用于改善哺乳動物血糖控制的肽及其組合物的制作方法

由于全世界的肥胖程度螺旋式上升，高血糖水平(高血糖癥)越來越普遍。世界衛生組織估計，年齡在20歲以上的成年人當中有超過14億人超重/肥胖，而三分之一的美國成年人和1.08億亞洲人被診斷有糖尿病。高血糖現在和高血壓以及高膽固醇血癥一樣重要，這導致提升了需要有助于餐后血糖水平產品的衛生專業人員和注重健康的消費者的意識。US2005/0089969公開了胰島素模擬肽。本發明的目的是解決至少一個上述提及的問題。技術實現要素：廣泛地，申請人已經鑒定了肽，SEQIDNO：11，及其生物活性片段，它們有改善哺乳動物血糖控制/狀態的功效，特別是在口服后增加胰島素分泌。所述SEQIDNO：11的肽與US2005/0089969中的SEQIDNO：2有大約94％的序列一致性，并且在重要的功能位點上有許多不同的殘基。具體地，申請人已經鑒定了，所述肽，以及包括所述肽的組合物，能在體外增加胰島β細胞的胰島素分泌(圖7A-7C)。申請人也已經表明了包括所述肽的組合物的急性治療在ob/ob小鼠的葡萄糖耐量試驗期間有降低葡萄糖的效果，以及引起小鼠肝臟脂肪含量的減少(圖8和9)。使用飲食誘導的肥胖模型，在高脂喂養的情況下用包括所述肽的組合物治療動物12周，與單獨的高脂喂養相比，改善了在葡萄糖耐量試驗(GTT)期間的葡萄糖清除率(圖11)。另外，申請人已經證明，當在臨床研究中包括本發明的肽的組合物與碳水化合物膳食一起給予人時，會引起血糖水平降低和胰島素水平升高(圖1和2)。所述肽是或者包括下面的SEQIDNO：11及其生物活性片段，所述生物活性片段通常包含SEQIDNO：1或5或兩者都有的序列。YPVEPFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSK(SEQUENCEIDNO：11)特定的生物活性片段包含以下SEQIDNO1至10。HQPHQPLPPTVMFPPQSVL(SEQUENCEIDNO：1)HQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSK(SEQUENCEIDNO：2)LQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL(SEQUENCEIDNO：3)LQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSK(SEQUENCEIDNO：4)PPQSVLSLSQSK(SEQUENCEIDNO：5)MHQPHQPLPPTVMFPPQSVL(SEQUENCEIDNO：6)MHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSK(SEQUENCEIDNO：7)SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL(SEQUENCEIDNO：8)SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSK(SEQUENCEIDNO：9)YPVEPFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL(SEQUENCEIDNO：10)一方面，本發明涉及的肽包含(a)SEQIDNO：11的序列，或(b)其生物活性片段，優選地包含SEQIDNO：1或5的序列(下文稱為“本發明的肽”)。另一方面，本發明涉及用于改善哺乳動物血糖控制和代謝綜合征方面的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中降低血漿血糖水平，特別是餐后血糖水平的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中治療或預防高血糖癥(特別是高脂飲食或肥胖誘發的高血糖癥)的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于增加哺乳動物餐后胰島素分泌的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中調節葡萄糖平衡的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中治療或預防或減輕胰島素抵抗的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中降低血漿膽固醇水平的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中治療或預防或降低肝臟脂肪含量的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于促進哺乳動物抗炎反應的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于減少高脂飲食或肥胖誘發的炎癥的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于治療或預防哺乳動物炎癥性疾病的方法的本發明的肽。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中降低血漿血糖水平，特別是餐后血糖水平，以及增加胰島素分泌，特別是餐后胰島素分泌的本發明的肽。另一方面，本發明也涉及包括多種不同的本發明的肽的組合物，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或11種本發明不同的肽。優選地，每一種本發明的肽包含SEQIDNO：11的序列，或其包含SEQIDNO：1或5序列的片段。另一方面，本發明也涉及包括基本上所有的SEQIDNO：1或11的肽的組合物。合適地，該組合物是牛酪蛋白產品的水解物。該組合物可以是藥物、食品、食品補充劑、膳食補充劑、特殊食品(用于糖尿病患者或嬰兒或老年患者)。另一方面，本發明涉及用于改善哺乳動物血糖控制的本發明的組合物。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中降低血漿血糖水平，特別是餐后血糖水平的本發明的組合物。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中治療或預防高血糖癥(特別是高脂飲食或肥胖誘發的高血糖癥)的本發明的組合物。在一個實施例中，本發明涉及用于增加哺乳動物餐后胰島素分泌的本發明的組合物。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中調節葡萄糖體內平衡的本發明的組合物。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中治療或預防或減輕胰島素抵抗的本發明的組合物。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中降低血漿膽固醇水平的本發明的組合物。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中治療或預防或降低肝臟脂肪含量的本發明的組合物。在一個實施例中，本發明涉及用于促進哺乳動物抗炎反應的本發明的組合物。在一個實施例中，本發明涉及用于減少高脂飲食或肥胖誘發的炎癥的本發明的組合物。另一方面，本發明涉及包括本發明的組合物的食品。典型地，該食品是特殊藥用食品(FSMP)。在一個實施例中，該食品是奶制品。I另一方面，本發明涉及用于改善哺乳動物血糖控制的本發明的食品。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中治療或預防高血糖癥(特別是高脂飲食或肥胖誘發的高血糖癥)的本發明的食品。在一個實施例中，本發明涉及用于增加哺乳動物餐后胰島素分泌的本發明的食品。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中調節葡萄糖平衡的本發明的食品。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中治療或預防或減輕胰島素抵抗的本發明的食品。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中降低血漿膽固醇水平的本發明的食品。在一個實施例中，本發明涉及用于在哺乳動物中治療或預防或降低肝臟脂肪含量的本發明的食品。在一個實施例中，本發明涉及用于促進哺乳動物抗炎反應的本發明的食品。在一個實施例中，本發明涉及用于減少高脂飲食或肥胖誘發的炎癥的本發明的食品。另一方面，本發明涉及用于預防或治療選自代謝紊亂或肥胖癥的本發明的組合物或肽。因此，本發明也涉及用于預防或治療人類代謝紊亂的方法，包括對人體施用治療有效量的本發明組合物或肽的步驟。另一方面，本發明提供包括結合有合適藥物載體的本發明的肽或組合物的藥物組合物。本發明提供包括多種不同的本發明的肽的牛酪蛋白產品衍生的水解物，例如包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或11種本發明不同的肽。合適地，至少1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％(w/w)的所述水解物包括本發明的肽。典型地，本發明的水解物通過在30℃至60℃的溫度范圍內使用胃-腸道酶制劑對牛酪蛋白產品進行水解得到。本發明所述的組合物可以包括本發明的水解物。本發明也涉及制備本發明牛酪蛋白產品衍生的水解物的方法，包括步驟：提供牛酪蛋白衍生產品，使用胃腸道蛋白酶制劑在30℃至60℃對牛酪蛋白衍生產品酶解合適的時間。該牛酪蛋白產品通常包括酪蛋白鹽，其實例為本領域技術人員熟知以及包含酪蛋白酸鈉。典型地，所述牛酪蛋白產品(和/或所述酪蛋白水解物)基本不含(即低于5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％(w/w)其它乳蛋白，例如乳清蛋白。典型地，蛋白酶與酪蛋白底物的比率(w.w)為0.1-1.0％，優選地0.2-2.0％。合適地，所述酪蛋白底物的水解用蛋白酶制劑在溫度30℃至60℃進行。定義在本說明書中，術語“改善血糖控制”應該被理解為以下的一種或多種：治療或預防高血糖、增加餐后胰島素分泌、調節葡萄糖體內平衡、減輕胰島素抵抗、增加胰高血糖素樣肽的水平、降低肝脂肪含量、防范HFD或肥胖誘發的炎癥。術語“改善代謝健康”應該被理解為降低血漿膽固醇水平、降低肝臟脂肪含量，或促進抗炎反應或它們的任何組合。在本說明書中，術語“哺乳動物”應該被理解為高等哺乳動物，特別是人。典型地，所述人患有選自代謝紊亂比如糖尿病或肥胖的紊亂癥。本文使用的術語“肽”是指通過肽鍵聯結起來的多達60個氨基酸單體組成的聚合物。本發明使用的肽(包含其變體和片段)可以全部或部分通過化學合成或通過核酸表達而產生。例如，本發明的和用于本發明的肽容易根據本領域熟知的已經建立的標準液體或優選固相肽合成方法制備(參見，例如，J.M.Stewart和J.D.Young，SolidPhasePeptideSynthesis，2ndedition，PierceChemicalCompany，Rockford，Illinois(1984)，inM.BodanzskyandA.Bodanzsky，ThePracticeofPeptideSynthesis，SpringerVerlag，NewYork(1984)。必要時，本發明使用的任何肽可以被化學修飾以增加它們的穩定性。化學修飾的肽或肽類似物包含所述肽的任何功能性化學等價物，其特征在于，關于本發明的實踐，其在體內或體外增加穩定性和/或功效。所述術語肽類似物也指本文描述的任何肽的氨基酸衍生物。通過程序可以產生肽類似物，所述程序包括但不限于對側鏈的修飾、在肽合成期間摻入非天然氨基酸和/或它們的衍生物以及使用交聯劑和對肽或它們的類似物施加構象約束的其它方法。側鏈修飾的實例包含氨基修飾，比如通過用醛反應接著用NaBH4還原進行還原烷基化；用甲基乙酰亞胺酯酰胺化；用乙酸酐乙酰化；用氰酸酯進行氨基的氨基甲酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)進行氨基的三硝基芐基化；用丁二酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐對氨基進行烷基化；以及用吡哆醛-5'-磷酸進行賴氨酸的吡哆酰基化，接著用NaBH4還原。精氨酸殘基的胍基可以通過與試劑比如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成雜環縮合產物來修飾。羧基可以通過碳化二亞胺活化進行修飾，通過鄰酰基異脲形成，然后隨之衍生化成，例如，相應的酰胺。巰基可以通過以下方法進行修飾，比如用碘乙酸或碘乙酰胺進行羧甲基化；過甲酸氧化成磺基丙氨酸；與其它硫醇化合物形成混合二硫化物；與馬來酰亞胺反應；馬來酸酐或其它的取代馬來酰亞胺；使用4-氯高汞苯甲酸、4-氯苯甲酰苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基酚和其它汞形成汞衍生物；用氰酸酯在堿性pH進行氨甲酰化。色氨酸殘基可以通過，例如，N-溴代丁二酰亞胺進行氧化或用2-羥基-5-硝基苯甲溴或磺酰鹵進行吲哚環的烷基化來修飾。酪氨酸殘基可以用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物來改變。組氨酸殘基的咪唑環的修飾可以通過用碘乙酸衍生物進行烷基化或用焦碳酸二乙酯進行N-乙酰基化來完成。在肽合成期間摻入非天然氨基酸和衍生物的實例包含但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構體。肽結構修飾包含產生包括由D-氨基酸編碼的反向序列的反轉肽。在本說明書中，術語“本發明的肽”是指包含SEQIDNO：11序列或其生物活性片段或生物活性變體的肽。應用于SEQIDNO：11中的術語“其生物活性片段”是指具有至少10個氨基酸的SEQIDNO：11的片段以及參考圖7B在下文中描述的與體外試驗的對照相比，該片段能夠增加胰島β細胞的胰島素分泌。公開的實例中SEQIDNO：11的生物活性片段具有至少12個氨基酸并包含序列PPQSVLSLSQSK(SEQIDNO：5)或序列HQPHQPLPPTVMFPPQSVL(SEQIDNO：1)。特定實例中SEQIDNO：11的生物活性片段包含SEQIDNO：1至11的序列(圖7B)。應用于給定參考肽的術語“生物活性變體”是指所述肽的變體具有至少80％序列同源性，并且通常在肽的全長上具有至少90％，優選地至少95％，理想地至少96％、97％、98％或99％序列同源性，并且參考圖7B在下文中描述的與體外試驗的對照相比，能夠增加胰島β細胞的胰島素分泌。在本文中，序列同源性包括序列一致性和相似性，即與SEQIDNO：11共有90％氨基酸同源性的變體，是在變體序列的全長上任何90％的比對殘基與SEQIDNO：11的相應殘基相同或是對SEQIDNO：11的相應殘基的保守替換。本發明的組合物包括不同肽的混合物，其至少包括2種肽，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或11種不同的肽，其中所述的肽選自于SEQIDNO：11或其生物活性片段。在一個實施例中，所述組合物包括SEQIDNO：1至11的基本上所有的肽，例如8、9或10種肽。術語“包括SEQIDNO1至11的基本上所有的肽的組合物”應該被理解為包括至少8、9或10種肽的組合物。所述組合物也可以包含另外的肽、多肽或蛋白質，或其它組分，例如難消化的碳水化合物。所述組合物可以通過使用胃腸道蛋白酶制劑在合適的溫度水解牛酪蛋白產品(例如酪蛋白酸鈉)充足的時間，以提供包括SEQIDNO：1至11中的至少兩種肽的水解物而制備。本文所用的術語“牛酪蛋白產品”應該被理解為主要由酪蛋白組成的牛奶衍生產品，例如凝乳酶酪蛋白酸鹽和酸酪蛋白酸鹽(酪蛋白酸鈉、鈣和鉀)。本文所用的術語“胃腸道蛋白酶制劑”應該被理解為包含胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶的蛋白酶制劑。典型地，所述水解在30℃至60℃下進行。在一個實施例中，本發明所述組合物是包括SEQIDNO：1至11的一系列肽的酪蛋白衍生的水解物，以下稱為“LFC24”。當根據下文描述的臨床研究條件給予成年人時，本發明所述的組合物通常能降低餐后血糖水平，增加餐后胰島素分泌水平，或二者都可以。本發明也涉及到包括一種或多種本發明的肽的組合物。術語“組合物”可以指食品、藥物、膳食補充劑或營養補充劑。所述食品可以是固體食物或液體。食品的實例包含乳制品(比如牛奶飲料、酸奶、酸奶飲料、奶酪、涂抹醬)、飲料、烘焙食品、肉制品、早餐谷物、零食食品。所述膳食補充劑可以以任何形式提供，包含粉末、顆粒、薄片或以單位劑量形式提供，比如一袋粉末、丸劑、膠囊、片劑、錠劑等等。本發明也涉及到食用產品，例如包括本發明組合物的食品。所述食品可以是固體食物或液體。食品的實例包括乳制品(比如牛奶飲料、酸奶、酸奶飲料、奶酪、涂抹醬)、飲料、烘焙食品、肉制品、早餐谷物、零食食品。所述食品可以包括任何量的本發明組合物，例如從0.1％到30％(w/w)。所述食品可以是特殊藥用食品(FSMP)，其被定義為特定配制、加工和旨在用于對處于醫療監護下治療的個體的疾病、紊亂或醫學情況進行膳食管理的食品。這些食品旨在用于正常食物不能滿足營養需求的人的專屬或部分喂養。“炎癥性疾病”是指影響人的免疫介導的炎癥病癥，并且通常特征在于一種或多種細胞因子的失調表達。炎癥性疾病的實例包含皮膚炎癥性疾病、關節炎癥性疾病、心血管系統炎癥性疾病、某些自身免疫疾病、肺和氣道炎癥性疾病、腸道炎癥性疾病。皮膚炎癥性疾病的實例包含皮炎，例如過敏性皮炎和接觸性皮炎，尋常痤瘡和牛皮癬。關節炎癥性疾病的實例包含類風濕性關節炎。心血管系統炎癥性疾病的實例是心血管疾病和動脈粥樣硬化。自身免疫疾病的實例包括1型糖尿病、格雷夫斯病、格林-巴利疾病、狼瘡、牛皮癬關節炎和潰瘍性結腸炎。肺和氣道炎癥性疾病的實例包含哮喘、囊性纖維化、COPD、肺氣腫和急性呼吸窘迫綜合征。腸道炎癥性疾病的實例包含結腸炎和炎癥性腸病。其它炎癥性疾病包括癌癥、花粉熱、牙周炎、過敏、超敏反應、缺血、抑郁、系統性疾病、感染后炎癥和支氣管炎。在本說明書中，術語“代謝紊亂”應該被理解為包括前期糖尿病、糖尿病；1型糖尿病；2型糖尿病；代謝綜合征；肥胖；糖尿病血脂異常；高脂血癥(hyperlipidemia)；高血壓；高甘油三酯血癥；高脂肪酸血癥(hyperfattyacidemia)；高膽固醇血癥；高胰島素血癥、MODY和HNF1A-MODY。本發明也提供包括結合合適的藥物賦形劑的本發明的肽或組合物的藥物組合物。所述術語“賦形劑”是指與所述肽或組合物一起給藥的稀釋劑、佐藥、賦形劑或載體。這樣的藥物賦形劑可以是無菌液體，比如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，比如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當所述藥物組合物靜脈內給藥時，水是優選的賦形劑。鹽水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可以用作液體賦形劑，特別是用作注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。必要時，所述組合物也可以含有少量的潤濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可以采用溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋制劑等形式。附圖說明圖1：用酪蛋白酸鈉或LFC24治療后120分鐘內葡萄糖的平均變化(Δ變化，mmol/L)。數據基于n＝62個健康成年人呈現，其中誤差線表示平均值的標準誤差(SEM)。治療效果顯著：p＜0.05。圖2：用酪蛋白酸鈉或LFC24治療后120分鐘內胰島素的平均變化(Δ變化，mU/L)。數據基于n＝62個健康成年人呈現，其中誤差線表示平均值的標準誤差(SEM)。治療效果顯著：p＜0.05。圖3：用酪蛋白酸鈉或水解的酪蛋白(LFC24)治療后120分鐘GIP的平均變化(Δ變化，pg/ml)。治療效果顯著：ns。數據基于n＝62個健康成年人呈現，其中誤差線表示平均值的標準誤差(SEM)。GIP(胰高血糖素樣肽)顯著增加，其中用LFC24治療導致濃度在15分鐘時上升高于對照水平之上17.1％，例如增加25.95pg/ml。圖4：用酪蛋白酸鈉或LFC24治療后120分鐘未酯化的脂肪酸的平均變化(Δ變化，mMol/L)。數據基于n＝62個健康成年人呈現，其中誤差線表示平均值的標準誤差。治療效果顯著：p＜0.001。消耗LFC24與消耗完整的酪蛋白酸鈉相比，未酯化的脂肪酸(NEFA)的響應明顯降低。圖5：暴露在LFC24之后，BRINBD11細胞的胰島素分泌(n＝3/4)。數值為平均值±SD。**p＜0.01。細胞暴露于(1)16.7mM葡萄糖(2)16.7mM葡萄糖和10mM丙氨酸以及(3)16.7mM葡萄糖和LFC24(1mg/ml)。圖6：胰島β細胞(BRIN-BD11)的胰島素分泌。用3T3-L1脂肪細胞條件培養基和具有LFC24的3T3-L1培養基(n＝4)培養2小時后BRIN-BD11細胞的胰島素分泌。數值為平均值±SD。暴露于LFC24預防了胰島β細胞功能障礙。**p＜0.01，***p＜0.001圖7A：暴露于16.7mmol/l葡萄糖和編號10的合成肽之后胰島β細胞(BRINBD11)(n＝3/4)的胰島素分泌。數值為平均值±SD。陽性對照是16.7mM葡萄糖和加有10mM丙氨酸的16.7mM葡萄糖。****p＜0.0001圖7B：暴露于16.7mmol/l葡萄糖和合成肽之后誘導的胰島β細胞(BRINBD11)(n＝3/4)的胰島素分泌。數值為平均值±SD。陽性對照是16.7mM葡萄糖和加有10mM丙氨酸的16.7mM葡萄糖。*與葡萄糖對照相比P＜0.05。圖7C：暴露于16.7mmol/l葡萄糖和所述合成肽的組合之后胰島β細胞(BRINBD11)(n＝3)的胰島素分泌。陽性對照是16.7mM葡萄糖和16.7mM葡萄糖以及10mM丙氨酸。肽1、3、4、5、9、10和11的合并樣品比合成肽2、6、7和8的組合更有效。圖8：與對照治療組相比，在ob/ob小鼠葡萄糖耐量試驗期間用LFC24進行急性治療，在15分鐘(*p＜0.05)和120分鐘(*p＜0.05)具有葡萄糖降低效果。結果表示為±SD。(對照n＝5，治療n＝6)。虛線表示對照組以及實線表示用LFC24治療。圖9：用LFC24長期治療引發ob/ob小鼠整個肝臟脂肪百分比在12周的治療后明顯下降。對照表示對照治療的小鼠以及治療表示用LFC24治療。與對照小鼠的肝臟相比，用酪蛋白衍生的水解物治療引起肝臟脂肪減少43％。結果表示為±SD，每個肝臟6個獨立的40×圖像。(對照n＝6，LFC24治療n＝5)，(p＜0.05)。用LFC24長期治療引發ob/ob小鼠平均肝臟脂肪球粒徑在12周的治療后明顯下降。平均脂肪球粒徑從對照肝臟平均39微米的粒徑下降到治療肝臟的28微米。結果表示為平均值±SD，每個肝臟6個獨立的40×圖像。(對照n＝6，LFC24治療n＝5)，(*p＜0.05)。圖10：用酪蛋白衍生的水解物長期治療引起ob/ob小鼠肝臟脂肪球粒徑和整個肝臟脂肪含量在12周的治療后明顯下降。A&B表示對照ob/ob小鼠喂水12周后的肝臟H&E染色切片。C&D表示用LFC24治療的ob/ob小鼠的肝臟H&E染色切片。比例尺＝300μm圖11：GTT期間的葡萄糖水平。數值是平均值±SEM。LFC24防止高脂飲食(HFD)誘發葡萄糖不耐受癥。補充LFC24防止了小鼠HFD誘發葡萄糖不耐受癥。HFD+LFC24喂養的小鼠明顯降低了對GTT的血糖響應，與HFD喂養的小鼠相比，明顯降低葡萄糖挑戰(challenge)后的血糖水平(p＜0.001，p＜0.05)。與HFD喂養的小鼠相比，HFD+LFC24喂養的小鼠的曲線下的GTT面積(AUC)也顯著下降。血糖控制的這種改善是獨立于體重的，因兩種HFD均引發等同的體重增加。圖12：LFC24防止高脂飲食(HFD)誘發脂肪組織中pAKT水平的降低。在處死小鼠之前15分鐘用1.5U/kg胰島素注射小鼠。立即將脂肪組織快速冷凍。(A)磷酸化AKT水平通過蛋白質印跡分析確定。(B)pAKT水平的光密度分析相對于GAPDH歸一化，并用任意單位(AU)表示。(**p＜0.01w.r.t食物+胰島素；++p＜0.01w.r.tHFD+胰島素)(n＝10只小鼠/組)圖13：LFC24防止高脂飲食(HFD)誘發炎癥，用LFC24對比不用LFC24的HDF喂養C57Bl/6小鼠，骨髓巨噬細胞(BMM)減少TNF-、IL-1和IL-18的分泌。從各研究組雄性C57Bl/6小鼠中獲得BMM。將BMM培養7天，接種密度1×105個細胞/ml，用LPS(10ng/ml)刺激3-24h±ATP(5mM)。收集上清液并通過ELISA測定TNF-、IL-1和IL-18的濃度(***p＜0.001；**p＜0.01w.r.t食物+LPS；###p＜0.001；##p＜0.01；#p＜0.05HFD+LFC24+LPS/ATP相對于HFD(不含LFC24)+LPS/ATP)(n＝3只小鼠/組)。圖14：LFC24改善脂肪組織的炎癥，用具有LFC24的HDF喂養C57Bl/6小鼠，脂肪組織外植體減少IL-1、IL-6和TNF-的分泌。給小鼠喂養食物或補充HFD的食物±LFC24處理過的水，獲取附睪的脂肪組織。所述組織用培養基±ATP(5mM)培養24h。收獲培養基，并測定IL-1β(A)IL-6(B)和TNF-α(C)細胞因子的分泌(**p＜0.01w.r.t食物+ATP；+p＜0.05w.r.tHFD+ATP)(n＝9-10只小鼠/組)。圖15：LFC24特異性抑制IL-1和TNF-α對3T3-L1脂肪細胞IL-6表達的促炎性作用；與改善的胰島素信號標記pAKT和GLUT4一致。3T3-L1脂肪細胞用±LFC24(1mg/mL)和NaCAS(1mg/mL)預處理72小時，接著用IL1β/TNFα(0.5ng/mL+0.5ng/mL)處理24小時。培養基和細胞收集起來進行分析。(A)IL-6細胞因子水平通過ELISA測定(***p＜0.001w.r.t.對照；++p＜0.01w.r.tIL1β/TNFα)。(B)在用±胰島素(100nM)處理15分鐘的3T3-L1細胞中，磷酸化AKT通過蛋白質印跡分析測定。(C)GLUT-4mRNA的表達通過RT-qPCR測定(***p＜0.001w.r.t.對照；**p＜0.01w.r.t對照；++p＜0.01IL-1β/TNFαw.r.tLFC24+IL-1β/TNFα)。具體實施例牛酪蛋白衍生的酶水解物(LFC24)的制備將牛奶的酪蛋白組分用胃腸道蛋白酶制劑(胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶)在30℃-60℃溫度范圍內進行蛋白水解消化。在反應完成后，將該溶液加熱使酶失活，并且將該消化物進行蒸發和噴霧干燥。產生的粉末制劑按照下文描述進行生物活性分析并通過反相固相萃取(SPE)分離進行肽的分析。人體研究研究人群通過海報和電臺廣告在都柏林地區招募健康的受試者。該研究由都柏林大學人類倫理研究委員會(UniversityCollegeDublinHumanEthicsResearchCommittee)批準。對感興趣的候選人進行了篩選，并且一旦接受，為他們的參與提供書面的知情同意書。入選標準要求受試者年齡在40-65歲，BMI＞25kg/m2，并且無疾病、未服處方藥、沒有懷孕或者不在哺乳期。表1.研究人群的基線特征(顯示的數據表示62名受試者(32名女性，30名男性)的平均值和標準偏差(SD))平均值SD年齡(歲)53.66.5BMI(kg/m2)31.34.6身體脂肪％37.08.2腰圍(cm)93.710.6收縮壓(mmHg)128.916.9舒張壓(mmHg)82.38.3研究設計和干預該研究是隨機交叉設計攝入完整的酪蛋白酸鈉和包括SEQIDNO：1至11的所有的肽的酪蛋白衍生的水解物(以下簡稱“LFC24”)。從KerryIngredients公司獲得完整的酪蛋白酸鈉。每種蛋白飲料通過在120ml礦泉水(Ballygowan)中重構12g干燥的LFC24或完整的酪蛋白酸鈉而制備，得到10％w/v溶液。達到空腹條件的受試者被指示在10分鐘內吃掉含有75g碳水化合物和蛋白飲料的膳食。在時間點t＝0、15、30、60、90和120分鐘時采集血樣。統計數據表示為平均值±SEM。使用SPSS18.0(美國，伊利諾伊州，芝加哥，SPSS公司)執行線性混合模型分析，對所有分析物進行對照組和治療組的響應的比較。0.05或更低的p值就認為是顯著的。結果總共有30名男性和32名女性成功完成了該研究(表1)。LFC24組和酪蛋白酸鈉組的葡萄糖和胰島素響應顯著不同(圖1和圖2)。體外研究LFC24可以促進胰島β細胞的胰島素分泌(圖5)。試驗最初在細胞系中實施并且使用主要胰島證實(數據未顯示)。LFC24拯救胰島β細胞功能的能力使用脂肪細胞條件培養基-β細胞功能模型檢驗。暴露于LFC24拯救了所述β細胞胰島素分泌的能力(圖6)。在LFC24中被鑒定存在一系列肽。鑒定所述肽后，合成一系列合成肽。測試了促進胰島素分泌的能力，結果如圖7所示。動物模型研究進行了三次動物研究。研究1和2使用ob/ob小鼠模型，研究3使用飲食誘導的肥胖小鼠模型。研究1和2在葡萄糖耐量測試期間酪蛋白衍生的水解物(LFC24)對葡萄糖和胰島素水平的急性效果為了評估LFC24的急性效果，在ob/ob和C57BL/6野生型小鼠中執行GTT。在ob/ob小鼠中發現葡萄糖降低效果，與ob/ob對照組相比，觀察到在15分鐘(*p＜0.05)和120分鐘(*p＜0.05)時葡萄糖水平下降(圖8)。在GTT期間為ob/ob小鼠測量胰島素；與對照條件相比，在GTT之前用酪蛋白衍生的水解物處理一個小時，在0、15和60分鐘時對胰島素水平沒有效果。補充酪蛋白衍生的水解物(LFC24)對肝臟脂肪的效果肝臟組織學研究表明，用酪蛋白衍生的水解物(LFC24)治療引起了肝臟總體脂肪含量顯著(p＜0.05)減少，脂肪滴尺寸顯著(p＜0.05)減少(圖9)。與對照小鼠的肝臟相比，用酪蛋白衍生的水解物治療引起了總體肝臟脂肪減少43％和平均脂肪球粒徑減少28％(圖9)。視覺觀察肝臟的H&E染色圖像揭示了治療后肝臟脂肪鮮明的改變(圖10)。研究3血糖控制和胰島素信號用LFC24治療使用飲食誘發肥胖模型的動物12周。在GTT期間，與單獨的高脂喂養相比，在高脂喂養的情況下用LFC24治療改善了葡萄糖清除率。在食物喂養期間，LFC24沒有效果(圖11)。這種血糖控制的改善可以通過脂肪組織(圖12)、骨骼肌和肝臟(數據未顯示)中pAKT表達的上調解釋。pAKT是調節血糖控制的關鍵胰島素信號分子。炎癥和血糖控制在飲食誘導的肥胖模型中，LFC24誘發抗炎效果，其中用具有LFC24的HFD預防了單獨HFD的促炎、胰島素過敏效應。LFC24顯著減少從骨髓巨噬細胞分泌的TNFα、IL-1β和IL-18(圖13)。此外，LFC24顯著減少離體脂肪組織IL-6、IL-1β和TNFα分泌(圖14)。炎癥-血糖控制交互作用為了明確LFC24對促炎胰島素敏化軸(sensitisingaxis)效果的特異性，我們證明了，LFC24通過減少3T3-L1脂肪細胞分泌IL-6能防止IL-1β和TNFα的促炎效果，這伴隨著胰島素信號分子pAKT和葡萄糖轉運GLUT4的改善(圖15)。本發明并不限于以上描述的實施例，在結構和細節上的變化并不脫離本發明的精神。當前第1頁1 2 3