包含因子VIII和馮·維勒布蘭德因子肽的制劑的制作方法

背景技術：

因子VIII(Factor VIII，“FVIII”)是約280kDa分子量的血漿糖蛋白。其參與導致血液凝固的凝血反應級聯。最常見的出血性疾病由缺乏功能性因子VIII引起，其稱為A型血友病。其用因子VIII的替代(血漿來源的或重組的)治療。因子VIII用于A型血友病患者出血的急性和預防性治療。

因子VIII的氨基酸序列被組織成三個結構域：330個氨基酸的三重A結構域(triplicated A domain)，980個氨基酸的單個B結構域，和150個氨基酸的雙重C結構域(duplicated C domain)。B結構域與其他蛋白質沒有同源性，并提供該蛋白質25個潛在天冬酰胺(N)-連接的糖基化位點中的18個。B結構域在凝血中顯然沒有作用。與全長因子VIII相比，B結構域缺失的因子VIII分子具有不變的促凝活性。一些重組因子VIII(recombinant Factor VIII，rFVIII)制劑是B結構域缺失的。

在血漿中，因子VIII通過與馮·維勒布蘭德因子蛋白(Von Willebrand Factor，“vWF”)締合而穩定，其似乎抑制因子VIII的清除，例如通過蛋白水解或受體介導的通過LRP受體的清除。在循環中，在正常生理條件下，馮·維勒布蘭德因子以相對于因子VIII的50倍摩爾過量存在。

馮·維勒布蘭德因子是存在于哺乳動物血漿中的多聚粘附糖蛋白，其具有多種生理功能。在初級止血期間，馮·維勒布蘭德因子充當血小板表面上的特異性受體與胞外基質(例如膠原蛋白)的組分之間的介體。此外，馮·維勒布蘭德因子還充當促凝血因子VIII的載體和穩定蛋白。馮·維勒布蘭德因子在內皮細胞和巨核細胞中以2813個氨基酸的前體分子合成。該前體多肽(前原馮·維勒布蘭德因子)由22殘基信號肽、741殘基前肽和在成熟血漿馮·維勒布蘭德因子中發現的2050殘基多肽組成(Fischer等，FEBS Lett.351：345-348，1994)。在分泌到血漿中后，馮·維勒布蘭德因子以具有不同分子大小的多個種類的形式循環。這些馮·維勒布蘭德因子分子由2050個氨基酸殘基的成熟亞基的寡聚體和多聚體組成。馮·維勒布蘭德因子通常可以大小約500至20,000 kDa的多聚體見于血漿中(Furlan，Ann Hematol.1996年6月；72(6)：341-8)。

人因子VIII在人體循環中的平均體內半衰期為約12小時。當與因子VIII形成復合物時，馮·維勒布蘭德因子可以通過針對因子VIII分子上的重鏈(A2結構域)和輕鏈(A3/C2結構域)上的已知潛在抑制劑抗體位點(Ragni，J Thromb.Haemost.10：2324-2327，2012)或其他潛在抗體抑制劑位點對FVIII進行保護，降低對因子VIII的可能免疫反應。

人的另一種出血性疾病是血管性血友病(Von Willebrand′s disease，vWD)。根據出血癥狀的嚴重程度，可以通過用含有馮·維勒布蘭德因子的濃縮物進行替代療法來治療vWD，所述馮·維勒布蘭德因子一般來自血漿，但是重組馮·維勒布蘭德因子也在開發中。已知馮·維勒布蘭德因子在體內穩定因子VIII，由此在調節因子VIII的血漿水平中起關鍵作用，因此是控制初級和二級止血的中心因素。

直到今天，A型血友病和vWD的標準治療涉及頻繁的靜脈內輸注因子VIII和因子VIII/馮·維勒布蘭德因子濃縮物的制劑。這些替代療法一般是有效的，然而，例如在經歷預防性治療的嚴重A型血友病患者中，由于因子VIII約12小時的短血漿半衰期，因此因子VIII必須每周靜脈內(i.v.)施用約3次。通過實現高于正常人血漿1％的因子VIII水平(對應于因子VIII水平升高0.01U/ml)，已經將嚴重的A型血友病轉變成中度A型血友病。在預防性治療中，設計給藥方案以使得因子VIII活性的水平不低于非血友病因子VIII活性的2-3％的水平。

通過靜脈內施用(i.v.)施用因子VIII是麻煩的，其與疼痛相關聯并且帶來感染的風險，尤其是因為這主要是由患者自己或由被診斷患有A型血友病的兒童的家長在家庭治療中完成的。此外，頻繁的靜脈內注射不可避免地導致疤痕形成，從而干擾未來的輸注。在緊急情況或手術中(即當立即需要高的因子VIII水平時)可能仍然需要靜脈內治療。

已經提出了因子VIII的皮下施用(s.c.)(例如在WO 95/01804 A1和WO 95/026750 A1中)。然而，必須施用非常高劑量的因子VIII以實現可接受的生物利用度。

在非靜脈內施用時改善生物利用度的另一種方法是使用白蛋白融合的因子VIII(WO 2011/020866 A2)。

WO 2013/057167 A1提出通過非靜脈內施用將因子VIII與硫酸化糖胺聚糖組合施用，其任選地與馮·維勒布蘭德因子一起施用。

WO 2008/151817 A1描述了未切割的馮·維勒布蘭德因子多聚體用于穩定因子VIII(血漿來源的或重組(全長和缺失突變體))的一般用途，旨在用于血管外治療。

WO 2013/160005 A1描述了重組馮·維勒布蘭德因子或重組馮·維勒布蘭德因子片段在皮下治療后改善非常特異性的因子VIII分子的生物利用度的一般用途，其中所述因子VIII分子包含大小為100-400個氨基酸的截短的B結構域。根據WO 2013/160005A1，與具有整個B結構域的因子VIII或者不具有或僅具有幾個氨基酸的B結構域截短的因子VIII分子相比，具有100至400個氨基酸的截短的B結構域的因子VIII分子具有更高的因子VIII生物利用度。

仍然需要表現出改善的生物利用度、穩定性和/或更低抗體產生風險的因子VIII制劑，從而避免現有技術的缺點。

本發明的目的是提供替代的因子VIII制劑。優選地，這些制劑應表現出改善的穩定性、改善的生物利用度和/或降低的免疫反應的風險。

在一個實施方案中，該目的通過包含因子VIII與一種或更多種馮·維勒布蘭德因子肽之復合物的組合物實現，其中所述馮·維勒布蘭德因子肽包含SEQ ID No.1的至少764至1035和1691至1905位氨基酸，但不包含SEQ ID NO 1的2255至2645位氨基酸。

根據本發明，提供了包含馮·維勒布蘭德因子肽的因子VIII制劑。因子VIII與所包含的馮·維勒布蘭德因子肽形成復合物。

本文所用的因子VIII涵蓋全長因子VIII、B結構域缺失的因子VIII或這樣的因子VIII：其中所述B結構域已被人工接頭或天然B結構域的片段或者這兩者的組合所替代，即所述B結構域與全長因子VIII相比具有不同的大小。其還涵蓋帶有有限數目的具有插入、缺失或替換之修飾的因子VIII，特別是適于如K.R.Viel，等New England J Med 2009；360：1618-1627中所述的單倍型的因子VIII。優選地，與因子VIII具有序列同源性(如1986年7月21日SwissProt的P00451的20-2351位氨基酸所限定的)，但是如在FASTA第36版中所執行的，忽略根據FASTA的99％的B結構域中的同源性，其基于W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequence comparison”Meth.Enzymol.266：227-258。換句話說，當計算序列同源性時，B結構域不包括在這兩種蛋白質的比較中。還涵蓋經修飾的因子VIII，如HES-因子VIII或PEG因子VIII或因子VIII Fc融合蛋白和因子VIII白蛋白融合蛋白，如在Oldenburg，Haemophilia(2014)，20(Suppl.4)，23-28中所述。

本發明的因子VIII可以是血漿來源的或重組的因子VIII。當使用重組因子VIII時，其優選在人細胞系中表達以模擬人糖基化模式(Casademunt，Eur J Haematol.2012；89：165-76)或如WO 2010/020690中所述。

本文所用的馮·維勒布蘭德因子肽是在單個氨基酸鏈中包含SEQ ID No.1的至少764至1035位氨基酸和SEQ ID No.1的1691至1905位氨基酸的肽。這些氨基酸可以是一起包含這些序列兩者的較長序列的一部分。換言之，本發明的馮·維勒布蘭德肽包含SEQ ID No.5和SEQ ID No.6兩者。其可以包含馮·維勒布蘭德因子的其他部分，但不包含2255至2645位的所有氨基酸(SEQ ID No.7)。馮·維勒布蘭德肽可以包含作為SEQ ID No.1的一部分的其他序列或不是SEQ ID No.1的一部分的序列，例如，氨基酸接頭等。優選地，不是SEQ ID No.1的一部分的氨基酸的總量不超過50個，不超過20個或不超過10個氨基酸。

本發明的一個重要方面是，SEQ ID No.1的2255至2645位氨基酸不是馮·維勒布蘭德因子肽的一部分。換言之，馮·維勒布蘭德因子肽不包含根據FASTA與SEQ ID No.7具有至少90％同源性的任何序列，如下所述。

SEQ ID No.1是2011年1月11日的Swiss Prot數據庫的序列P04275。

本發明組合物中的馮·維勒布蘭德因子肽可以是具有相同序列的肽，或可以是具有上述序列的肽的混合物。

通常，因子VIII與馮·維勒布蘭德因子肽的分子比為1∶1至1∶20，優選1∶2至1∶10。如果馮·維勒布蘭德因子肽是二聚體或多聚體的形式，則在單個氨基酸鏈上計算分子比，即因子VIII分子與馮·維勒布蘭德因子肽的二聚體的復合物將具有1∶2的比。

本文所用的復合物是指因子VIII與一種或更多種馮·維勒布蘭德因子肽的非共價結合。

在本發明的一個優選實施方案中，馮·維勒布蘭德因子肽是馮·維勒布蘭德因子的片段，即馮·維勒布蘭德因子的N端和域C端截短形式。

在一個實施方案中，所述片段包含SEQ ID No.1的764至1905位氨基酸。

本發明的另一個實施方案是包含因子VIII與一種或更多種馮·維勒布蘭德因子肽之復合物的組合物，所述馮·維勒布蘭德因子肽是馮·維勒布蘭德因子的片段，并具有這樣的氨基酸序列：其對應于SEQ ID NO 1之起始于764位氨基酸并且在1905和2153位氨基酸之間終止的氨基酸序列并具有多至20，或多至10個選自氨基酸缺失、氨基酸插入或氨基酸替換的修飾。

優選的馮·維勒布蘭德因子肽是：

具有SEQ ID NO.1的764至1905位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1906位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1907位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1908位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1909位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至1910位序列的肽

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具有SEQ ID NO.1的764至2134位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2135位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2136位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2137位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2138位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2139位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2140位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2141位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2142位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2143位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2144位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2145位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2146位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2147位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2148位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2149位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2150位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2151位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2152位序列的肽

具有SEQ ID NO.1的764至2153位序列的肽。

本發明的另一個實施方案是包含因子VIII與一種或更多種馮·維勒布蘭德因子肽之復合物的組合物，其中

-所述馮·維勒布蘭德因子肽是馮·維勒布蘭德因子的片段

-相比于單獨的因子VIII，所述因子VIII與所述馮·維勒布蘭德因子的片段的復合物表現出與磷脂膜的結合降低

-相比于因子VIII與全長馮·維勒布蘭德因子的復合物，所述因子VIII與所述馮·維勒布蘭德因子的片段的復合物表現出與膠原蛋白III的結合降低

-相比于因子VIII與全長馮·維勒布蘭德因子的復合物，所述因子VIII與所述馮·維勒布蘭德因子的片段的復合物表現出與肝素的結合降低。

優選地，馮·維勒布蘭德因子肽的分子量＜500kD，優選＜400kD。由于馮·維勒布蘭德因子通常形成寡聚體或多聚體，因此本發明的肽也可以是多聚體或寡聚體的形式。

在一個優選的實施方案中，本發明的肽具有選自以下的至少一種性質：

(i)對肝素的親和結合常數K_D＞1nM，優選≥2.43nM

(ii)對膠原蛋白III的親和結合常數K_D＞5nM，優選≥17.02nM

(iii)對因子VIII的親和結合常數K_D＜100nM或＜10nM，優選≤6.19nM，以及

(iv)抑制至少70％，優選至少80％或至少90％的因子VIII磷脂結合。

本發明的馮·維勒布蘭德因子肽優選表現出與肝素結合的降低、對膠原蛋白(如膠原蛋白III)的較低親和力、對磷脂的較低親和力，但仍然對因子VIII具有高結合。

令人驚奇的是，在非靜脈內施用(特別是皮下施用)的情況下，與磷脂和膠原蛋白的低結合改善了釋放速率。

各親和結合常數的測量在實驗部分中進行了描述。

在一個實施方案中，馮·維勒布蘭德因子肽通過蛋白水解切割或化學切割從馮·維勒布蘭德因子獲得。如果使用蛋白水解切割，則金黃色葡萄球菌(S.aureus)V-8蛋白酶是特別優選的。

優選地，本發明的組合物具有以下的至少一種性質：

(i)所述馮·維勒布蘭德因子肽保護因子VIII免受抗體結合以使患者中的抑制劑形成最小化

(ii)穩定因子VIII，以在-70℃下以冷凍液體形式儲存12個月后提供至少90％的剩余因子VIII活性

(iii)穩定因子VIII，以在5℃下以凍干形式儲存24個月后提供至少90％的剩余因子VIII活性

(iv)穩定因子VIII，以在25℃下以凍干形式儲存12個月后提供至少90％的剩余因子VIII活性

(v)將因子VIII的體內半衰期延長至少20％，以及

(vi)在用所述組合物處理6個月后，將先前未處理患者中的抑制劑形成減少至小于20％，優選小于10％。

令人驚訝的是，馮·維勒布蘭德因子肽似乎在儲存時(貨架期)提高因子的穩定性和/或減少患者中的抑制劑形成。抑制劑形成是治療慢性出血性疾病中的主要問題之一。

本發明的組合物尤其可用于治療或預防出血性疾病。

因此，本發明的另一個實施方案是治療出血性疾病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的本發明組合物。

所述量取決于待治療的疾病或病癥，并且可以由本領域技術人員選擇。對于長期治療，每次施加20至40IU/kg體重的量通常是合適的。在緊急情況下，所述量可以為約10至50IU/kg體重。

本發明的組合物可以通過靜脈內施用或非靜脈內施用來施加。非靜脈內施用可以是皮下注射、皮內注射或肌內施用。

本發明方法的一個優點是可使用納米過濾來除去病毒。馮·維勒布蘭德因子由于其大小，不能用具有小孔徑以除去病毒的納米過濾器進行納米過濾。因為馮·維勒布蘭德因子肽的大小比全長馮·維勒布蘭德因子分子小得多，所以具有小孔徑的納米過濾變得可能。任選地使用一個或更多個串聯的納米過濾器，在這樣的孔徑和條件下進行納米過濾，所述孔徑和條件將最小的已知病毒之一豬細小病毒(porcine parvovirus)的濃度降低至少100倍(2log)，優選至少1000倍(3log)，最優選降低至低于細小病毒測定的檢測極限的濃度。對于該測試，將豬細小病毒摻入(spike)樣品中，并在過濾后進行分析。

因此，本發明的另一個實施方案是用于減少病毒的方法，其包括在與因子VIII組合之前或之后納米過濾所述馮·維勒布蘭德因子肽的步驟，由此豬細小病毒將減少至少2log。

用于施用本發明組合物的一種優選緩沖液(puffer)包含優選高達1000mM，特別是約10mM至約200mM，特別是約10mM至約100mM的量的松三糖(melizitose)。

本發明的另一個實施方案是制備馮·維勒布蘭德因子肽的方法，其包括以下步驟：

·將馮·維勒布蘭德因子與金黃色葡萄球菌V-8蛋白酶在酶與馮·維勒布蘭德因子重量/重量比為1∶5至1∶100的條件下孵育2至16小時

·在陰離子交換劑上結合和純化，并通過施加增加量的鹽濃度，在來自所述陰離子交換劑的級分中收集期望的經純化的vWF肽。

附圖說明

圖1示出了來自通過金黃色葡萄球菌V8蛋白酶消化的pdVWF的片段III(SPIII)的純化。A-片段III(由箭頭指示)洗脫譜的MonoQ色譜圖。B-純化片段的SDS-PAGE凝膠；red.-還原；n.r.-非還原。

圖2示出了來自通過胰蛋白酶消化的片段III的片段I(III-T4)的純化。片段I(由箭頭指示)洗脫譜的MonoQ色譜圖。純化片段的非還原SDS-PAGE圖片示于插圖中。

圖3示出了在第二次金黃色葡萄球菌V8蛋白酶消化后來自片段III的片段II的純化。A-還示出了第二切割產物片段II(由箭頭指示)以及V8蛋白酶洗脫譜的MonoQ色譜圖。B-完全去除蛋白酶所需的第二MonoQ色譜法的色譜圖。純化片段的還原SDS-PAGE圖片示于插圖中。

圖4示出了pdVWF、片段II和III與rFVIII的結合。A，B，C-結合傳感圖(灰色曲線)，和曲線比對(黑色曲線)，其代表固定的rFVIII與pdVWF/純化的片段II和III之間的相互作用。濃度和樣品類型如圖上所示。C-以平均值和SEM表示的解離常數(K_D)；n＝8。

圖5示出了SPR中rFVIII與磷脂單層的結合以及pdVWF的抑制。A-在108nM BSA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白)或47.6nM pdVWF存在下的rFVIII和rFVIII的結合傳感圖；每個樣品一式三份。B-在分析物注射結束后120秒測量的結合水平的平均值和SD，表示為rFVIII結合的百分比；n＝3。

圖6示出了在SPR中測量的通過馮·維勒布蘭德因子衍生的片段對rFVIII-磷脂相互作用的抑制。在三種不同濃度的三種馮·維勒布蘭德因子衍生片段的存在下進行rFVIII與磷脂單層的結合(濃度和片段類型示于圖上)。圖表示分析物注射結束后120秒測量的結合水平的平均值和SD，表示為rFVIII結合的百分比；n＝3。

圖7示出了片段III對rFVIII與磷脂單層結合的濃度依賴性抑制。A-在不同濃度的片段III(濃度如圖上所示)存在下rFVIII與磷脂單層的結合傳感圖，每個樣品一式三份。B-在分析物注射結束后120秒測量的結合水平的平均值和SD，表示為rFVIII結合的百分比；n＝3。

圖8示出了pdVWF和片段III與III型膠原蛋白的結合。A，B-結合傳感圖(灰色曲線)，和曲線比對(黑色曲線)，其代表固定的III型膠原蛋白和pdVWF/純化的片段III之間的相互作用。濃度和樣品類型如圖上所示。C-以平均值和SEM表示的解離常數(K_D)；n＝9。

圖9示出了pdVWF和片段III與肝素的結合。A，B-結合傳感圖(灰色曲線)，和曲線比對(黑色曲線)，其代表固定的肝素和pdVWF/純化片段III之間的相互作用。濃度和樣品類型如圖上所示。C-以平均值和SEM表示的解離常數(K_D)；n＝6。

圖10示出了在單獨用FVIII或與VWF片段III組合皮下處理的來自A型血友病狗的血液樣品中測量的全血凝血時間(whole blood clottingtime，WBCT)值的比較。在200IU FVIII/kg BW施加下，將與5倍摩爾過量的VWF片段III組合的FVIII經皮下施加后獲得WBCT。水平虛線標記正常狗的凝血時間的上限(12分鐘)。

圖11示出了在施加FVIII或者FVIII與VWF片段III組合后獲得的A型血友病狗血漿樣品中用顯色FVIII活性測定測量的FVIII活性。A-將FVIII或具有5倍摩爾過量VWF片段III的FVIII以200IU FVIII/kg BW皮下施加；單獨FVIII樣品的曲線下面積(area under the curve，AUC)為2.867，而FVIII與VWF片段III的組合為4.917。B-FVIII或具有5倍摩爾過量VWF片段III的FVIII以200IU FVIII/kg BW靜脈內施加。單獨的FVIII樣品的AUC為27.69，而FVIII與VWF片段III的組合為45.72。

圖12示出了重組片段III單體、重組片段III二聚體和血漿來源的VWF(nVWF)與rFVIII的結合。A，B，C-結合傳感圖(灰色曲線)，和曲線比對(黑色曲線)，其代表固定的VWF或重組VWF片段與FVIII之間的相互作用。樣品類型如圖上所示。所施加的FVIII的濃度為0、0.2、0.6、1.7、5、15、45和135nM。D-以平均值和SD表示的解離常數(K_D)；n＝4。

圖13示出了VWF片段III對FVIII的穩定化。在不同時間點測量單獨的FVIII或與VWF片段III之復合物中的FVIII在40℃下孵育的FVIII活性。

圖14示出了如實施例9中所述的使用兩種VWF片段的肝素親和色譜法的肝素結合。

實施例

通過以下非限制性實施例進一步解釋本發明。

實施例1

產生和純化來自血漿的馮·維勒布蘭德因子的片段。

片段III(SPIII，res.764-2128)的產生和純化(根據Marti等Identification of disulfide-bridged substructures within human von Willebrand factor.Biochemistry 1987；26：8099-8109，有修改)(SEQ.ID.No.2)：

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRPGDVWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVNCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILE

通過用金黃色葡萄球菌V-8蛋白酶消化血漿來源的馮·維勒布蘭德因子(pdVWF)來制備片段III。消化在37℃下在50mM Tris-HCl，150mM NaCl pH7.8緩沖液中以1∶40的酶與蛋白質重量比進行3小時。

使用強陰離子交換柱(MonoQ)進行片段的純化。運行緩沖液是20mM Tris-HCl pH 7.4，而洗脫緩沖液(緩沖液B)是20mM Tris-HCl，500mM NaCl pH7.4。以約22mS/cm(約40％緩沖液B)將金黃色葡萄球菌V-8蛋白酶從陰離子交換柱洗脫，因此在洗脫片段之前需要在42％下的長時間洗滌步驟以洗出蛋白酶。或者，可以在Superose 6 10/300 GL上進行SEC步驟以除去蛋白酶。片段III的純化和獲得的產物描述于圖1。Marti等1987所限定的序列已經通過MS分析確認。

片段I(III-T4，res.764-1035)的產生和純化(根據Marti等1987，有修改)(SEQ.ID.No.3)：

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTR

片段I由片段III(SPIII)通過胰蛋白酶(從牛處理得到的TPCK)消化制備。消化在100mM NH₄HCO₃pH 8.0緩沖液中以1∶100的酶與蛋白質重量比進行1.5小時。通過添加大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化。

使用強陰離子交換柱(MonoQ)進行片段I的純化，隨后在Superose 6，10/300GL上進行SEC。陰離子交換柱的運行緩沖液是20mM Tris-HCl pH 7.4，而洗脫緩沖液(緩沖液B)是20mM Tris-HCl，500mM NaCl pH 7.4。SEC的運行緩沖液是PBS(phosphate buffered saline磷酸鹽緩沖鹽水)pH 7.0。

片段I純化和獲得的產物描述于圖2。Marti等1987所限定的序列已經通過MS分析確認。

片段II(Fes.764-1673)的產生和純化(SEQ.ID.No.4)：

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGE

片段II為通過第二次金黃色葡萄球菌V8蛋白酶消化從片段III制備。消化在50mM Tris-HCl，150mM NaCl pH 7.8緩沖液中以1∶10的酶與蛋白質重量比進行21小時。

使用強陰離子交換柱(MonoQ)進行片段II的純化。運行緩沖液是20mM Tris-HCl pH 7.4，而洗脫緩沖液(緩沖液B)是20mM Tris-HCl，500mM NaCl pH 7.4。需要在42％B下具有長時間洗滌步驟的第二MonoQ純化以除去蛋白酶。

片段II純化和獲得的產物描述于圖3。Glu¹⁶⁷³-Gly¹⁶⁷⁴之間的第二V8切割位點由Fretto等1986確定并通過MS分析確認。

實施例2

測定因子VIII結合親和力。

根據McCormick等2004(有修改)，使用Biacore 2000儀器(GE Healthcare)進行分析。簡言之，將rFVIII共價偶聯至CM5傳感器芯片，得到約200RU包被水平。隨后將馮·維勒布蘭德因子片段以及全長馮·維勒布蘭德因子(full length Von Willebrand Factor，flvWF)注射到傳感器芯片表面上。運行緩沖液是20mM HEPES，150mM NaCl，5m M CaCl₂，0.02％Tween 20。測定了flVWF以及片段II和III的解離親和常數，片段I與因子VIII沒有顯著的結合，因此沒有測定K_D。結合傳感圖和計算的K_D值示于圖4中。flVWF以0.67nM的K_D結合于rFVIII，片段III以較低的親和力結合(K_D為6.18nM)，片段II的親和力進一步降低(K_D為154.60nM)。

實施例3

測定因子VIII與磷脂單層的結合以及由馮·維勒布蘭德因子和馮·維勒布蘭德因子衍生的片段的抑制。

根據Saenko等1999(有修改)，使用Biacore 2000儀器(GE Healthcare)進行分析。簡言之，從DOPC(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿)和DOPS(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L_絲氨酸)制備磷脂-囊泡。根據MacDonal等1991使用擠出機制備單層囊泡并將其包被在HPA傳感器芯片上。隨后將目的化合物注射到PCPS表面上，并評價注射結束后120秒的結合水平。

陰性對照：馮·維勒布蘭德因子和BSA不與PSPC表面結合(未示出)，相比之下，示出了rFVIII的高結合水平。這種結合可以用馮·維勒布蘭德因子完全抑制，相反地，高BSA濃度的添加對結合沒有作用(圖5)。

為了評價，如果通過有限消化獲得的片段能夠類似于flVWF抑制PSPC結合，則將片段I、II和III注射到傳感器芯片表面上。只有片段III能夠抑制rFVIII和磷脂單層之間的相互作用(圖6)。該效應是劑量依賴性的，相比于rFVIII，在2.5x過量的片段III下，幾乎完全抑制(圖7)。

實施例4

測定flVWF和片段III的膠原蛋白III結合親和力。

根據Romjin等2003(有修改)，使用Biacore 2000儀器(GE Healthcare)進行分析。簡言之，將人胃蛋白酶消化的III型膠原蛋白共價結合到CM5傳感器芯片的表面。隨后，將樣品注射到傳感器芯片表面上。運行緩沖液是10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween 20。flVWF以非常高的親和力(0.75nM)結合到膠原蛋白III，而片段III的結合顯著降低到17.02nM(圖8)。

實施例5

測定flVWF和片段III的肝素結合親和力。

根據Sarafanov等2001，使用Biacore T200儀器(GE Healthcare)進行分析。簡言之，使用NHS-生物素試劑試劑盒將來自豬腸粘膜的肝素生物素化，并結合到SA傳感器芯片的表面。將參比流動池用生物素包被。隨后，將樣品注射到傳感器芯片表面上。運行緩沖液是150mM HEPES，150mM NaCI，5mM CaCl₂，0.05％Tween 20。flVWF以0.65nM的親和力結合肝素，片段III的結合親和力顯著降低至2.43nM(圖9)。

實施例6

測定FVIII或FVIII/VWF片段III復合物恢復以及A型血友病狗中的循環半衰期。

將單獨的重組B結構域缺失的FVIII或其與5倍摩爾過量的VWF片段III的組合對兩只A型血友病狗進行皮下注射，隨后進行靜脈內注射。狗1接受200IU/kg BW的單獨FVIII，而狗2接受與VWF片段III復合的200IU/kg BW的FVIII。在每次皮下或靜脈內藥物施用后0.5、1、2、4、8、12、24、32、48、72和96小時收集血樣。分析樣品的全血凝血時間(WBCT)和在顯色FVIII活性測定中的活性。與單獨皮下施用FVIII相比，皮下施用與FVIII復合的VWF片段III導致需要超過正常狗凝血時間之增加1.4倍的時間(圖10)。與單獨施用FVIII相比，VWF片段III與FVIII的施用也導致狗血漿中的FVIII活性隨時間的提高以及皮下施加和靜脈內施加兩者的近兩倍的曲線下面積(AUC)值(圖11)。

實施例7

測定重組片段III單體和二聚體的FVIII結合親和力。

將具有C端Strep標簽的重組片段III在的HEK293細胞系中瞬時表達，并通過Strep-tactin親和色譜法純化。通過尺寸排阻色譜法(size exclusion chromatography，SEC)分離片段III單體和二聚體。使用Biacore 2000儀器進行分析。將片段III單體和二聚體固定在CM5上，并將FVIII濃度系列注射到傳感器芯片表面上。使用血漿來源的全長VWF作為對照。運行緩沖液為150mM HEPES，150mM NaCl，5mM CaCl₂，0.05％Tween 20。FVIII結合于片段III二聚體，其親和常數為1.9nM。FVIII對單體片段III的親和力顯著更低(K_D＝14.3nM)(圖12)。

實施例8

通過VWF片段III在溶液中穩定rFVIII。

將2000IU重組FVIII在2.5ml水中重構，添加或不添加5倍摩爾過量的VWF片段III。將這兩種制劑在40℃下孵育，并在48、96、192、384、408和672小時取等分試樣。在顯色FVIII活性測定中分析樣品的FVHI活性。在40℃下VWF片段III有助于FVIII的顯著更長的活性(圖13)。

實施例9

比較重組片段III和NovoSeq21片段之間的肝素結合。

將具有C端Strep標簽的重組片段III和NovoSeq21(來自WO2013/160005A1的SEQ ID No 21)片段在HEK293細胞系中瞬時表達，并通過Strep-tactin親和色譜法純化。使用肝素親和色譜法測試肝素結合。將這兩個重組片段均結合于肝素柱(HiTrap Heparin HP 1ml，GE Healthcare)，并用0至500mM NaCl的線性鹽梯度洗脫。將這兩個片段一式三份地運行，參見圖14。NovoSeq21片段的平均洗脫峰在15.57±0.04分鐘，其對應于285.381mM NaCl，而片段III的平均洗脫峰在15.47±0.02分鐘，其對應于282.051mM NaCl。這表明NovoSeq21片段更高的肝素親和力。

分析方法

分析方法的描述

FVIII：C，基于Coatest的篩選方法

該方法基于兩階段原理，并使用微板技術進行。在第一階段，通過其中FVIII：C充當輔因子的固有通路產生活化的因子X(Xa)。然后在第二階段，通過在凝血酶抑制劑I-2581存在下(以防止凝血酶水解底物)使用合成的顯色底物S-2222來測定因子Xa。用酸終止反應，并且在405nm光度測定VIII：C對試劑空白的活性，其與pNA(對硝基苯胺)的釋放成比例。

所述方法符合歐洲藥典中的要求。FVIII：C的單位以世界衛生組織(World Health Organization，WHO)建立的當前國際濃縮標準(International Concentrate Standard，IS)中定義的國際單位(international unit，IU)表示。常規使用含有1％BSA而不是嚴重血友病血漿以用于預稀釋的緩沖液已得到驗證。也參見文獻參考(European Pharmacopoeia Supplement 2000，general Methods，2.7.4.Assay of Blood Coagulation FVIII；Rosén S(1984)Assay of FVIII：C with a Chromogenic Substrate.J，Haematol，Suppl 40，vol 33，139-145，1984；G，Oswaldsson U，Rosén S(1987)A simple and accurate micro plate assay for the determination of FVIII activity.Thrombosis Research 47；5-14，1987；Mire-Sluis AR，Gerrard T，Gaines das R，Padilla A和Thorpe R.Biological assays：Their Role in the development and quality Control of Recombinant Biological Medicinal Products.Biological，24，351-362(1996))。

根據Bradford法測定總蛋白

根據Bradford法的蛋白質測定是基于以下觀察：當與蛋白質發生結合時，考馬斯亮藍G-250的酸性溶液的最大吸光度從465nm移至595nm。疏水性和離子相互作用兩者均穩定染料的陰離子形式，從而引起可見的顏色變化。該測定是可用的，因為染料-白蛋白復合物溶液的消光系數在10倍濃度范圍內是恒定的。其他信息也參見參考文獻Bradford，MM.A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry 72：248-254.1976。

根據氨基酸分析(amino acid analysis，AAA)測定總蛋白

在AAA之前，在110℃下通過6M HCl水解所有蛋白質，持續24小時。通過在磺化聚苯乙烯樹脂上的陽離子交換色譜法分離氨基酸，并在洗脫液中持續檢測。該檢測基于柱后茚三酮衍生化(post-column ninhydrin derivatisation)，其使用雙光度計以同時在440nm下測量脯氨酸和羥脯氨酸，并在570nm下測量所有其他氨基酸。氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺兩者均在AAA期間被脫酰胺化，并分別被確定為天冬氨酸和谷氨酸。因此，天冬氨酸和谷氨酸的結果分別代表原始樣品中天冬氨酸/天冬酰胺(Asx)和谷氨酸/谷氨酰胺(Glx)的總和。使用該方法，色氨酸不會產生明顯的響應，因此，不通過AAA對其進行量化。半胱氨酸在水解期間被破壞并且不被量化。AAA在參考文獻中進一步描述：Total protein AAA analytical method.Spackman，D.H.，Stein，W.H.，和Moore，S.(1958)Anal.Biochem.30：1190-1206。

純度或比活性(FVIII：C/總蛋白)

采用從FVIII：C分析獲得的值計算樣品的純度(或也稱為比活性)，并將其與從總蛋白分析獲得的值相除。

SDS-PAGE(分子量分布)

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)涉及基于其大小的蛋白質分離。該方法描述了在還原條件下運行的蛋白質的SDS-PAGE。通過在變性和還原條件下加熱樣品，蛋白質解折疊并由陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS)包被，從而獲得與多肽鏈長度成比例的高凈負電荷。當加載到聚丙烯酰胺凝膠基質上并置于電場中時，帶負電荷的蛋白質分子向帶正電的電極遷移，并通過分子篩效應，即通過它們的分子量分離。聚丙烯酰胺凝膠限制較大的分子以與較小分子一樣的速度遷移。因為SDS變性多肽之間的荷質比幾乎相同，所以蛋白質的最終分離幾乎完全取決于多肽的相對分子量的差異。在均勻密度的凝膠中，蛋白質的相對遷移距離(R_f)與其質量的對數成反比。如果已知質量的蛋白質與未知物同時運行，則可以繪制Rf和質量之間的關系，并估計未知蛋白質的質量。通過電泳分離的蛋白質條帶通過銀染顯色觀察。通過判斷標準品、參比(對照樣品)和分析樣品的外觀來目測完成評價。

因子VIII抗原含量(FVIII：Ag)

用ELISA試劑盒(VIII：Ag，用于因子VIII的酶免疫測定試劑盒，Diagnostica Stago(法國))測量因子VIII抗原含量(FVIII：Ag)的量，如進一步描述的⁽¹⁸⁾，用Tris-NaCl緩沖液+1％牛血清白蛋白替換提供的試劑盒緩沖液，以用于樣品稀釋。

尺寸排阻色譜法(SEC)

使用在天然緩沖液條件(25mM HEPES，0.5M NaCl，0.3M精氨酸，50mM CaCl₂，0.02％聚山梨醇酯80，pH 7.5)下處理的尺寸排阻色譜(SEC-HPLC)分析柱(Superdex 200，10/300GL，GE Healthcare)測量單體、聚集體和片段。樣品負載為尺寸排阻柱的約1％，且因子VIII：C濃度為約1000IU/ml。

針對因子VIII的Western印跡

使用FVIII Western印跡測量基于大小的因子VIII變性產物。在還原條件下通過十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)根據分子量分離在因子VIII制劑中的FVIII分子量分布蛋白質和肽。此后，將蛋白質從凝膠基質經電泳轉移至硝酸纖維素膜，隨后用封閉劑孵育。然后添加針對整個人因子VIII分子的市售多克隆綿羊抗體，隨后添加第二酶標記的抗體作為探針。作為第三步，添加化學發光底物，當其與酶組合時產生作為副產物的光。使用冷卻的電荷耦合器件相機捕獲光輸出作為實時圖像。信號的強度與印跡膜上的抗原(FVIII)的豐度相關。

2D-PAGE

進行使用銀染的2D電泳以研究因子VIII蛋白鏈的電泳帶模式。使用pH 3至10的線性pH梯度以第一維運行進行等電聚焦。使用Tris-乙酸鹽(3至8％)凝膠運行第二維SDS-PAGE。在第二維運行后，用銀染對凝膠進行染色。

總蛋白(Bradford法)

根據Bradford法的蛋白質測定是基于以下觀察：當與蛋白質發生結合時，考馬斯亮藍G-250的酸性溶液的最大吸光度從465nm移至595nm。疏水性和離子相互作用兩者會穩定染料的陰離子形式，從而引起可見的顏色變化。該測定是可用的，因為染料-白蛋白復合物溶液的消光系數在10倍濃度范圍內是恒定的。其他信息也參見參考文獻Bradford，MM.A rapid and sensitive method for the quantisation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry 72：248-254.1976。

本文引用的所有參考文獻均通過引用完全并入本文，其并入與本文的明確教導不矛盾。