3H44/西妥昔單抗，觀察對西妥昔單抗的偏愛性，即D3H44重鏈優先地與西妥昔單抗輕鏈配對(參見圖9b)。對于曲妥單抗/西妥昔單抗系統，觀察對曲妥單抗的偏愛性，即西妥昔單抗重鏈優先地與曲妥單抗輕鏈配對(參見圖9c)。對于測試每個雙特異性抗體系統內25個代表性設計中的每個，所用的H1∶H2∶L1∶L2DNA比率是產生大量雙特異性抗體種類，同時具有小量半抗體的對應的野生型雙特異性系統的比率(參見表32a、b和c)。對于D3H44/曲妥單抗系統，所用的比率為15(H1)、15(H2)、53(L1)、17(L1)，其中H1和L1是指D3H44，H2和L2是指曲妥單抗。對于曲妥單抗/西妥昔單抗系統，所用的比率為15(H1)、15(H2)、17(L1)、53(L2)，其中H1和L1是指曲妥單抗，H2和L2是指西妥昔單抗。對于D3H44/西妥昔單抗系統，所用的比率為15(H1)、15(H2)、53(L1)、17(L2)，其中H1和L1是指D3H44，H2和L2是指西妥昔單抗。此外，對于D3H44/西妥昔單抗和曲妥單抗/西妥昔單抗雙特異性系統，在兩個方向測試設計，使得在一個方向，分別在雙特異性抗體系統的抗體1(Ab1)和抗體2(Ab2)上測試H1L1和H2L2上存在的置換，在另一個“翻轉”方向，分別在Ab2和Ab1上測試H1L1和H2L2上存在的置換(參見表28a和b)。唯一標識符所附的“_1”表示這樣的設計：其中獲得較強LCCA優先配對結果(參見表13a)的重鏈和相關的輕鏈置換置于其中重鏈弱競爭其相關的輕鏈，而非其他抗體的輕鏈的抗體上。唯一標識符所附的“_2”表示相反的“翻轉”方向：其中獲得較強LCCA優先配對結果(參見表13a)的重鏈和相關的輕鏈置換置于其中重鏈較強地競爭其相關的輕鏈，而非其他抗體的輕鏈的抗體上。對于D3H44/曲妥單抗系統，僅沿“_1”方向測試設計(參見表28c)。SMCA結果僅用一種酶(PNGase-F)處理D3H44/曲妥單抗系統并進行完全去糖基化。對于多酶處理，Fab區中的連接糖通常截短為核心M3F(使用四種酶處理)或G0F(使用3種酶處理)。總之，在大多數情況下，去糖基化處理產生能夠鑒定LC-MS所鑒定的所有可能的不同種類的能力。在許多情況下，每種種類以單個LC-MS峰表示。例外包括可能對應于所需的雙特異性種類的側峰(可能是加合物或前導肽切割的不均一性)；然而，由于側峰的模糊性，在雙特異性種類的貢獻中不考慮這些側峰。此外，D3H44/西妥昔單抗(3519_1、3522_1)和曲妥單抗/西妥昔單抗(9748-9338_1)系統內的一些設計需要多個峰來解釋由于所連接的高甘露糖的波動而產生的種類。所有這些設計在西妥昔單抗輕鏈中引入糖基化位點。注意到，在一些情況下，由于種類之間的質量分離較低(即差異小于50Da)，不可能區分一些小種類(包括小于所有種類的5％)。此外，所需的雙特異性種類H1-L1_H2-L2通常不能基于LC/MS通過實驗與錯配類型H1-L2_H2-L1區分。因此，當在表格中報告雙特異性含量時，不能完全排除其不包含該類型的錯配種類。然而，觀察到的含量非常低種類諸如H1-L2_H1-L2和H2-L1_H2-L1以及H1-L2和H2-L1半抗體是只出現微量(如果有的話)雙特異性種類雜質的表征。LC-MS數據提供于表29a、29b和29c中。作為比較，野生型數據也提供于表33a、33b和33c中，并且在“SMCA唯一標識符”列中以及“簇”列中以“NA”表示。全部三個雙特異性野生型系統表現出失真的偏愛性，使得一條輕鏈優于結合兩條重鏈(參見表33和圖9)。此外，至少在曲妥單抗/西妥昔單抗系統中，標簽位置似乎也對H1L1和H2L2配對具有顯著影響。因此，為評估設計對所需的雙特異性種類與野生型的可轉移性和百分比的影響，以相同的H1∶H2∶L1∶L2DNA比率進行與對應的野生型雙特異性構建體的比較，并報告于“％H1L1配對的變化(所有H1種類)，相對于野生型”、“％H2L2配對的變化(所有H2種類)，相對于野生型”和“％H1∶H2∶L1∶L2的變化，相對于野生型”(只考慮全抗體種類)列(參見表29)。注意到，對于％H1L1配對(所有H1種類)或％H2L2配對(所有H2種類)的評估，評估所有種類在Fab區中的配對。當不通過SMCA評估對應的野生型雙特異性構建體時，與類似的野生型構建體進行比較。估計值以報告值之后的“***”表示。如下所述選擇用于比較的類似野生型構建體。為評估可轉移性，每個野生型構建體以表現出最高“％H1L1和％H2L2配對(所有種類)”的SMCA實驗(以不同的比率進行)表示。為評估設計對所需的雙特異性種類與野生型的百分比的影響，每個野生型構建體以表現出最高％H1∶H2∶L1∶L2(只考慮全抗體種類)的SMCA實驗(以不同的比率進行)表示。就兩種情況而言，在雙特異性系統內的所有野生型構建體中，選擇中值作為用于比較的野生型值。對于每個設計，可轉移性通過記錄所有種類中相對于野生型的總體H∶L配對，特別是％H1L1/所有H1種類和/或％H2L2/所有H2種類的增加來評估。此外，還評估對所需的雙特異性種類的百分比的影響，其著重于僅全抗體種類比較，因為半抗體(如果存在)可通過制備性SEC或通過另外的H1∶H2∶L1∶L2DNA滴定移除/最小化。表30a、b和c顯示，制備性SEC可有效地用于半抗體種類的移除/最小化。表32a、b和c顯示，半抗體種類的百分比也可在轉染期間使用各種DNA滴定比率操作。對于D3H44/西妥昔單抗系統(表29a)，轉移除一個設計(9327-6054_2)之外的所有設計，如通過所有種類中相對于野生型的H1L1配對所評估。大部分設計(除9327-6054_2和9134-9521_2之外)還顯示，當僅考慮全抗體種類時，所需的雙特異性抗體的百分比增加。此外，除一個不轉移的設計(9327-6054_2)之外，設計減少了野生型所觀察的最初錯配抗體種類(H1H2L2L2)。此外，除其他方向的9327-6054_2和對應的設計9327-6054_1之外，設計以兩個方向轉移，大部分設計在兩個方向顯示出類似的有效H∶L配對。對于D3H44/曲妥單抗系統(表29b)，轉移所有設計，如通過所有種類中相對于野生型的H1L1配對所評估。此外，所有設計顯示出所需的雙特異性抗體的百分比增加(當僅考慮全抗體種類時)。此外，大部分設計顯著減少了野生型所觀察的最初錯配抗體種類(H1H2L2L2)。然而，注意到，由于缺少表達，未報告9611-9077_1的數據(表28c)。對于曲妥單抗/西妥昔單抗系統(表29c)，49個設計中的至少35個顯示出可轉移性，如通過所有H2種類中(“％H2L2配對的變化(所有H2種類)，相對于野生型”列的正值)的H2L2配對所評估。似乎未轉移的設計包括9279-9518_2、3522_2、9815-9825_2、9327-6054_2、9118-6098_2、9748-9338_2、9692-9846_2、9587-9735_2、9814-9828_2、3519_2、9986-9978_2、9168-9342_2和9066-9335_1(“％H2L2配對的變化(所有H2種類)，相對于野生型”列的負值)；然而，其他方向的設計表現出可轉移性(注意到，由于缺乏樣品，未測試9279-9518_1)。所有表現出可轉移性的設計表現出野生型實驗所觀察的最初錯配的抗體種類(H1H2L1L1)的百分比減少。此外，在轉移的設計中，當僅考慮全抗體種類時，與野生型相比，僅2個設計(9134-9521_1和9279-9518_2)顯示出所需的雙特異性抗體的百分比減少。一般來講，大部分弱競爭抗體的H∶L配對增加的設計使所需的雙特異性抗體的百分比減少(僅考慮全抗體)。就方向而言，與“_2”方向相比，“_1”方向的大部分設計表現出類似或更好的H∶L配對比較的可轉移性(例外主要在曲妥單抗/西妥昔單抗系統中觀察)。此外，表35a列出了所有3個測試雙特異性系統(D3H44/西妥昔單抗、D3H44/曲妥單抗和曲妥單抗/西妥昔單抗)中在兩個方向轉移的那些設計。表35b列出了所有3個雙特異性系統(D3H44/西妥昔單抗、D3H44/曲妥單抗和曲妥單抗/西妥昔單抗)中在一個方向轉移，以及僅一個雙特異性系統中在另一個方向轉移的那些設計。此外，在指定方向上，相同的突變存在于所有3個雙特異性系統中的重鏈和弱競爭同源輕鏈，并且輕鏈利用率至少大于10％。對于簇的可轉移性和性能，就D3H44/曲妥單抗雙特異性系統而言，所有簇內的所有成員表現出可轉移性(參見圖11a)，以及所需的雙特異性抗體百分比增加(僅考慮全抗體)(參見圖11b)。就D3H44/西妥昔單抗雙特異性系統而言，所有簇顯示出可轉移性，其中與野生型相比，在所有H1種類中，簇3內僅一個成員顯示出H1L1配對減少(參見圖11c)。另外，所有簇包括表現出所需的雙特異性抗體相對于野生型的百分比增加的成員(僅考慮全抗體)；然而，3個簇(簇1、3和4)還包括顯示出所需的雙特異性抗體相對于野生型的百分比減少的成員(僅考慮全抗體)(參見圖11d)。對于曲妥單抗/西妥昔單抗雙特異性系統，所有簇包括表現出設計可轉移性的變體；然而，僅幾個簇(1、5、7、8、10、11)包括其中全部各自的成員表現出可轉移性的變體(參見圖11e)。此外，所有簇包括表現出所需的雙特異性抗體相對于野生型的百分比增加的成員(僅考慮全抗體)(參見圖11f)。對于其中所有成員顯示出可轉移性的那些簇，簇5、7、8、10和11內的所有成員還顯示出所需的雙特異性抗體相對于野生型的百分比增加(僅考慮全抗體)。總之，當整體考慮全部3個雙特異性系統時，簇1、5、7、8、10和11內的所有成員表現出可轉移性(參見圖11g)；簇5、7、8、10和11包括這樣的成員，其中表現出所需的雙特異性抗體相對于野生型的百分比增加的所有成員(僅考慮全抗體)(參見圖11h)。總之，大部分弱競爭抗體的H∶L配對增加的設計使所需的雙特異性抗體的百分比減少(僅考慮全抗體)。就方向而言，與“_2”方向相比，“_1”方向的大部分設計表現出類似或更好的H∶L配對比較的可轉移性(例外主要在曲妥單抗/西妥昔單抗系統中觀察)。實施例10：用于生物物理學表征的選擇SMCA雙特異性異源二聚體抗體和親代Mab的制備性尺寸排阻色譜(SEC)。選擇SMCA樣品的子集進行另外的生物物理學表征。大部分這些SMCA樣品通常表現出半抗體種類的高配對(大于～80％配對，在H1L1+H2L2/所有種類列中)和低含量(小于-30％，考慮所有半抗體種類)。制備性SEC如下所述進行。使用安裝在Pharmacia(GEHealthcare)Purifier系統上的Superdex20010/300GL(GEHealthcare)柱分離異源二聚體抗體樣品。將溶于PBS(HycloneDPBS/改良，無鈣，無鎂，CatnoSH-300028.02)的異源二聚體抗體樣品(0.3-0.5ml)手動加載至0.5ml環(填充有PBS)。然后將樣品自動注射到柱子，并使用1CV洗脫柱以0.5ml/min解析。監測OD280下的蛋白質洗脫，并收集0.5ml級分。對于每個SMCA樣品，匯合那些包含主峰的級分，并進一步進行生物物理學表征。實施例11：在制備性尺寸排阻色譜后，抗體形式的雙特異性異源二聚體的優先配對評估在制備性SEC后，如實施例9所述，使用LC-MS方法分析選擇樣品的雙特異性異源二聚體抗體的優先配對。所有這些樣品顯示出所需雙特異性抗體種類的百分比增加，以及半抗體種類的百分比減少(表29和30)。實施例12：SMCA雙特異性異源二聚體抗體的熱穩定性。在制備性SEC之后，測定選擇SMCA雙特異性異源二聚體抗體的熱穩定性，并與親代D3H44和曲妥單抗單克隆抗體以及西妥昔單抗單臂抗體進行比較。一般來講，單臂抗體是指由一條全長重鏈、一條缺乏Fab區(包括C233S置換)的截短重鏈和一條輕鏈構成的構建體，其中重鏈異源二聚化如實施例9所述實現。熱穩定性的測定選擇雙特異性異源二聚體抗體和野生型對照的熱穩定性使用差示掃描量熱法(DSC)如下文所述測定。在制備性SEC處理后，使用VP-CapillaryDSC(GEHealthcare)對主要以0.2mg/ml或0.4mg/mL的濃度溶于PBS的400μL樣品進行DSC分析。在每次DSC運行開始時，進行5次緩沖液空白注射以穩定基線，并且進行緩沖液注射，然后是每次樣品注射參照。以60℃/小時的速率以及低反饋、8s過濾、5minpreTstat和70psi氮氣壓從20℃至100℃掃描每個樣品。參照所得的熱譜曲線，并使用Origin7軟件分析。結果示于表31a、b和c中。表格中報告的野生型FabTm值從D3H44(79℃)和曲妥單抗(81℃)的同源二聚體抗體以及西妥昔單抗(72℃)的單臂抗體獲得。就WTD3H44/西妥昔單抗和曲妥單抗/西妥昔單抗異源二聚體抗體而言，僅觀察到FabTm對應的2個峰。未觀察到CH2(由于與西妥昔單抗Fab重疊)或CH3(由于與D3H44和曲妥單抗Fab的Tm值重疊)的不同峰。就WTD3H44/曲妥單抗異源二聚體抗體而言，由于D3H44和曲妥單抗的兩個Fab的Tm值相似，81℃下的峰值可能對應于兩個Fab，而大約72℃下的峰值可能對應于CH2。在表31a、b和c中，僅報告兩個Fab對應的峰的Tm值，除非另外指明。還注意到，就一些異源二聚體樣品而言，蛋白質濃度很低(小于0.4mg/mL)，導致基線的噪聲增加。因此，在D3H44/曲妥單抗系統中，一些樣品產生低峰值強度的DSC曲線，使得難以區分CH2峰和可能不穩定的Fab。在這些情況下，還報告70至72℃下的Tm值(表31a)。總之，大部分異源二聚體抗體表現出類似于對應的野生型分子的熱穩定性(3℃或更小)。此外，大部分異源二聚體抗體不表現另外的峰，暗示CH2或CH3峰明顯不穩定。一個例外包括從曲妥單抗/西妥昔單抗系統工程改造異源二聚體抗體9611-9077_2，其在60℃下表現出另外的峰，可能是由于CH2不穩定。實施例13：雙特異性異源二聚體抗體的抗原親和力測定評估雙特異性抗體結合相關的抗原的能力，以確定氨基酸置換是否對抗原結合有影響。抗原結合親和力如下文所述通過SPR測定。SPR生物傳感分析EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；NHS：N-羥基琥珀酰亞胺；SPR：表面等離振子共振；EDTA：乙二胺四乙酸；TF：組織因子；EGFRECD：表皮生長因子受體胞外域；Her2ECD：人上皮生長因子受體2胞外域。SPR供應商。SeriesS傳感器芯片CM5、Biacore胺耦合試劑盒(NHS、EDC和1M乙醇胺)和10mM乙酸鈉緩沖液購自GEHealthcareLifeScience(Mississauga，ON)。重組Her2胞外域(ECD)蛋白購自eBioscience(SanDiego，CA)。含1％Tween20(PBST)的PBS運行緩沖液購自TeknovaInc.(Hollister，CA)。山羊多克隆抗人Fc抗體購自JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.(WestGrove，PA)。EDTA購自Bioshop(Burlington，ON)。所有表面等離振子共振分析使用BiacoreT200表面等離振子共振儀器(GEHealthcareLifeScience，(Mississauga，ON))和PBST運行緩沖液(加入0.5MEDTA儲液達到3.4mM的終濃度)在25℃的溫度下進行。抗人Fc捕獲表面利用SeriesS傳感器芯片CM5，使用默認參數，借助BiacoreT200控制軟件的ImmobilizationWizard(設定為靶向2000個共振單位(RU))生成。篩選結合Her2ECD、TF或EGFRECD抗原靶標的抗體變體以兩步進行：抗體變體間接捕獲到抗人Fc抗體流動池表面，然后注射5個濃度的純化抗原，使用單循環動力學方法進行動力學分析。用于捕獲的變體或對照以1μg/mL在單個流動池上以10μL/min的流速注射60s。一般來講，結果是抗人Fc表面上捕獲大約50至100RU。第一流動池留空，用作空白對照。在該捕獲步驟后，立即在所有四個流動池上以100μL/min按順序注射五個濃度的抗原(TF或EGFRECD抗原為5nM、2.5nM、1.25nM、0.63nM和0.31nM，或Her2ECD抗原為40nm、20nm、10nm、5nm和2.5nm)180s，EGFRECD的解離階段300s，Her2ECD的解離階段1800s，TF的解離階段3600s。捕獲抗體表面通過10mM甘氨酸pH1.5、30μL/min、120s再生，以準備下一次注射循環。對于每次分析物注射，進行至少兩次模擬緩沖液注射，以用作參照。使用BiacoreT200BiaEvaluation軟件分析所得的單循環動力學傳感圖，并擬合至1∶1結合模型。結合各自的野生型對照：D3H44的Mab、曲妥單抗OAA和西妥昔單抗OAA評估異源二聚體抗體的抗原親和力。還獲得了野生型雙特異性抗體的抗原親和力；然而，WT雙特異性的SPR捕獲可以是不均一的(例如涉及捕獲錯配的異源二聚體)，從而干擾KD測定(參見表31a和c)。就在D3H44/西妥昔單抗系統中測定抗原結合的異源二聚體抗體而言，抗原親和力類似于對應的WT對照(參見表31b)。就在D3H44/曲妥單抗和曲妥單抗/西妥昔單抗系統中測定抗原結合的大部分異源二聚體抗體而言，抗原親和力類似于對應的WT對照(參見表31a和c)。例外包括不表現出Her2結合的十一個工程改造抗體。在D3H44/曲妥單抗和曲妥單抗/西妥昔單抗系統中，未觀察到六個工程改造異源二聚體抗體9049-9759_1和9682-9740_1和3522_1的her2結合。此外，就曲妥單抗/西妥昔單抗系統而言，五個另外的工程改造抗體9696-9848_1、9561-9095_2、9611-9077_2、9286-9402_2和9060-9756_2也缺乏Her2結合。這十一個工程改造抗體中的十個共有H鏈(L143E_K145T)和L鏈(Q124R_T178R)上的恒定區突變。另一個工程改造抗體9286-9402_2共有H鏈(L143E_K145T)上相同的恒定區突變和L鏈(Q124K和S176R)上的類似突變。實施例14：工程改造異源二聚體抗體以及野生型異源二聚體和同源二聚體抗體的超效液相色譜尺寸排阻色譜(UPLC-SEC)圖譜在工程改造異源二聚體抗體以及對照野生型雙特異性和同源二聚體抗體的制備性SEC之后，UPLC-SEC使用WatersBEH200SEC柱(2.5mL、4.6x150mm、不銹鋼、1.7μm顆粒)進行，該色譜柱設定為30℃并且安裝在具有PDA檢測器的WatersAcquityUPLC系統上。運行時間包括7min，每次注射總體積2.8mL，運行緩沖液為PBS和0.02％聚山梨醇酯20或20mMNaPO4、50mMKCl、0.02％聚山梨醇酯20、10％乙腈，pH7，0.4ml/min。通過210-400nm范圍內的UV吸光度監測洗脫，并提取280nm下的色譜圖。使用Empower3軟件進行峰積分。圖10示出了代表性工程改造異源二聚體抗體以及代表性野生型異源二聚體抗體的UPLC-SEC圖譜。在大多數情況下，工程改造異源二聚體抗體顯示出與對應的野生型異源二聚體抗體類似的UPLC-SEC圖譜，就D3H44/曲妥單抗、D3H44/西妥昔單抗和曲妥單抗/西妥昔單抗而言，單體的平均百分比分別為99.18％、98.70％和98.77％(參見表31a、31b和31c)。雖然結合優選的實施方案和各種替代實施方案特別展示和描述了本發明，但相關領域的技術人員應當理解，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，可對其中的形式和詳情作出各種改變。本文公開的所有參考文獻、公布專利、專利公開和序列登錄號據此全文以引用方式并入用于所有目的。表格表1：Fab模型的關鍵標準表2：D3H44中重鏈和輕鏈的界面處的熱點氨基酸位置(典型的Fab包含κ輕鏈)。重鏈＊輕鏈＊V37Y36Q39Q38L45P44W47L89F100F98W103F116L124F118A139V133F174L135*Kabat編號表4.具有一條免疫球蛋白重鏈和/或兩條免疫球蛋白輕鏈的修飾的LCCA設計，其中H1優先地與L1配對*Kabat編號；WT是指無氨基酸突變的野生型免疫球蛋白鏈。**給每個獨特的H1、L1和L2突變集(LCCA形式)分配集編號或“唯一標識符”。表11：用于輕鏈競爭分析和檢驗的H1∶L1∶L2DNA比率^另外的DNA：AKTddpTT22是指包含組成型活性蛋白激酶B突變(顯性正性AKT突變)的載體；ssDNA是指鮭精DNA。表12.LCCA設計的LCCA性能、穩定性和抗原結合評估，以H1L1Fab異源二聚體的DSF值降序排列*表示來源于不同之處僅為存在/不存在連接的L鏈標簽(HA或FLAG)的其他Fab異源二聚體的估計值。**值來源于333(H1)、250(L1)、749(L2)LCCA實驗。***值來源于333(H1)、100(L1)、899(L2)LCCA實驗。ND表示數據不可用。表13a.滿足正確配對：錯配Fab異源二聚體為86∶14的LCCA平均性能標準的設計的LCCA性能*值從LCCA實驗(以1∶3的L1∶L2DNA比率進行)獲得，并歸一化為1∶1的L1∶L2DNA比率**值從LCCA實驗(以1∶9的L1∶L2DNA比率進行)獲得，并歸一化為1∶1的L1∶L2DNA比率***“唯一標識符”由沿(集#H1L1L2-集#H2L2L1)或(集#H2L2L1-集#H1L1L2)方向的兩個組成LCCA的唯一標識符構成表13b.滿足正確配對：錯配Fab異源二聚體為86∶14的LCCA平均性能標準的設計的穩定性和抗原結合評估*表示來源于不同之處僅為存在/不存在連接的L鏈標簽(HA或FLAG)的其他Fab異源二聚體的估計值。**“唯一標識符”由沿(集#H1L1L2-集#H2L2L1)或(集#H2L2L1-集#H1L1L2)方向的兩個組成LCCA的唯一標識符構成表14a.性能低于正確配對：錯配Fab異源二聚體為86∶14的LCCA平均性能標準的設計的LCCA性能*值從LCCA實驗(以1∶3的L1∶L2DNA比率進行)獲得，并歸一化為1∶1的L1∶L2DNA比率**值從LCCA實驗(以1∶9的L1∶L2DNA比率進行)獲得，并歸一化為1∶1的L1∶L2DNA比率***“唯一標識符”由沿(集#H1L1L2-集#H2L2L1)或(集#H2L2L1-集#H1L1L2)方向的兩個組成LCCA的唯一標識符構成權利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種包含至少第一異源二聚體和第二異源二聚體的分離的抗原結合多肽構建體，所述第一異源二聚體包含第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)；并且所述第二異源二聚體包含第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)，其中所述第一異源二聚體的所述H1或L1序列中的至少一個不同于所述第二異源二聚體的所述對應的H2或L2序列，并且其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域)；L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域)；并且H1、H2、L1和L2中的至少一個包含至少一個氨基酸修飾，其中與L2相比H1優先地與L1配對，并且與L1相比H2優先地與L2配對；或H1、H2、L1和L2包含一組氨基酸修飾，其中與L2相比H1優先地與L1配對，并且與L1相比H2優先地與L2配對；其中所述Fab區的熱穩定性通過所述第一和第二異源二聚體中的至少一個的熔融溫度(Tm)測定，所述熔融溫度在無所述至少一個氨基酸修飾或氨基酸修飾組的所述對應的異源二聚體的所述Tm的約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃之內。2.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含L124、K145、D146、Q179和S186處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。3.根據權利要求2所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自L124R、L124E、K145M、K145T、D146N、Q179E、Q179K、S186R和S186K的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含選自Q124E、S131R、S131K、V133G、Q160E、S176R、S176D、T178D、T178E和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。4.根據權利要求3所述的構建體，其中：H1包含選自L124E、K145M、K145T和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自S131R、S131K、V133G和S176R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、V133G、Q160E、S176D、T178D、T178E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。5.根據權利要求4所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L124E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾S131K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和S186R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。6.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179和S186處的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含Q124、V133、Q160、S176、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。7.根據權利要求6所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自L124E、L124R、L143E、L143D、K145T、K145M、D146N、Q179K、S186R和S186K的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自Q124K、Q124E、V133G、Q160K、S176R、S176D、T178E、T178K、T178R、T178D和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。8.根據權利要求7所述的構建體，其中：H1包含選自L124E、L143E、L143D、K145T和K145M或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q124K、V133G、Q160K、S176R、T178K和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、V133G、S176D、T178E、T178D和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。9.根據權利要求8所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L124E、L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾Q124K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178E。10.根據權利要求8所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L124E、L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾Q124K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和S186R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。11.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含Q39、L45、L124、L143、F122和H172處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、V133、N137、S174、S176和T178處的至少一個或一組氨基酸修飾。12.根據權利要求11所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自Q39E、Q39R、L45P、F122C、L124E、L124R、L143F、H172T和H172R的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自Q38R、Q38E、P44F、Q124C、S131T、S131E、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K、S176D、T178Y和T178D的至少一個或一組氨基酸修飾。13.根據權利要求12所述的構建體，其中H1包含選自Q39E、L45P、F122C、L124E、L143F、H172T和H172R或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q38R、P44F、Q124C、S131T、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K和T178Y或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自Q39R、L124R和H172R或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q38E、S131E、V133G、S176D和T178D或它們的組合的氨基酸修飾。14.根據權利要求13所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾Q39E和L124E；L1包含氨基酸修飾Q38R、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾Q39R和L124R；并且L2包含氨基酸修飾Q38E、V133G和S176D。15.根據權利要求13所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L45P和L124E；L1包含氨基酸修飾P44F、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。16.根據權利要求13所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L124E和L143F；L1包含氨基酸修飾V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。17.根據權利要求13所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾F122C和L124E；L1包含氨基酸修飾Q124C、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R；并且L2包含氨基酸修飾V133G和S176D。18.根據權利要求13所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L124E和H172T；L1包含氨基酸修飾V133G、N137K、S174R和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和H172R；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S176D和T178D。19.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含L124、A125、H172和K228處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含S121、V133、N137、S174、S176和T178處的至少一個或一組氨基酸修飾。20.根據權利要求19所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自L124E、L124R、A125S、A125R、H172R、H172T和K228D至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自S121K、V133G、N137K、S174R、S176K、S176R、S176D和T178D的至少一個或一組氨基酸修飾。21.根據權利要求20所述的構建體，其中H1包含選自L124E、A125S、H172R和K228D或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自S121K、V133G和S176R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124R、A125R和H172T或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自V133G、N137K、S174R、S176D和T178D或它們的組合的氨基酸修飾。22.根據權利要求21所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L124E和K228D；L1包含氨基酸修飾S121K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和A125R；并且L2包含氨基酸修飾V133G和S176D。23.根據權利要求21所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L124E和H172R；L1包含氨基酸修飾V133G和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R和H172T；并且L2包含氨基酸修飾V133G、S174R和S176D。24.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含L124、A139和V190處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含F116、V133、L135和S176處的至少一個或一組氨基酸修飾。25.根據權利要求24所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自L124E、L124R、A139W、A139G和V190A的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自F116A、V133G、L135V、L135W、S176R和S176D的至少一個或一組氨基酸修飾。26.根據權利要求25所述的構建體，其中H1包含選自L124E和A139W或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自F116A、V133G、L135V和S176R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124R、A139G和V190A或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自V133G、L135W和S176D或它們的組合的氨基酸修飾。27.根據權利要求26所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L124E和A139W；L1包含氨基酸修飾F116A、V133G、L135V和S176R；H2包含氨基酸修飾L124R、A139G和V190A；并且L2包含氨基酸修飾V133G、L135W和S176D。28.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含Q39、L45、K145、H172、Q179和S186處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、Q160、T180和C214處的至少一個或一組氨基酸修飾。29.根據權利要求28所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自Q39E、Q39R、L45P、K145T、H172R、Q179E和S186R的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自Q38R、Q38E、P44F、Q124E、S131K、Q160E、T180E和C214S的至少一個或一組氨基酸修飾。30.根據權利要求29所述的構建體，其中H1包含選自Q39E、L45P、K145T、H172R和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q38R、P44F和S131K或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自Q39R、H172R和S186R或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q38E、Q124E、Q160E、T180E和C214S或它們的組合的氨基酸修飾。31.根據權利要求30所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾Q39E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q38R和S131K；H2包含氨基酸修飾Q39R和S186R；并且L2包含氨基酸修飾Q38E、Q124E、Q160E和T180E。32.根據權利要求30所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L45P、K145T、H172R和Q179E；L1包含氨基酸修飾P44F和S131K；H2包含氨基酸修飾H172R和S186R；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、Q160E和T180E。33.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和V190處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含F116、Q124、L135、Q160、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。34.根據權利要求33所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自A139W、A139G、L143E、K145T、Q179E、Q179K和V190A的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自F116A、Q124R、Q124E、L135V、L135W、Q160E、T178R和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。35.根據權利要求34所述的構建體，其中H1包含選自A139W、L143E、K145T和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自F116A、Q124R、L135V和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自A139G、Q179K和V190A或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、L135W、Q160E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。36.根據權利要求35所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾A139W、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾F116A、Q124R、L135V和T178R；H2包含氨基酸修飾Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、L135W、Q160E和T180E。37.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含Q39、L143、K145、D146、H172和Q179處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含Q38、Q124、Q160、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。38.根據權利要求37所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自Q39E、Q39R、L143E、K145T、D146G、H172R、Q179E和Q179K的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自Q38R、Q38E、Q124R、Q124E、Q160K、Q160E、T178R和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。39.根據權利要求38所述的構建體，其中H1包含選自Q39E、L143E、K145T、H172R和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q38R、Q124R、Q160K和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自Q39R、H172R和Q179K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q38E、Q124E、D146G、Q160E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。40.根據權利要求39所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾Q39E、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q38R、Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修飾Q39R、H172R和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q38E、Q124E、Q160E和T180E。41.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含L45、L143、K145、D146、H172和Q179處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、N137、Q160、S174、T178、T180和C214處的至少一個或一組氨基酸修飾。42.根據權利要求41所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自L45P、L143E、K145T、D146G、H172R、H172T、Q179E和Q179K的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自Q38E、P44F、Q124R、Q124E、N137K、Q160K、Q160E、S174R、T178R、T180E和C214S的至少一個或一組氨基酸修飾。43.根據權利要求42所述的構建體，其中H1包含選自L45P、L143E、K145T、H172R和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自P44F、Q124R、Q160K和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自D146G、H172R、H172T和Q179K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q38E、Q124E、N137K、Q160E、S174R、T180E和C214S或它們的組合的氨基酸修飾。44.根據權利要求43所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L45P、L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾P44F、Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修飾D146G和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q38E、Q124E、Q160E和T180E。45.根據權利要求43所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L143E、K145T和H172R；L1包含氨基酸修飾Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修飾H172T和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、Q160E、N137K、S174R和T180E。46.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含L124、L143、K145和Q179處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含Q124、S131、V133、S176、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。47.根據權利要求46所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自L124W、L124A、L143E、L143F、K145T、Q179E和Q179K的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自Q124R、Q124K、Q124E、S131K、V133A、V133W、S176T、T178R、T178L、T178E和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。48.根據權利要求47所述的構建體，其中H1包含選自L124W、L143E、K145T和Q179E或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q124R、Q124K、S131K、V133A、S176T、T178R和T178L或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124A、L143F和Q179K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、V133W、S176T、T178L、T178E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。49.根據權利要求48所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L124W、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q124R、V133A、S176T和T178R；H2包含氨基酸修飾L124A、L143F和Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、V133W、S176T、T178L和T180E。50.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和S186處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含F116、Q124、V133、Q160、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。51.根據權利要求50所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自A139C、L143E、L143D、L143R、L143K、K145T、Q179E、Q179D、Q179R、Q179K、S186K、S186R的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自F116C、Q124R、Q124K、Q124E、V133E、V133D、Q160K、Q160E、T178R、T178K、T178E和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。52.根據權利要求51所述的構建體，其中H1包含選自A139C、L143E、L143D、K145T、Q179E和Q179D或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自F116C、Q124R、Q124K、Q160K、T178R和T178K或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L143R、L143K、Q179R、Q179K、S186K和S186R或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、V133E、V133D、Q160E、T178E和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。53.根據權利要求52所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾A139C、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾F116C、Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾Q179K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、Q160E和T180E。54.根據權利要求52所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾S186K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、Q160E和T178E。55.根據權利要求52所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修飾Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾L143R；并且L2包含氨基酸修飾Q124E和V133E。56.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179、S186和S188處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180處的至少一個或一組氨基酸修飾。57.根據權利要求56所述的構建體，其中(i)H1和/或H2包含選自L124A、L143A、L143R、L143E、L143K、K145T、D146G、Q179R、Q179E、Q179K、S186R、S186K和S188L處的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1和/或L2包含選自Q124R、Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160K、Q160M、S176L、T178R、T178E、T178F、T178Y和T180E的至少一個或一組氨基酸修飾。58.根據權利要求57所述的構建體，其中H1包含選自L143E、K145T、Q179E和S188L或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q124R、Q160K和T178R或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含選自L124A、L143A、L143R、L143K、D146G、Q179R、Q179K、S186R和S186K或它們的組合的氨基酸修飾；并且L2包含選自Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160M、S176L、T178E、T178F、T178Y和T180E或它們的組合的氨基酸修飾。59.根據權利要求58所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L143E、K145T、Q179E和S188L；L1包含氨基酸修飾Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾S186K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、S176L和T180E。60.根據權利要求58所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L143E、K145T、Q179E和S188L；L1包含氨基酸修飾Q124R和T178R；H2包含氨基酸修飾S186K；并且L2包含氨基酸修飾Q124E、S131T、T178Y和T180E。61.根據權利要求58所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修飾S186K；并且L2包含氨基酸修飾S131E。62.根據權利要求58所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾L143E和K145T；L1包含氨基酸修飾Q124R；H2包含氨基酸修飾L143R；并且L2包含氨基酸修飾Q124E和V133E。63.根據權利要求1所述的構建體，其中(i)H1包含F122和C233處的至少一個或一組氨基酸修飾，并且(ii)L1包含Q124和C214處的至少一個或一組氨基酸修飾。64.根據權利要求63所述的構建體，其中(i)H1包含選自F122C和C233S的至少一個或一組氨基酸修飾；并且(ii)L1包含選自Q124C和C214S的至少一個或一組氨基酸修飾。65.根據權利要求64所述的構建體，其中H1包含選自F122C和C233S或它們的組合的氨基酸修飾；L1包含選自Q124C和C214S或它們的組合的氨基酸修飾；H2包含野生型或未經修飾的氨基酸序列；并且L2包含野生型或未經修飾的氨基酸序列。66.根據權利要求65所述的構建體，其中：H1包含氨基酸修飾F122C和C233S；L1包含氨基酸修飾Q124C和C214S；H2包含野生型或未經修飾的氨基酸序列；并且L2包含野生型或未經修飾的氨基酸序列。67.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中當H1、H2、L1和L2在細胞或哺乳動物細胞中共表達時，或當H1、H2、L1和L2在無細胞表達系統中共表達時，或當H1、H2、L1和L2共生成時，或當H1、H2、L1和L2通過氧化還原生成方法共生成時，與L2相比H1優先地與L1配對，并且與L1相比H2優先地與L2配對。68.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中H1、H2、L1和L2中的至少一個包含VH和/或VL結構域的至少一個氨基酸修飾，和/或CH1和/或CL結構域的至少一個氨基酸修飾，使得與L2相比H1優先地與L1配對，和/或與L1相比H2優先地與L2配對。69.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中如果H1包含所述CH1結構域中的至少一個氨基酸修飾，則L1和L2中的至少一個包含所述CL結構域中的至少一個氨基酸修飾；和/或如果H1包含所述VH結構域中的至少一個氨基酸修飾，則L1和L2中的至少一個包含所述VL結構域中的至少一個氨基酸修飾；或其中如果H2包含所述CH1結構域中的至少一個氨基酸修飾，則L1和L2中的至少一個包含所述CL結構域中的至少一個氨基酸修飾；和/或如果H2包含所述VH結構域中的至少一個氨基酸修飾，則L1和L2中的至少一個包含所述VL結構域中的至少一個氨基酸修飾。70.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中H1、L1、H2和/或L2包含所述Fab區中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸突變。71.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中H1、H2、L1和L2中的至少一個包含至少一個恒定結構域和/或至少一個可變結構域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸修飾。72.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中當L1和L2二者與H1和H2中的至少一個共表達時，H1-L1和H2-L2異源二聚體對中的所述至少一個的相對配對與所述各自對應的H1-L2或H2-L1異源二聚體對之比大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且其中所述經修飾的H1-L1或H2-L2異源二聚體對的相對配對大于無所述至少一個氨基酸修飾的所述對應的H1-L1或H2-L2異源二聚體對中觀察到的各自相對配對。73.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中所述第一和第二異源二聚體中的至少一個的所述Fab區的熱穩定性在無所述至少一個氨基酸修飾或氨基酸修飾組的所述對應的異源二聚體的所述Tm的約0、1、2或3℃之內。74.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中每個異源二聚體對其結合的抗原的親和力在所述各自未經修飾的異源二聚體對相同的抗原的親和力的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45或50倍之內，如通過表面等離振子共振(SPR)或FACS所測定。75.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中H1和L1中的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L2相比當H1與L1配對時產生更大的氨基酸空間互補；或其中H2和L2中的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L1相比當H2與L2配對時產生更大的氨基酸空間互補；或其中H1和L1中的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L2相比當H1與L1配對時產生更大的帶電氨基酸之間的靜電互補；或其中H2和L2中的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L1相比當H2與L2配對時產生更大的帶電氨基酸之間的靜電互補；或其中H1和L1中的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L2相比當H1與L1配對時產生更大的氨基酸空間和靜電互補；或其中H2和L2中的至少一個包含至少一個這樣的結構域：其包含至少一個氨基酸修飾，與L1相比當H2與L2配對時產生更大的氨基酸空間和靜電互補；或其中H1和L1中的至少一個包含至少一個這樣的結構域，其包含至少一個氨基酸修飾，在H1和L1之間產生共價鍵；或其中H2和L2中的至少一個包含至少一個這樣的結構域，其包含至少一個氨基酸修飾，在H2和L2之間產生共價鍵。76.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中H1、H2、L1和L2包含一組選自表5至表6、表15至表27或表28a至表28c所示的唯一標識符設計集的氨基酸修飾。77.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中所述構建體還包含Fc，所述Fc包含第一CH3序列和第二CH3序列，其中所述第一CH3序列通過或不通過一個或多個接頭連接至所述第一異源二聚體，并且所述第二CH3序列通過或不通過一個或多個接頭連接至所述第二異源二聚體。78.根據權利要求77所述的構建體，其中所述Fc是人Fc、人IgG1Fc、人IgAFc、人IgGFc、人IgDFc、人IgEFc、人IgMFc、人IgG2Fc、人IgG3Fc或人IgG4Fc。79.根據權利要求77或78所述的構建體，其中所述Fc是異源二聚體Fc。80.根據權利要求77至79中任一項所述的構建體，其中所述Fc包含所述CH3序列中的至少一個中的一個或多個修飾。81.根據權利要求77至80中任一項所述的構建體，其中所述二聚化CH3序列具有如DSF所測定的約68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、77.5℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃或更高的熔融溫度(Tm)。82.根據權利要求77至81中任一項所述的構建體，其中在制備時，所述Fc是以大于約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的純度形成的異源二聚體；或其中在表達時或在經由單個細胞表達時，所述Fc是以大于約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的純度形成的異源二聚體。83.根據權利要求77至82中任一項所述的構建體，其中所述Fc包含所述CH3序列中的至少一個中的一個或多個修飾，所述修飾有助于形成穩定性相當于野生型同源二聚體Fc的異源二聚體Fc。84.根據權利要求78至84中任一項所述的構建體，其中所述Fc包含：i)具有第一Fc多肽中的修飾L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T366L_K392M_T394W的異源二聚體IgG1Fc；ii)具有第一Fc多肽中的修飾L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T366L_K392L_T394W的異源二聚體IgG1Fc；iii)具有第一Fc多肽中的修飾T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T350V_T366L_K392L_T394W的異源二聚體IgG1Fc；iv)具有第一Fc多肽中的修飾T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T350V_T366L_K392M_T394W的異源二聚體IgG1Fc；或v)具有第一Fc多肽中的修飾T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修飾T350V_T366L_N390R_K392M_T394W的異源二聚體IgG1Fc。85.根據權利要求77至84中任一項所述的構建體，其中所述Fc還包含至少一個CH2序列。86.根據權利要求85所述的構建體，其中所述Fc的所述CH2序列包含一個或多個修飾。87.根據權利要求77至86中任一項所述的構建體，其中所述Fc包含一個或多個修飾以有助于Fc-γ受體的選擇性結合。88.根據權利要求77至87在任一項所述的構建體，其中所述Fc通過一個或多個接頭偶聯到所述異源二聚體，或其中所述Fc通過一個或多個接頭偶聯到H1和H2。89.根據權利要求88所述的構建體，其中所述一個或多個接頭是一個或多個多肽接頭。90.根據權利要求88所述的構建體，其中所述一個或多個接頭包含一個或多個抗體鉸鏈區。91.根據權利要求88所述的構建體，其中所述一個或多個接頭包含一個或多個IgG1鉸鏈區。92.根據權利要求88至91中任一項所述的構建體，其中所述一個或多個接頭包含一個或多個修飾。93.根據權利要求92所述的構建體，其中所述一個或多個修飾有助于Fc-γ受體的選擇性結合。94.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中所述至少一個氨基酸修飾是至少一個氨基酸突變，或其中所述至少一個氨基酸修飾是至少一個氨基酸置換。95.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中H1、H2、L1和L2中的每一個的序列來源于人序列。96.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中所述構建體是多特異性的或雙特異性的。97.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中所述構建體是多價的或二價的。98.一種分離的多核苷酸或分離的多核苷酸組，其包含至少一個編碼根據前述權利要求中任一項所述的構建體序列。99.根據權利要求98所述的分離的多核苷酸或分離的多核苷酸組，其中所述多核苷酸或多核苷酸組是cDNA。100.一種載體或載體組，其包含根據權利要求98或99所述的多核苷酸或多核苷酸組中的一個或多個。101.根據權利要求100所述的載體或載體組，其選自質粒、多順反子載體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體、表達載體和重組表達載體。102.一種分離的細胞，其包含根據權利要求98或99所述的多核苷酸或多核苷酸組，或根據權利要求100或101所述的載體或載體組。103.根據權利要求102所述的分離的細胞，其中所述細胞是酵母細胞、細菌細胞、雜交瘤、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或HEK293細胞。104.一種藥物組合物，包含根據前述權利要求中任一項所述的構建體和藥學上可接受的載體。105.根據權利要求104所述的藥物組合物，還包含一種或多種選自緩沖液、抗氧化劑、低分子量分子、藥物、蛋白質、氨基酸、糖類、脂質、螯合劑、穩定劑和賦形劑的物質。106.根據權利要求1至96所述的構建體或根據權利要求104或105所述的藥物組合物用于治療受試者中的疾病或病癥或用于藥物制造中的用途。107.一種治療患有疾病或病癥的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用根據權利要求1至96中任一項所述的構建體或根據權利要求104或105所述的藥物組合物。108.一種從宿主細胞培養物獲得根據權利要求1至96中任一項所述的構建體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)獲得包含至少一種宿主細胞的宿主細胞培養物，所述宿主細胞包含一個或多個編碼所述構建體的核酸序列；以及(b)從所述宿主細胞培養物回收所述構建體。109.一種獲得根據權利要求1至96中任一項所述的構建體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)獲得H1、L1、H2或L2；(b)允許與L2相比H1優先地與L1配對，并且與L1相比H2優先地與L2配對；以及(c)獲得所述構建體。110.一種制備根據權利要求1至96中任一項所述的構建體的方法，所述方法包括：a.獲得編碼至少一種構建體的多核苷酸或多核苷酸組；b.確定用于引入至少一種宿主細胞的所述多核苷酸或多核苷酸組中的每一個的最佳比率，其中所述最佳比率通過評估與在H1、L1、H2或L2表達時形成的錯配的H1-L2和H2-L1異源二聚體對相比在H1、L1、H2或L2表達時形成的H1-L1和H2-L2異源二聚體對的量來確定；c.選擇優選的最佳比率，其中用所述優選的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸組的轉染至少一種宿主細胞導致所述構建體表達；d.用所述最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸組轉染所述至少一種宿主細胞；以及e.培養所述至少一種宿主細胞以表達所述構建體。111.根據權利要求110所述的方法，其中選擇所述最佳比率通過在瞬時轉染系統中轉染來評估。112.根據權利要求110或111所述的方法，其中用所述優選的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸組轉染所述至少一種宿主細胞導致所述構建體的最佳表達。113.根據權利要求110至112中任一項所述的方法，其中所述構建體包含Fc，所述Fc包含至少兩個CH3序列，其中所述Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯到所述第一異源二聚體和所述第二異源二聚體。114.根據權利要求113所述的方法，其中所述Fc是異源二聚體，任選地包含一個或多個氨基酸修飾。115.一種計算機可讀存儲介質，所述介質存儲：包含表示第一異源二聚體和第二異源二聚體中的互補突變的數據的數據集，所述第一異源二聚體包含第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)；并且所述第二異源二聚體包含第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域)；其中L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域)，并且其中所述互補突變的數據集包含表示表4至表6、表15至表27、表28a至表28c列出的那些突變或那些突變的子集的數據。116.一種制備雙特異性抗原結合多肽構建體的方法，所述雙特異性構建體包含第一異源二聚體和第二異源二聚體，所述第一異源二聚體包含來自第一單特異性抗原結合多肽的第一免疫球蛋白重鏈多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L1)；并且所述第二異源二聚體包含來自第二單特異性抗原結合多肽的第二免疫球蛋白重鏈多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白輕鏈多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重鏈可變結構域(VH結構域)和重鏈恒定結構域(CH1結構域)；其中L1和L2各自包含至少輕鏈可變結構域(VL結構域)和輕鏈恒定結構域(CL結構域)，所述方法包括：a.將根據權利要求115所述的數據集的一個或多個互補突變引入所述第一異源二聚體和/或所述第二異源二聚體；以及b.使所述第一異源二聚體和所述第二異源二聚體在至少一種宿主細胞中共表達，以生成包含所述雙特異性構建體的表達產物。117.根據權利要求116所述的方法，其還包括確定所述表達產物相對于其他多肽產物中所述雙特異性構建體的量，以選擇優選的互補突變子集。118.根據權利要求116或117所述的方法，其中與其他多肽產物相比，所述雙特異性構建體以大于70％的純度生成。119.根據權利要求116至118中任一項所述的方法，其還包括將另外的氨基酸修飾添加至H1、H2、L1或L2中的至少一個，以提高所述雙特異性構建體相較于其他多肽產物的純度的步驟。120.根據權利要求116至119中任一項所述的方法，其中所述構建體包含Fc，所述Fc包含至少兩個CH3序列，其中所述Fc通過或不通過一個或多個接頭偶聯到所述第一異源二聚體和所述第二異源二聚體。121.根據權利要求120所述的方法，其中所述Fc是異源二聚體，任選地包含一個或多個氨基酸修飾。122.根據權利要求116至121中任一項所述的方法，其中所述抗原結合多肽是抗體、單鏈單克隆抗體、Fab或單鏈Fab。123.一種制備根據權利要求1至96中任一項所述的分離的抗原結合多肽構建體的方法，所述方法包括在至少一個表達系統中表達H1、H2、L1和L2，以生成表達產物；表征所述表達產物；以及選擇其中大于90％的所述表達產物是所述分離的抗原結合多肽構建體的所述表達系統。124.根據權利要求1所述的構建體，其中所述氨基酸修飾選自對應于表35a的唯一標識符的SMCA設計9561-9095_1、9561-9095_2，其中H1包含L124W、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R、V133A、S176T和T178R，H2包含L124A、L143F和Q179K，并且L2包含Q124E、V133W、S176T、T178L和T180E；9121-9373_1、9121-9373_2，其中H1包含L124E和H172T，L1包含V133G、N137K、S174R和S176R，H2包含L124R和H172R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；9116-9349_1、9116-9349_2，其中H1包含L124E和A139W，L1包含F116A、V133G、L135V和S176R，H2包含L124R、A139G和V190A，并且L2包含V133G、L135W和S176D；9134-9521_1、9134-9521_2，其中H1包含L124E、K145T和Q179E，L1包含S131K、V133G和S176R，H2包含L124R和S186R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；9286-9402_1、9286-9402_2，其中H1包含L124E、L143E和K145T，L1包含Q124K、V133G和S176R，H2包含L124R和Q179K，并且L2包含V133G、S176D和T178E；9667-9830_1、9667-9830_2，其中H1包含L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、Q160E和T178E；9696-9848_1、9696-9848_2，其中H1包含L143E、K145T、Q179E和S188L，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、S176L和T180E；9060-9756_1、9060-9756_2，其中H1包含A139W、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116A、Q124R、L135V和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、L135W、Q160E和T180E；9682-9740_1、9682-9740_2，其中H1包含L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R和T178R，H2包含L143R，并且L2包含Q124E和V133E；9049-9759_1、9049-9759_2，其中H1包含A139C、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116C、Q124R和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E；以及9820-9823_1、9820-9823_2，其中H1包含Q39E、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q38R、Q124R、Q160K和T178R，H2包含Q39R、H172R和Q179K，并且L2包含Q38E、Q124E、Q160E和T180E。125.根據權利要求1所述的構建體，其中所述氨基酸修飾選自對應于表35b的唯一標識符的SMCA設計9327-6054_1，其中H1包含L124E和L143F，L1包含V133G和S176R，H2包含L124R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；9815-9825_1、9815-9825_2，其中H1包含Q39E和L124E，L1包含Q38R、V133G和S176R，H2包含Q39R和L124R，并且L2包含Q38E、V133G和S176D；9587-9735_l、9587-9735_2，其中H1包含L143E和K145T，L1包含Q124R，H2包含L143R，并且L2包含Q124E和VI33E；3522_1、3522_2，其中H1包含L45P、L143E和K145T，L1包含P44F、Q124R、Q160K和T178R，H2包含D146G和Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E；以及3519_1、3519_2，其中H1包含L45P、K145T、H172R和Q179E，L1包含P44F和S131K，H2包含H172R和S186R，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E。126.根據權利要求1所述的構建體，其中所述氨基酸修飾選自對應于唯一標識符的SMCA設計9060-9756，其中H1包含A139W、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116A、Q124R、L135V和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、L135W、Q160E和T180E；9820-9823，其中H1包含Q39E、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q38R、Q124R、Q160K和T178R，H2包含Q39R、H172R和Q179K，并且L2包含Q38E、Q124E、Q160E和T180E，3519，其中H1包含L45P、K145T、H172R和Q179E，L1包含P44F和S131K，H2包含H172R和S186R，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E，9049-9759，其中H1包含A139C、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116C、Q124R和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E；3522，其中H1包含L45P、L143E和K145T，L1包含P44F、Q124R、Q160K和T178R，H2包含D146G和Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E；9696-9848，其中H1包含L143E、K145T、Q179E和S188L，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、S176L和T180E；9692-9846，其中H1包含L143E、K145T、Q179E和S188L，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、S131T、T178Y和T180E；9986-9978，其中H1包含L143E和K145T，L1包含Q124R、Q160K和T178R，H2包含S186K，并且L2包含S131E，以及9667-9830，其中H1包含L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、Q160E和T178E。127.根據權利要求1所述的構建體，其中所述氨基酸修飾選自對應于唯一標識符的SMCA設計9587-9735，其中H1包含L143E和K145T，L1包含Q124R，H2包含L143R，并且L2包含Q124E和V133E；9561-9095，其中H1包含L124W、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R、V133A、S176T和T178R，H2包含L124A、L143F和Q179K，并且L2包含Q124E、V133W、S176T、T178L和T180E；9611-9077，其中H1包含L143E、K145T和H172R，L1包含Q124R、Q160K和T178R，H2包含H172T和Q179K，并且L2包含Q124E、N137K、Q160E、S174R和T180E；9168-9342，其中H1包含L124E和K228D，L1包含S121K、V133G和S176R，H2包含L124R和A125R，并且L2包含V133G和S176D；9164-9555，其中H1包含L124E、K145T和Q179E，L1包含S131R、V133G和S176R，H2包含L124R和S186R，并且L2包含V133G、S176D和T180E；9279-9518，其中H1包含L124E、L143E和K145T，L1包含Q124K、V133G和S176R，H2包含L124R和S186R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；9290-9432，其中H1包含L124E、L143E和K145T，L1包含Q124K、V133G和S176R，H2包含L124R和Q179K，并且L2包含V133G、S176D和T180E；9142-9414，其中H1包含L124E、K145T和Q179E，L1包含S131K、V133G和S176R，H2包含L124R和Q179K，并且L2包含V133G、S176D和T178E；9060-9756，其中H1包含A139W、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116A、Q124R、L135V和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、L135W、Q160E和T180E；9121-9373，其中H1包含L124E和H172T，L1包含V133G、N137K、S174R和S176R，H2包含L124R和H172R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；9066-9335，其中H1包含F122C和L124E，L1包含Q124C、V133G和S176R，H2包含L124R，并且L2包含V133G和S176D；9820-9823，其中H1包含Q39E、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q38R、Q124R、Q160K和T178R，H2包含Q39R、H172R和Q179K，并且L2包含Q38E、Q124E、Q160E和T180E；9814-9828，其中H1包含Q39E、K145T和Q179E，L1包含Q38R和S131K，H2包含Q39R和S186R，并且L2包含Q38E、Q124E、Q160E和T180E；9696-9848，其中H1包含L143E、K145T、Q179E和S188L，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、S176L和T180E；9667-9830，其中H1包含L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、Q160E和T178E；9986-9978，其中H1包含L143E和K145T，L1包含Q124R、Q160K和T178R，H2包含S186K，并且L2包含S131E；3522，其中H1包含L45P、L143E和K145T，L1包含P44F、Q124R、Q160K和T178R，H2包含D146G和Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E，以及3519，其中H1包含L45P、K145T、H172R和Q179E，L1包含P44F和S131K，H2包含H172R和S186R，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3