用于治療由谷氨酸興奮性毒性引起的疾病的細胞可滲透肽系統的制作方法

本發明涉及醫療領域。更詳細地，本發明涉及能夠阻斷NMDA誘導的谷氨酸突觸前釋放的新的肽系統。本發明的肽系統適用于治療與谷氨酸興奮性毒性相關的病狀。

背景技術：

腦中最豐富的氨基酸之一是L-谷氨酸。其在神經元水平上最重要的功能是控制興奮性神經傳遞，這自20世紀50年代就已經被描述，并且其生理拮抗劑是γ-氨基丁酸(GABA)。

L-谷氨酸被認為是興奮性信號和中樞神經系統中快速突觸傳遞的主要介質。L-谷氨酸在中樞神經系統(CNS)的發育中，在突觸的形成和消除中以及在細胞遷移、分化和死亡中起重要作用。此外，L-谷氨酸還是外周器官和組織以及內分泌細胞中傳遞信號的重要分子。

當它在生理水平釋放時，L-谷氨酸在腦功能中具有基本作用，并且似乎參與正常腦功能的許多方面，包括認知、記憶和學習。矛盾的是，當L-谷氨酸在突觸空間中達到高水平時，它變得高度毒性。因此有必要保持作為神經遞質的游離L-谷氨酸和從突觸空間去除和降解的L-谷氨酸的平衡。如果這種平衡得到良好控制，它會保持突觸傳遞的正常生理。當這種平衡由于某些原因朝著突觸空間中的L-谷氨酸持久性不平衡時，該事件導致對細胞存活非常危險的毒性狀態。這種病理狀態被定義為“谷氨酸興奮性毒性”，并且其專門涉及中樞神經系統(CNS)，盡管該氨基酸具有普遍存在的性質。

谷氨酸能突觸傳遞因CNS細胞上存在L-谷氨酸受體(GluR)的存在而發生。這些受體分為兩個主要類別：離子型(iGluR)和代謝型(mGluR)谷氨酸能受體。

這兩種受體類別功能不同。實際上，離子型受體是一組蛋白質(亞基)，其在細胞膜上形成離子通道，并通過向外和向內打開和流動離子來轉導信號。相反，代謝型受體是橫貫在細胞膜上，不允許分子通過膜但傳遞外部信號，開始一系列細胞內事件(第二信使)的蛋白。

亞型NMDA、AMPA和紅藻氨酸鹽(KA)構成離子型受體組的一部分。

代謝型受體組被標記為mGluR，并且其中8種不同的蛋白是已知的。

許多研究已經表明，谷氨酸的急性形式的神經毒性主要由谷氨酸(iGluR)的離子型受體介導。這種形式的神經毒性的特征在于iGluR突觸前和突觸后的過度活化，其涉及被動跟隨Cl^-離子的大量Na⁺的神經元內的流入和K⁺離子的流出。離子的這種運動負責水的進入，這引起神經元“腫脹”，滲透性溶解和壞死。此外，大量的Ca²⁺流完成離子運動。

在負責谷氨酸突觸前釋放的谷氨酸能受體中，有被稱為NMDA的谷氨酸能受體。這種受體是第一個被發現和表征的谷氨酸能受體。

NMDA從以特定方式藥理活化它的化學物質命名，即：N-甲基D-天冬氨酸。它是由4個亞基形成的配體激活的通道受體，其中4個亞基一起在細胞膜中產生孔。它在神經元中的定位是突觸后和突觸前。

NMDA通道具有被鎂離子正常阻斷的特定特性。當存在神經元的去極化時，例如當谷氨酸的其他受體(AMPA，代謝型)被激活時，這種“鎂阻斷”不會發生。

NMDA受體由多個亞單位的組裝體：GLUN1和GLUN2構成。后者又相應地分為其他同種型(2A-B-C-D)。亞基的組成在腦的各個部位和亞細胞定位中是可變的，但是GLUN1的存在對于正常受體功能是必需的。

NMDA受體復合物對于不同分子具有許多不同的鍵合位點——由于它們與谷氨酸一起是共激動劑——可以調節通道的開放，并因此調節對該事件的細胞反應的強度。這些調節位點是谷氨酸的位點(也是NMDA的位點)、甘氨酸的位點和多胺(精胺和亞精胺)的位點。

一旦突觸前NMDA通道開放，存在Na⁺，Ca²⁺離子的入口和K⁺離子的出口。這種離子運動導致膜的去極化，并因此導致谷氨酸的釋放。NMDA的去極化誘導細胞內激活導致神經遞質釋放的所有系統的Ca²⁺的增加和遷移。

即使現在許多研究已經描述了NMDA受體將外部信號轉移到細胞內部的模式，仍然需要許多努力來了解在這種機制中哪些是結合NMDA受體和釋放谷氨酸的蛋白。

這個論點的重要性在于許多病理學與興奮毒性相關，即使藥物存在試圖對抗它們，但是迫切需要找到更具體地可以作為創新藥物的目標的新的藥理學靶點。

然而，除了對于神經元的生命是必需的之外，谷氨酸也可以變得相當有毒。在急性應激事件例如缺血、顱腦損傷和癲癇危象期間GluR的過度活化導致腦神經元的死亡。此外，谷氨酸的神經毒性也可以參與在神經變性和神經炎癥的背景下分類的各種慢性疾病的發病機理。谷氨酸的神經毒性可通過NMDA、AMPA、KA受體或谷氨酸代謝型受體的第I組的異常刺激而發生。這些不同類型的受體的相對貢獻根據所涉及的神經元和各種其他情況而變化。

谷氨酸通過這種受體的過度激活似乎在各種攻擊后的細胞死亡中起重要作用，例如與癲癇狀態、腦缺血、圍產期窒息和顱外傷有關的那些。更具體地，似乎NMDA受體是更大程度地參與這些病理的受體；實際上，通過使用NMDA拮抗劑，可以緩解與這些病理相關的腦損傷程度。

當應激嚴重時，細胞死亡通過壞死發生，而如果其不太嚴重，則可觸發凋亡型過程。所涉及的主要機制是通過配體依賴和電壓依賴性通道連接到Na+和Ca²⁺的過量進入有關的離子不平衡。細胞內Ca²⁺濃度的增加以級聯方式激活有助于細胞死亡的各種酶。離子穩態的變化、改變的能量細胞代謝、線粒體的毒性和來自自由基的氧化應激之間存在復雜的相互作用。

還已經提出GluR受體的慢性活化也起到基本作用，因為這可以在多種遲發性神經性障礙中誘導神經變性的過程。至少部分地，過度和長期活化受體如NMDA或AMPA的內源性谷氨酸似乎是諸如肌萎縮性側索硬化(ALS)、多發性硬化、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病和帕金森病疾病的發病機制的原因。目前在市場上臨床藥物被用于急性和慢性病。它們的活性通常是NMDA受體拮抗劑的活性。這種受體阻斷劑一方面似乎有效并且在有些上述病狀中產生初步益處，另一方面產生甚至可能是嚴重的副作用。因此，醫學研究必須盡最大努力，繼續鑒定受體的細胞內配偶體，在這種特定情況下是NMDA，以使得可能的藥物的作用越來越具有特異性和少毒性。

在老年人群中引起慢性癡呆的最常見疾病是阿爾茨海默病(AD)。

在這種病理學中，發作是進行性的，并且從年輕時開始發展，那時認知功能輕微下降。

然后，在偶發性記憶減少發作之后，在語言和現實感知以及執行正常日常活動的能力方面存在認知缺陷的增加。

現在已經確定，該病理學是由于在分配給記憶的區域中的神經炎斑塊和神經原纖維纏結的沉積。這些沉積物隨時間流逝導致進行性神經元死亡，從而誘導尤其是皮質和海馬的腦萎縮。

已認識到，通過淀粉樣前體蛋白(AβPP)的淀粉樣加工過量產生的β-淀粉樣蛋白(Aβ)肽的片段是AD原因的第一個因素。實際上，Aβ肽的胞外積累導致神經炎斑的形成。正在討論關于神經元毒性的物質是循環的細胞外肽還是不溶性斑塊。

神經原纖維纏結是病理學的另一種組織病理學特征。在這些纏結中最存在的蛋白質是與其超磷酸化形式的微管(Tau)相關的蛋白質。這些細胞間聚集體存在于各種神經變性病理學中，其被稱為tau蛋白病。這種蛋白質的過度磷酸化被指示為這些病理學中神經元變性的原因。

帕金森病(PD)是一種神經退行性病變，其中中樞神經系統的特定區域主要由于嚴重的排尿問題擊中運動系統而受到損傷。這種類型的缺陷歸因于投射到條紋體的黑色物質的多巴胺能神經元的進行性變性。在腦組織中的分子水平上，PD的特征在于Lewy體的積累，Lewy體是蛋白質聚集體，其中α-突觸核蛋白和泛素也可以在其他元件中被識別。有各種導致該病的病理學遺傳突變體和蛋白質；在目前已知的那些中，還有Parkin，其突變是大多數家族性PD形成的原因和涉及各種基因轉錄的多功能蛋白DJ-1，DJ-1的功能喪失是早期PD發病的原因之一。

肌萎縮性側索硬化(ALS)是影響腦運動神經元和脊髓的高度失能的退行性神經病理學。

該病起始于大量消耗，導致肌肉萎縮，并逐漸發展成肌肉癱瘓。

SLA通常是零星來源的，但一部分的遺傳形式被認可。在遺傳形式的情況下，超氧化物歧化酶(SOD1)的突變是疾病的原因。SOD1參與通過發揮解毒作用保護神經元細胞免受“氧化”。

突變的人SOD1導致對所討論的神經元細胞有毒的聚集體的形成。

亨廷頓舞蹈病(HD)是具有遺傳特性的神經變性病理學，其屬于來自多聚谷氨酰胺的病理學類別。紋狀體神經元的逐漸萎縮是這種病理學的主要特征，其導致具有非常熟知的排尿缺陷。

HD是亨廷頓蛋白(HTT)的N末端鏈的polyQ延長的結果，其不被這樣降解并積聚在神經元中。

腦缺血不是具有退行性特征的病理學；然而，擊中注定要死亡的神經細胞也可以在與其他神經變性病理的病理性共病中具有重要作用，并且其存在于癲癇以及圍產期窒息和頭顱創傷中。它是一種高度致殘的疾病，會導致死亡或嚴重殘疾。當由于心臟病發作，動脈瘤、血管閉塞、出血、創傷等原因，正常血流不再提供大腦區域時，局部缺血以明顯突然的方式發生。由于受影響區域中的血液再灌注缺血期間氧和葡萄糖的喪失以及損傷導致神經元細胞經歷高代謝應激。

在細胞水平上，缺血引起ATP的減少，細胞內鈣的增加，氧化損傷和線粒體功能障礙。所有這些事件導致高的谷氨酸能傳遞，其導致興奮性毒性并因此損害注定死亡的神經元細胞。

多發性硬化(MS)是脫髓鞘性慢性自身免疫性疾病，其擊中中樞神經系統，引起各種各樣的體征和癥狀。多發性硬化癥擊中神經細胞，使得腦和脊髓之間的交流困難。神經細胞通過軸突傳遞電信號，軸突被隔離物質髓鞘覆蓋。在該疾病中，患者的免疫防御攻擊并損傷該鞘。當這種情況發生時，軸突不再能夠有效地傳輸信號。其致病機制是復雜的，并由興奮毒性基礎上的炎癥和變性過程維持；確切的病因仍然未知。不同的理論提出遺傳和感染原因；此外，已經指示了與環境風險因素的相關性。該疾病可以表現為許多神經系統癥狀，并且可以發展為身體和認知殘疾。多發性硬化可以呈現多種形式，包括復發和進行性形式。

重性抑郁障礙是一種情緒障礙或病理學，其特征為抑郁情緒的發作伴隨著低自尊和在正常的愉悅活動中的興趣或快樂的喪失。抑郁癥是一種復雜的疾病，由于遺傳和環境因素，涉及神經系統的復雜網絡。最確認的假說是“抑郁癥的單胺能理論”，根據該假說，臨床抑郁癥將源于使用單胺例如5-羥色胺、多巴胺或去甲腎上腺素的一種或多種類型的腦突觸的效率降低。新的研究表明抑郁癥和一些參與谷氨酸信號傳遞的基因的一些變體之間的關系。據此，已經證明氯胺酮(已知用于阻斷NMDA受體的物質)具有比常規抗抑郁藥更快的抗抑郁作用，而常規抗抑郁藥在顯示結果之前需要許多周：氯胺酮能夠在很大程度上反對抑郁癥比目前用抗抑郁藥(其確實沒有有效地解決目前的問題)發生的方式更有效。

精神分裂癥是一種嚴重的精神障礙，是復雜的，往往是有病的。精神分裂癥的第一癥狀通常表現在青春期和早期成年期。受精神分裂癥影響的人難以表達他們的想法；這種情況導致他們有幻覺、妄想、不連貫的思想以及不尋常的行為和言語。由于這些癥狀，被這種疾病打擊的人們在與他人交流中具有嚴重的困難，并且傾向于與外部世界隔離。已經進行了各種嘗試來解釋改變的腦功能和精神分裂癥之間的聯系。最經典的假說之一是多巴胺的作用：多巴胺能神經元的功能障礙可能是導致精神病的癥狀的原因。最近的結果支持物理受試者中多巴胺和谷氨酸神經遞質系統之間的異常關系的假說，并且表明能夠影響谷氨酸鹽傳遞途徑的藥物的開發可用于治療精神病。

焦慮癥是精神疾病的常見形式，其通常引起明顯的痛苦和問題并導致生活質量下降。存在不同類型的焦慮障礙：例如，廣泛性焦慮障礙、社交焦慮障礙、恐慌障礙和強迫性強迫性障礙。焦慮癥的原因是未知的。然而，腦功能的一些改變似乎涉及各種焦慮癥。此外，社會和壓力條件可能有助于焦慮癥的發展。由于遺傳學、神經化學、心理藥理學和神經成像技術的發展，對涉及恐懼、焦慮和相關干擾的生物學基礎的理解-即使仍然不全面-已經取得了相當大的進展。特別地，關于焦慮的神經生物學基礎的知識的顯著增加源自對恐懼反應的行為組分的研究，特別是與涉及神經解剖學途徑(杏仁核、前額皮質[PFC]、丘腦和海馬)，以及可以至少部分解釋個體對焦慮障礙的不同脆弱性的受體和遺傳方面。在涉及的神經遞質中，GABA、谷氨酸、5-羥色胺、神經肽和內源性大麻素發揮重要作用。

偏頭痛是一種高度禁用的局限于中樞神經系統的神經病理學，其在最嚴重的情況下也與自主神經系統的癥狀相關。通常，病理學表現為局限在頭部的疼痛，但也與惡心、嘔吐、畏光和恐懼癥有關。許多遭受偏頭痛的人會有預兆，其表現在頭痛之前的暫時視覺、運動和感覺障礙。目前，最確認的分子原因是在神經元，特別是皮質中發生的異常興奮性興奮性喘振，然后是在整個皮層區域延伸的神經元活動的抑制。目前使用的藥物是在最嚴重的情況下與止吐藥物相關的經典的鎮痛藥物。因此，在這種病理學中，谷氨酸鹽的過度釋放是器官紊亂的基礎。

另一種谷氨酸釋放是疼痛癥狀的原因之一的病理是慢性神經性疼痛。這是自外周纖維和中心纖維之間的神經信號的連接以異常方式起作用開始的中樞神經系統的病理學。通常，癥狀表現為持續的燒灼或電擊感，并且感覺異常也常常存在于主疼痛位置的周圍區域。痛覺過敏和異常性疼痛是這種病理的主要特征。

不幸的是，神經性疼痛難以治愈；目前使用的唯一藥物是鎮痛藥，其通常導致無效。

本發明基于識別位于神經元終止的突觸前區室上的NMDA受體的活化所誘導的谷氨酸釋放的非常特異性的機制。特別地，下文詳細描述的本發明實現了蛋白質c-Jun N-末端激酶(JNK)參與由NMDA受體活化觸發的細胞事件的級聯中的識別。這發生在第一次記錄在突觸前水平的JNK蛋白的存在時。在開始更詳細的描述之前，及時指出JNK是具有與涉及許多細胞功能的不同信號途徑相關的酶活性的普遍存在的細胞內激酶。JNK是涵蓋在導致神經元死亡的信號中的核心作用的蛋白質，其在各種病理條件下得到驗證。JNK可以在刺激酪氨酸激酶受體、細胞因子受體，與G蛋白偶聯的受體和配體依賴性離子通道(包括NMDA受體)后被激活，并且它們表示信號細胞死亡的真正指標。雖然JNK通常與突觸后NMDA受體相關，但其突觸前的作用仍然很大程度上未被發現。

技術實現要素：

本發明涉及能夠特異性阻斷NMDA誘導的谷氨酸突觸前釋放的肽系統。特別地，本發明涉及適于制備用于抑制參與控制谷氨酸釋放的蛋白質的相互作用的兩種細胞滲透性肽。在本發明肽系統的定義的上游，通過生物化學和電生理學方法，證實了JNK在突觸前水平的存在，參與NMDA誘發的谷氨酸釋放的控制。此外，通過使用敲除小鼠與JNK的單一同種型結合分子模型研究，在與本發明有關的研究過程中證明JNK的同種型2是介導該突觸前的必需蛋白事件。更詳細地，表明JNK2位于神經元的突觸前部分，并且可能通過與稱為突觸融合蛋白1a(STX1a)的專有突觸蛋白的相互作用來執行其對NMDA介導的釋放的控制的作用。由于STX1a是神經遞質釋放機制的必需蛋白，本發明是基于JNK2和STX1a之間相互作用的研究，以確定兩種蛋白質相互作用的部位。因此，設計了兩種細胞可滲透的肽，其能夠阻斷這種JNK2-STX1a相互作用。以這樣的方式設計肽，使得它們可以通過細胞屏障并抑制位于突觸前水平的相互作用。因此，這兩種肽能夠特異性阻斷NMDA誘導的谷氨酸突觸前釋放。這兩種肽在下文中稱為JGRi1和JGRi2。

附圖說明

圖1表示JNK蛋白的抑制對谷氨酸的突觸前釋放的作用，并且還顯示了在不同刺激的作用下JNK蛋白的突觸活化。A)表示從野生型小鼠的皮質制備的突觸體的相關結果，所述突觸體預先裝載有放射性神經遞質，然后如所示用不同的刺激孵育。結果表示為誘導釋放的百分比。數據表示為三個重復(每個實驗條件三個灌注室)的三個實驗獲得的平均值±SEM(平均值的標準誤差)。**p<0.01相對于基礎釋放。B)從野生型小鼠的皮質制備的突觸體預先裝載放射性神經遞質，并在如所示的刺激之前與L-JNKi1(2μM)孵育30分鐘。結果表示為誘導釋放的百分比。數據表示為從三個重復的三個實驗(每個實驗條件三個灌注室)獲得的平均值±SEM(平均值的標準誤差)。L-JNKi1阻止NMDA刺激引起的釋放。**p<0.01相比于由NMDA誘發的100％釋放。C-D-E)具有相對定量的代表性蛋白質印跡，顯示在KCl(B)刺激90秒，NMDA(C)10分鐘，AMPA(D)10分鐘后達到的p-JNK水平和用帶L-JNKi1的突觸體處理。結果表示為p-JNK/JNK比例相比對照(按100％計)的增加百分率。數據表示每個條件4個實驗的平均值±SEM。用NMDA處理誘導JNK磷酸化增加**p<0.01相對于對照的100％)，而JNKi1不降低NMDA的作用(*p<0.05，相對于對照的100％)。

圖2表示JNK在依賴于NMDA的谷氨酸的釋放中的功能性作用。A)描述了來自菌株C57BL6/J的小鼠切片的7個神經元記錄和與L-JNKi1(2μM)預孵育的小鼠C57BL6/J切片的10個神經元記錄的誘發型EPSC的配對脈沖比(PPR)直方圖(平均值±SEM)。在左邊，在對照條件下，在施用D-AP5(50μM)期間和在洗滌D-AP5后，從相同的神經元獲得代表性印跡。B)表示mEPSC(左)和從C57BL6/J的單個神經元記錄的事件間間隔(右)或與D-AP5響應的與L-JNKi1預孵育的C57BL6/J神經元的振幅的累積分布。在對照條件下，在施用D-AP5和隨后的洗滌期間，從相同的神經元獲得頂部印跡。C)描繪了從C57BL6/J株的小鼠切片的11個神經元和回應D-AP5與L-JNKi1預孵育的小鼠C57BL6/J神經元切片的10個神經元記錄的誘發EPSC的配對脈沖比(PPR)的直方圖(平均值±SEM)。**p<0.01(t-檢驗)。

圖3表示JNK控制Syntaxin 1a的磷酸化，并且JNK2/3與Syntaxin 1a一起免疫共沉淀。A)顯示了在所示的治療期間各自定量的STX1a的磷酸化的代表性的蛋白印跡結果。結果表示為百分比，并用對照標準化。數據是5個實驗的平均值±SEM，其中10分鐘的NMDA+L-JNKi1降低了pSTX1a/STX1a的比率(**p<0.01相對于對照的100％)，L-JNKi1自身也是如此(**p<0.01相對于對照的100％)。B)表示代表性的蛋白質印跡結果，其中各自的定量顯示了在用D-AP5處理期間JNK的磷酸化水平。結果表示為相對于對照的百分比(100％)。數據是3次實驗的平均值±SEM。C)顯示了代表性的蛋白質印跡結果，其中各自的定量顯示了在用D-AP5處理期間STX1a的磷酸化水平。結果表示為百分比，并用對照標準化。數據表示3個實驗的平均值±SEM。D)表示相對定量的免疫共沉淀(Co-IP)的實驗結果。如圖所示刺激野生型小鼠的皮質突觸體，并用STX1a抗體進行免疫沉淀。代表性的蛋白質印跡結果顯示剝離程序后p-JNK的Co-Ip和JNK。將膜印跡為STX1a(作為免疫沉淀的對照)和SYT1(作為特異性的對照)。結果表示為相對于對照條件p-JNK/STX1a或JNK/STX1a比率增加的百分比。數據是每個處理的4個實驗的平均值±SEM(*p<0.05，**p<0.01，相對于對照的100％)。

圖4表示NMDA-誘發的谷氨酸釋放和NMDA-誘導的JNK磷酸化在JNK2KO小鼠中如何被抑制。

A)表示在預裝有放射性示蹤劑的野生型和JNK-KO型小鼠的皮質中的突觸體中通過NMDA刺激誘導的谷氨酸釋放的結果。結果表示為誘導釋放的百分比。數據是一次三個進行的4個實驗的平均值±SEM(每個實驗條件3個灌注室)。**p<0.01相對于WT；相對于JNK1-KO或JNK3-KO，p<0.05。B)表示定量的代表性蛋白質印跡結果，其顯示了在治療期間JNK2-KO或JNK3-KO小鼠中pJNK/JNK的比率。結果表示為相對于對照的百分比(100％)。數據表示3個實驗的平均值±SEM(**p<0.01相對于100％的對照)。

圖5表示同種型JNK2如何參與NMDA介導的谷氨酸釋放。A)表示響應于D-AP5(50μM)的同工型JNK KO小鼠的單個神經元記錄的mEPSC的幅度(左)和事件間間隔(右)的累積分布。在對照條件下，在施用D-AP5和隨后的洗滌期間，從相同的神經元獲得頂線。B)表示mEPSC(左)和事件間間隔(右)的振幅值的平均值的直方圖(平均值±SEM)，其中響應D-AP5放的n＝8JNK1KO，n＝7JNK2KO和n＝6JNK3KO神經元。**p<0.01t-檢驗。

圖6表示蛋白質相互作用JNK-STX1a的分子對接模型。A、B、C)代表從分別鑒定為模型1、2和3的STX1a和JNK2之間相互作用的研究中獲得的三個最佳對接可能性。JNK2蛋白由組100表示，而STX1a的N末端部分由組200表示。D)表示STX1a的N-末端部分的結構：示出了300、400和500區段，其表示以最高概率與JNK2相互作用的部分。所有圖像的渲染是通過使用VMD軟件進行的。

圖7表示用L-JNKi1處理不引起NMDA和AMPA受體亞單位(A)的改變，也不引起釋放機制(B)的蛋白質的改變，不論在NMDA刺激條件期間還是它獨自施用。

圖8表示在電生理學膜片鉗實驗中兩種肽JGRi1和JGRi2對野生型小鼠皮層切片中谷氨酸鹽的釋放的影響。更詳細地，所討論的圖表示具有n＝9個神經元的事件間間隔的幅度值的平均值的直方圖(平均值±SEM)，其中JGRi1和JGRi2一起應用或n＝4個神經元用于JGRi1和n＝6個神經元的JGRi2。**p<0.01t-檢驗。

圖9表示肽的固相化學合成方法的實例。符號表示：小圈，氨基酸鏈保護基；R，氨基團保護；X、Y、Z、L，官能團。

循環重復該過程，直到獲得肽。

圖10表示從具有序列SEQ ID NO.5：GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS的肽JGRi1的HPLC分析獲得的色譜圖。

圖11表示從具有序列SEQ ID NO.8：GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER的肽JGRi2的HPLC分析獲得的色譜圖。

圖12表示具有序列SEQ ID NO:5：GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS的肽JGRi1的質譜。

圖13表示具有序列SEQ ID NO.8:GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER的肽JGRi2的質譜。

具體實施方式

本發明基于在STX1a突觸前水平存在JNK同種型(JNK1、JNK2、JNK3)存在的證實。以這種蛋白質相互作用為起點，設計兩種肽：細胞可滲透的JGRi1和JGRi2，其能夠阻斷這種JNK2-STX1a相互作用并減少通過刺激NMDA受體誘導的谷氨酸的釋放。

實驗數據

c-Jun N端激酶(JNK)調節谷氨酸的突觸前釋放

JNK在突觸前水平上的生理學存在通過進行谷氨酸釋放實驗來證明。由于該實驗類型，可以研究JNK激酶在突觸前區室中的作用。使用小鼠品系C57/BL6的分離皮層末端(突觸體)。對預先裝載有氚化的D-天冬氨酸([³H]D-Asp)的這些突觸體進行由不同刺激誘導的谷氨酸釋放。突觸體用已經使用多年的方法即超表達進行刺激，其中突觸體用連續的電流溶液不斷洗滌，并且在某一點進行刺激。在該過程中釋放的氚化谷氨酸由于突觸前細胞內事件而被排他地釋放，并且一旦收集，就被分配到β-發射輻射計數器中。突觸體對輕微去極化刺激(8mM KCl)的瞬時暴露(90秒)誘導[³H]D-Asp明顯地胞吐釋放(158±37％對比，**P<0.01)，其與暴露于100μMNMDA的10分鐘獲得的釋放相當(202±21％相對于對照，**p<0.01)。在缺乏Mg²⁺的培養基中應用NMDA刺激以確保突觸前NMDA受體的有效性。以相同的方式，10分鐘的50μM(S)-AMPA的刺激能夠顯著增加[³H]D-Asp的釋放(98±11％相對于對照，**P<0.01)(圖1A)。所有應用的刺激已知用于以Ca²⁺依賴性方式觸發神經遞質的釋放。然后，為了研究JNK的可能的突觸前作用，使用阻斷JNK信號級聯的特異性抑制劑

(L-JNKi1)，阻止JNK與結合JNK結合域(JBD)的靶蛋白的相互作用。L-JNKi1是市售的細胞滲透性肽，皮質突觸體與它在2μM濃度下處理30分鐘。有趣的是觀察到，僅NMDA-刺激的谷氨酸的釋放被L-JNKi1強烈抑制(-60±10％相對于對照＝100％**P<0.01)(圖1B)，這表明是JNK信號級聯在特異性調節NMDA誘發的谷氨酸釋放中存在特異性。

在突觸按鈕級別激活JNK

上述報告的結果首次說明JNK在突觸前按鈕中的存在以及相應的功能。此外，很明顯JNK能夠調節由NMDA受體活化誘導的谷氨酸的釋放。為了證實JNK的突觸前位置及其它們可能的活化，對小鼠的皮質突觸體進行生化實驗，測量由上述刺激誘導的磷酸化(圖1C-E)。在不含Mg²⁺的培養基中暴露于100μMNMDA 10分鐘后，JNK的磷酸化增加(+63±18％，相對于對照＝100％**P<0.01)。由于L-JNKi1不影響JNK的磷酸化，即使其已經預孵育，所應用的NMDA刺激繼續導致磷酸化JNK的增加(+49±10％相對于對照＝100％。*P<0.05)。相反，當L-JNKi1單獨應用時，JNK基礎磷酸化保持不變，表明該物質在基礎系統中沒有作用(圖1D)。另外兩種去極化刺激，AMPA和KCl，反而不能增加JNK的磷酸化，表明NMDA刺激是特異性調節JNK活性的(圖1C-E)。

JNK介導NMDA依賴性谷氨酸的突觸前釋放

谷氨酸能末端上的突觸前NMDA受體被自發釋放的谷氨酸激活，并且通過正反饋機制，確定谷氨酸的強直釋放。進行電生理記錄以研究JNK在谷氨酸鹽釋放中的功能作用。為此，從與或不與JNK、L-JNKi1抑制劑(2μM，30min)一起孵育的成年小鼠C57BL6/J獲得的內嗅皮質(EC)的大腦切片的錐體神經元測量稱為雙脈沖易化(PPF)的參數。這種雙脈沖易化是通過膜片鉗配置中電生理記錄技術進行研究的模式。

在這種情況下，用NMDA受體拮抗劑D-AP5(50μM)的灌注不可逆地降低了以50ms間隔獲得的雙脈沖(PPR)關系(**p<0.01，Student t-檢驗，對照相對于D-AP5，n＝7；**p<0.01，Student t-檢驗，D-AP5相對于洗滌，n＝7；圖2A)。當切片用L-JNKi1預孵育時，用D-AP5灌注不改變PPR(p>0.05，Student t-檢驗，對照相對于D-AP5，n＝10；圖2A)。該數據表明，即使在更加整合的系統如大腦切片中，L-JNKi1也消除了NMDA依賴性突觸前釋放的概率，并且與突觸體的釋放數據一致。

隨后，根據已經常用的方案，通過測量微型興奮性電流(mEPSC)，研究L-JNKi1對NMDA依賴性突觸前谷氨酸釋放的影響。當在膜片電極下在存在細胞外河豚毒素(1mM)和微毒素(100μM)以及MK-801(10mM)、NMDA抑制劑(在記錄的細胞中為了阻斷突觸后NMDA通道)的存在下將D-AP5應用，觀察到累積事件(IEI)之間的間隔分布的可逆增加(***p<0.001，KS測試，C57BL6/J相對于D-AP5，n＝11；圖2B)和其平均值(**p<0.01，Student t-檢驗，對照相對于D-AP5，n＝11；圖2C)；另外，相同事件的累積幅度和平均值都沒有受到影響(p>0.05，KS測試，C57BL6/J相對于D-AP5，n＝11；圖2B，p>0.05，Student t-檢驗，對照相對于D-AP5，n＝11；圖2C)。D-AP5引起的頻率降低是由于突觸前NMDA受體的阻斷，這有助于補充性谷氨酸鹽的釋放。在與L-JNKi1預孵育的切片中，D-AP5效應丟失。實際上，發現用D-AP5灌注沒有導致事件間間隔的顯著變化(p>0.05，KS測試，C57BL6/J+L-JNKi1相對于D-AP5，n＝10；2B；p>0.05，學生t檢驗，對照相對于D-AP5，n＝10；圖2C)，其振幅也沒有(p>0.05，KS檢驗，C57BL6/J+L-D-AP5，n＝10；圖2B；p>0.05，Student t-檢驗，對照相對于D-AP5，n＝10；圖2C)。這些結果表明JNK的抑制降低了由突觸前NMDA受體介導的谷氨酸的釋放。

總體而言，我們的電生理數據表明JNK在NMDA急性治療的腦切片中的谷氨酸的NMDA依賴性釋放中發揮功能性作用。

JNK調節STX1a的磷酸化

Syntaxin 1a是用于裝配SNARE復合物(可溶性NSF附著蛋白受體)的必需蛋白，其是釋放神經遞質的必要步驟。STX1a在ser14(pSTX1a)磷酸化在神經遞質釋放機制中的作用仍是一個有爭議的主題。已經有一些報道，pSTX1a的減少具有降低神經遞質釋放的直接后果，而另一些實驗證明pSTX1a的減少促進了神經遞質的釋放。

在暴露NMDA10分鐘后，JNK磷酸化增加(圖1D)，這引起STX1a(STX1a(S14))磷酸化的輕微但非顯著降低(圖3A)。有趣的是觀察到用L-JNKi1預處理30分鐘，然后NMDA刺激導致pSTX1a的顯著降低(-40±6.4％，相對于對照＝100％，**P<0.01)。即使其對JNK的磷酸化沒有影響(圖1D)，L-JNKi1自身的施用令人驚訝地引起STX1a的磷酸化的強烈降低(-45±6.4％，相對于對照＝100％，**P<0.01)。為了解釋這種現象，我們可以假設，由于突觸體與缺乏Mg²⁺的培養基分批保持，所以神經遞質(包括谷氨酸)可以積聚在細胞外區室中，因此即使在L-JNKi1單獨施用時。然后將NMDA拮抗劑D-AP5用于估計pJNK(+10±8.9％相對于對照)(圖3B)或pSTX1a(-10±7.2％相對于對照)相比對照條件(100％)下(圖3C)可能的變化，從而排除發生這種變化的可能性。由于已知其他蛋白質是神經遞質釋放系統的一部分，所以分析了JNK與突觸蛋白磷酸化的可能相互作用。

突觸蛋白(SYN(S9))的磷酸化不受在所有實驗條件下引起的刺激的影響(圖3A)。總的來說，這些結果讓我們可以假設JNK活性的抑制特異性地降低了STX1a的磷酸化。

JNK與STX1a相互作用

為了更好地理解在NMDA誘導的谷氨酸釋放中JNK和STX1a之間的協同相互作用，進行了共免疫沉淀(Co-IP)實驗(圖3D)。用針對STX1a的特異性抗體免疫沉淀從突觸體提取的蛋白質，然后通過蛋白質印跡用特異性抗體檢測pJNK和JNK。對照(非免疫沉淀樣品)給出具有較低條帶(JNK1，46kDa)和較高條帶(JNK2/3，54kDa)的典型JNK信號。令人驚訝的是，以JNK和磷酸化的pJNK形式的STX1a僅免疫沉淀JNK2和3同工型；事實上，抗體檢測到上帶。這個結果明顯地阻止了蛋白質STX1a綁定到JNK1上，并表明STX1a和JNK2/3相互作用的形成已經在基礎條件(Ctrl)下得到驗證。此外，當用NMDA施用到L-JNKi1上時，相對于對照條件，JNK和pJNK的免疫反應性都顯著降低(圖3DA/KNK/STX1a：-42±2％對照＝100％；**p<0.01，比值pJNK/STX1a：-39±3％與對照＝100％；*p<0.05)，表明蛋白質-蛋白質相互作用被L-JNKi1擾亂。有趣的是觀察到，通過應用L-JNKi1，在非刺激條件下STX1a-JNK2/3相互作用減少(圖3D，比率JNK/STX1a：-44±4％，相對于對照＝100％；**p<0.01和比率pJNK/STX1a：-46±8％，相對于對照＝100％；**p<0.01)，顯示相互作用是結構性存在的。為了評價免疫沉淀物的特異性，還使用了抗突觸結合蛋白1抗體(Syt1)，其沒有免疫沉淀，這表明STX1a-JNK2/3相互作用是特異性的。

在敲除JNK2的小鼠中，谷氨酸的釋放和JNK的磷酸化不再受NMDA誘導

為了識別由突觸前區室中的NMDA刺激活化的JNK的特異性同種型，對從敲除JNK(KO)的小鼠獲得的皮質突觸小體進行谷氨酸釋放實驗。通過NMDA施用10分鐘誘導出谷氨酸的釋放，測量[³H]D-Asp的流出量。有趣的是觀察到，相對于JNK1、JNK3-KO小鼠和野生型型小鼠(WT)，只有在JNK2-KO小鼠中NMDA誘導的釋放相對于對照顯著降低(相對于本底為28±19％)，(圖4A)。該結果表明突觸前JNK2同工型特異性控制NMDA誘發的釋放。

為了確認釋放實驗，如果不存在JNK2降低JNK的磷酸化，則對用NMDA刺激的突觸小體進行研究。如所預期的，在JNK2-KO小鼠中，相對于對照，JNK的磷酸化被完全消除。相反，它仍保持在JNK3-KO小鼠中，其中NMDA誘導pJNK的增加(相對于對照＝100％為+76±10％；**p<0.01)(圖4B)與在WT小鼠中完全相當(圖1D)。在這兩種情況下，L-JNKi1自身不能影響JNK的磷酸化。

膜片鉗實驗中JNK2調節NMDA依賴性谷氨酸釋放

通過記錄mEPSC，使用相同的上述方案對JNK1 KO、JNK2-KO和JNK3-KO小鼠進行電生理記錄。D-AP5的灌注誘導JNK1-KO中的事件間期的累積分布的增加(***p<0.001，KS測試，JNK1 KO相對于D-AP5，圖5A)和JNK3 KO(***p<0.001，KS測試，JNK3-KO相對于D-AP5，圖5A)和平均值的增加(**p<0.01，Student t-檢驗，對照相對于JNK1或JNK3 KO；圖5B)。在兩種基因型中，mEPSC的振幅從未受D-AP5的影響(p>0.05，KS測試，JNK1或JNK3-KO相對于D-AP5，圖5A；P>0.05，Student t-檢驗，JNK1或JNK3KO；圖5B)，而在JNK2-KO小鼠中由于施用D-AP5而導致谷氨酸鹽釋放的減少已被特異性降低。實際上，D-AP5在mEPSC中沒有產生顯著變化(p>0.05，KS測試，JNK2-KO相對于D-P5；圖5A；p>0.05，Student t-檢驗，對照相對于JNK2KO，圖5B)，或幅度(p>0.05，KS測試，JNK2-KO相對于D-P5，圖5A；p>0.05，Student t-檢驗，對照相對于JNK2KO，圖5B)。總體而言，這些數據表明，在我們的實驗條件下，只有JNK2同種型介導谷氨酸的突觸前釋放。

JNK變種的對接結果

通過比較三個JNK的不同序列，觀察到JNK1提供18個特征性殘基，JNK245個，而JNK3僅有11個。特征殘基被定義為僅有一個同種型的特異性變體的殘基，與其他兩個JNK不同。

特征殘基在蛋白質-蛋白質相互作用中是重要的，尤其是如果Syntaxin 1a與JNK的僅一種變體特異性相互作用，則這種變體的特征殘基相對于其他JNK應當是不同的。JNK2明顯不同于JNK1和JNK3的事實可以是其與Syntaxin的特異性相互作用的第一個指示。

隨后，使用Rosetta軟件進行蛋白質-蛋白質對接的模擬，用于模擬Syntaxin 1a和JNK2之間的復合物。

觀察到從分析得到的三個主要結構是基于界面得分的三個最佳分類結構。這些中的每一個的渲染圖像在圖6中報告，其中JNK2用白色表示，而突觸融合蛋白1a的N端用紅色表示。

為了更好地評價這些結構，計算了隱藏的表面積。在模型1(圖6a)和2(圖6b)中，存在約1700A2的隱藏表面積，而模型3(圖6c)呈現2680A2的表面積。然后分析界面殘基并與JNK2的特征殘基比較。該測試證明在模型3中，Syntaxin 1a的N-末端與八個特征殘基相互作用，在模型2中具有五個這樣的殘基，在模型1中僅具有兩個這樣的殘基。這些觀察促使我們將模型3解釋為獲得的最佳相互作用構象。

然后獲得呈現圖像，其指示了突觸融合蛋白1a的N-末端部分(區段300和400)的可能的接觸位點。

在囊泡蛋白和NMDA或AMPA受體的亞基水平的機制下JNK的抑制沒有引起變化。

然后監測幾種突觸前蛋白如Syntaxin 1a(STX1a)、突觸蛋白(SYN)、Munc18-1和突觸結合蛋白1(Syt1)的表達水平，因為它們的改變削弱了神經遞質的釋放機制。在我們的實驗條件下，L-JNKi1，如果單獨施用或與NMDA組合施用，沒有修改突觸體中STX1a、SYN、Munc18-1和Syt1的存在(圖7A)。以相同的方式，NMDA和AMPA受體亞基的表達(圖7B)保持不變，因此確保NMDA介導的對突觸前JNK的影響不依賴于其表達水平的特異性修飾。

分析和構建抑制谷氨酸釋放的肽

分析突觸融合蛋白1a的N-末端部分的氨基酸序列，可鑒定形成特征性3α-螺旋的3個不同殘基；它們是Ha、Hb和Hc。氨基酸序列(總共288個氨基酸)表示如下：

SEQ ID NO.1:

MKDRTQELRTAKDSDDDDDVTVTVDRDR(28)FMDEFFEQVEEIRGFIDKIAENVEEVKRKHSAIL(62)ASPNPDEKT(71)KEELEELMSDIKKTANKVRSKLKSIEQSIEQEE(104)GLNRSSA(111)DLRIRKTQHSTLSRKFVEVMSEYNATQSDYRER(144)CKGRIQRQLEITGRTTTSEELEDMLESGNPAIFASGIIMDSSISKQALSEIETRHSEIIKLETSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVERAVSDTKKAVKYQSKARRKKIMIIICCVILGIIIASTIGGIFG

Ha從氨基酸28到62

Hb從氨基酸71到104

Hc從氨基酸111到144

已經鑒定為在Syntaxin 1a上JNK2的相互作用位點的兩個序列如下：

1)SEQ ID NO.2:IEQEEGLNRS

2)SEQ ID NO.3:MSEYNATQSDYRER

然后將這兩個序列用于構建兩個細胞可滲透肽JGRi1和JGRi2。

所述肽的功能是基于中斷JNK2蛋白與突觸融合蛋白1a的N-末端部分的相互作用的原理。因此，如果細胞具有不同長度的Syntaxin 1a的氨基酸序列，其從兩種蛋白質之間的最小相互作用的位點或直到Syntaxin 1a的N末端的整個部分變化，那么這些肽將競爭性地參與與JNK2的相互作用，從而抑制與內源性Syntaxin 1a的鍵合。該事件能夠減少谷氨酸的釋放。可以認為有效的肽從Syntaxin 1a的整個N末端部分(288個氨基酸)至對應于序列SEQ ID NO.2：IEQEEGLNRS的最少10個氨基酸的長度上變化。或對應于序列SEQ ID NO.3：MSEYNATQSDYRER的14個氨基酸。

為了使肽具有細胞可滲透性，在本序列的N-末端部分之前插入HIV病毒的Tat蛋白(48-59)的序列，因此又增加了12個氨基酸。

Tat(48-59)具有以下12個氨基酸的序列：GRKKRRQRRRPP。

該序列是非常有效的，無論其是在每種可能的合成肽的N-或C-末端位置加入。肽的一個實例是以一種方式合成的具有26個氨基酸總長度的肽。

兩個肽的序列如下：

JGRi1(SEQ ID NO.5):GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.6)IEQSIEQEEGLNRSGRKKRRQRRRPP或甚至關于Tat序列的相應的鏡像序列例如(SEQ ID NO.7)PPRRRQRRKKRGIEQSIEQEEGLNRS

JGRi2(SEQ ID NO.8):GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER或(SEQ ID NO.9)MSEYNATQSDYRERGRKKRRQRRRPP或甚至關于Tat序列的相應的鏡像序列如(SEQ ID NO.10)PPRRRQRRKKRGMSEYNATQSDYRER

所述兩種肽由具有L對映體結構的氨基酸合成，但也合成為D對映體，以提高其在活生物體中的穩定性。

相同的序列可以作為相應的DNA序列插入，也插入到用于在細胞系、細菌中以及在病毒生產的載體中表達的不同載體中。

表達載體中的插入可以是完整序列，因此是

JGRi1(SEQ ID NO：5)：GRKKRRQRRRPPIEQSIEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.6)IEQSIEQEEGLNRSGRKKRRQRRRPP或關于Tat序列的相應的鏡像序列例如(SEQ ID NO.7)PPRRRQRRKKRGIEQSIEQEEGLNRS

JGRi2(SEQ ID NO.8):GRKKRRQRRRPPMSEYNATQSDYRER或(SEQ ID NO.9)MSEYNATQSDYRERGRKKRRQRRRPP或關于Tat序列的相應的鏡像序列如(SEQ ID NO.5)PPRRRQRRKKRGMSEYNATQSDYRER或通過添加不同的結構域，因此首先是TAT的序列，然后是(SEQ ID NO.2)IEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.3)MSEYNATQSDYRER，或反之亦然。此外，為了使最終蛋白在細胞系統中可識別，可以加入小片SNA，其編碼小(tag)肽，例如HA、GST、Myc、EGFP等。

例如：pGEX-4、pTAT、p-EGFP-C1、pc-DNA、商購或還未用于基因治療的3代慢病毒載體、用于辛德比斯病毒的載體、用于感染(轉導)神經元的腺病毒。

在谷氨酸釋放實驗(如上所述)和電生理學實驗(膜片鉗，如上所述)中測試兩種肽，以測試它們在減少神經遞質的NMD誘發釋放中的有效性。

在膜片鉗實驗中兩種肽都導致谷氨酸的NMDA依賴性釋放降低。將小鼠皮層切片處理30分鐘，然后記錄mEPSC與各種條件下肽的間期的累積分布。兩種肽(JGRi1和JGRi2)無論以5μM的濃度一起加入還是以10μM的濃度分別加入，降低了抑制劑D-AP5阻斷NMDA突觸前受體的功能(圖8)。該數據表明NMDA受體已經被細胞內通路中的兩種肽有效阻斷，因此作用于NMDA胞外部分的受體抑制劑不再具有作用。

這兩種肽證實了突觸體和腦切片上的有效性，表明假設它們在細胞外環境中施用，它們能夠滲透進入細胞，也擴散到完整的組織中。還預計所述肽能夠在生物體中完全擴散。為了減少它們的降解，從而增加它們的半衰期，本發明的肽系統是通過使用屬于D立體化學系列的氨基酸合成的。

D-JGRi1:

dG-dR-dK-dK-dR-dR-dQ-dR-dR-dR-dP-dP-dI-dE-dQ-dS-dI-dE-dQ-dE-dE-dG-dL-dN-dR-dS

D-JGRi2:

d-G-dR-dK-dK-dR-dR-dQ-dR-dR-dR-dP-dP-dM-dS-dE-dY-dN-dA-dT-dQ-dS-dD-dY-dR-dE-dR

這些細胞可滲透肽的可能的給藥途徑包括所有已知的組合，其范圍從具有直接生物利用度的那些到隨著時間改變釋放的那些組合。

我們包括通過腹膜內、肌內、皮下和靜脈內注射(肽系統的生理溶液)，透皮吸收途徑(膏藥、軟膏、乳膏、油等)、舌下(糊劑或固體溶液)、鼻內(各種生理溶液)和口服(口服制劑如懸浮液，片劑，膠囊等)途徑。

此外，所有納米技術制劑產生改性釋放，無論是經皮或系統通過注射或口服給藥。

此外，考慮新的給藥途徑：神經元干細胞的產生，工程改造使得它們以細胞可滲透形式(表達序列Tat)或非細胞可滲透形式產生肽系統。這些細胞一旦注射，一旦它們到達受退行性疾病襲擊的腦區，能夠增殖并原位釋放肽系統。

制備本發明肽系統的方法

這些肽的合成通過目前通常使用的化學方法進行，其允許獲得高達甚至70個殘基的氨基酸鏈。使用固相化學合成儀，其中第一個氨基酸錨定于固體堿基(樹脂)下，然后通過氨基酸之間的異肽反應，肽鏈通過重復循環延長(圖9；改自Current Protocols in Molecular Biology(2002)11.15.1-11.15.9)。

合成后，使用HPLC(高效液相色譜)分析來從反應廢物的污染物中純化肽。此外，進行質譜分析的循環以驗證肽的身份。當所獲得的產率(具有26個氨基酸的肽)超過95％時，認為肽是良好的。

如果最終肽是L形式，則使用L立體化學形式的氨基酸形成肽鏈，如果最終肽是D形式，則使用D形式的肽。

質粒載體合成。

關于質粒系統，肽的核苷酸序列-無論它們是否都包含Syntaxin 1a的N-末端部分，或甚至更短的對應于序列(SEQ ID NO.2)IEQEEGLNRS長度為10個氨基酸的肽和對應于序列(SEQ ID NO.3)MSEYNATQSDYRER的含有14個氨基酸的肽以及所有可能的長度，也可在序列Tat＝(SEQ ID NO.4)GRKKRRQRRRPP的前(N末端)或后(C末端)端-插入在質粒表達載體中。

例如，對應于氨基酸序列(SEQ ID NO.2)IEQEEGLNRS或(SEQ ID NO.11)IEQSIEQEEGLNRS和(SEQ ID NO.3)MSEYNATQSDYRER插入核苷酸序列，并且還將Syntaxin 1a的整個N末端部分插入細菌表達載體pTAT中。該載體的特定性質在于細菌合成的融合蛋白含有不同標簽，其從N末端部分開始為：6xHis，序列Tat＝(SEQ ID NO.4)GRKKRRQRRRPP和標簽人流感血凝素(HA)。除了用于使合成的蛋白質細胞可滲透的序列Tat之外，其它標簽可用于通過特異性抗體識別外源蛋白質。

細胞表達的質粒制備和質粒細菌合成的蛋白純化

在下文中，描述了關于含有包含作為本說明書目標的肽系統的質粒載體的細菌菌株的制備的幾個實施例。下文指出的物質的量僅作為非限制性實例報道。因此，在本說明書的過程中，假設本領域技術人員理解使用甚至不同量的可能性，只要試劑之間的比例遵循以下實施例中所述。

含有上述序列的慢病毒質粒pGEX-4或pTAT或p-EGFP-C1或pc-DNA被插入大腸桿菌，例如菌株DH5α或BL21和化學感受態衍生物(rosetta)。然后，根據需要將5μg質粒DNA(p-EGFP-C1或pc-DNA)加入到20μL KCM 5X(含有0.5M KCl；0.15M CaCl₂；0.25M MgCl₂)，5μL MnCl₂，加水至100μL溶液。此時，加入等體積的化學感受態DH5α細菌細胞。將它們在冰(4℃)上放置幾分鐘。將整個溶液在室溫下放置幾分鐘，產生熱沖擊。

然后，因為質粒含有抗生素抗性，加入含有100μg/mL氨芐青霉素在37℃下加熱的600μL Luria Broth培養基(LB)(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，15g/L瓊脂)。然后將溶液鋪在具有相同濃度的氨芐青霉素的瓊脂上。然后，通過MAXI-prep商業試劑盒進行質粒DNA的純化用于細胞轉染或用文獻中經典方法合成慢病毒顆粒。

細菌BL21和衍生物的轉化用不同的方案進行。

將5μg載體(pGEX-4或pTAT)加入到100μL細菌中，然后將其在4℃下孵育30分鐘。然后，將溶液在42℃下放置45秒誘導熱沖擊。以這種方式，細菌摻入質粒。然后將溶液在冰中放置5分鐘，接著加入4倍體積(400μl)LB。將整個溶液鋪在含有氨芐青霉素的瓊脂上，并使菌落在約37℃下生長12小時。

MINI-PREP，用限制酶切割

由于目的序列被插入限制酶之間，因此測試細菌生長以控制質粒在細菌內的實際摻入。

然后用無菌點提取生長的菌落，并置于5mL含氨芐青霉素的LB中。在37℃細菌生長5-6小時后，用商業試劑盒制備小量制備物。然后，將從每個菌落獲得的等分試樣DNA溶液進行酶切，利用限制酶作為亞克隆(37℃，60分鐘)。

之后，讓DNA在瓊脂糖凝膠上運行，并在光度計上控制切割的序列。

讓表達更多質粒的幾微升菌落生長，以便接下來制備在-80℃冷凍的甘油儲液。

生長和誘導：

從甘油儲液中，來自單個菌落的細菌在37℃下在攪拌(250rpm)下作為預接種物接種在LB+氨芐青霉素(100μg/ml)中生長。

用1/50的預接種物在37℃(250rpm)下在新鮮的LB+Amp中生長(數量取決于預期產量的多少)，直至達到0.8-1的OD 600。

然后加入0.5mM IPTG以誘導外源蛋白的產生。

提取1mL的預接種物，并以5000rpm離心5分鐘。然后將沉淀儲存在-20℃下，以便隨后在SDS-PAGE凝膠上分析。

在37℃以250rpm的速度誘導持續4-5小時。然后，將細菌在4℃以8000rpm離心20分鐘。

傾析上清液稱重沉淀并在-20℃下儲存。

細菌團塊的溶解

將具有以下組成(0.1M TRIS-HCl、1mM EDTA pH 7.5)的裂解緩沖液加入到沉淀中，每克沉淀物加2ml裂解緩沖液。

然后將沉淀重懸浮并加入1.5mg/g Lisozyme(來自10mg/ml儲液)以裂解細菌。將溶液在室溫下孵育2小時，并在200rpm下攪拌。

將裂解物在冰上孵育10分鐘，然后持續50秒的4個脈沖進行超聲處理。在一個脈沖與下一個脈沖之間，將溶液在冰中放置1分鐘。

然后，在4℃下以12000rpm離心20分鐘。

儲存上清液并取出沉淀的薄片；將此片花破碎，使其變軟。

包涵體的分離

加入裂解物的體積(超聲處理后)是Triton緩沖液的體積的1/2。然后，將其在室溫下以200rpm攪拌孵育30分鐘。然后在4℃下以12000rpm的速度離心20分鐘。將沉淀重懸于裂解緩沖液中。然后，加入Triton緩沖液，其體積等于管中體積的一半。然后將其在室溫下以200rpm孵育。在4℃下12000rpm離心20分鐘。

將沉淀重懸浮于洗滌緩沖液中并在4℃下以12000rpm離心20分鐘。再次洗滌沉淀3或4次，總是用洗滌緩沖液。然后將沉淀儲存在-20℃下。

溶解和透析

沉淀用5mL/g含有6M胍和1mM DTT的增溶緩沖液溶解。

2-3小時后，用HCl將pH調節至3-4。然后在4℃下以12000rpm離心20分鐘。

然后將上清液用6M胍鹽在pH 3-4下透析。

將透析溶液改變3次：每次洗滌在3小時后進行，第三次洗滌在4℃下保持整夜。

然后透析溶液變為pH為7的50mM的磷酸鈉緩沖液**，用與胍鹽進行透析所用的相同的模式更換透析溶液。

最后，在丙烯酰胺凝膠上使用透析物質的等分試樣，用考馬斯染色，其中必須看到對應于合成蛋白質的條帶。

剩余的透析物質在離子交換柱上純化。

**磷酸鹽緩沖液的制備：

制備1M的NaH2PO4溶液和1M Na₂HPO₄溶液。將兩種溶液一起加入，并確認pH 7。

在離子交換柱上純化。

使用三種溶液：50mM pH 7磷酸鹽緩沖液；50mM pH 7磷酸鹽緩沖液+1M NaCl；20％乙醇+20％乙酸鈉的H₂O溶液。

將溶液過濾，脫氣并在+4℃下儲存，以便在使用時是冷卻的。

<110> 馬爾科?費利焦尼

羅伯特?喬瓦尼?尼斯蒂科

<120> 用于治療由谷氨酸興奮性毒性引起的疾病的細胞可滲透肽系統

<130> A7718

<140> ITRM2014A000171

<141> 2014-04-04

<160> 13

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 288

<212> PRT

<213> 鼠科

<400> 1

Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Asp Val Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu

20 25 30

Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala

35 40 45

Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser

50 55 60

Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser

65 70 75 80

Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile

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Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp

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Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val

115 120 125

Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg

130 135 140

Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr

145 150 155 160

Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile

165 170 175

Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu

180 185 190

Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser

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210 215 220

Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala

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Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys

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<212> PRT

<213> 鼠科

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<212> PRT

<213> 鼠科

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<212> PRT

<213> 鼠科

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<212> PRT

<213> 鼠科

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<213> 鼠科

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<212> PRT

<213> 鼠科

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20 25

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<212> PRT

<213> 鼠科

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<212> PRT

<213> 鼠科

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<213> 鼠科

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<213> 鼠科

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100 105 110

Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp Leu Arg Ile Arg

115 120 125

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180 185 190

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<213> 鼠科

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