具有內切葡聚糖酶活性的多肽的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：11141460閱讀：1308來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
            本申請包括計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結合在此。
            發明背景
            發明領域
            本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性的多肽，特別涉及具有內切葡聚糖酶活性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。本發明還涉及包括這些多核苷酸的核酸構建體、載體以及宿主細胞連同產生和使用這些多肽的方法。本發明進一步涉及包括用于在洗滌劑以及用于在鉆探和石油工業中使用的多肽和任選地黃原膠裂解酶的組合物。
            相關技術描述
            黃原膠是一種來源于野油菜黃單胞菌的細菌包被的多糖。黃原膠通過由野油菜黃單胞菌細菌發酵葡萄糖、蔗糖或乳糖而產生。在發酵周期后，用異丙醇將該多糖從生長培養基中沉淀，干燥，并磨成細粉。稍后，將該粉添加至液體介質中，以形成膠質。
            黃原膠由五糖亞基構成，形成了纖維素主鏈，其三糖側鏈由通過α1,3鍵附接到主鏈中替代的葡萄糖殘基上的甘露糖(β1,4)葡萄糖醛酸(β1,2)甘露糖構成。這種生物聚合物由于其優異的假塑性、觸變性和粘度而具有巨大的商業意義。目前，其廣泛用作食品和非食品工業中的增稠劑或增粘劑，并且用作各種懸浮液、乳液和泡沫的穩定劑。
            近年來，黃原膠已經被用作許多消費品中的成分，包括食品(例如在沙拉醬(salat dressing)和乳制品中作為增稠劑)和化妝品(例如在牙膏和化妝品中作為穩定劑和增稠劑，以阻止成分分離)和化妝品(例如防曬霜)。另外，黃原膠已經在石油工業中得以應用，其中黃原膠被大量使用以增稠鉆井泥漿。這些流體用于將由鉆頭切割的固體運送回表面。當循環停止時，固體仍保持懸浮在鉆井液中。水平鉆井的廣泛使用和對鉆井固體的良好控制的需求已經導致其擴大使用。它還被添加到自密實混凝土中(包括在水下澆筑的混凝土)以增加其粘度。
            黃原膠的廣泛使用已導致對黃原膠的溶液或凝膠進行降解和/或改性的需求。黃原膠的完全酶降解需要若干酶活性，包括黃原膠裂解酶活性和內切-β-1,4-葡聚糖酶活性。
            黃原膠裂解酶是切割黃原膠的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基鍵、從而去除末端丙酮酸甘露糖的酶。兩種已經被分離自溶藻弧菌類芽孢桿菌XL-1的黃原膠裂解酶(例如，魯基森納斯(Ruijssenaars)等人(1999)“在由解藻朊類芽孢桿菌XL-1降解黃原膠中涉及的一種丙酮酸甘露糖特異性黃原膠裂解酶(A pyruvated mannose-specific xanthan lyase involved in xanthan degradation by Paenibacillus alginolyticus XL-1)”，應用與環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)65(6):2446-2452和魯基森納斯等人(2000)，“一種編碼解藻朊類芽孢桿菌菌株XL-1的黃原膠降解酶的新穎基因(A novel gene encoding xanthan lyase of Paenibacillus alginolyticus strain XL-1)”，應用與環境微生物學66(9):3945-3950)。
            具有內切-β-1,4-葡聚糖酶活性的酶必須能夠切割去除末端丙酮酸甘露糖之后的黃原膠的高度取代的主鏈。這類酶從糖基水解酶家族GH9(WO 2013/167581)已知。
            來源于Chthoniobacter flavus(uniprot:B4D329)的全基因組測序的預測氨基酸序列與本發明的多肽的氨基酸序列具有41％一致性。
            發明概述
            本發明提供了用于降解黃原膠的新的且改進的酶以及此類酶用于清潔目的(例如除去黃原膠污物)以及在鉆探和石油工業中的用途。由于這些酶對纖維素也具有顯著的活性，所以這些酶也可以用于降解纖維素材料的方法中，例如在纖維素生物質的降解中例如用于生產可發酵糖。
            諸位發明人已經出人意料地發現了具有內切-β-1,4-葡聚糖酶活性并且能夠切割黃原膠的高度取代的主鏈的酶，并且該酶不屬于已知包含這種酶活性的糖基水解酶家族。該酶與任何已知的具有黃原膠降解活性的酶沒有顯著的序列相似性，并且不能歸入已知的糖基水解酶家族中。
            本發明提供了具有內切葡聚糖酶活性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的的多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸。
            因此，本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽，該多肽選自下組，該組由以下各項組成：
            (a)多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
            (b)由如下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在中嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、或(ii)(i)的全長互補體雜交；
            (c)由如下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
            (d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的變體，該變體在一個或多個位置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
            (e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，該片段具有內切葡聚糖酶活性并且對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性。
            本發明還涉及編碼本發明的多肽的多核苷酸；包括這些多核苷酸的核酸構建體；重組表達載體；重組宿主細胞；以及產生這些多肽的方法。
            本發明還涉及包含這些多肽的全培養液配制品或細胞培養組合物，涉及包含這些多肽的組合物。
            本發明還涉及這些多肽和組合物用于降解黃原膠的用途，例如用于洗滌或清潔紡織品和/或硬表面(如餐具洗滌)中的用途。
            本發明還涉及這些多肽和組合物用于降解纖維素材料的用途。
            序列表綜述
            SEQ ID NO:1是編碼本發明的多肽的DNA序列，其分離自浮霉狀菌屬物種R1(Planctomycete sp.R1)。
            SEQ ID NO:2是本發明的多肽的氨基酸序列。成熟肽是氨基酸1至846。
            定義
            等位基因變體：術語“等位基因變體”意指占據同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產生，并且可以導致群體內多態性。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
            纖維素結合結構域：術語“纖維素結合結構域”是指介導酶結合至纖維素底物的非晶區域的酶的區域。
            催化結構域：術語“催化結構域”意指酶的包含該酶的催化機器的區域。
            cDNA：術語“cDNA”意指可以通過從得自真核或原核細胞的成熟的、剪接的mRNA分子進行反轉錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應基因組DNA中的內含子序列。早先的初始RNA轉錄本是mRNA的前體，其在呈現為成熟的剪接的mRNA之前要經一系列的步驟進行加工，包括剪接。
            清潔或洗滌劑應用：術語“清潔或洗滌劑應用”意指用于手動、機械或自動化清潔或洗滌硬表面或紡織品的目的，將本發明的多肽應用于任何組合物中。
            清潔或洗滌劑組合物：術語“清潔或洗滌劑組合物”是指用于從有待清潔的物品(例如紡織品、餐具和硬表面)除去不希望的化合物的組合物。這些術語涵蓋經選擇用于希望的具體類型的清潔組合物和產品的形式(例如，液體、凝膠、粉末、顆粒、糊狀、或噴霧組合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗滌劑組合物(例如，液體和/或固體衣物洗滌劑和精細織物洗滌劑；硬表面清潔配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷以及金屬臺面和窗戶；地毯清潔劑；爐灶清潔劑；織物清新劑；織物柔軟劑；以及紡織品和衣物預去污劑(pre-spotter)，連同餐具洗滌劑)。除了本發明的多肽之外，該洗滌劑配制品還可以包含一種或多種另外的酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角質酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、黃原膠酶、黃原膠裂解酶、過氧化物酶、鹵代過氧合酶、過氧化氫酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或組分，例如表面活性劑、助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelating agent)、漂白系統或漂白組分、聚合物、織物調理劑、增泡劑、抑泡劑、染料、香料、晦暗抑制劑、光學增亮劑、殺細菌劑、殺真菌劑、污垢懸浮劑、防蝕劑、酶抑制劑或穩定劑、酶激活劑、一種或多種轉移酶、水解酶、氧化還原酶、上藍劑和熒光染料、抗氧化劑以及增溶劑。
            編碼序列：術語“編碼序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始并且以終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
            控制序列：術語“控制序列”是指表達編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每個控制序列對于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是天然的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是天然的或外源的。這些控制序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有多個接頭。
            降解黃原膠：在此將術語“降解黃原膠”或“黃原膠降解活性”定義為將黃原膠解聚、降解或分解為更小的組分。黃原膠的降解可以是去除一個或多個側鏈糖，將黃原膠的骨架切成更小的組分，或去除一個或多個側鏈糖并且將黃原膠的骨架切成更小的組分。黃原膠的降解優選地可以使用如描述于實例4中的粘度降低方法來測量。可替代地，黃原膠的降解可以使用如描述于實例5中的還原末端方法來測量。
            洗滌劑組合物：術語“洗滌劑組合物”是指用于從有待清潔的物品(例如紡織品、餐具和硬表面)去除不希望的化合物的組合物。該洗滌劑組合物可以用于例如清潔紡織品、餐具以及硬表面，用于家用清潔劑和工業清潔二者。這些術語涵蓋經選擇用于希望的具體類型的清潔組合物和產品的形式(例如，液體、凝膠、粉末、顆粒、糊狀、或噴霧組合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗滌劑組合物(例如，液體和/或固體衣物洗滌劑和精細織物洗滌劑；硬表面清潔配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷以及金屬臺面和窗戶；地毯清潔劑；爐灶清潔劑；織物清新劑；織物柔軟劑；以及紡織品和衣物預去污劑(pre-spotter)，連同餐具洗滌劑)。除了包含本發明的多肽之外，該洗滌劑配制品還可以包含一種或多種另外的酶(例如黃原膠裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角質酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、黃原膠酶、過氧化物酶、鹵代過氧合酶、過氧化氫酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或組分，例如表面活性劑、助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelating agent)、漂白系統或漂白組分、聚合物、織物調理劑、增泡劑、抑泡劑、染料、香料、晦暗抑制劑、光學增亮劑、殺細菌劑、殺真菌劑、污垢懸浮劑、防蝕劑、酶抑制劑或穩定劑、酶激活劑、一種或多種轉移酶、水解酶、氧化還原酶、上藍劑和熒光染料、抗氧化劑以及增溶劑。
            餐具洗滌：術語“餐具洗滌”是指所有形式的洗滌餐具，例如手動或自動化餐具洗滌。洗滌餐具包括但不限于，清潔所有形式的陶器，例如盤子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的用餐工具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具連同陶瓷，塑料，金屬，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。
            餐具洗滌組合物：術語“餐具洗滌組合物”是指用于清潔硬表面的所有形式的組合物。本發明不局限于任何具體類型的餐具洗滌組合物或任何具體洗滌劑。
            內切葡聚糖酶：術語“內切葡聚糖酶”意指一種內切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷鍵和混合β-1,3葡聚糖如谷類β-D-葡聚糖、木葡聚糖、黃原膠以及含有纖維素組分的其他植物材料中的β-1,4鍵的內切水解。可以通過測量底物粘度的降低或通過還原糖測定所確定的還原末端的增加來確定內切葡聚糖酶活性(張(Zhang)等人，2006，生物技術進展(Biotechnology Advances)24:452-481)。
            對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶：將術語“對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶”或“具有內切葡聚糖酶活性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽”定義為對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶。本發明的內切葡聚糖酶對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性。在本發明的一個方面，對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶是具有如SEQ ID NO:2的氨基酸1至846所示序列的多肽。可以如實例5所披露地確定對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠的活性。
            酶洗滌益處：在此將術語“酶洗滌益處”定義為將一種酶添加至洗滌劑中與不具有該酶的同一洗滌劑相比的有利效果。可能由酶提供的重要去污益處是污漬去除伴隨在洗滌和/或清潔之后無可見污物或污物非常少、阻止或減少在洗滌過程中釋放的污物再沉積(一種又稱作抗再沉積的作用)、完全或部分地恢復紡織品的白度(一種又稱作增白的作用)，其中所述紡織品最初是白色的，但是在反復使用和洗滌后獲得淡灰或淡黃色外觀。不直接與污垢的催化去污或其再沉積的預防相關的紡織品護理益處對于酶洗滌益處而言也是重要的。此類紡織品護理益處的實例是預防或減少染料從一織物轉移至另一織物或同一織物的另一部分(一種也被稱作染料轉移抑制或抗返染的效果)，從織物表面去除突出或斷裂的纖維以減少起球傾向或去除已經存在的絨球或絨毛(一種也被稱作抗起球的效果)，改善織物柔軟性，織物的顏色澄清以及去除陷在織物或服裝的纖維中的微粒狀污垢。酶漂白是一種另外的酶洗滌益處，其中通常將催化活性用于催化漂白組分(例如過氧化氫或其他過氧化物)的形成。
            表達：術語“表達”包括涉及多肽的產生的任何步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。
            表達載體：術語“表達載體”意指直鏈或環狀DNA分子，該分子包括編碼多肽的多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達的控制序列。
            片段：術語“片段”意指在一種成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一個或多個(例如若干個)氨基酸的一種多肽；其中該片段具有內切葡聚糖酶活性并且對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性。在一方面，該片段包含至少840個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至840)、至少835個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至835)、或至少830個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至830)。
            糖基水解酶家族：糖苷水解酶是催化糖基鍵水解以釋放更小的糖的酶。存在超過100種已經被分類為糖基水解酶(GH)家族的糖苷水解酶，參見漢麗塞塔(Henrissat)等人(1991)‘基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分類(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)’，生物化學雜志(J.Biochem.)280:309-316和Uniprot網站，www.cazy.org。
            硬表面清潔：在此將術語“硬表面清潔”定義為清潔硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墻壁、屋頂等，連同硬物體的表面，例如汽車(汽車洗滌)和餐具(餐具洗滌)。餐具洗滌包括但不限于，清潔盤子、杯子、玻璃杯、碗、及刀具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金屬、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
            宿主細胞：術語“宿主細胞”意指易于用包括本發明的多核苷酸的核酸構建體或表達載體轉化、轉染、轉導等的任何細胞類型。術語“宿主細胞”涵蓋由于復制期間發生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。
            改進的洗滌性能：在此將術語“改進的洗滌性能”定義為一種(變體)酶(還有酶的共混物，不只是變體還有骨架，以及與某種清潔組合物組合，等)相對于親本蛋白酶變體的洗滌性能展示出一種蛋白質變體的洗滌性能的改變，例如增加的去污。術語“洗滌性能”包括在衣物洗滌并且例如在餐具洗滌中的洗滌性能。
            分離的：術語“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環境中的物質。分離的物質的非限制性實例包括(1)任何非天然存在的物質；(2)至少部分地從一個或多個或所有與它在自然界中相關的天然存在的成分中除去的任何物質，包括但不限于，任何酶、變體、核酸、蛋白質、肽或輔因子，也就是；(3)相對于在自然界中發現的物質經過人為改變的任何物質；或(4)相對于與它天然相關聯的其它組分通過增加該物質的量(例如，在宿主細胞中的重組生產；編碼該物質的基因的多個拷貝；以及使用比與編碼該物質的基因天然相關聯的啟動子更強的啟動子)而改變的任何物質。分離的物質可以存在于發酵液樣品中，例如，可以將宿主細胞進行遺傳修飾來表達本發明多肽。來自宿主細胞的發酵液將包括分離的多肽。
            濕洗(laundering)：術語“濕洗”涉及家用濕洗和工業濕洗兩者并且意指用一種包含本發明的清潔或洗滌劑組合物的溶液處理紡織品的過程。洗衣過程可以例如使用例如家用或工業洗衣機進行或可以手動進行。
            成熟多肽：術語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。本發明的成熟多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸1至846組成。SEQ ID NO:2的氨基酸-1至-27是信號肽。
            本領域已知，宿主細胞可以產生由同一多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本領域還已知，不同的宿主細胞不同地加工多肽，并且因此一個表達一種多核苷酸的宿主細胞當與另一個表達相同多核苷酸的宿主細胞相比時可以產生一種不同的成熟多肽(例如，具有一個不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。使用N-末端測序，發現本發明的成熟肽的主要部分開始于ATPGKLF。成熟肽的次要部分具有N-末端序列TPGKLFP。因此，成熟多肽可以由SEQ ID NO:2的氨基酸2至846、SEQ ID NO:2的氨基酸3至846、SEQ ID NO:2的氨基酸4至846、SEQ ID NO:2的氨基酸5至846或其混合物組成。
            在一個方面，成熟多肽含有多達846個氨基酸殘基、多達845個氨基酸殘基、多達844個氨基酸殘基、多達843個氨基酸殘基、多達842個氨基酸殘基、多達841個氨基酸殘基、多至840個氨基酸殘基或多達835個氨基酸殘基。
            成熟多肽編碼序列：術語“成熟多肽編碼序列”意指一種編碼成熟多肽的多核苷酸，該成熟多肽具有內切葡聚糖酶性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性。在一方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸82至2619。SEQ ID NO:1的核苷酸1至81編碼信號肽。
            在一方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸85至2619。在一方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸88至2619。在一方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸91至2619。在一方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸94至2619。
            核酸構建體：術語“核酸構建體”意指單鏈-或雙-鏈的核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來不存在于自然界中的方式被修飾成含有核酸的區段，或是合成的，該核酸分子包括一個或多個控制序列。
            可操作地連接：術語“可操作地連接”意指如下的構造，其中，控制序列相對于多核苷酸的編碼序列安置在適當位置，從而使得該控制序列指導該編碼序列的表達。
            序列一致性：兩個氨基酸序列之間或者兩個核苷酸序列之間的關聯度通過參數“序列一致性”來描述。
            出于本發明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：歐洲分子生物學開放軟件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學趨勢(Trends Genet.)16:276-277)(優選5.0.0版或更新版本)的尼德爾(Needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)48:443-453)來確定兩個氨基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數是空位開放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為“最長一致性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比一致性并且是如下計算的：
            (一致的殘基X 100)/(比對長度-比對中的空位總數)
            出于本發明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：歐洲分子生物學開放軟件套件，賴斯等人，2000，同上)(優選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼和翁施，1970，同上)來確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所使用的參數是空位開放罰分10，空位拓展罰分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。將標記為“最長一致性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)用作百分比一致性并且是如下計算的：
            (一致的脫氧核糖核苷酸×100)/(比對長度-比對中的空位總數)
            嚴格條件：術語“非常低嚴格條件”意指對于至少100個核苷酸長度的探針，按照標準DNA印跡程序在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和變性的鮭精DNA和25％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。
            術語“低嚴格條件”意指對于至少100個核苷酸長度的探針，按照標準DNA印跡程序在42℃于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和變性的鮭精DNA和25％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。
            術語“中嚴格條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭精DNA和35％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。
            術語“中-高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭精DNA和35％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。
            術語“高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭精DNA和50％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。
            術語“非常高嚴格條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭精DNA和50％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。
            子序列：術語“子序列”意指使一個或多個(例如，若干個)核苷酸從成熟多肽編碼序列的5’端和/或3’端缺少的多核苷酸，其中該子序列編碼具有內切葡聚糖酶活性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的片段。在一個方面中，子序列包含至少2520個核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸82至2601)，至少2505個核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸82至2586)，或至少2490個核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸82至2571)。
            紡織品：術語“紡織品”意指包括紗線、紗線中間體、纖維、非機織物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他紡織品材料的任何紡織品材料，這些材料制造的織物和由這些織物制成的產品(例如服裝和其他物品)。該紡織品或織物可以處于針織品、機織物、牛仔布、非機織物、氈、紗線、以及毛巾布的形式。這些紡織品可以是纖維素基的，如天然纖維素，包括棉布、亞麻/亞麻布、黃麻、苧麻、劍麻或椰殼纖維或者人造纖維素(例如，來源于木漿)，包括纖維膠/人造絲、苧麻、醋酸纖維素纖維(三胞)、萊賽爾纖維(lyocell)或其共混物。紡織品或織物也可以不基于纖維素，如天然聚酰胺，包括羊毛、駝毛、羊絨、馬海毛、兔毛和蠶絲或合成聚合物如尼龍、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨綸/彈性纖維(spandex/elastane)、或其共混物其以及基于纖維素和不基于纖維素的纖維的共混物。共混物的例子是棉和/或人造絲/纖維膠與一種或多種伴隨材料的共混物，該伴隨材料例如是羊毛、合成纖維(例如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙烯纖維、聚亞胺酯纖維、聚脲纖維、芳族聚酰胺纖維)以及含纖維素的纖維(例如人造絲/纖維膠、苧麻、亞麻/亞麻布、黃麻、醋酸纖維素纖維、萊賽爾纖維)。織物可以是常規的可洗滌衣物，例如弄臟的家居衣物。當使用術語織物或衣服時，旨在也包括廣義術語紡織品。
            紡織品護理益處：不直接與污垢的催化去污或其再沉積的預防相關的“紡織品護理益處”對于酶洗滌益處而言也是重要的。此類紡織品護理益處的實例是預防或減少染料從一紡織品轉移至另一紡織品或同一紡織品的另一部分(一種也被稱作染料轉移抑制或抗返染的效果)，從紡織品表面去除突出或斷裂的纖維以減少起球傾向或去除已經存在的絨球或絨毛(一種也被稱作抗起球的效果)，改善紡織品柔軟性，紡織品的顏色澄清以及去除陷在紡織品的纖維中的微粒狀污垢。酶漂白是一種另外的酶洗滌益處，其中通常將催化活性用于催化漂白組分(例如過氧化氫或其他過氧化物或其他漂白種類)的形成。
            變體：術語“變體”意指一種具有內切葡聚糖酶活性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的、并且在一個或多個(例如，若干個)位置處包括改變(即取代、插入、和/或缺失)的多肽。取代意指占據一個位置的氨基酸由不同的氨基酸代替；缺失意指除去占據一個位置的氨基酸；以及插入意指在占據一個位置的氨基酸的毗鄰處和緊鄰處添加一個氨基酸。
            洗滌性能：術語“洗滌性能”被用作酶在例如洗滌或硬表面清潔過程中除去存在于有待清潔的物體上的污物的能力。可以通過計算如在此的‘用于衣物洗滌的自動機械應力測定(AMSA)’中的所謂的強度值(Int)或如在WO 2013/167581中所定義的反射值(Rem)來量化洗滌性能的改進。
            白度：在此將術語“白度”定義為在不同領域并且針對不同顧客具有不同含義的廣義術語。白度的損失可以例如歸因于灰化、黃化、或光學增亮劑/調色劑的去除。灰化和黃化可歸因于污垢再沉積、身體污垢、來自例如鐵和銅離子或染料轉移的著色。白度可包括來自以下列表的一個或若干個問題：著色劑或染料作用、不完全污漬去除(例如身體污垢、皮脂等)、再沉積(該物體的灰化、黃化或其他變色)(去除的污垢與紡織品的其他部分(弄臟的或未弄臟的)再關聯)、在應用中紡織品的化學變化、以及顏色的澄清或淡色化。
            黃原膠裂解酶：在此將術語“黃原膠裂解酶”定義為一種切割黃原膠中的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基鍵的酶(EC 4.2.2.12)。出于本發明的目的，根據實例5中所述的程序確定黃原膠裂解酶活性。
            發明詳述
            本發明提供了對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶以及編碼這些多肽的多核苷酸。內切葡聚糖酶不屬于已知包含降解黃原膠的酶的GH家族。另外，黃原膠裂解酶與本發明的對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶的組合顯示超過單獨使用黃原膠裂解酶或對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶的協同的改進洗滌性能。此外，該酶可以對底物纖維素、凝膠多糖和β-葡聚糖中的任一種具有活性。
            對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶
            在一個實施例中，本發明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，該多肽具有內切葡聚糖酶活性和對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性。在一個方面中，這些多肽與SEQ ID NO:14的成熟多肽的區別不超過50個氨基酸，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、或49個。在一個優選的方面中，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多達10個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個)氨基酸。
            在一個具體的實施例中，本發明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少70％的內切葡聚糖酶活性和/或黃原膠降解活性。
            在一個具體的實施例中，本發明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少75％的內切葡聚糖酶活性和/或黃原膠降解活性。
            在一個具體的實施例中，本發明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少80％的內切葡聚糖酶活性和/或黃原膠降解活性。
            在一個具體的實施例中，本發明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少85％的內切葡聚糖酶活性和/或黃原膠降解活性。
            在一個具體的實施例中，本發明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少90％的內切葡聚糖酶活性和/或黃原膠降解活性。
            在一個具體的實施例中，本發明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少95％的內切葡聚糖酶活性和/或黃原膠降解活性。
            在一個具體的實施例中，本發明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少75％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的多肽，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少100％的內切葡聚糖酶活性和/或黃原膠降解活性。
            在一個實施例中，該多肽已經被分離。本發明的多肽優選地包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至846或其等位變體或由其組成；或者是其具有內切葡聚糖酶活性和黃原膠降解活性的片段。在另一方面中，該多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其組成。在另一方面中，該多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸2至846或由其組成。
            在另一個實施例中，本發明涉及具有內切葡聚糖酶活性并對由黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽，該多肽由多核苷酸編碼，該多核苷酸在高嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、或(ii)(i)的全長補體雜交(薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，實驗室手冊(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，紐約)。在一個實施例中，該多肽已經被分離。
            根據本領域熟知的方法，SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO:2的多肽或其片段可用于設計核酸探針以鑒定和克隆DNA，該DNA編碼具有內切葡聚糖酶活性和對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽。具體地，可以遵循標準DNA印跡程序，使用此類探針與來自不同屬或種的株系的感興趣的細胞的基因組DNA或cDNA雜交，以便鑒定和分離其中的對應基因。此類探針可以明顯短于完整序列，但是長度應為至少15，例如至少25、至少35、或至少70個核苷酸。優選地，核酸探針的長度為至少100個核苷酸，例如長度為至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、或至少900個核苷酸。DNA和RNA探針兩者都可使用。典型地將探針進行標記(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以檢測相應的基因。本發明涵蓋此類探針。
            可以篩選從此類其他菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫的與上述探針雜交并編碼本發明的多肽的DNA。來自此類其他菌株的基因組DNA或其他DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、或其他分離技術來分離。來自文庫的DNA或分離的DNA可轉移到并固定在硝酸纖維素或其他適合的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO:1或其子序列雜交的克隆或DNA，將載體材料用于DNA印跡中。
            出于本發明的目的，雜交表明多核苷酸在非常低到非常高嚴格條件下與一種被標記的核酸探針雜交，該探針對應于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列；(iii)其全長互補體；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射線膠片或本領域已知的任何其他檢測手段來檢測在這些條件下核酸探針雜交的分子。
            在一個方面，核酸探針是核苷酸是SEQ ID NO:1的子序列。在另一個方面，該核酸探針是編碼以下項的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，該核酸探針是SEQ ID NO:1。
            在另一個實施例中，本發明涉及一種具有內切葡聚糖酶活性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽，該多肽由一種與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸編碼。在另外的實施例中，該多肽已經被分離。
            在另一個實施例中，本發明涉及在一個或多個(例如，若干個)位置包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的變體。在一個實施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數目多達10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。氨基酸變化可能是較小的種類，即不顯著影響蛋白質的折疊和/或活性的保守的氨基酸取代或插入；小的缺失，典型地為1-30個氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多達20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另外的功能來促進純化的小的延伸，例如His-標簽(多組氨酸束)、抗原表位或結合結構域。
            保守取代的實例是在下組的范圍內：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸)。一般不會改變比活性的氨基酸取代是本領域已知的并且例如由H.諾伊拉特(Neurath)和R.L.希爾(Hill)，1979，在蛋白質(The Proteins)，學術出版社(Academic Press)，紐約中描述。常見的取代為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
            可替代地，氨基酸改變具有這樣一種性質:改變多肽的物理化學特性。例如，氨基酸改變可以提高多肽的熱穩定性、改變底物特異性、改變最適pH，等等。
            可以根據本領域中已知的程序，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(坎寧漢(Cunningham)和威爾斯(Wells)，1989，科學(Science)244:1081-1085)來鑒定多肽中的必需氨基酸。在后一項技術中，在該分子中的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并且對所得分子的內切葡聚糖酶活性進行測試以鑒定對于該分子的活性至關重要的氨基酸殘基。還參見希爾頓(Hilton)等人，1996，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。酶活性位點或其他生物學相互作用也可以通過對結構進行物理學分析來進行確定，如通過以下技術例如核磁共振、結晶學、電子衍射、或光親和標記，與假定接觸位點氨基酸的突變相結合來進行確定。參見，例如，德沃斯(de Vos)等人，1992，科學(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)224:899-904；Wlodaver等人，1992，歐洲生化學會聯合會快報(FEBS Lett.)309:59-64。還可以從與相關多肽的比對推斷鑒別必需氨基酸。
            可以做出單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組的已知方法進行測試，隨后進行相關篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森(Reidhaar-Olson)和薩奧爾(Sauer)，1988，科學(Science)241:53-57；博維(Bowie)和薩奧爾，1989，美國科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，羅曼(Lowman)等人，1991，生物化學(Biochemistry)30:10832-10837；美國專利號5,223,409；WO 92/06204)和區域定向誘變(德比舍爾(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；內爾(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
            可以結合誘變/改組方法與高通量自動化篩選方法來檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(內斯(Ness)等人，1999，自然生物技術(Nature Biotechnology)17:893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子可以回收自宿主細胞，并且使用本領域的標準方法對其進行迅速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。
            該多肽可以是雜合多肽，其中一種多肽的區域在另一種多肽的區域的N-末端或C-末端處融合。
            該多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一種多肽在本發明多肽的N-末端或C-末端處融合。通過將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發明的多核苷酸而產生融合多肽。用于產生融合多肽的技術在本領域是已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，這樣使得它們在框內并且使得融合多肽的表達處于相同的一個或多個啟動子和終止子的控制下。還可以使用內含肽技術構建融合多肽，其中在翻譯后產生融合多肽(庫珀(Cooper)等人，1993，歐洲分子生物學學會雜志12:2575-2583；道森(Dawson)，1994，科學(Science)266:776-779)。
            融合多肽可以在兩種多肽之間進一步包括切割位點。在融合蛋白分泌之時，該位點被切割，從而釋放出這兩種多肽。切割位點的實例包括但不限于在如下文獻中披露的位點：馬丁(Martin)等人，2003，工業微生物學生物技術雜志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；Svetina等人，2000，生物技術雜志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯馬森-威爾遜(Rasmussen-Wilson)等人，1997，應用與環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技術(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技術9:378-381；伊頓(Eaton)等人，1986，生物化學(Biochemistry)25:505-512；Collins-Racie等人，1995，生物技術13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白質：結構、功能和遺傳學(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；和史蒂文斯(Stevens)，2003，世界藥物發現(Drug Discovery World)4:35-48。
            具有內切葡聚糖酶活性和對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽的來源
            本發明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。出于本發明的目的，如在此結合給定的來源使用的術語“從…中獲得”應意指由多核苷酸編碼的多肽是由該來源或者由其中已經插入來自該來源的多核苷酸的菌株產生的。在一方面，從給定來源中獲得的多肽被分泌到細胞外。
            在另一方面，該多肽是浮霉狀菌多肽，例如獲自浮霉狀菌屬物種R1(Planctomycete sp.R1)的多肽。
            這一物種和相關物種的菌株可以容易地在許多培養物保藏中心為公眾所獲得，如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷蘭菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美國農業研究服務專利培養物保藏中心北方地區研究中心(NRRL)。
            可以使用以上提到的探針從其他來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得該多肽。用于從自然生活環境中直接分離微生物和DNA的技術是本領域熟知的。然后可以通過類似地篩選另一微生物的基因組DNA或cDNA文庫或混合的DNA樣品來獲得編碼該多肽的多核苷酸。一旦用一種或多種探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就可以通過使用本領域普通技術人員已知的技術分離或克隆該多核苷酸(參見例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，同上)。
            多核苷酸
            本發明還涉及編碼本發明的多肽的多核苷酸，如在此所述。在一個實施例中，編碼本發明的多肽的多核苷酸已經被分離。
            用于分離或克隆多核苷酸的技術是本領域中已知的并且包括從基因組DNA或cDNA，或其組合進行分離。來自基因組DNA的多核苷酸的克隆可以例如通過使用眾所周知的聚合酶鏈反應(PCR)或用以對具有共有的結構特征的克隆的DNA片段進行檢測的表達庫抗體篩選來實現。參見例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和應用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，學術出版社(Academic Press)，紐約。可以使用其他核酸擴增程序例如連接酶鏈式反應(LCR)、連接激活轉錄(LAT)和基于多核苷酸的擴增(NASBA)。這些多核苷酸可以克隆自浮霉狀菌屬的菌株或相關有機體，并且因此，例如可以是該多核苷酸多肽編碼區的等位基因變體或物種變體。
            修飾編碼本發明多肽的多核苷酸對于合成與所述多肽基本上類似的多肽可為必需的。術語“基本上類似”于該多肽是指該多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以某種工程化方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如在比活性、熱穩定性、最適pH等方面不同的變體。這些變體可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列(例如其子序列)形式呈現的多核苷酸，和/或通過引入不會改變該多肽的氨基酸序列，但對應于預定用于產生該酶的宿主有機體的密碼子使用的核苷酸取代，或通過引入可能產生不同氨基酸序列的核苷酸取代來構建。對于核苷酸取代的一般描述，參見例如福德(Ford)等人，1991，蛋白質表達與純化(Protein Expression and Purification)2:95-107。
            核酸構建體
            本發明還涉及核酸構建體，這些核酸構建體包含可操作地連接至一個或多個控制序列的本發明的多核苷酸，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導編碼序列在適合的宿主細胞中表達。
            可以用許多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表達。取決于表達載體，在其插入載體以前操縱多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術是本領域熟知的。
            該控制序列可以是啟動子，即，被宿主細胞識別以對編碼本發明的多肽的多核苷酸進行表達的多核苷酸。該啟動子包含轉錄控制序列，這些序列介導該多肽的表達。該啟動子可以是在宿主細胞中顯示出轉錄活性的任何多核苷酸，包括變體、截短型及雜合型啟動子，并且可以由編碼與該宿主細胞同源或異源的細胞外或細胞內多肽的基因獲得。
            用于在細菌宿主細胞中指導本發明的核酸構建體的轉錄的適合啟動子的實例是從以下基因中獲得的啟動子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(阿蓋塞(Agaisse)和勒爾克呂(Lereclus)，1994，分子微生物學(Molecular Microbiology)13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動子(埃貢(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天藍鏈霉菌瓊脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-內酰胺酶基因(維拉-卡馬洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac啟動子(德波爾(DeBoer)等人，1983，美國國家科學院院刊80:21-25)。其他啟動子描述在吉爾伯特(Gilbert)等人，1980，科學美國人(Scientific American)242:74-94的“來自重組細菌的有用蛋白質(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及在薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，同上。串聯啟動子的實例披露在WO 99/43835中。
            在絲狀真菌宿主細胞中，用于指導本發明的核酸構建體的轉錄的合適啟動子的實例是獲得自以下各項的基因的啟動子：構巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、尖鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶(WO 96/00787)、鑲片鐮孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、鑲片鐮孢菌Daria(達莉亞)(WO 00/56900)、鑲片鐮孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶I、里氏木霉內切葡聚糖酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶III、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻譯延伸因子，連同NA2-tpi啟動子(來自曲霉屬中性α-淀粉酶基因的修飾的啟動子，其中已經用來自曲霉屬丙糖磷酸異構酶基因的未翻譯的前導子替換未翻譯的前導子；非限制性實例包括來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修飾的啟動子，其中已經用來自構巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的未翻譯的前導子替換未翻譯的前導子)；和變體的、截短的和雜合的啟動子。其他啟動子在美國專利號6,011,147中描述。
            在酵母宿主中，有用的啟動子從以下各項的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)、以及釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主細胞的其他有用的啟動子。
            控制序列還可以是由宿主細胞識別以終止轉錄的轉錄終止子。該終止子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的3'-末端。在該宿主細胞中起作用的任何終止子都可以用于本發明中。
            用于細菌宿主細胞的優選終止子是從克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyL)以及大腸桿菌核糖體RNA(rrnB)的基因獲得。
            用于絲狀真菌宿主細胞的優選終止子是從以下各項的基因獲得：構巢曲霉乙酰胺酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶I、里氏木霉內切葡聚糖酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶III、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻譯延長因子。
            用于酵母宿主細胞的優選終止子從以下各項的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。用于酵母宿主細胞的其他有用的終止子由羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，見上文描述。
            該控制序列還可以是在啟動子下游并且在基因編碼序列上游的mRNA穩定子區域，它增加該基因的表達。
            適合的mRNA穩定子區的實例是從以下獲得的：蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢桿菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，細菌學雜志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。
            該控制序列還可以是前導子，一種對宿主細胞翻譯很重要的非翻譯mRNA區域。該前導子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主細胞中起作用的任何前導子。
            用于絲狀真菌宿主細胞的優選前導子是從米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶的基因獲得。
            適用于酵母宿主細胞的前導子從以下各項的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子、以及釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。
            控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，一種可操作地連接至該多核苷酸的3’-末端并且當轉錄時由宿主細胞識別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉錄的mRNA的信號的序列。可以使用在宿主細胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
            用于絲狀真菌宿主細胞的優選聚腺苷酸化序列是從以下各項的基因中獲得的：構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。
            對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和謝爾曼(Sherman)，1995，分子細胞生物學(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。
            控制序列也可以是編碼與多肽的N-末端連接并指導多肽進入細胞的分泌通路的信號肽的信號肽編碼區。多核苷酸的編碼序列的5’-端可以固有地包含在翻譯閱讀框中與編碼多肽的編碼序列的區段天然地連接的信號肽編碼序列。可替代地，編碼序列的5’-端可以包含對于該編碼序列而言是外源的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號肽編碼序列。可替代地，外源信號肽編碼序列可簡單地替換天然的信號肽編碼序列以便增強該多肽的分泌。然而，可以使用指導所表達多肽進入宿主細胞的分泌通路的任何信號肽編碼序列。
            用于細菌宿主細胞的有效信號肽編碼序列是從以下各項的基因獲得的信號肽編碼序列：芽孢桿菌屬NCIB 11837產麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢桿菌prsA。西蒙納(Simonen)和帕爾瓦(Palva)，1993，微生物學評論(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信號肽。
            用于絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼序列是獲得自以下各項的基因的信號肽編碼序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質霉纖維素酶、特異腐質霉內切葡聚糖酶V、柔毛腐質霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。
            對于酵母宿主細胞有用的信號肽獲得自以下項的基因：釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，見上文，描述了其他有用的信號肽編碼序列。
            該控制序列還可以是編碼位于多肽的N-末端處的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原通常是無活性的并且可以通過催化切割或自身催化切割來自多肽原的前肽而轉化為活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項的基因獲得：枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α-因子。
            在信號肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰多肽的N-末端并且該信號肽序列定位成緊鄰該前肽序列的N-末端。
            還可能希望地是添加調節序列，這些調節序列相對于宿主細胞的生長來調節多肽的表達。調節序列的實例是使得基因的表達響應于化學或物理刺激(包括調節化合物的存在)而開啟或關閉的那些。原核系統中的調節序列包括lac、tac以及trp操縱子系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKAα-淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子、里氏木霉纖維二糖水解酶I啟動子以及里氏木霉纖維二糖水解酶II啟動子。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些調控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸將與調控序列可操作地連接。
            表達載體
            本發明還涉及包含本發明的多核苷酸、啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號的重組表達載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產生重組表達載體，該重組表達載體可以包括一個或多個便利的限制酶切位點以允許在這些位點處插入或取代編碼該多肽的多核苷酸。可替代地，該多核苷酸可以通過將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構建體插入用于表達的適當載體中來表達。在產生該表達載體時，該編碼序列位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達的適當控制序列可操作地連接。
            重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA程序，并且能夠引起多核苷酸的表達。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細胞的相容性。該載體可以是線性的或閉合的環狀質粒。
            該載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。該載體可以包含任何用以保證自我復制的要素。可替代地，該載體可以是這樣載體，當它被引入該宿主細胞中時，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個或多個染色體一起復制。此外，可以使用單一載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒(這些載體或質粒共同包含待引入宿主細胞的基因組中的總DNA)或轉座子。
            該載體優選包含允許方便地選擇轉化細胞、轉染細胞、轉導細胞等細胞的一個或多個選擇性標記。選擇性標記是這樣一種基因，該基因的產物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營養缺陷型的原養型等。
            細菌性選擇性標記的實例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環素抗性)的標記。用于酵母宿主細胞的適合的標記包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在絲狀真菌宿主細胞中使用的選擇性標記包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶)、bar(草丁膦乙酰轉移酶)、hph(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷基轉移酶)、以及trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)、連同其等效物。優選在曲霉屬細胞中使用的是構巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌bar基因。優選在木霉屬細胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
            選擇性標記可以是如在WO 2010/039889中描述的雙選擇性標記系統。在一個方面，雙選擇性標記是hph-tk雙選擇性標記系統。
            載體優選包含允許載體整合到宿主細胞的基因組中或載體在細胞中獨立于基因組自主復制的一個或多個元件。
            對于整合到該宿主細胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或者用于通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該載體可以包含用于指導通過同源重組而整合到宿主細胞基因組中的一個或多個染色體中的一個或多個精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整合元件應包含足夠數量的核酸，例如100至10,000個堿基對、400至10,000個堿基對、以及800至10,000個堿基對，這些堿基對與對應的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細胞的基因組內的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。
            對于自主復制，該載體可以進一步包括使該載體能夠在所討論的宿主細胞中自主復制的復制起點。復制起點可以是在細胞中起作用的介導自主復制的任何質粒復制子。術語“復制起點(origin of replication)”或“質粒復制子(plasmid replicator)”意指使得質粒或載體可在體內復制的多核苷酸。
            細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的復制起點，以及允許在芽孢桿菌屬中復制的質粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的復制起點。
            用于在酵母宿主細胞中使用的復制起點的實例是2微米復制起點ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合以及ARS4與CEN6的組合。
            在絲狀真菌細胞內有用的復制起點的實例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡倫(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分離和包括該基因的質粒或載體的構建可以根據披露于WO 00/24883中的方法完成。
            可以將本發明的多核苷酸的多于一個拷貝插入宿主細胞中以增加多肽的產生。通過將序列的至少一個另外的拷貝整合到宿主細胞基因組中或者通過包含與該多核苷酸一起的可擴增的選擇性標記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數目，其中通過在適當的選擇性試劑的存在下培養細胞可以選擇包含選擇性標記基因的經擴增的拷貝的細胞、以及由此該多核苷酸的另外的拷貝。
            用于連接以上所描述的元件以構建本發明的重組表達載體的程序是本領域的普通技術人員熟知的(參見，例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，同上)。
            宿主細胞
            本發明還涉及重組宿主細胞，這些宿主細胞包含可操作地連接到一個或多個控制序列的本發明的多核苷酸，這些控制序列指導本發明的多肽的產生。將包括多核苷酸的構建體或載體引入宿主細胞中，這樣使得該構建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復制的染色體外載體，如早前所述。術語“宿主細胞”涵蓋由于復制過程中發生的突變與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。宿主細胞的選擇在很大程度上取決于編碼該多肽的基因及其來源。
            該宿主細胞可以是有用于重組產生本發明的多肽的任何細胞，例如原核細胞或真核細胞。
            原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于：彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、以及脲原體屬。
            細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌細胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌細胞。
            細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌以及馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。
            細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌細胞，包括但不局限于不產色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰鏈絲菌、以及淺青紫鏈霉菌細胞。
            將DNA引入芽孢桿菌屬細胞中可通過以下來實現：原生質體轉化(參見例如，張(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遺傳學與基因組學(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受態細胞轉化(參見例如，楊格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，細菌學雜志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大衛杜夫-阿貝爾森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、電穿孔(參見例如，茂川(Shigekawa)和道爾(Dower)，1988，生物技術(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(參見例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，細菌學雜志169:5271-5278)。將DNA引入大腸桿菌細胞中可通過以下來實現：原生質體轉化(參見例如，哈納汗(Hanahan)，1983，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或電穿孔(參見例如，道爾(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。將DNA引入鏈霉菌屬細胞中可通過以下來實現：原生質體轉化、電穿孔(參見例如，貢(Gong)等人，2004，葉線形微生物學(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(參見例如，馬佐迪耶(Mazodier)等人，1989，細菌學雜志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或轉導(參見例如，伯克(Burke)等人，2001，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。將DNA引入假單孢菌屬細胞中可通過以下來實現：電穿孔(參見例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物學方法雜志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(參見例如，皮內多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，應用與環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。將DNA引入鏈球菌屬細胞中可通過以下來實現：天然感受態(參見，例如，佩里(Perry)和藏滿(Kuramitsu)，1981，感染與免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生質體轉化(參見，例如，凱特(Catt)和喬力克(Jollick)，1991，微生物學(Microbios)68:189-207)、電穿孔(參見，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，應用與環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(參見，例如，克萊威爾(Clewell)，1981，微生物學評論(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本領域已知的用于將DNA引入宿主細胞中的任何方法。
            宿主細胞還可以是真核細胞，如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。
            宿主細胞可以是真菌細胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、以及接合菌門(Zygomycota)、連同卵菌門(Oomycota)和全部有絲分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌詞典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，國際應用生物科學中心(CAB International)，大學出版社(University Press)，英國劍橋(Cambridge，UK)中進行定義的)。
            該真菌宿主細胞可以是酵母細胞。如在此使用的“酵母”包括產子嚢酵母(內孢霉目)、產擔子酵母和屬于半知菌類(芽孢綱)的酵母。由于酵母的分類在將來可能有變化，出于本發明的目的，酵母應如酵母生物學和活動性(Biology and Activities of Yeast)(斯金納(Skinner)、帕斯莫爾(Passmore)、以及達文波特(Davenport)編輯，應用細菌學學會討論會(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地進行定義。
            酵母宿主細胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯弗酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或耶氏酵母屬細胞，如乳酸克魯弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)細胞。
            真菌宿主細胞可以是絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由霍克斯沃思等人，1995，見上文所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由幾丁質、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復雜多糖構成的菌絲體壁。營養生長是通過菌絲延伸，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母(如釀酒酵母)的營養生長是通過單細胞菌體的出芽(budding)，而碳分解代謝可以是發酵的。
            絲狀真菌宿主細胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、線黑粉菌科(Filibasidium)、鐮孢屬、腐質霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。
            例如，絲狀真菌宿主細胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬蠟菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡內基擬蠟菌(Ceriporiopsis caregiea)、淺黃擬蠟孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(Ceriporiopsis pannocinta)、環帶擬蠟菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微紅擬蠟菌(Ceriporiopsis subrufa)、蟲擬蠟菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狹邊金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角質金孢子菌、盧克諾文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、糞狀金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質霉、柔毛腐質霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脈菌(Phlebia radiata)、刺芹側耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢殼霉、長域毛栓菌(Trametes villosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細胞。
            可以通過涉及原生質體形成、原生質體轉化、以及以本身已知的方式進行細胞壁再生的過程來轉化真菌細胞。用于轉化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的適合程序在EP 238023和約爾頓(Yelton)等人，1984，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技術(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于轉化鐮孢屬物種的適合方法由馬拉迪爾(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文獻描述的程序轉化酵母：貝克爾(Becker)和瓜倫特(Guarente)，在阿貝爾森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.編，酵母遺傳學與分子生物學指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶學方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187頁，學術出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，紐約；伊藤(Ito)等人，1983，細菌學雜志(J.Bacteriol.)153:163；以及Hinnen等人，1978，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
            生產方法
            本發明還涉及產生本發明多肽的方法，該方法包括：(a)培養細胞，該細胞處于其野生型形式，在有益于產生該多肽的條件下產生該多肽；以及任選地，(b)回收該多肽。在一個方面中,該細胞是浮霉狀菌屬細胞。在另一方面，該細胞是來自浮霉狀菌屬物種R1菌株的細胞。
            本發明還涉及產生本發明多肽的方法，該方法包括：(a)在有益于產生該多肽的條件下培養本發明的重組宿主細胞；以及任選地，(b)回收該多肽。
            這些宿主細胞是在適合于使用本領域中已知的方法產生該多肽的一種營養培養基中培養的。例如，可以通過在適合的培養基中和在允許表達和/或分離該多肽的條件下，進行搖瓶培養，或者在實驗室或工業發酵罐中進行小規模或大規模發酵(包括連續，分批，分批補料，或固態發酵)來培養細胞。該培養是使用本領域中已知的程序，在一種適合營養培養基中發生，該培養基包括碳和氮來源及無機鹽。適合的培養基可從商業供應商獲得或可以根據公開的組成(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到該營養培養基中，那么可直接從培養基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可從細胞裂解液中進行回收。
            可以使用特異性針對這些多肽的本領域已知的方法來檢測該多肽。這些檢測方法包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定來確定該多肽的活性。
            可以使用本領域已知的方法來回收多肽。例如，該多肽可以通過常規程序，包括但不限于，收集、離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀，從該營養培養基回收。在一方面，回收包含該多肽的發酵液。
            可以通過本領域中已知的多種程序來純化該多肽以獲得基本上純的多肽，這些程序包括但不限于：色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及尺寸排阻色譜)、電泳程序(例如，制備型等電點聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或提取(參見例如，蛋白質純化(Protein Purification)，詹森(Janson)和賴登(Ryden)編輯，VCH出版社(VCH Publishers)，紐約，1989)。
            在替代性方面中，沒有回收該多肽，而是將表達該多肽的本發明的宿主細胞用作該多肽的來源。
            植物
            本發明還涉及分離的植物，例如轉基因植物、植物部分或植物細胞，該分離的植物、植物部分或植物細胞包含本發明的多核苷酸，以用來按可回收的量表達并且產生多肽。多肽可從植物或植物部分回收。可替代地，可以按原樣將包含該多肽的植物或植物部分用于改善食品或飼料的質量，例如，改善營養價值、適口性、以及流變性質，或用以破壞抗營養因子。
            轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草，如草甸草(藍草，早熟禾屬)；飼草，如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；溫帶草，如翦股穎屬(Agrostis)；以及谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
            雙子葉植物的實例是煙草、豆類(如羽扇豆(lupins)、馬鈴薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及緊密相關的模式生物擬南芥)。
            植物部分的實例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、以及塊莖、以及包括這些部分的獨立組織，例如，表皮、葉肉、薄壁組織(parenchyme)、維管組織、分生組織。特定植物細胞區室，如葉綠體、質外體(apoplast)、線粒體、液泡、過氧化物酶體以及細胞質也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論是何種組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以有助于本發明的利用的特定組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和種皮。
            同樣包括于本發明范圍內的是此類植物、植物部分以及植物細胞的子代。
            表達多肽的轉基因植物或植物細胞可以根據本領域已知的方法構建。
            本發明還涉及產生本發明的多肽的方法，包括：(a)在有助于產生該多肽的條件下培養包括編碼該多肽的多核苷酸的轉基因植物或植物細胞；并且(b)回收該多肽。
            發酵液配制品或細胞組合物
            本發明還涉及包含本發明的多肽的發酵液配制品或細胞組合物。發酵液產物進一步包括在發酵過程中使用的另外的成分，例如像，細胞(包括含有編碼本發明的多肽的基因的宿主細胞，這些宿主細胞被用于產生感興趣的多肽)、細胞碎片、生物質、發酵介質和/或發酵產物。在一些實施例中，該組合物是含有一種或多種有機酸、殺滅的細胞和/或細胞碎片以及培養基的細胞殺滅的全培養液。
            如在此使用的術語“發酵液”是指由細胞發酵產生、不經歷或經歷最低限的回收和/或純化的制劑。例如，當微生物培養物生長至飽和，在碳限制條件下孵育以允許蛋白質合成(例如，由宿主細胞進行酶的表達)并且分泌到細胞培養基中時，產生發酵液。發酵液可以包含在發酵結束時得到的發酵材料的未分級的或分級的內容物。典型地，發酵液是未分級的并且包括用過的培養基以及例如通過離心去除微生物細胞(例如，絲狀真菌細胞)之后存在的細胞碎片。在一些實施例中，發酵液包含用過的細胞培養基、胞外酶以及有活力的和/或無活力的微生物細胞。
            在一個實施例中，該發酵液配制品和細胞組合物包括第一有機酸組分(包括至少一種1-5碳的有機酸和/或其鹽)以及第二有機酸組分(包括至少一種6碳或更多碳的有機酸和/或其鹽)。在具體實施例中，該第一有機酸組分是乙酸、甲酸、丙酸、其鹽，或前述兩種或更多種的混合物；并且該第二有機酸組分是苯甲酸、環己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其鹽，或前述兩種或更多種的混合物。
            在一個方面，該組合物包含一種或多種有機酸，并且任選地進一步含有殺滅的細胞和/或細胞碎片。在一個實施例中，從細胞殺滅的全培養液中去除這些殺滅的細胞和/或細胞碎片，以提供不含這些組分的組合物。
            這些發酵液配制品或細胞組合物可以進一步包括防腐劑和/或抗微生物(例如，抑菌)劑，包括但不限于山梨醇、氯化鈉、山梨酸鉀、以及本領域中已知的其他試劑。
            該細胞殺滅的全培養液或組合物可以包含在發酵結束時得到的發酵材料的未分級的內容物。典型地，該細胞殺滅的全培養液或組合物包含用過的培養基以及在微生物細胞(例如，絲狀真菌細胞)生長至飽和、在碳限制條件下孵育以允許蛋白合成之后存在的細胞碎片。在一些實施例中，細胞殺滅的全培養液或組合物含有用過的細胞培養基、胞外酶和殺滅的絲狀真菌細胞。在一些實施例中，可以使用本領域已知的方法來使細胞殺滅的全培養液或組合物中存在的微生物細胞透性化和/或裂解。
            如在此描述的全培養液或細胞組合物典型地是液體，但是可以含有不溶性組分，例如殺滅的細胞、細胞碎片、培養基組分和/或一種或多種不溶性酶。在一些實施例中，可以除去不溶性組分以提供澄清的液體組合物。
            可以通過WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法產生本發明的全培養液配制品和細胞組合物。
            洗滌劑組合物
            在一個實施例中，本發明涉及一種洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物包括分離的內切葡聚糖酶，這些內切葡聚糖酶對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性并且與與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在一個實施例中，本發明針對洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物包含結合一種或多種額外的清潔組合物組分的本發明的酶。另外的組分的選擇在普通技術人員技術內并且包括常規成分，包括以下列出的示例性、非限制性組分。
            對于紡織品護理，組分的選擇可以包括以下考慮：有待清潔的紡織品的類型、污物的類型和/或程度、進行清潔時的溫度以及洗滌劑產品的配制。盡管根據一種具體的功能性將以下提及的組分通過一般標題進行了分類，但是由于該組分可能具有熟練的業內人士將領會的一種或多種另外的功能，因此不應該將這理解為限制。
            洗滌劑組合物可以適于洗滌紡織品，例如像織物、衣服或亞麻布，或用于清潔硬表面，例如像地板、桌子、或餐具洗滌。
            本發明的酶-在本發明的一個實施例中，可以將本發明的多肽以對應于以下的量添加至一種洗滌劑組合物中：每升的洗滌液0.0001-200mg的酶蛋白，例如0.0005-100mg的酶蛋白，優選0.001-30mg的酶蛋白，更優選0.005-8mg的酶蛋白，甚至更優選0.01-2mg的酶蛋白。
            用于在自動洗碗機(ADW)中使用的組合物例如可以包括按該組合物的重量計0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
            用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的組合物例如可以包含按該組合物的重量計0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
            用于在洗衣液中使用的組合物例如可以包括按該組合物的重量計0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。
            可以使用常規穩定劑穩定本發明的洗滌劑組合物的一種或多種酶，這些常規穩定劑例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制該組合物。
            在某些市場中，不同洗滌條件并且就其本身而言，使用不同類型的洗滌劑。這披露于例如EP 1 025 240中。例如，在亞洲(日本)使用低的洗滌劑濃度體系，而美國使用中等洗滌劑濃度體系，并且歐洲使用高的洗滌劑濃度體系。
            低的洗滌劑濃度體系包含以下洗滌劑，其中在洗滌水中存在少于約800ppm的洗滌劑組分。日本洗滌劑典型地被認為是低的洗滌劑濃度體系，因為它們具有存在于洗滌水中的大約667ppm的洗滌劑組分。
            中等洗滌劑濃度體系包含以下洗滌劑，其中在洗滌水中存在約800ppm與約2000ppm之間的洗滌劑組分。北美洗滌劑通常被認為是中等洗滌劑濃度體系，因為它們具有存在于洗滌水中的大約975ppm的洗滌劑組分。
            高的洗滌劑濃度體系包含以下洗滌劑，其中在洗滌水中存在多于約2000ppm的洗滌劑組分。歐洲洗滌劑通常被認為是高的洗滌劑濃度體系，因為在洗滌水中它們具有大約4500-5000ppm的洗滌劑組分。
            拉丁美洲洗滌劑通常是高泡沫磷酸鹽助洗劑洗滌劑并且在拉丁美洲使用的洗滌劑的范圍可以落入中等和高的洗滌劑濃度兩者中，因為在洗滌水中它們的洗滌劑組分的范圍從1500ppm至6000ppm。此類洗滌劑組合物都是本發明的實施例。
            本發明的多肽還可以結合到WO 97/07202中所披露的洗滌劑配制品中，通過引用將其結合在此。
            表面活性劑-洗滌劑組合物可以包括一種或多種表面活性劑，它們可以是陰離子的和/或陽離子的和/或非離子的和/或半極性的和/或兼性離子的或其混合物。在一個具體實施例中，洗滌劑組合物包括一種或多種非離子型表面活性劑和一種或多種陰離子表面活性劑的混合物。這種或這些表面活性劑典型地以按重量計從約0.1％至60％的水平存在，例如約1％至約40％、或約3％至約20％、或約3％至約10％。基于所希望的清潔應用來選擇這種或這些表面活性劑，并且這種或這些表面活性劑包括本領域中已知的任何一種或多種常規表面活性劑。可以利用本領域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何表面活性劑。
            當包含在其中時，所述去污劑通常將會含有按重量計約1％至約40％，例如約5％至約30％，包括約5％至約15％，或約20％至約25％的陰離子型表面活性劑。陰離子表面活性劑的非限制性實例包括硫酸鹽和磺酸鹽，具體地，直鏈烷基苯磺酸鹽(LAS)，LAS的異構體，支鏈烷基苯磺酸鹽(BABS)，苯基鏈烷磺酸鹽，α-烯烴磺酸鹽(AOS)，烯烴磺酸鹽，鏈烯烴磺酸鹽，鏈烷-2,3-二基雙(硫酸鹽)，羥基鏈烷磺酸鹽以及二磺酸鹽，烷基硫酸鹽(AS)(例如十二烷基硫酸鈉(SDS))，脂肪醇硫酸鹽(FAS)，伯醇硫酸鹽(PAS)，醇醚硫酸鹽(AES或AEOS或FES，也被稱為醇乙氧基硫酸鹽或脂肪醇醚硫酸鹽)，仲鏈烷磺酸鹽(SAS)，石蠟烴磺酸鹽(PS)，酯磺酸鹽，磺化的脂肪酸甘油酯，α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸鹽(MES))，烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)，氨基酸的脂肪酸衍生物，磺酸基琥珀酸或皂的二酯和單酯，以及它們的組合。
            當被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0％至約10％的陽離子表面活性劑。陽離子表面活性劑的非限制性實例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化銨(DSDMAC)、以及烷基芐基二甲基銨、烷基季銨化合物、烷氧基化季銨(AQA)化合物及其組合。
            當被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0.2％至約40％的非離子型表面活性劑，例如從約0.5％至約30％，特別是從約1％至約20％、從約3％至約10％，例如從約3％至約5％、或從約8％至約12％。非離子型表面活性劑的非限制性實例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸單乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(PFAM)，多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，連同在SPAN和TWEEN商品名下可獲得的產品及其組合。
            當被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0％至約10％的半極性表面活性劑。半極性表面活性劑的非限制性實例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-雙(2-羥乙基)氧化胺、脂肪酸鏈烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸鏈烷醇酰胺及其組合。
            當被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0％至約10％的兼性離子表面活性劑。兼性離子表面活性劑的非限制性實例包括甜菜堿、烷基二甲基甜菜堿、磺基甜菜堿及其組合。
            助水溶劑-助水溶劑是如下化合物，該化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非極性環境中的極性物質)。典型地，助水溶劑同時具有親水的和疏水的特征(如從表面活性劑已知的所謂兩親特性)；然而助水溶劑的分子結構一般并不有利于自發自聚集，參見例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的綜述，膠體&界面科學新見(Current Opinion in Colloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶劑并不顯示臨界濃度，高于該濃度就會發生如對表面活性劑而言所發現的自聚集以及脂質形成膠束、薄層或其他很好地定義的中間相。相反，許多助水溶物顯示連續類型的聚集過程，其中聚集物的大小隨著濃度增加而增長。然而，很多助水溶劑改變了包括極性和非極性特征的物質的系統(包括水、油、表面活性劑、和聚合物的混合物)的相行為、穩定性、和膠體特性。經典地從制藥、個人護理、食品跨行業至技術應用使用助水溶劑。助水溶劑在洗滌劑組合物中的使用允許例如更濃的表面活性劑配制品(如在通過除去水而壓縮液體洗滌劑的過程中)而不引起不希望的現象，例如相分離或高粘度。
            洗滌劑可以包含按重量計0％-5％，例如約0.5％至約5％、或約3％至約5％的助水溶劑。可以利用本領域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何助水溶劑。助水溶劑的非限制性實例包括苯磺酸鈉、對甲苯磺酸鈉(STS)、二甲苯磺酸鈉(SXS)、枯烯磺酸鈉(SCS)、傘花烴磺酸鈉、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羥基萘甲酸鈉、羥基萘磺酸鈉、乙基己基磺酸鈉及其組合。
            助洗劑和共助洗劑-該洗滌劑組合物可以包含按重量計約0-65％，例如約5％至約45％的洗滌劑助洗劑或共助洗劑、或其混合物。在洗滌餐具洗滌劑中，助洗劑的水平典型地是40％-65％，特別是50％-65％。助洗劑和/或共助洗劑可以具體是形成具有Ca和Mg的水溶性復合物的螫合劑。可以利用本領域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何助洗劑和/或共助洗劑。助洗劑的非限制性實例包括沸石、二磷酸鹽(焦磷酸鹽)、三磷酸鹽例如三磷酸鈉(STP或STPP)、碳酸鹽例如碳酸鈉、可溶性硅酸鹽例如硅酸鈉、層狀硅酸鹽(例如來自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也稱為亞氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也稱為2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其組合。
            洗滌劑組合物還可以包含按重量計0-20％，例如約5％至約10％的洗滌劑共助洗劑或其混合物。洗滌劑組合物可以單獨地包括一種共助洗劑，或與一種助洗劑，例如沸石助洗劑組合。共助洗劑的非限制性實例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/馬來酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性實例包括檸檬酸鹽，螯合劑，例如氨基羧酸鹽、氨基多羧酸鹽和膦酸鹽，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具體實例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、亞氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羥基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亞甲基膦酸)(EDTMPA)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-單乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-單丙酸(ASMP)、亞氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亞氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、絲氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、異絲氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、鄰氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羥乙基)-亞乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸鹽(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亞甲基膦酸)(ATMP)及其組合和鹽。其他示例性助洗劑和/或共助洗劑描述于例如WO 09/102854、US 5977053中
            漂白系統-洗滌劑可以包含按重量計0％-50％，如大約0.1％至大約25％的漂白系統。可以利用本領域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何漂白系統。適合的漂白系統組分包括漂白催化劑、光漂白劑、漂白活化劑、過氧化氫源如過碳酸鈉和過硼酸鈉、預成型過酸及其混合物。適合的預成型過酸包括但不限于：過氧羧酸及鹽，過碳酸及鹽，過亞氨酸(perimidic acid)及鹽，過氧單硫酸及鹽(例如過硫酸氫鉀(Oxone(R))，及其混合物。漂白系統的非限制性實例包括基于過氧化物的漂白系統，這些系統可以包括例如與過酸形成漂白活化劑組合的無機鹽，包括堿金屬鹽，如過硼酸鹽(通常是單水合物或四水合物)、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過硅酸鹽的鈉鹽。術語漂白活化劑在此意指一種與過氧化物漂白劑(像過氧化氫)反應以形成過酸的化合物。以此方式形成的過酸構成活化的漂白劑。有待在此使用的適合漂白活化劑包括屬于酯酰胺、酰亞胺或酸酐類別的那些。適合的實例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸鈉(ISONOBS)、二過氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸鹽(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸鹽、4-(癸酰基氧基)苯甲酸鹽(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸鹽(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。感興趣的漂白活化劑的具體家族披露于EP 624154中并且在那個家族中特別優選的是乙酰檸檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短鏈甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下優點，它是環境友好的，因為它最終降解為檸檬酸和醇。此外，乙酰檸檬酸三乙酯和三醋汀在儲存時在產品中具有良好的水解穩定性，并且它是一種有效的漂白活化劑。最后，ATC為洗衣添加劑提供一種良好的助洗能力。可替代地，漂白系統可以包括例如酰胺、酰亞胺、或砜型的過氧酸。漂白系統還可以包括過酸，例如6-(苯二甲酰亞氨基)過己酸(PAP)。漂白系統還可以包括漂白催化劑。在一些實施例中，漂白組分可以是選自下組的有機催化劑，該組由以下各項組成：具有下式的有機催化劑：
            (iii)及其混合物；其中每個R1獨立地是包含從9至24個碳的支鏈烷基基團或包含從11至24個碳的直鏈烷基基團，優選地，每個R1獨立地是包含從9至18個碳的支鏈烷基基團或包含從11至18個碳的直鏈烷基基團，更優選地，每個R1獨立地選自下組，該組由以下各項組成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、異-壬基、異-癸基、異-十三烷基和異-十五烷基。其他示例性漂白系統描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。適合的光漂白劑可以例如是磺化的酞菁鋅。
            聚合物-該洗滌劑可以包含按重量計0％-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本領域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何聚合物。聚合物可以作為如以上提到的共助洗劑起作用，或可以提供抗再沉積、纖維保護、污垢釋放、染料轉移抑制、油污清潔和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一種的以上提到的特性和/或多于一種的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纖維素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(環氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亞乙基亞胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修飾CMC(HM-CMC)和硅酮、對苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(對苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯對苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚環氧乙烷和聚環氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季銨鹽。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考慮了以上提到的聚合物的鹽。
            織物調色劑-本發明的洗滌劑組合物還可以包括織物調色劑，例如染料或色素，當配制在洗滌劑組合物中時，當所述織物與一種洗滌液接觸時織物調色劑可以沉積在織物上，該洗滌液包括所述洗滌劑組合物，并且因此通過可見光的吸收/反射改變所述織物的色彩。熒光增白劑發射至少一些可見光。相比之下，因為它們吸收至少一部分可見光光譜，所以織物調色劑改變表面的色彩。適合的織物調色劑包括染料和染料-粘土軛合物，并且還可以包括色素。適合的染料包括小分子染料和聚合物染料。適合的小分子染料包括選自下組的小分子染料，該組由落入顏色索引(Colour Index)(C.I.)分類的以下染料組成：直接藍、直接紅、直接紫、酸性藍、酸性紅、酸性紫、堿性藍、堿性紫和堿性紅、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(將其通過引用而特此結合)。洗滌劑組合物優選包括從約0.00003wt％至約0.2wt％、從約0.00008wt％至約0.05wt％、或甚至從約0.0001wt％至約0.04wt％的織物調色劑。該組合物可以包括從0.0001wt％至0.2wt％的織物調色劑，當該組合物處于單位劑量袋的形式時，這可以是特別優選的。適合的調色劑還披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。
            另外的酶-洗滌劑添加劑連同洗滌劑組合物可以包括一種或多種另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、過氧化物酶和/或黃原膠裂解酶。
            一般而言，一種或多種所選酶的特性應與選定的洗滌劑相容(即，最適pH，與其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且該一種或多種酶應以有效量存在。
            纖維素酶：適合的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括經化學修飾的或蛋白質工程改造的變體。適合的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬、鐮孢屬、梭孢殼菌屬、支頂孢屬的纖維素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特異腐質霉、嗜熱毀絲霉和尖孢鐮孢屬產生的真菌纖維素酶。
            尤其適合的纖維素酶是具有顏色護理益處的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的實例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纖維素酶。其他實例為纖維素酶變體，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。
            表現出內切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纖維素酶(EC 3.2.1.4)的實例是已經描述于WO 02/099091中的那些。
            纖維素酶的其他實例包括描述于WO 96/29397中的家族45纖維素酶，并且特別是在對應于WO 02/099091的SEQ ID NO:8中的以下位置的一個或多個位置處具有取代、插入和/或缺失的其變體：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，優選選自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。
            可商購的纖維素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(諾維信公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科國際有限公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式會社(Kao Corporation))。
            蛋白酶：另外的酶可以是另一種蛋白酶或蛋白酶變體。該蛋白酶可以是動物、植物或微生物來源的，包括化學或基因修飾的變體。優選微生物來源。它可以是一種堿性蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草桿菌蛋白酶)。金屬蛋白酶的蛋白酶可以例如是來自例如家族M4、M5、M7或M8的嗜熱菌蛋白酶。
            術語“枯草桿菌酶”是指根據斯艾森(Siezen)等人，蛋白質工程學(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白質科學(Protein Science)6(1997)501-523的絲氨酸蛋白酶亞組。絲氨酸蛋白酶是特征為在活性位點具有與底物形成共價加合物的絲氨酸的蛋白酶的一個亞組。枯草桿菌酶可以劃分為6個亞部，即，枯草桿菌蛋白酶家族、嗜熱蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。在本發明的一個方面，該蛋白酶可以是一種枯草桿菌酶，例如枯草桿菌蛋白酶或其變體。另外，枯草桿菌酶(以及絲氨酸蛋白酶)的特征為除了絲氨酸以外，還具有兩個活性位點氨基酸殘基，即一個組氨酸和一個天冬氨酸殘基。
            枯草桿菌蛋白酶的實例是來源于芽孢桿菌的那些，如枯草桿菌蛋白酶lentus、芽孢桿菌lentus、枯草桿菌蛋白酶Novo、嘉士伯枯草桿菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)、地衣芽孢桿菌、枯草桿菌蛋白酶BPN’、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147以及枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279中)以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。另外的絲氨酸蛋白酶實例描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602以及WO 04/099401中。枯草桿菌酶變體的實例可以是在任何以下位置上具有突變的那些：使用BPN’編號的3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252以及274。更優選的枯草桿菌酶變體可以包括以下突變：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN'編號)。另外的優選的蛋白酶是來自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的堿性蛋白酶(如在(例如)WO 95/23221中所述)、以及其變體(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
            胰蛋白酶樣蛋白酶的實例為胰蛋白酶(例如，豬或牛來源的)，以及在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實例是如WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946所描述的變體，特別是在下述位置中的一個或多個處發生取代的變體：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
            金屬蛋白酶的實例是如描述于WO 07/044993中的中性金屬蛋白酶。
            優選的可商購的蛋白酶酶類包括AlcalaseTM、CoronaseTM、DuralaseTM、DurazymTM、EsperaseTM、EverlaseTM、KannaseTM、LiquanaseTM、Liquanase UltraTM、OvozymeTM、PolarzymeTM、PrimaseTM、RelaseTM、SavinaseTM和Savinase UltraTM(諾維信公司(Novozymes A/S))，AxapemTM(Gist-Brocases N.V.公司)，BLAP和BLAP X(Henkel AG&Co.KGaA)，ExcellaseTM、FN2TM、FN3TM、FN4TM、MaxacaTM、MaxapemTM、MaxataseTM、ProperaseTM、PurafastTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、Purafect PrimeTM和PuramaxTM(杰能科有限公司(Genencor int.))。
            脂肪酶和角質酶：適合的脂肪酶和角質酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學修飾的或蛋白工程化的變體酶。實例包括來自嗜熱真菌屬的脂肪酶，例如如描述于EP 258068和EP 305216中的來自疏綿狀嗜熱絲孢菌(早先命名為疏棉狀腐質霉)；來自腐質霉屬的角質酶，例如特異腐質霉(WO 96/13580)；來自假單胞菌屬的菌株的脂肪酶(這些中的一些現在改名為伯克霍爾氏菌屬)，例如產堿假單胞菌或類產堿假單胞菌(EP 218272)、洋蔥假單胞菌(EP 331376)、假單胞菌屬菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型鏈霉菌屬脂肪酶(WO 10/065455)；來自稻瘟病菌的角質酶(WO 10/107560)；來自門多薩假單胞菌的角質酶(US 5,389,536)；來自褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜熱脂肪土芽孢桿菌脂肪酶(WO 11/084417)；來自枯草芽孢桿菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及來自灰色鏈霉菌(WO 11/150157)和始旋鏈霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
            另外的實例是有時被稱為酰基轉移酶或過水解酶(perhydrolase)的脂肪酶，例如與南極假絲酵母脂肪酶A具有同源性的酰基轉移酶(WO 10/111143)、來自恥垢分枝桿菌的酰基轉移酶(WO 05/56782)、來自CE 7家族的過水解酶(WO 09/67279)、以及恥垢分枝桿菌過水解酶的變體，特別是用于在來自亨斯邁紡織染化私人有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商業化產品Gentle Power Bleach(柔和漂白劑)中使用的S54V變體(WO 10/100028)。
            其他實例是脂肪酶變體，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
            優選的商業化脂肪酶產品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(諾維信公司)，Lumafast(來自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(來自吉斯特布羅卡德斯公司(Gist-Brocades))。
            淀粉酶-淀粉酶可以是α-淀粉酶，β-淀粉酶或葡糖淀粉酶，并且可以是細菌或真菌來源的。包括經化學修飾的或蛋白質工程改造的變體。淀粉酶包括例如獲得自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更詳細描述的地衣芽孢桿菌具體株系的α-淀粉酶。
            淀粉酶的實例是具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的那些或與SEQ ID NO:3具有90％序列一致性的其變體。優選的變體描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的一個或多個以下位置處具有取代的變體：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
            可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其與SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:6的優選變體是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
            其他淀粉酶實例是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的殘基36-483的雜合α-淀粉酶或具有90％序列一致性的其變體。此雜合α-淀粉酶的優選變體是在一個或多個以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和SEQ ID NO:4的殘基36-483的雜合α-淀粉酶的最優選變體是具有以下取代的那些：
            M197T；
            H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
            G48+T49+G107+H156+A181+N190+I201+A209+Q264。
            另外的淀粉酶實例是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其與SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:6的優選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特別優選的淀粉酶是在位置G182和H183或位置H183和G184中具有缺失的那些。
            另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的優選變體是在以下位置的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更優選的變體是在位置182和183或位置183和184中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最優選的淀粉酶變體是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中具有取代的那些。
            可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其與WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或與WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的變體。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的優選變體是在一個或多個以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
            可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其與SEQ ID NO:2具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:2的優選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的最優選的變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最優選的淀粉酶變體是具有以下取代的那些：
            N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
            N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
            S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
            S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中該變體任選地進一步在位置243處包括取代和/或在位置180和/或位置181處包括缺失。
            淀粉酶的其他實例是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或與SEQ ID NO:12具有至少90％，例如至少95％序列一致性的變體。優選的淀粉酶變體是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的一個或多個以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特別優選的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的變體，以及另外在選自下組的一個或多個位置中具有取代的變體：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最優選的是另外在所有這些位置中具有取代的變體。
            可商購的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM和BANTM(諾維信公司)，RapidaseTM和PurastarTM(來自杰能科國際有限公司)。
            過氧化物酶/氧化酶：適合的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些。包括經化學修飾的或蛋白質工程改造的變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬，例如來自灰蓋鬼傘的過氧化物酶，及其變體，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
            可商購的過氧化物酶包括GuardzymeTM(諾維信公司)。
            該一種或多種酶可以通過添加包含一種或多種酶的單獨的添加劑，或通過添加包括所有這些酶的組合添加劑而被包括于洗滌劑組合物中。本發明的洗滌劑添加劑，即單獨的或組合的添加劑，可以配制成例如顆粒、液體、漿液等，優選的洗滌劑添加劑劑型為顆粒，特別是無粉塵顆粒；液體，特別是穩定化液體；或者漿液。
            非塵顆粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而產生，并且可以任選地通過本領域已知的方法進行包衣。蠟狀包衣材料的實例為具有1000至20000的平均摩爾重量的聚(環氧乙烷)產物(聚乙二醇，PEG)；具有從16至50個環氧乙烷單元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中該醇包含從12至20個碳原子，并且其中具有15至80個環氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油單酯和甘油二酯以及甘油三酯。適用于通過流化床技術應用的成膜包衣材料的實例在GB 1483591中給出。液體酶制品可以例如通過根據已確立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而穩定化。受保護的酶可以根據EP 238,216中披露的方法來制備。
            輔料-還可以利用本領域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何洗滌劑組分。其他任選的洗滌劑組分包括防腐劑、防縮劑、抗污垢再沉積劑、抗皺劑、殺細菌劑、粘合劑、腐蝕抑制劑、崩解劑(disintegrant)/崩解試劑(disintegration agent)、染料、酶穩定劑(包括硼酸、硼酸鹽、CMC和/或多元醇如丙二醇)、織物整理劑(包括粘土)、填充劑/加工助劑、熒光增白劑/光學增亮劑、增泡劑、泡沫(泡)調節劑、香料、污垢助懸劑、軟化劑、抑泡劑、晦暗抑制劑以及芯吸劑，單獨抑或組合使用。可以利用本領域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何成分。此類成分的選擇完全在普通技術人員的技術內。
            分散劑：本發明的洗滌劑組合物還可以包含分散劑。具體地說，粉狀洗滌劑可以包括分散劑。適合的水溶性有機材料包括均聚合或共聚合的酸或其鹽，其中聚羧酸包括至少兩個羧基，這兩個羧基被不超過兩個碳原子彼此分開。適合的分散劑例如描述于粉狀洗滌劑，表面活性劑科學系列(Surfactant Science Series)，第71卷中，馬塞爾·德克爾公司(Marcel Dekker)。
            染料轉移抑制劑：本發明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種染料轉移抑制劑。合適的聚合物染料轉移抑制劑包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮與N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。當存在于主題組合物中時，染料轉移抑制劑可以按組合物重量計的以下水平存在：從約0.0001％至約10％、從約0.01％至約5％或甚至從約0.1％至約3％。
            熒光增白劑：本發明的洗滌劑組合物將優選地還包含另外的組分，這些組分可以給正在清潔的物品著色，例如熒光增白劑或光學增亮劑。其中增亮劑優選以約0.01％至約0.5％的水平存在。在本發明的組合物中可以使用適合用于在衣物洗滌劑組合物中使用的任何熒光增白劑。最常用的熒光增白劑是屬于以下類別的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-聯苯乙烯基衍生物。熒光增白劑的二氨芪-磺酸衍生物型的實例包括以下各項的鈉鹽：4,4'-雙-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羥基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽、4,4'-雙-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羥基-乙胺基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽以及2-(芪基(stilbyl)-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸鹽。優選的熒光增白劑是可從汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞爾，瑞士)獲得的天來寶(Tinopal)DMS和天來寶CBS。天來寶DMS是4,4'-雙-(2-嗎啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸鹽的二鈉鹽。天來寶CBS是2,2'-雙-(苯基-苯乙烯基)二磺酸鹽的二鈉鹽。還優選熒光增白劑，是可商購的Parawhite KX，由派拉蒙礦物與化學(Paramount Minerals and Chemicals)，孟買，印度供應。適合用于在本發明中使用的其他熒光劑包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。適合的熒光增亮劑水平包括從約0.01wt％、從0.05wt％、從約0.1wt％或甚至從約0.2wt％的較低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的較高水平。
            污物釋放聚合物：本發明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種污垢釋放聚合物，這些聚合物幫助從織物(如棉布和基于聚酯的織物)移除污物，特別是從基于聚酯的織物移除疏水性污物。污垢釋放聚合物可以例如是非離子型或陰離子型對苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己內酰胺和相關共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，參見例如粉狀洗滌劑，表面活性劑科學系列第71卷第7章，馬塞爾·德克爾公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一種類型的污垢釋放聚合物是包括核心結構和連接至該核心結構的多個烷氧基化基團的兩親性烷氧基化油污清潔聚合物。核心結構可以包括聚烷基亞胺結構或聚烷醇胺結構，如WO 2009/087523中詳細描述的(將其通過引用而特此結合)。此外，任意接枝共聚物是適合的污物釋放聚合物。適合的接枝共聚物更詳細地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(將其通過引用而特此結合)。其他污垢釋放聚合物是取代的多糖結構，尤其是取代的纖維素結構，例如改性纖維素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(將二者都通過引用而特此結合)。適合的纖維素聚合物包括纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維素酰胺及其混合物。適合的纖維素聚合物包括陰離子改性的纖維素、非離子改性的纖維素、陽離子改性的纖維素、兼性離子改性的纖維素及其混合物。適合的纖維素聚合物包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、酯羧甲基纖維素及其混合物。
            抗再沉積劑：本發明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種抗再沉積劑，例如羧甲基纖維素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和馬來酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亞胺。以上在污垢釋放聚合物下描述的纖維素基聚合物還可以用作抗再沉積劑。
            其他適合的輔料包括但不限于防縮劑、抗皺劑、殺細菌劑、粘合劑、載體、染料、酶穩定劑、織物軟化劑、填充劑、泡沫調節劑、助水溶劑、香料、色素、抑泡劑、溶劑以及用于液體洗滌劑的結構劑和/或結構彈性劑。
            洗滌劑產品的配制
            本發明的洗滌劑組合物可以處于任何常規形式，例如條、均勻的片劑、具有兩個或更多個層的片劑、具有一個或多個室的袋、規則的或壓縮的粉末、顆粒、膏、凝膠、或規則的、壓縮的或濃縮的液體。存在多種洗滌劑配制品形式，例如層(相同或不同相)、袋以及用于機械給料裝置的形式。
            可以將小袋配置為單一隔室或多隔室。它可以具有適合保存該組合物的任何形式、形狀和材料，例如在與水接觸之前，不允許該組合物從袋中釋放出來。袋由封裝內體積的水溶性膜制成。可以將所述內體積分為袋的室。優選的膜是形成膜或片的聚合材料，優選是聚合物。優選的聚合物、共聚物或其衍生物選自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素、糊精鈉、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最優選地是聚乙烯醇共聚物和羥丙基甲基纖維素(HPMC)。優選地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少約60％。優選的平均分子量將典型地是約20,000至約150,000。膜還可以是共混物組合物，該共混物組合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在貿易參考M8630下，如由美國印第安納州蓋里(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工業產品公司(Chris Craft In.Prod.)銷售)加增塑劑，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。這些袋可以包括固體衣物清潔組合物或部分組分和/或液體清潔組合物或由水溶性膜分開的部分組分。用于液體組分的室在構成上可以與包含固體的室不同。參考：(US 2009/0011970 A1)。
            可以由水可溶的袋中或片劑的不同層中的室來將洗滌劑成分物理地彼此分開。由此可以避免組分之間的負面的存儲相互作用。在洗滌溶液中，每個室的不同溶解曲線還可以引起選擇的組分的延遲溶解。
            非單位劑量的液體或凝膠洗滌劑可以是水性的，典型地包含按重量計至少20％并且最高達95％的水，例如高達約70％的水、高達約65％的水、高達約55％的水、高達約45％的水、高達約35％的水。包括但不限于鏈烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他類型的液體可以被包括在水性液體或凝膠中。含水液體或凝膠洗滌劑可以包含從0-30％的有機溶劑。液體或凝膠洗滌劑可以是非水性的。
            本發明的酶可以被添加至洗衣皂條中并且用于手洗洗衣、織物和/或紡織品。術語洗衣皂條包括洗衣條、皂條、組合條(combo bar)、合成洗滌劑條以及洗滌劑條。條的類型通常區別在于它們包含的表面活性劑的類型，并且術語洗衣皂條包括包含來自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂條具有在室溫下為固體而非液體、凝膠或粉末的物理形式。術語固體被定義為不隨時間推移顯著改變的實體形式，即如果將一個固體物件(例如洗衣皂條)放置在一種容器內，那么該固體物件不會改變以填充放置該固體物件的容器。該條是典型地呈條形式但是可以呈其他固體形狀、如圓形或卵形的一種固體。
            洗衣皂條可以包含一種或多種另外的酶，蛋白酶抑制劑例如肽醛類(或次硫酸鹽加合物或半縮醛加合物)，硼酸，硼酸鹽，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，一種或多種肥皂或合成表面活性劑，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、檸檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一價陽離子和有機陰離子的鹽，其中該一價陽離子可以是例如Na+、K+或NH4+并且該有機陰離子可以是例如甲酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽或乳酸鹽，這樣使得一價陽離子和有機陰離子的鹽可以是例如甲酸鈉。
            洗衣皂條還可以包含絡合劑像EDTA和HEDP，香料和/或不同類型的填充劑，表面活性劑例如陰離子型合成表面活性劑，助洗劑，聚合的污垢釋放劑，洗滌劑螯合劑，穩定劑，填充劑，染料，著色劑，染料轉移抑制劑，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡劑，結構劑，粘合劑，浸出劑，漂白活化劑，粘土去污劑，抗再沉積劑，聚合分散劑，增白劑，織物柔軟劑，香料和/或本領域已知的其他化合物。
            洗衣皂條可以在常規的洗衣皂條制造設備中進行加工，例如但不限制于：混合器、壓條機例如雙級真空壓條機、擠出機、切割機、標識壓模機(logo-stamper)、冷卻隧道以及包裝機。本發明不局限于通過任何單一方法制備洗衣皂條。可以在過程的不同階段向肥皂中添加本發明的預混料。例如，可以制備包含肥皂、酶、任選地一種或多種另外的酶、蛋白酶抑制劑以及一價陽離子和有機陰離子的鹽的預混料并且然后將該混合物壓條。可以同時添加作為例如處于液態的蛋白酶抑制劑的酶以及任選的另外的酶。除了混合步驟和壓條步驟以外，該工藝還可以進一步包括研磨、擠出、切割、壓模、冷卻和/或包裝的步驟。
            用于降解黃原膠的用途
            已經將黃原膠用作許多消費品(包括食品和化妝品)中的成分并且已經用于石油工業中。因此，黃原膠的降解可以導致改進的清潔過程，例如更容易除去包含膠質(例如黃原膠)的污物，連同通常用于石油與鉆探工業中的黃原膠的降解。因此，本發明針對本發明的內切葡聚糖酶或其組合物用于降解黃原膠的用途。本發明還針對黃原膠裂解酶或其組合物用于降解黃原膠的用途。一個實施例是本發明的內切葡聚糖酶與黃原膠裂解酶一起或其組合物用于降解黃原膠的用途。優選地使用如描述于實例4中的粘度減小測定(ViPr測定)或可替代地如描述于實例5中的還原末端測定測量黃原膠的降解。
            在一個實施例中，可以使用如有關黃原膠的在此描述的粘度減小測定測量黃原膠的降解。一個優選實施例是黃原膠(0.25％或0.5％)在緩沖液或水中的用途，其中在5分鐘、30分鐘、1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時或4小時后測量粘度的下降。一個更優選的實施例是黃原膠(0.25％)在水中的用途，其中在3小時后測量粘度的下降。
            當使用粘度減小測定時，用于降解黃原膠的粘度的下降是至少200Pa。當使用粘度減小測定時，用于降解黃原膠的粘度的下降是至少250Pa。當使用粘度減小測定時，用于降解黃原膠的粘度的下降是至少300Pa。當使用粘度減小測定時，用于降解黃原膠的粘度的下降是至少350Pa。當使用粘度減小測定時，用于降解黃原膠的粘度的下降是至少400Pa。當使用粘度減小測定時，用于降解黃原膠的粘度的下降是至少450Pa。當使用粘度減小測定時，用于降解黃原膠的粘度的下降是至少500Pa。當使用粘度減小測定時，用于降解黃原膠的粘度的下降是至少550Pa。當使用粘度減小測定時，用于降解黃原膠的粘度的下降是至少600Pa。
            可替代地，可以使用由萊韋爾(Lever)(1972)，分析生物化學(Anal.Biochem.)47:273-279,1972研發的比色測定通過用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠上的還原末端測量黃原膠降解活性。一個優選實施例是用黃原膠裂解酶預處理的0.1％黃原膠的用途。可以通過計算空白與樣品之間的差異確定用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠的降解，其中大于0.1mAU、大于0.15mAU、大于0.2mAU、大于0.25mAU、大于0.5mAU，優選大于0.6mAU，更優選大于0.7mAU或甚至更優選大于0.8mAU的差異顯示用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠的降解。
            在去污劑中的用途
            本發明針對本發明的內切葡聚糖酶或其組合物在清潔過程中的用途，例如紡織品和織物的濕洗，例如家用衣物洗滌和工業衣物洗滌，以及家用和工業硬表面清潔，例如餐具洗滌。可以將本發明的內切葡聚糖酶添加至包括一種或多種洗滌劑組分的洗滌劑組合物中。
            一個實施例是本發明的內切葡聚糖酶連同黃原膠裂解酶或其組合物在清潔過程中的用途，例如紡織品和織物的濕洗(例如家用衣物洗滌和工業衣物洗滌)以及家用和工業硬表面清潔，例如餐具洗滌。可以將本發明的內切葡聚糖酶連同黃原膠裂解酶添加至包括一種或多種洗滌劑組分的洗滌劑組合物中。
            可以將本發明的多肽添加至洗滌劑組合物中并且因此變成洗滌劑組合物的組分。本發明的洗滌劑組合物可以配制為例如用于家用和工業衣物清潔兩者的手洗或機洗衣物洗滌劑組合物，包括適用于預處理有污物的織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物軟化劑組合物，或者配制為用于一般家用或工業硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配制用于手洗或機洗(家用和工業兩者)餐具洗滌操作。在一個特定的方面中，本發明提供了一種洗滌劑添加劑，該添加劑包括如在此描述的本發明的多肽。
            在一個實施例中，可以如WO 2013/167581中所述使用AMSA關于黃原膠與碳黑小塊布樣測量ΔInt酶值。一個優選實施例是黃原膠與碳黑(DN31、DN31C或DN31D)小塊布樣在20℃或40℃下的使用。一個更優選的實施例是黃原膠與碳黑(DN31C或DN31D)小塊布樣在40℃下的使用。一個甚至更優選的實施例是黃原膠與碳黑(DN31D)小塊布樣在40℃下的使用。用于對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶和用于黃原膠裂解酶的優選的酶濃度分別為0.5mg EP/L和1.0mg EP/L。
            如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少3個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少3.5個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少4個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少4.5個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少5個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少5.5個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少6個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少7個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少8個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少9個單位。如通過AMSA所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的δ強度值是至少10個單位。
            在一個實施例中，可以如WO 2013/167581中所述使用MiniMUM測定關于黃原膠與碳黑小塊布樣測量ΔRem酶值。一個優選實施例是黃原膠與碳黑(DN31、DN31C或DN31D)小塊布樣在20℃或40℃下的使用。一個更優選的實施例是黃原膠與碳黑(DN31C或DN31D)小塊布樣在40℃下的使用。一個甚至更優選的實施例是黃原膠與碳黑(DN31D)小塊布樣在40℃下的使用。優選地在460nm處測量反射值。用于對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的內切葡聚糖酶和用于黃原膠裂解酶的優選酶濃度分別為0.5mg EP/L和1.0mg EP/L。
            如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少1.5個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少1.75個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少2個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少2.25個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少2.5個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少2.75個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少3個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少3.5個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少4個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少4.5個單位。如通過MiniLOM所確定，黃原膠與碳黑小塊布樣的ΔRem酶值是至少5個單位。
            本發明還涉及用于降解紡織品的表面或硬表面上的黃原膠的方法，這些方法包括向黃原膠施用包括一種或多種本發明的內切葡聚糖酶的組合物。本發明進一步涉及用于降解紡織品的表面或硬表面上的黃原膠的方法，這些方法包括向黃原膠施用包括一種或多種黃原膠裂解酶的組合物。一個實施例是一種用于紡織品的表面或硬表面上的降解黃原膠的方法(例如餐具洗滌)，該方法包括向黃原膠施用包括一種或多種本發明的內切葡聚糖酶連同一種或多種黃原膠裂解酶的組合物。一個實施例是包括如在此描述的一種或多種洗滌劑組分的組合物。
            在地下地層的壓裂(石油和/或氣體鉆探)中的用途
            使用水力壓裂來創造自鉆孔延伸至巖層的地下壓裂，以便增加通過地層可以產生的流體的流速。通常，將高粘度壓裂液以足夠壓裂地下地層的壓力泵入井中。為了維持向地層的增加的暴露，將固體支撐劑添加至壓裂液中，通過施加至流體的高壓將其帶進壓裂處。一旦高粘度壓裂液將該支撐劑帶進地層中，破碎物用于減少流體的粘度，這允許該支撐劑停留在壓裂處中并且由此增加地層向井的暴露。破碎物通過減少聚合物的分子量而工作，以此方式‘破碎’或降解聚合物。壓裂處然后變為一種高滲透性管道，用于有待產生的流體和空氣回至井中。此類過程進一步披露于美國專利號7,360,593、5,806,597、5,562,160、5,201,370以及5,067,566中。
            因此，本發明涉及本發明的內切葡聚糖酶作為酶破碎物的用途。本發明的一個實施例是本發明的內切葡聚糖酶連同黃原膠裂解酶作為酶破碎物的用途。
            因此，本發明提供了一種用于破碎鉆井孔中的黃原膠的方法，該方法包括：(i)將包括水性流體的可膠凝壓裂液、一種或多種能水合的聚合物、用于交聯能水合的聚合物以形成一種聚合物凝膠的適合的交聯劑，以及一種或多種本發明的酶(即，酶破碎物)共混在一起；(ii)將交聯聚合物凝膠在足夠壓裂周圍地層的壓力下泵入鉆井孔中；并且(iii)允許酶破碎物降解交聯聚合物，以減少流體的粘度，這樣使得可以將流體從地層泵回至井表面。因此，本發明的內切葡聚糖酶可以用于控制壓裂液的粘度。此外，一種或多種本發明的內切葡聚糖酶連同一種或多種黃原膠裂解酶可以用于控制壓裂液的粘度。
            本發明的酶破碎物可以是壓裂液或破碎物-交聯劑-聚合物復合物的一種成分，該壓裂液或復合物進一步包括一種能水合的聚合物和一種交聯劑。壓裂液或復合物可以是一種凝膠或可以是可膠凝化的。該復合物在以下方法中是有用的，該方法用于在一種壓裂液中使用該復合物以將鉆井孔周圍的地下地層壓裂，這是通過在足夠將周圍的地下地層壓裂的壓力下將該流體泵至鉆井孔中的所希望的位置。該復合物可以通過維持特定條件的pH和溫度來維持基本上非反應的狀態，直到該流體被放置在鉆井孔中的時刻并且完成所希望的壓裂。一旦壓力完成，該復合物維持無活性的特定條件便不再維持。當這些條件顯著變化時，該復合物變得有活性并且破碎物開始催化聚合物降解，從而導致壓裂液變得足夠流動，以從地下地層泵至井表面。
            降解黃原膠的方法，其中黃原膠用于壓裂由鉆井孔形成的地下地層
            當鉆井時，儲層鉆井液(RDF)在鉆探設備內循環以冷卻并清潔鉆頭，除去鉆井孔外的鉆屑，減少鉆柱與鉆孔的側邊之間的摩擦力，并且形成濾餅以便阻止流體滲漏進入地層中。用于形成濾餅的驅動力是應用以維持鉆孔穩定性的較高的鉆井孔壓力。這一濾餅限制儲層流體在鉆探以及完井設備的放置過程中流入鉆井孔。如果在井竣工之前或過程中未除去在鉆探過程中造成的濾餅損傷，則當該井投入生產時可以出現一系列問題，即完井設備失敗和受損的儲層生產力。
            鉆井液(泥漿)(也稱為儲層鉆井液(RDF))可以是合成/油基的或水基的。為了使鉆井液對地層的侵入最小化，油基和水基泥漿濾餅兩者都典型地包含一種橋接劑或增重劑，通常是碳酸鈣顆粒、重晶石或兩者的混合物，其橋接在地層的孔喉處并且由此形成相對低滲透性濾餅。油基和水基泥漿濾餅兩者還都包含在鉆探過程中帶出的稱作鉆屑的固體，與添加在鉆井液的配制品中的橋接/增重劑截然相反。這些固體可以是石英(砂)、粉砂和/或頁巖，取決于儲層地層以及由鉆探路徑至儲層穿過的地層。另外，油基鉆井泥漿包含陷于濾餅的孔域中的水滴，而水基泥漿濾餅包含聚合物，例如淀粉和黃原膠，以及其他無機鹽。
            形成泥漿濾餅對于鉆探而言通常是必須的，特別是在具有鉆井孔穩定性問題并且典型地具有高滲透性的疏松地層中。然后將濾餅用不同化學品處理，例如螯合劑或酸，以溶解方解石組分；和/或酶或氧化劑，以降解聚合物組分，從而恢復滲透性。
            在一個方面中，本發明提供了一種用于降解黃原膠的方法，其中黃原膠用于壓裂由鉆井孔造成的地下地層，該方法是通過應用包括一種或多種本發明的酶的組合物。該方法可以包括以下步驟：(i)將包括一種或多種本發明的酶的處理流體泵入與有待去除的濾餅接觸的鉆孔中，以在該處理流體與鄰接該濾餅的地層之間建立不同的壓力并且(ii)在不同的壓力周期過程中均勻地傳播濾餅的處理，以通過該處理流體延遲突破。
            在一個實施例中，該方法包括在地層與鉆孔之間通過處理的濾餅建立滲透性。在另一個實施例中，該濾餅可以包括鉆井固體和黏土，并且可以形成自水性鉆井液。如果希望的話，用于處理水性鉆井液濾餅的處理流體還可以包括氧化劑和/或螯合劑，或它可以是基本上不含螯合劑和氧化劑添加劑的。在另一個實例中，該濾餅可以形成自油或反相乳化鉆井液。如果希望的話，用于處理油或反相乳化鉆井液濾餅的處理流體還可以包括互溶溶劑、水潤濕劑或其組合，以將疏水性組分分散在濾餅中。
            在一個實施例中，該處理流體包括一種或多種本發明的內切葡聚糖酶。在另一個實施例中，該處理流體包括一種或多種黃原膠裂解酶。在一個優選實施例中，該處理流體包括一種或多種內切葡聚糖酶以及一種或多種黃原膠裂解酶。
            降解黃原膠的方法，其中黃原膠是鉆孔濾餅中的一種組分
            在一個方面中，本發明提供了一種一旦鉆孔濾餅被泵至表面，用于清潔該濾餅的方法，該濾餅包括聚合物，例如黃原膠和鉆井液固體。鉆井泥漿從泥漿池泵至鉆頭然后再泵出至表面，在該過程中帶出除其他東西之外的破碎的或切碎的巖石(鉆屑)。將鉆屑濾出并且將泥漿返回至泥漿池，在泥漿池中細粒可以沉淀和/或可以將添加化學品或酶(破碎物)進行添加。
            用于降解黃原膠的方法(其中黃原膠是鉆孔濾餅中的一種組分)可以包括以下步驟：(i)用一種處理流體處理該鉆孔濾餅，該處理流體包括一種或多種本發明的酶并且(ii)將固體與流體分離。在一個實施例中，該處理流體包括一種或多種本發明的內切葡聚糖酶。在另一個實施例中，該處理流體包括一種或多種黃原膠裂解酶。在一個優選實施例中，該處理流體包括一種或多種本發明的內切葡聚糖酶以及一種或多種黃原膠裂解酶。
            可以將鉆孔濾餅在泥漿池中用一種或多種本發明的酶處理并且可以再循環鉆井液。可替代地，一旦濾餅已經被一種或多種本發明的酶處理，使用固液分離方法(例如離心)將固體與流體分離。
            在纖維素材料加工中的用途。
            本發明多肽的內切葡聚糖酶活性也可用于降解或轉化纖維素材料，包括：用包含本發明多肽的酶組合物處理纖維素材料。在一個優選方面，該方法進一步包括對降解的或轉化的纖維素材料進行回收。
            本發明還涉及產生一種發酵產物的方法，這些方法包括：(a)在本發明的多肽的存在下，用一種酶組合物使纖維素材料糖化；(b)用一種或多種(若干種)發酵微生物發酵糖化的纖維素材料，以產生該發酵產物；并且(c)從發酵中回收該發酵產物。
            本發明還涉及對纖維素材料進行發酵的方法，該方法包括用一種或多種(若干種)發酵微生物對纖維素材料進行發酵，其中纖維素材料是在本發明的多肽的存在下用酶組合物進行糖化。在一個優選方面，發酵該纖維素材料產生一種發酵產物。在另一個優選方面，該方法進一步包括從發酵中回收發酵產物。
            本發明的方法可被用于將一種纖維素材料糖化成可發酵糖，并且將這些可發酵糖轉化成許多有用的物質，例如燃料、飲用乙醇、和/或發酵產物(例如酸類、醇類、酮類、氣體等)。由該纖維素材料產生所希望的發酵產物典型地涉及預處理、酶水解(糖化)、以及發酵。
            根據本發明，可以使用本領域常規的過程來完成纖維素材料的加工。此外，可以使用被配置為根據本發明進行操作的常規生物質加工裝置來實施本發明的方法。
            分開或同時的水解(糖化)和發酵包括但不限于：分開水解和發酵(SHF)、同時糖化和發酵(SSF)、同時糖化和共發酵(SSCF)、雜合的水解和發酵(HHF)、分開水解和共發酵(SHCF)、雜合的水解和共發酵(HHCF)，以及直接微生物轉化(DMC)。
            常規裝置可以包括補料分批攪拌反應器、分批攪拌反應器、具有超過濾的連續流攪拌反應器、和/或連續活塞流動柱反應器(柯瑞芝(Corazza)等人，2003，用于纖維二糖水解的補料分批反應器中的最佳控制(Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis)，技術學報(Acta Scientiarum.Technology)25:33-38；古薩科夫(Gusakov)和辛涅特西(Sinitsyn)，1985，纖維素酶水解動力學：1.用于分批反應器過程的數學模型(Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process)，酶與微生物技術(Enz.Microb.Technol.)7:346-352)，研磨反應器(隆(Ryu)和李(Lee)，1983，通過使用研磨生物反應器，生物轉化廢物纖維素(Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor)，生物技術和生物工程(Biotechnol.Bioeng)25:53-65)，或具有電場誘導的有力攪拌的反應器(古薩科夫(Gusakov)等人，1996，使用具有電場誘導的有力攪拌的新穎類型的生物反應器的纖維素酶水解的增強(Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field)，應用生物化學與生物技術(Appl.Biochem.Biotechnol.)56:141-153)。另外的反應器類型包括：用于水解和/或發酵的流化床反應器、升流層(upflow blanket)反應器、固定化反應器、以及擠出機型反應器。
            預處理。在本發明的方法的實踐中，可以使用本領域已知的任何預處理方法來破壞植物細胞壁的纖維素材料組分(錢德拉(Chandra)等人，2007，底物預處理：木質纖維素的有效酶水解的關鍵？(Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics？)，生物化學工程/生物技術的進展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93；蓋博(Galbe)和小林(Zacchi)，2007，用于高效生物乙醇生產的木質纖維素材料的預處理(Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production)，生物化學工程/生物技術的進展108:41-65；亨德里克斯(Hendriks)和季曼(Zeeman)，2009，用以增強木質纖維素生物質的消化性的預處理(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass)，生物資源技術(Bioresource Technol.)100:10-18；莫熱(Mosier)等人，2005，用于木質纖維素生物質的預處理的有前景技術的特征(Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass)，生物資源技術96:673-686；塔希爾扎德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi)，2008，預處理木質纖維素廢棄物以改善乙醇和生物氣體產生：綜述(Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review)，分子科學國際雜志(Int.J.of Mol.Sci.)9:1621-1651；楊(Yang)和懷曼，2008，預處理：釋放低成本纖維素乙醇的關鍵(Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol)，生物燃料、生物產品與生物精煉(Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.)2:26-40)。
            纖維素材料也可以在預處理之前使用本領域中已知的方法進行顆粒粒度減小、預浸泡、潤濕、洗滌或調理。
            常規預處理包括但不限于：蒸汽預處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預處理、熱水預處理、堿預處理、石灰預處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機溶劑預處理、以及生物預處理。另外的預處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界H2O、臭氧、以及γ輻射預處理。
            可以在水解和/或發酵之前對纖維素材料進行預處理。優選在水解前進行預處理。可替代地，預處理可以與酶水解同時進行，以釋放可發酵的糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纖維二糖。在多數情況下，預處理步驟自身導致將生物質轉化為可發酵糖(即使在沒有酶的情況下)。
            蒸汽預處理。在蒸汽預處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細胞壁組分，包括木質素、半纖維素、以及纖維素，以使酶可接觸纖維素和其他級分，例如，半纖維素。使纖維素材料經過或通過反應容器，其中注入蒸汽以將溫度增加至所需的溫度和壓力，并且在其中保持所希望的反應時間。蒸汽預處理優選在140℃-230℃，更優選160℃-200℃，并且最優選170℃-190℃進行，其中最優的溫度范圍依賴于任何化學催化劑的添加。蒸汽預處理的停留時間優選1-15分鐘，更優選3-12分鐘，并且最優選4-10分鐘，其中最優的停留時間依賴于溫度范圍和任何化學催化劑的添加。蒸汽預處理允許相對較高的固體加載量，這樣使得纖維素材料在預處理過程中通常僅變得潮濕。蒸汽預處理經常與預處理后的材料的爆發放料(explosive discharge)合并，這被稱為蒸汽爆炸，即，快速急驟蒸發至大氣壓和材料的湍流，以通過破碎增加可接觸的表面積(迪福(Duff)和默里(Murray)，1996，生物資源技術(Bioresource Technology)855:1-33；蓋爾貝(Galbe)和賽琪(Zacchi)，2002，應用微生物學與生物技術(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:618-628；美國專利申請號20020164730)。在蒸汽預處理過程中，半纖維素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纖維素部分水解成單糖和寡糖。僅在有限的程度上去除木質素。
            經常在蒸汽預處理之前添加一種催化劑(例如H2SO4或SO2)(典型地是0.3至3％w/w)，該催化劑減少時間并降低溫度、增加回收率、并改進酶水解(巴列斯特羅斯(Ballesteros)等人，2006，應用生物化學與生物技術129-132:496-508；瓦爾加(Varga)等人，2004，應用生物化學與生物技術113-116:509-523；塞斯尼爾(Sassner)等人，2006，酶與微生物技術(Enzyme Microb.Technol.)39:756-762)。
            化學預處理：術語“化學處理”是指促進纖維素、半纖維素、和/或木質素的分離和/或釋放的任何化學預處理。適合的化學預處理方法的實例包括(例如稀酸預處理、石灰預處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)、以及有機溶劑預處理。
            在稀酸預處理中，纖維素材料與稀酸(典型地是H2SO4)和水混合，以形成漿料，由蒸汽加熱至希望的溫度，并且在停留時間后閃變至大氣壓。可以用許多反應器設計來進行稀酸預處理，例如，活塞流反應器、逆流反應器、或連續逆流收縮床反應器(達夫和默里，1996，見上文，舍爾(Schell)等人，2004，生物資源技術91:179-188；李(Lee)等人，1999，生物化學工程與生物技術的進展65:93-115)。
            還可以使用堿性條件下的若干預處理方法。這些堿預處理包括但不限于：石灰預處理、濕氧化、氨滲濾(APR)、以及氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。
            用碳酸鈣、氫氧化鈉、或氨，在85℃-150℃的低溫下進行石灰預處理，并且停留時間為從1小時到幾天(懷曼(Wyman)等人，2005，生物資源技術(Bioresource Technol.)96:1959-1966；莫熱(Mosier)等人，2005，生物資源技術96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901公開了使用氨的預處理方法。
            濕氧化是一種熱預處理，其典型地在添加氧化劑(如過氧化氫或過壓氧)的情況下在180℃-200℃下持續5-15分鐘進行(施密特(Schmidt)和湯姆森(Thomsen)，1998，生物資源技術(Bioresource Technol.)64:139-151；帕羅內(Palonen)等人，2004，應用生物化學與生物技術(Appl.Biochem.Biotechnol.)117:1-17；瓦爾加等人，2004，生物技術與生物工程(Biotechnol.Bioeng.)88:567-574；馬丁(Martin)等人，2006，化學技術與生物技術雜志(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81:1669-1677)。預處理優選以1％至40％干物質，更優選2％至30％干物質，并且最優選5％至20％干物質進行，并且經常通過添加堿如碳酸鈉來增加初始pH。
            被稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)的濕氧化預處理方法的修改方案能夠處理高達30％的干物質。在濕爆炸中，在某一停留時間后，在預處理過程中引入氧化劑。然后通過急驟蒸發至大氣壓結束預處理(WO 2006/032282)。
            氨纖維爆炸(AFEX)涉及在如90℃-100℃的中等溫度和如17至20巴的高壓下，用液體或氣態氨處理纖維素材料5至10分鐘，其中干物質含量可以高達60％(格拉帕里(Gollapalli)等人，2002，應用生物化學與生物技術(Appl.Biochem.Biotechnol.)98:23-35；俊達瓦特(Chundawat)等人，2007，生物技術與生物工程(Biotechnol.Bioeng.)96:219-231；阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，應用生物化學與生物技術121:1133-1141；泰莫里(Teymouri)等人，2005，生物資源技術(Bioresource Technol.)96:2014-2018)。AFEX預處理導致纖維素的解聚和半纖維素的部分水解。木質素-碳水化合物復合物被裂解。
            有機溶劑預處理通過使用含水乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃下萃取30-60分鐘而將纖維素材料脫木質素(潘(Pan)等人，2005，生物技術與生物工程(Biotechnol.Bioeng.)90:473-481；潘等人，2006，生物技術與生物工程94:851-861；庫拉比(Kurabi)等人，2005，應用生物化學與生物技術(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:219-230)。通常加入硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理中，大部分半纖維素被去除。
            適合的預處理方法的其他實例由謝爾(Schell)等人，2003，應用生物化學與生物技術(Appl.Biochem.and Biotechnol.)105-108:69-85，和馬塞爾(Mosier)等人，2005，生物資源技術(Bioresource Technology)96:673-686，以及美國公開申請號2002/0164730進行描述。
            在一個方面中，化學預處理優選是以酸處理進行，并且更優選持續稀酸和/或弱酸處理。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫、或其混合物。弱酸處理優選在1-5，更優選1-4，并且最優選1-3的pH范圍內進行。在一個方面，該酸濃度在優選從0.01至20wt％酸，更優選0.05至10wt％酸，甚至更優選0.1至5wt％酸，并且最優選0.2至2.0wt％酸的范圍中。使酸與纖維素材料相接觸，并在優選160℃-220℃，并且更優選165℃-195℃范圍內的溫度下保持從幾秒到幾分鐘，例如1秒至60分鐘范圍內的時間。
            在另一個方面中，預處理是作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預處理步驟)進行。
            在另一個方面中，預處理在水性漿料中進行。在優選的方面，在預處理過程中纖維素材料以優選10-80wt％之間，更優選20-70wt％之間，并且最優選30-60wt％之間，例如50wt％左右的量存在。預處理的纖維素材料可以不洗滌或使用本領域已知的任何方法洗滌，例如，用水洗滌。
            機械預處理：術語“機械預處理”是指各種類型的研磨或碾磨(例如，干磨、濕磨、或振動球磨)。
            物理預處理：術語“物理預處理”是指促進纖維素、半纖維素、和/或木質素從纖維素材料中分離和/或釋放的任何預處理。例如，物理預處理可包括輻射(例如微波輻射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解及其組合。
            物理預處理可以包括高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個方面中，高壓意指在優選約300至約600psi，更優選約350至約550psi，并且最優選約400至約500psi，例如450psi左右的范圍中的壓力。在另一個方面中，高溫意指在約100℃至約300℃，優選約140℃至約235℃范圍內的溫度。在一個優選的方面，機械預處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、蒸汽槍水解器系統，例如來自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer中進行。
            組合的物理和化學預處理：纖維素材料可以物理地且化學地預處理。例如，該預處理步驟可包括稀酸或弱酸預處理以及高溫和/或高壓處理。這些物理預處理和化學預處理可以根據需要順序地進行或同時進行。也可以包括機械預處理。
            因此，在一個優選方面中，使纖維素材料經受機械、化學或物理預處理、或其任何組合，以促進纖維素、半纖維素、和/或木質素的分離和/或釋放。
            生物預處理：術語“生物預處理”是指促進纖維素、半纖維素、和/或木質素從纖維素材料中分離和/或釋放的任何生物預處理。生物預處理技術可以涉及應用溶解木質素的微生物(參見，例如，舒·T.-A.(Hsu,T.-A.)，1996，生物質的預處理(Pretreatment of biomass)，生物乙醇手冊：生產和利用，懷曼·C.E.編輯，泰勒-弗朗西斯出版集團，華盛頓特區，179-212；高希(Ghosh)和辛格(Singh)，1993，用于纖維素生物質的酶/微生物轉化的物理化學與生物處理(Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass)，應用微生物學進展(Adv.Appl.Microbiol.)39:295-333；麥克米蘭·J.D.(McMillan,J.D.)，1994，預處理木質纖維素生物質：綜述(Pretreating lignocellulosic biomass:a review)，用于燃料生產的生物質的酶轉化(Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production)，希默爾·M.E.、貝克·J.O.、以及奧弗倫·R.P.(Overend,R.P.)編輯，美國化學學會討論會系列566(ACS Symposium Series 566)，美國化學學會(American Chemical Society)，華盛頓特區，第15章；貢·C.S.(Gong,C.S.)、卡奧·N.J.(Cao,N.J.)、杜·J.(Du,J.)、以及曹·G.T.(Tsao,G.T.)，1999，由可再生資源生產乙醇(Ethanol production from renewable resources)，生物化學工程/生物技術的進展，舍佩爾·T.編輯，施普林格出版社德國海德堡柏林(Berlin Heidelberg,Germany)，65:207-241)；奧爾森(Olsson)和哈恩-哈格達爾(Hahn-Hagerdal)，1996，用于乙醇生產的木質纖維素水解物的發酵(Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production)，酶與微生物技術(Enz.Microb.Tech.)18:312-331；以及瓦藍德(Vallander)和埃里克松(Eriksson)，1990，由木質纖維素材料生產乙醇：技術現狀(Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art)，生物化學工程/生物技術的進展42:63-95)。
            糖化。在水解步驟(還稱為糖化)中，將(例如預處理的)纖維素材料水解，以將纖維素以及可替代地還有半纖維素分解成可發酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解由酶組合物在本發明的多肽的存在下酶促進行。該組合物可進一步包括一種或多種(若干種)半纖維素分解酶或木聚糖降解酶。還可順序地添加這些組合物的酶。
            酶水解優選在易于由本領域技術人員確定的條件下、在合適的含水環境中執行。在一個優選方面，水解在適合于一種或多種酶的活性，即對于該一種或多種酶來說最佳的條件下進行。水解可以作為分批補料過程或連續過程進行，其中將預處理的纖維素材料(底物)逐漸補料至例如含酶的水解溶液中。
            糖化通常在攪拌釜反應器或發酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進行。適合的處理時間、溫度以及pH條件可以由本領域技術人員容易地確定。例如，糖化可以持續長達200小時，但是典型地進行優選約12至約96小時，更優選約16至約72小時，并且最優選約24至約48小時。溫度在優選約25℃至約70℃，更優選約30℃至約65℃，并且更優選約40℃至約60℃，特別是約50℃的范圍中。pH在優選約3至約8，更優選約3.5至約7，并且最優選約4至約6，特別是約pH 5的范圍中。干燥固體含量在優選約5wt％至約50wt％，更優選約10wt％至約40wt％，并且最優選約20wt％至約30wt％的范圍中。
            該酶組合物優選地包括多種具有纖維素分解活性和/或木聚糖降解活性的酶。在一個方面，該酶組合物包括一種或多種(若干種)纖維素分解酶。在另一個方面，該酶組合物包括一種或多種(若干種)木聚糖降解酶。在另一個方面，該酶組合物包括一種或多種(若干種)纖維素分解酶和一種或多種(若干種)木聚糖降解酶。
            該一種或多種(若干種)纖維素分解酶優選是選自下組，該組由以下各項組成：內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。該一種或多種(若干種)木聚糖降解酶優選是選自下組，該組由以下各項組成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
            在另一個方面，該酶組合物進一步或甚至進一步包括一種具有纖維素分解增強活性的多肽(參見，例如WO 2005/074647、WO 2005/074656、以及WO 2007/089290)。在另一個方面，該酶組合物可進一步或甚至進一步包括一種或多種(若干種)另外的酶活性以改善含纖維素材料的降解。優選的另外的酶是半纖維素酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、內切-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、內切-α-L-阿拉伯聚糖酶、β-半乳糖苷酶)、碳水化合物-酯酶(例如乙酰基-木聚糖酯酶、乙酰基-甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡萄糖醛酸酯酶)、果膠酶、蛋白酶、木質素分解酶(例如漆酶、錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶、H2O2生產酶、氧化還原酶)、棒曲霉素、膨脹素、或其混合物。在本發明的方法中，可以在發酵之前或過程中，例如在糖化過程中，或在發酵微生物的繁殖過程中或之后添加這一種或多種另外的酶。
            該酶組合物的一種或多種(若干種)組分可以是野生型蛋白、重組蛋白、或野生型蛋白與重組蛋白的組合。例如，一種或多種(若干種)組分可以是用作宿主細胞以重組表達該酶組合物的一種或多種(若干種)其他組分的細胞的原生蛋白質。該酶組合物的一種或多種(若干種)組分可以作為單組分產生，然后將這些單組分組合以形成該酶組合物。酶組合物可以是多組分和單組分蛋白制劑的組合。
            用于本發明的方法中的酶可以處于適合用于此處所述的過程中的任何形式，例如像去除或未去除細胞的粗發酵液、具有或不具有細胞碎片的細胞裂解液、半純化的或純化的酶制劑、或作為酶來源的宿主細胞。酶組合物可以是干粉或顆粒、非塵顆粒、液體、穩定化的液體、或穩定化的受保護的酶。可以根據已建立的方法例如通過添加穩定劑(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一種有機酸，對液體酶制劑進行穩定化。
            在下面各段中對本發明進行了進一步的概述：
            1.一種具有內切葡聚糖酶活性并且對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽，該多肽選自下組，該組由以下各項組成：
            (a)多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
            (b)由如下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在中嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、或(ii)(i)的全長互補體雜交；
            (c)由如下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
            (d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的變體，該變體在一個或多個位置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
            (e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，該片段具有內切葡聚糖酶活性并且對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性。
            2.如段落1所述的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。
            3.如段落1或2所述的多肽，該多肽由如下多核苷酸編碼，該多核苷酸在中-高嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、或(ii)(i)的全長補體雜交。
            4.如段落1-3中任一項所述的多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
            5.如段落1-4中任一項所述的多肽，該多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或者由其組成。
            6.如段落5所述的多肽，其中該成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至846。
            7.如段落1-4中任一項所述的多肽，該多肽是SEQ ID NO:2的成熟多肽的變體，該變體在一個或多個位置處(例如多達10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個位置)包括取代、缺失和/或插入。
            8.如段落1至7中任一項所述的多肽，該多肽是SEQ ID NO:2的片段，其中該片段具有內切葡聚糖酶活性并且對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性。
            9.一種編碼如段落1-8中任一項所述的多肽的多核苷酸。
            10.一種核酸構建體或表達載體，該核酸構建體或表達載體包括如段落9所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導多肽在表達宿主內產生的一個或多個控制序列。
            11.一種重組宿主細胞，該重組宿主細胞包括如段落9所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導該多肽產生的一個或多個控制序列。
            12.一種產生如段落1-8中任一項所述的多肽的方法，該方法包括：在有益于產生該多肽的條件下培養一種細胞，該細胞處于其野生型形式時產生該多肽。
            13.如段落12所述的方法，該方法進一步包括回收該多肽。
            14.一種產生具有內切葡聚糖酶活性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽的方法，該方法包括在有益于產生該多肽的條件下培養如段落11所述的宿主細胞。
            15.一種用編碼如段落1-8中任一項所述的多肽的多核苷酸轉化的轉基因植物、植物部分或植物細胞。
            16.一種產生具有內切葡聚糖酶活性并對用黃原膠裂解酶預處理的黃原膠具有活性的多肽的方法，該方法包括在有益于產生該多肽的條件下培養如段落15所述的轉基因植物或植物細胞。
            17.如段落16所述的方法，該方法進一步包括回收該多肽。
            18.一種包括如段落1-8中任一項所述的多肽的全培養液配制品或細胞培養組合物。
            19.一種組合物，該組合物包括如段落1-8中任一項所述的多肽。
            20.如段落19所述的組合物，該組合物進一步包括具有黃原膠裂解酶活性的多肽。
            21.如段落19或20中任一項所述的組合物，該組合物是一種洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物包括一種或多種洗滌劑組分。
            22.如段落19-21中任一項所述的組合物，其中這些洗滌劑組分選自下組，該組包括表面活性劑、助洗劑、助水溶劑、漂白系統、聚合物、織物調色劑、輔料、分散劑、染料轉移抑制劑、熒光增白劑以及污垢釋放聚合物，或其任何混合物。
            23.如段落19-22中任一項所述的組合物，其中該洗滌劑組合物處于以下形式：棒，均勻的片劑，具有兩個或更多個層的片劑，具有一個或多個室的袋，規則的或壓縮的粉末，顆粒，膏，凝膠，或規則的、壓縮的或濃縮的液體。
            24.根據段落19-23中任一項所述的組合物用于降解黃原膠的用途。
            25.如權段落24所述的用途，用于控制鉆井液的粘度。
            26.如段落24所述的用途，用于洗滌或清潔紡織品和/或硬表面，例如餐具洗滌。
            27.如段落24所述的用途，其中該洗滌劑組合物具有酶洗滌益處。
            28.一種用于降解黃原膠的方法，該方法包括向黃原膠應用根據段落19-23中任一項所述的組合物。
            29.如段落28所述的方法，其中該黃原膠在紡織品的表面上或硬表面，例如餐具洗滌。
            30.如段落28所述的方法，其中該黃原膠在由鉆井孔形成的地下地層的壓裂中使用。
            31.如段落28所述的方法，其中該黃原膠是鉆孔濾餅中的組分。
            32.一種用于降解或轉化纖維素材料的方法，該方法包括：用根據段落19-23中任一項所述的酶組合物或在段落1-8中任一項所述的多肽存在下處理該纖維素材料。
            33.如段落32所述的的方法，其中該纖維素材料經過預處理。
            34.如段落31或32所述的方法，其中該酶組合物包括選自下組的一種或多種酶，該組由以下各項組成：纖維素酶、具有纖維素分解增強活性的多肽、半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、或過氧化物酶。
            35.如段落34所述的方法，其中該纖維素酶是選自下組的一種或多種酶，該組由以下各項組成：內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。
            36.如段落34所述的方法，其中該半纖維素酶是選自下組的一種或多種酶，該組由以下各項組成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
            37.如段落32-36中任一項所述的方法，進一步包括回收降解的纖維素材料。
            38.如段落37所述的方法，其中該降解的纖維素材料是糖，優選地選自下組，該組由以下各項組成：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖以及阿拉伯糖。
            39.一種用于產生發酵產物的方法，該方法包括：
            (a)在如段落1-8中任一項所述的多肽的存在下，用酶組合物對纖維素材料進行糖化；
            (b)用一種或多種發酵微生物對糖化的纖維素材料進行發酵，以產生該發酵產物；并且
            (c)從發酵中回收該發酵產物。
            通過以下實施例進一步對本發明進行描述，但不應將其理解為對本發明范圍的限制。
            實例
            菌株
            浮霉狀菌屬物種R1菌株從2009年-2012年在俄羅斯聯邦收集的環境水樣(溫泉，46℃-58℃，pH 5.7-7.3)中分離。
            培養基和溶液
            Ka-Na-酒石酸鹽/NaOH緩沖液：將Ka-Na-酒石酸鹽(50g)和NaOH(20g)溶解于水中，至總體積為1升。
            終止溶液：將PAHBAH(西格瑪H-9882)溶解于Ka-Na-酒石酸鹽/NaOH溶液中，至濃度為15mg/ml(例如，將500mg PAHBAH溶解于33ml Ka-Na-酒石酸鹽/NaOH溶液中)
            測定緩沖液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，調節至pH 3-11
            經修飾的黃原膠：基質修飾的黃原膠(mXG)是用可以將末端丙酮酸甘露糖除去的黃原膠裂解酶處理的黃原膠(XG)，并且使用改編的Nankai，Hashimoto等人1999，環境微生物(Environ.Microbiol)65(6):2520-2526：在2L燒杯中將2.5g的黃原膠(CP Kelco)用5mL的96％乙醇潤濕。添加500mL的100mM ACES緩沖液pH 7.00，并將溶液在環境溫度下攪拌2h。添加250μL的黃原膠裂解酶(Megazyme產品E-XANLB，芽孢桿菌屬物種)，將該溶液在50℃孵育20h。在水解后，在攪拌下將1400mL的96％乙醇添加到500mL樣品中。發生沉淀，并且在約5min后，傾析出乙醇，由此除去丙酮酸化的甘露糖殘基。將500mL的96％乙醇再次添加到剩余的溶液中，并在任何沉淀后傾析。將樣品在Whatman過濾器GF/C上在蒸發漏斗上干燥。將過濾器在50℃下干燥20h。收集樣品，研磨并通過300μM篩分過篩。
            實例1：浮霉狀菌屬內切葡聚糖酶編碼基因的鑒定
            將浮霉狀菌屬物種菌株R1進行基因組測序，并鑒定了編碼推定的分泌蛋白(SEQ ID NO:1)的開放閱讀框。針對Pfam數據庫的Blast搜索(M.帕他(M.Punta)，P.C.柯吉爾(P.C.Coggill)，R.Y.埃博哈特(R.Y.Eberhardt)，J.密斯崔(J.Mistry)，J.特特(J.Tate)，C.保爾瑟爾(C.Boursnell)，N.潘(N.Pang)，K.福斯蘭德(K.Forslund)，G.格瑞克(G.Ceric)，J.克里門特(J.Clements)，A.海格(A.Heger)，L.霍爾姆(L.Holm)，E.L.L.索恩哈默(E.L.L.Sonnhammer)，S.R.艾迪(S.R.Eddy)，A.比特曼(A.Bateman)，R.D.費恩(R.D.Finn.)Pfam:蛋白質家族數據庫(the protein families database.)核酸研究(Nucleic Acids Research)(2014)數據庫卷(Database Issue)42:D222-D230)鑒定了非常遙遠相關的Pfam PF00150結構域(SEQ ID NO:2，殘基93..229)，具有21.1％的序列一致性和22.2的HMM得分，恰好高于由Pfam定義的噪聲水平。此外，發現PF00150結構域僅是部分的，跨越在定義為Pfam服務器(pfam.sanger.ac.uk)的管理和模型信息的281個中的137個殘基。此外，鑒定了具有25.4％的序列一致性和40.4的HMM得分的PF02018結構域(SEQ ID NO 2，殘基284至413)。PF00150的假定的催化結構域由β鏈四和七的羧基末端附近的兩個谷氨酸組成，一個作為質子供體，另一個作為親核體(吉克斯J(Jenkins J)，羅樂格L(Lo Leggio L)，哈瑞斯G(Harris G)和皮克斯吉爾RPickersgill R)β-葡糖苷酶，β-半乳糖苷酶，A家族纖維素酶，F家族木聚糖酶和兩種大麥聚糖酶形成具有8倍β/α結構的酶的超家族，并且在β鏈四和七的羧基末端附近具有兩個保守的谷氨酸，歐洲生化學會聯合會快報(FEBS Lett.)1995年4月10日；362(3):281-5)。推定的谷氨酸質子供體(E229)存在于部分PF00150結構域中，并且推定的親核體(E566)位于PF02018結構域之后。這表明PF02018結構域已經被引入谷氨酸催化殘基之間，導致新的結構域結構。
            實例2：來自浮霉狀菌屬的內切葡聚糖酶的克隆和表達
            鑒定內切葡聚糖酶基因的編碼部分的成熟肽(SEQ ID NO:1中的位置82至2619)并插入大腸桿菌中。從大腸桿菌轉化體純化含有插入片段的表達質粒，并轉化到米曲霉宿主細胞中。使轉化的宿主細胞在液體培養基中生長。收集上清液，并且通過疏水相互作用層析，凝膠過濾和陰離子交換層析的組合來純化酶。
            使用N-末端測序，發現成熟肽的主要部分開始于ATPGKLF。成熟肽的次要部分具有N-末端序列TPGKLFP。
            實例3：來自浮霉狀菌屬的純化的內切葡聚糖酶的表征
            AZCL-HE-纖維素(交聯的和染色的纖維素)測定用于檢測內切葡聚糖酶活性并且用于獲得pH-活性曲線，溫度-活性曲線以及底物特異性曲線。通過溫和攪拌將1％AZCL-HE-纖維素(來自麥格酶公司(Megazyme))懸浮在0.01％Triton X-100中。將200微升該懸浮液和200微升測定緩沖液在微量離心管中混合并置于冰上。添加20微升內切葡聚糖酶樣品。通過將微量離心管轉移至設定為測定溫度的恒溫混合器來開始測定。將管在恒溫混合器上以其最高振蕩速率(1400rpm)孵育達60min。通過將微量離心管轉移回冰浴停止孵育。然后將微量離心管在冰冷的離心機中離心2min，將200微升上清液轉移至微量滴定板并讀取OD590。在該測定中包括空白緩沖液。使用ΔOD590＝OD590(酶)-OD590(緩沖液)來測量內切葡聚糖酶活性。
            不同測定條件
            溫度：30℃-80℃
            底物：AZCL-HE-纖維素，AZCL-普魯蘭，AZCL-木葡聚糖，AZCL-凝膠多糖和AZCL-β-葡聚糖。
            測定緩沖液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，調節至pH 3-11。
            實例4：來自浮霉狀菌屬的內切葡聚糖酶的黃原膠降解活性
            本發明多肽的黃原膠降解活性通過測量與內切葡聚糖酶孵育后黃原膠溶液的粘度降低來評估。
            使用描述于WO 2011/107472中的粘度壓力測定進行粘度測量。
            水解條件如下所示：50℃，0.6％黃原膠(XG)或0.3％經修飾的黃原膠(mSG)在50mM HEPES緩沖液中+0.01％triton X-100pH 7.0中。熱平衡后添加酶。在熱平衡后和酶添加之前測量初始粘度。對照亦如此，只是添加緩沖液而不是酶。
            樣品大小為100μL/1mL水解或對照。下表X中所示的結果是三次測量的平均值。
            粘度的降低是酶活性的量度。當內切葡聚糖酶和黃原膠裂解酶與黃原膠一起孵育時，或當內切葡聚糖酶與經修飾的黃原膠單獨孵育時，觀察到粘度的顯著下降。這表明一旦除去丙酮酸化的甘露糖，底物現在是空間可得的并且被內切葡聚糖酶降解。
            實例5：還原端測定
            可替代地，可以使用由萊韋爾(Lever)(1972)，分析生物化學(Anal.Biochem.)47:273-279,1972研發的比色測定，通過用黃原膠裂解酶(mXG)預處理的黃原膠上的還原末端確定內切葡聚糖酶活性。產生的任何還原末端都將與PAHBAH反應，從而產生顏色的變化，該顏色變化在用于該測定的條件下與酶活性成比例。
            如以上描述通過還原末端測量黃原膠裂解酶活性，除了將0.1％黃原膠用作底物以外。
            材料與化學品：0.1％底物：24ml Milli-Q水中的用黃原膠裂解酶預處理的6ml(5mg/ml)黃原膠。
            活性緩沖液：100mM乙酸鈉，100mM MES，1mM CaCl2，在0.01％Triton X100中，pH 7。
            Ka-Na-酒石酸鹽/NaOH緩沖液：將Ka-Na-酒石酸鹽(50g)和NaOH(20g)溶解于水中，至總體積為1升。在4℃下儲存。
            終止溶液：將PAHBAH(西格瑪H-9882)溶解于Ka-Na-酒石酸鹽/NaOH溶液中，至濃度為15mg/ml(例如，將500mg PAHBAH溶解于33ml Ka-Na-酒石酸鹽/NaOH溶液中)。
            樣品制備：使用BioMek液體處理機器人，將酶樣品在柯仕達條(costarstrip)中的活性緩沖液中稀釋至0.1mg/ml。將50μl的底物和50μl的每種稀釋的樣品轉移至96孔PCR-MTP板，向每個樣品中添加50μl活性緩沖液并將溶液混合。將密封的PCR-板在37℃下、在PCR機中孵育15min，然后立即冷卻至10℃。向每個樣品中添加75μl的終止溶液，將混合物振蕩，并且將75μl的每個樣品丟棄。將這些樣品在95℃下孵育10min，然后在10℃下孵育1min。將150μl的每種樣品轉移至新的96孔PCR-MTP并且測量405nm處的吸光度。
            比色反應與產生的還原末端的量成比例，并且因此與存在的內切葡聚糖酶的量成比例。
            序列表
            <110> 諾維信公司
            <120> 具有內切葡聚糖酶活性的多肽
            <130> 12796-WO-PCT
            <160> 2
            <170> PatentIn 版本3.5
            <210> 1
            <211> 2622
            <212> DNA
            <213> 浮霉狀菌
            <220>
            <221> CDS
            <222> (1)..(2619)
            <220>
            <221> 信號肽
            <222> (1)..(81)
            <220>
            <221> 成熟肽
            <222> (82)..(2619)
            <220>
            <221> PF00150
            <222> (277)..(687)
            <220>
            <221> PF02018
            <222> (850)..(1239)
            <400> 1
            atg agg cga aac gtt gcg ttc gat tgc att ctg atc ctg cta ctt ggg 48
            Met Arg Arg Asn Val Ala Phe Asp Cys Ile Leu Ile Leu Leu Leu Gly
                    -25                 -20                 -15
            cta ctg tgc ttc gga gca aca ccc tct cgg gga gaa gaa acg gca act 96
            Leu Leu Cys Phe Gly Ala Thr Pro Ser Arg Gly Glu Glu Thr Ala Thr
                -10                 -5              -1  1               5
            cca ggc aag ctc ttt ccg ttt gtc ctg agc tac gaa cca acg gac agc 144
            Pro Gly Lys Leu Phe Pro Phe Val Leu Ser Tyr Glu Pro Thr Asp Ser
                            10                  15                  20
            atc aca aac atc tca gaa tgg ctt gac cgt ccc gct ggg aag cac ggg 192
            Ile Thr Asn Ile Ser Glu Trp Leu Asp Arg Pro Ala Gly Lys His Gly
                        25                  30                  35
            ttt att cgg gcg gaa aat ggg cac ttt gtg aca gat gcc ggg cgg atc 240
            Phe Ile Arg Ala Glu Asn Gly His Phe Val Thr Asp Ala Gly Arg Ile
                    40                  45                  50
            cgg ctg tgg gcc act aac ctc tgt ttt gaa gcc tgc ttc cca acc aag 288
            Arg Leu Trp Ala Thr Asn Leu Cys Phe Glu Ala Cys Phe Pro Thr Lys
                55                  60                  65
            gaa gag gca gaa cgc ctt gcc agg cgt ctc gcc agc ctg ggg atc aat 336
            Glu Glu Ala Glu Arg Leu Ala Arg Arg Leu Ala Ser Leu Gly Ile Asn
            70                  75                  80                  85
            tgt gtg cga atg cat cac atg gac aat cgg cac atc tgg ggt aaa agc 384
            Cys Val Arg Met His His Met Asp Asn Arg His Ile Trp Gly Lys Ser
                            90                  95                  100
            ccc aat aag ctg acg att gat ccc gaa atg ctg gat aag ctg gat tac 432
            Pro Asn Lys Leu Thr Ile Asp Pro Glu Met Leu Asp Lys Leu Asp Tyr
                        105                 110                 115
            ctg att tat caa ttg aaa ttg cac ggg atc tat acc aac ctc aat ctg 480
            Leu Ile Tyr Gln Leu Lys Leu His Gly Ile Tyr Thr Asn Leu Asn Leu
                    120                 125                 130
            cat gtg tcc cgg gag ttt ggc ccg gcc gaa ggc ttt ccc gcg gtg gag 528
            His Val Ser Arg Glu Phe Gly Pro Ala Glu Gly Phe Pro Ala Val Glu
                135                 140                 145
            ggc ctc ccc aac tac gat aaa ggg atc gac aac ttt gaa ccc cgg atg 576
            Gly Leu Pro Asn Tyr Asp Lys Gly Ile Asp Asn Phe Glu Pro Arg Met
            150                 155                 160                 165
            atc gag tac cag aaa aaa tat gcc cgc gat ttg ctc acg cac gtc aat 624
            Ile Glu Tyr Gln Lys Lys Tyr Ala Arg Asp Leu Leu Thr His Val Asn
                            170                 175                 180
            ccc tac acc ggc acg gcg tac atc aac gaa ccg gcc att gcg atg gtc 672
            Pro Tyr Thr Gly Thr Ala Tyr Ile Asn Glu Pro Ala Ile Ala Met Val
                        185                 190                 195
            gaa atc aat aac gaa aat gca gcg ttt gac gag tac cgc aag gga gcg 720
            Glu Ile Asn Asn Glu Asn Ala Ala Phe Asp Glu Tyr Arg Lys Gly Ala
                    200                 205                 210
            ttt gat cat ttg ccc gag ccg tac gcc agc caa ctc cgc aag ctg tgg 768
            Phe Asp His Leu Pro Glu Pro Tyr Ala Ser Gln Leu Arg Lys Leu Trp
                215                 220                 225
            aat gcc tgg ctg aaa aag aaa tac ggc agt gac gac gcg ctt cgc aaa 816
            Asn Ala Trp Leu Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Asp Asp Ala Leu Arg Lys
            230                 235                 240                 245
            gcg tgg aat gcc cag cgt caa ccc ctg ggc gag gaa atc ctg aaa aat 864
            Ala Trp Asn Ala Gln Arg Gln Pro Leu Gly Glu Glu Ile Leu Lys Asn
                            250                 255                 260
            cgt gac ttt tcc ggc cag tgg gaa aag gtg tgg aac ctc cag cgt gac 912
            Arg Asp Phe Ser Gly Gln Trp Glu Lys Val Trp Asn Leu Gln Arg Asp
                        265                 270                 275
            aat ctc tcg gag gtc gtc gcc gag gtc att ccg aat ggc ttt cag ggc 960
            Asn Leu Ser Glu Val Val Ala Glu Val Ile Pro Asn Gly Phe Gln Gly
                    280                 285                 290
            aaa ccc gcc ttg cgt ttg cgc gtc atc cgc aac gga caa gaa acc tgg 1008
            Lys Pro Ala Leu Arg Leu Arg Val Ile Arg Asn Gly Gln Glu Thr Trp
                295                 300                 305
            atc ccc cag tta agc cag ggc ggt ttt tca gtt cag aaa ggt cag gtg 1056
            Ile Pro Gln Leu Ser Gln Gly Gly Phe Ser Val Gln Lys Gly Gln Val
            310                 315                 320                 325
            tac act ctc cga ttc tgg ctg aaa gcg gac aaa ccg ggc cgg atc gac 1104
            Tyr Thr Leu Arg Phe Trp Leu Lys Ala Asp Lys Pro Gly Arg Ile Asp
                            330                 335                 340
            gtg aac tgc atg atg aac cac gat ccc tgg cag cgt ctc ggc ctt tcc 1152
            Val Asn Cys Met Met Asn His Asp Pro Trp Gln Arg Leu Gly Leu Ser
                        345                 350                 355
            gcg gat gtt caa acc tcg gcc gag tgg aag gaa tat cgc ctc agc ttt 1200
            Ala Asp Val Gln Thr Ser Ala Glu Trp Lys Glu Tyr Arg Leu Ser Phe
                    360                 365                 370
            gtg gcg gat cgc gat gat cca aat gcc agg atc acg ttc agc caa ctc 1248
            Val Ala Asp Arg Asp Asp Pro Asn Ala Arg Ile Thr Phe Ser Gln Leu
                375                 380                 385
            cgt ccc ggg acg tac gaa ctg gca gac gtg tca ctc cgg ccg ggt ggg 1296
            Arg Pro Gly Thr Tyr Glu Leu Ala Asp Val Ser Leu Arg Pro Gly Gly
            390                 395                 400                 405
            gtc atc ggc ctg gaa gag ggc caa tcc ctc gcc gat cag acg gtt ccc 1344
            Val Ile Gly Leu Glu Glu Gly Gln Ser Leu Ala Asp Gln Thr Val Pro
                            410                 415                 420
            att gtt cct gct cgc gga ccg caa atg acg gcc gcc gcc cgg gcc gac 1392
            Ile Val Pro Ala Arg Gly Pro Gln Met Thr Ala Ala Ala Arg Ala Asp
                        425                 430                 435
            ttc gca gat ttt ttg tgg gag ctc gaa cgc gac tac tgg tgg gga atg 1440
            Phe Ala Asp Phe Leu Trp Glu Leu Glu Arg Asp Tyr Trp Trp Gly Met
                    440                 445                 450
            tac cga ttt ctg aag gag gaa ctc aag ctg aag ccg ctg gtc gcg gga 1488
            Tyr Arg Phe Leu Lys Glu Glu Leu Lys Leu Lys Pro Leu Val Ala Gly
                455                 460                 465
            acg caa ctc tcc tac agt cca gtt cac att caa gct ggg ctg gac tac 1536
            Thr Gln Leu Ser Tyr Ser Pro Val His Ile Gln Ala Gly Leu Asp Tyr
            470                 475                 480                 485
            atc gac tcg cat gcc tac tgg cag cat ccc gtt ttc ccc ggc agg cca 1584
            Ile Asp Ser His Ala Tyr Trp Gln His Pro Val Phe Pro Gly Arg Pro
                            490                 495                 500
            tgg gat ccg gaa aac tgg tat gtg cgt agt ctg gcc ctc gtg aat cag 1632
            Trp Asp Pro Glu Asn Trp Tyr Val Arg Ser Leu Ala Leu Val Asn Gln
                        505                 510                 515
            ccg gga ggc aca ctt tcc gga ctc gcc agt cgg cgt gtc gaa ggt ttg 1680
            Pro Gly Gly Thr Leu Ser Gly Leu Ala Ser Arg Arg Val Glu Gly Leu
                    520                 525                 530
            ccg ttc acc gtg agc gaa tac aac cac ccg gct ccc aac gaa tac gcc 1728
            Pro Phe Thr Val Ser Glu Tyr Asn His Pro Ala Pro Asn Glu Tyr Ala
                535                 540                 545
            gcc gaa gga ttt ccg atg atc gcg gct ttt ggg gct ttt cag gat tgg 1776
            Ala Glu Gly Phe Pro Met Ile Ala Ala Phe Gly Ala Phe Gln Asp Trp
            550                 555                 560                 565
            gat gga atc ttc agc ttc act tac agc cac agt cga gat tac gag ccg 1824
            Asp Gly Ile Phe Ser Phe Thr Tyr Ser His Ser Arg Asp Tyr Glu Pro
                            570                 575                 580
            cga aaa atc acg ggt ttc ttc gac atc aaa agc gag gtg acc aaa ctc 1872
            Arg Lys Ile Thr Gly Phe Phe Asp Ile Lys Ser Glu Val Thr Lys Leu
                        585                 590                 595
            gtt cac atg ccc gcc tgc gtc gcc atg ttc tac cgg ggt gat gtg caa 1920
            Val His Met Pro Ala Cys Val Ala Met Phe Tyr Arg Gly Asp Val Gln
                    600                 605                 610
            ccc gcc acc cag gct gtg gtc gtg ggc atg acc cgt gaa aag gaa caa 1968
            Pro Ala Thr Gln Ala Val Val Val Gly Met Thr Arg Glu Lys Glu Gln
                615                 620                 625
            tcc atc ctc cga gaa aca ctc aat ccc tgg gcg ctg acc gcc gac cgt 2016
            Ser Ile Leu Arg Glu Thr Leu Asn Pro Trp Ala Leu Thr Ala Asp Arg
            630                 635                 640                 645
            ttg ggt att ccc gcc aac ctg agc ttg ctc cat cgg gtg gcc atg gca 2064
            Leu Gly Ile Pro Ala Asn Leu Ser Leu Leu His Arg Val Ala Met Ala
                            650                 655                 660
            ctg aaa gaa ccc agc gat agt gtg cca cca ccc acg ctg tcc gcg gag 2112
            Leu Lys Glu Pro Ser Asp Ser Val Pro Pro Pro Thr Leu Ser Ala Glu
                        665                 670                 675
            cag aag gtt ttc ctg tcc gat acg caa caa atc tgc tgg gat gtc tct 2160
            Gln Lys Val Phe Leu Ser Asp Thr Gln Gln Ile Cys Trp Asp Val Ser
                    680                 685                 690
            cag ccc ggc gcc ggg gtg ttc ctg gtc aac tcg ccg aaa acg aaa ctc 2208
            Gln Pro Gly Ala Gly Val Phe Leu Val Asn Ser Pro Lys Thr Lys Leu
                695                 700                 705
            gtg acc ggt ttc ccc gcc gga aga act ttc aat ctg aat gga atc cag 2256
            Val Thr Gly Phe Pro Ala Gly Arg Thr Phe Asn Leu Asn Gly Ile Gln
            710                 715                 720                 725
            att cag att gga gaa acg gag ctg ggt tgg gcg acc gtt tcg ctc acc 2304
            Ile Gln Ile Gly Glu Thr Glu Leu Gly Trp Ala Thr Val Ser Leu Thr
                            730                 735                 740
            gtt atc aaa ggg gac gga ttt gat cgg cct ggc cga atc ctc ctc gct 2352
            Val Ile Lys Gly Asp Gly Phe Asp Arg Pro Gly Arg Ile Leu Leu Ala
                        745                 750                 755
            gct acg gga aag gcc caa aat aca ggc tgg gac ttc cgt aaa gag ggc 2400
            Ala Thr Gly Lys Ala Gln Asn Thr Gly Trp Asp Phe Arg Lys Glu Gly
                    760                 765                 770
            gat cgg gtg acc gtg gga cgc cgc tgg ggc gac gag ccg atc ctc tgc 2448
            Asp Arg Val Thr Val Gly Arg Arg Trp Gly Asp Glu Pro Ile Leu Cys
                775                 780                 785
            gaa gga gtg ccg gct cgc atc gtg ctg ccg gtt tcg tcc agc cgc gtg 2496
            Glu Gly Val Pro Ala Arg Ile Val Leu Pro Val Ser Ser Ser Arg Val
            790                 795                 800                 805
            aaa gtc tat gcc ctc gac gag gcg gga cgc cgc agg gac gcg gtg acg 2544
            Lys Val Tyr Ala Leu Asp Glu Ala Gly Arg Arg Arg Asp Ala Val Thr
                            810                 815                 820
            gtt tct ggt ggc gat cag gcc gtt gtc gaa ata ggg ccc caa ttc agg 2592
            Val Ser Gly Gly Asp Gln Ala Val Val Glu Ile Gly Pro Gln Phe Arg
                        825                 830                 835
            acg ctg tgg tac gaa atc gaa atc caa tga 2622
            Thr Leu Trp Tyr Glu Ile Glu Ile Gln
                    840                 845
            <210> 2
            <211> 873
            <212> PRT
            <213> 浮霉狀菌
            <400> 2
            Met Arg Arg Asn Val Ala Phe Asp Cys Ile Leu Ile Leu Leu Leu Gly
                    -25                 -20                 -15
            Leu Leu Cys Phe Gly Ala Thr Pro Ser Arg Gly Glu Glu Thr Ala Thr
                -10                 -5              -1  1               5
            Pro Gly Lys Leu Phe Pro Phe Val Leu Ser Tyr Glu Pro Thr Asp Ser
                            10                  15                  20
            Ile Thr Asn Ile Ser Glu Trp Leu Asp Arg Pro Ala Gly Lys His Gly
                        25                  30                  35
            Phe Ile Arg Ala Glu Asn Gly His Phe Val Thr Asp Ala Gly Arg Ile
                    40                  45                  50
            Arg Leu Trp Ala Thr Asn Leu Cys Phe Glu Ala Cys Phe Pro Thr Lys
                55                  60                  65
            Glu Glu Ala Glu Arg Leu Ala Arg Arg Leu Ala Ser Leu Gly Ile Asn
            70                  75                  80                  85
            Cys Val Arg Met His His Met Asp Asn Arg His Ile Trp Gly Lys Ser
                            90                  95                  100
            Pro Asn Lys Leu Thr Ile Asp Pro Glu Met Leu Asp Lys Leu Asp Tyr
                        105                 110                 115
            Leu Ile Tyr Gln Leu Lys Leu His Gly Ile Tyr Thr Asn Leu Asn Leu
                    120                 125                 130
            His Val Ser Arg Glu Phe Gly Pro Ala Glu Gly Phe Pro Ala Val Glu
                135                 140                 145
            Gly Leu Pro Asn Tyr Asp Lys Gly Ile Asp Asn Phe Glu Pro Arg Met
            150                 155                 160                 165
            Ile Glu Tyr Gln Lys Lys Tyr Ala Arg Asp Leu Leu Thr His Val Asn
                            170                 175                 180
            Pro Tyr Thr Gly Thr Ala Tyr Ile Asn Glu Pro Ala Ile Ala Met Val
                        185                 190                 195
            Glu Ile Asn Asn Glu Asn Ala Ala Phe Asp Glu Tyr Arg Lys Gly Ala
                    200                 205                 210
            Phe Asp His Leu Pro Glu Pro Tyr Ala Ser Gln Leu Arg Lys Leu Trp
                215                 220                 225
            Asn Ala Trp Leu Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Asp Asp Ala Leu Arg Lys
            230                 235                 240                 245
            Ala Trp Asn Ala Gln Arg Gln Pro Leu Gly Glu Glu Ile Leu Lys Asn
                            250                 255                 260
            Arg Asp Phe Ser Gly Gln Trp Glu Lys Val Trp Asn Leu Gln Arg Asp
                        265                 270                 275
            Asn Leu Ser Glu Val Val Ala Glu Val Ile Pro Asn Gly Phe Gln Gly
                    280                 285                 290
            Lys Pro Ala Leu Arg Leu Arg Val Ile Arg Asn Gly Gln Glu Thr Trp
                295                 300                 305
            Ile Pro Gln Leu Ser Gln Gly Gly Phe Ser Val Gln Lys Gly Gln Val
            310                 315                 320                 325
            Tyr Thr Leu Arg Phe Trp Leu Lys Ala Asp Lys Pro Gly Arg Ile Asp
                            330                 335                 340
            Val Asn Cys Met Met Asn His Asp Pro Trp Gln Arg Leu Gly Leu Ser
                        345                 350                 355
            Ala Asp Val Gln Thr Ser Ala Glu Trp Lys Glu Tyr Arg Leu Ser Phe
                    360                 365                 370
            Val Ala Asp Arg Asp Asp Pro Asn Ala Arg Ile Thr Phe Ser Gln Leu
                375                 380                 385
            Arg Pro Gly Thr Tyr Glu Leu Ala Asp Val Ser Leu Arg Pro Gly Gly
            390                 395                 400                 405
            Val Ile Gly Leu Glu Glu Gly Gln Ser Leu Ala Asp Gln Thr Val Pro
                            410                 415                 420
            Ile Val Pro Ala Arg Gly Pro Gln Met Thr Ala Ala Ala Arg Ala Asp
                        425                 430                 435
            Phe Ala Asp Phe Leu Trp Glu Leu Glu Arg Asp Tyr Trp Trp Gly Met
                    440                 445                 450
            Tyr Arg Phe Leu Lys Glu Glu Leu Lys Leu Lys Pro Leu Val Ala Gly
                455                 460                 465
            Thr Gln Leu Ser Tyr Ser Pro Val His Ile Gln Ala Gly Leu Asp Tyr
            470                 475                 480                 485
            Ile Asp Ser His Ala Tyr Trp Gln His Pro Val Phe Pro Gly Arg Pro
                            490                 495                 500
            Trp Asp Pro Glu Asn Trp Tyr Val Arg Ser Leu Ala Leu Val Asn Gln
                        505                 510                 515
            Pro Gly Gly Thr Leu Ser Gly Leu Ala Ser Arg Arg Val Glu Gly Leu
                    520                 525                 530
            Pro Phe Thr Val Ser Glu Tyr Asn His Pro Ala Pro Asn Glu Tyr Ala
                535                 540                 545
            Ala Glu Gly Phe Pro Met Ile Ala Ala Phe Gly Ala Phe Gln Asp Trp
            550                 555                 560                 565
            Asp Gly Ile Phe Ser Phe Thr Tyr Ser His Ser Arg Asp Tyr Glu Pro
                            570                 575                 580
            Arg Lys Ile Thr Gly Phe Phe Asp Ile Lys Ser Glu Val Thr Lys Leu
                        585                 590                 595
            Val His Met Pro Ala Cys Val Ala Met Phe Tyr Arg Gly Asp Val Gln
                    600                 605                 610
            Pro Ala Thr Gln Ala Val Val Val Gly Met Thr Arg Glu Lys Glu Gln
                615                 620                 625
            Ser Ile Leu Arg Glu Thr Leu Asn Pro Trp Ala Leu Thr Ala Asp Arg
            630                 635                 640                 645
            Leu Gly Ile Pro Ala Asn Leu Ser Leu Leu His Arg Val Ala Met Ala
                            650                 655                 660
            Leu Lys Glu Pro Ser Asp Ser Val Pro Pro Pro Thr Leu Ser Ala Glu
                        665                 670                 675
            Gln Lys Val Phe Leu Ser Asp Thr Gln Gln Ile Cys Trp Asp Val Ser
                    680                 685                 690
            Gln Pro Gly Ala Gly Val Phe Leu Val Asn Ser Pro Lys Thr Lys Leu
                695                 700                 705
            Val Thr Gly Phe Pro Ala Gly Arg Thr Phe Asn Leu Asn Gly Ile Gln
            710                 715                 720                 725
            Ile Gln Ile Gly Glu Thr Glu Leu Gly Trp Ala Thr Val Ser Leu Thr
                            730                 735                 740
            Val Ile Lys Gly Asp Gly Phe Asp Arg Pro Gly Arg Ile Leu Leu Ala
                        745                 750                 755
            Ala Thr Gly Lys Ala Gln Asn Thr Gly Trp Asp Phe Arg Lys Glu Gly
                    760                 765                 770
            Asp Arg Val Thr Val Gly Arg Arg Trp Gly Asp Glu Pro Ile Leu Cys
                775                 780                 785
            Glu Gly Val Pro Ala Arg Ile Val Leu Pro Val Ser Ser Ser Arg Val
            790                 795                 800                 805
            Lys Val Tyr Ala Leu Asp Glu Ala Gly Arg Arg Arg Asp Ala Val Thr
                            810                 815                 820
            Val Ser Gly Gly Asp Gln Ala Val Val Glu Ile Gly Pro Gln Phe Arg
                        825                 830                 835
            Thr Leu Trp Tyr Glu Ile Glu Ile Gln
                    840                 845
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
            當前第1頁1 2 3 
            
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
                        網友詢問留言
                        已有0條留言
                    
            
                    
            
                        
            
                            
                            
              

                                								

						

            • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊！
              • 


                            
            
                        
            
                        
            
                         1 
                    
            
                        
                        
            
                            
            
                              
                            
            
                            
                        
            
                    
            
                
            
            
            
            
            
                
                     
            
            
          
            
      
            
    
            
      

        

  
婷婷六月激情在线综合激情,亚洲国产大片,久久中文字幕综合婷婷,精品久久久久久中文字幕,亚洲一区二区三区高清不卡,99国产精品热久久久久久夜夜嗨
,欧美日韩亚洲综合在线一区二区,99国产精品电影,伊人精品线视天天综合,精品伊人久久久大香线蕉欧美

            

亚洲精品1区
国产成人一级
91精品国产欧美一区二区
亚洲精品乱码久久久久久下载
国产精品久久久久久久伊一
九色国产
国产精品九九视频
伊人久久成人爱综合网
欧美日韩亚洲区久久综合
欧美日本一道免费一区三区
夜夜爽一区二区三区精品
欧美日韩高清一区二区三区
国产成人av在线
国产精品对白交换绿帽视频
国产视频亚洲
国产在线欧美精品
国产精品综合网
国产日韩精品欧美一区色
国产日韩精品欧美一区喷
欧美日韩在线观看区一二
国产区精品
欧美视频日韩视频
中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97
视频一二三区
欧美高清在线精品一区二区不卡
国产精品揄拍一区二区久久
99久久综合狠狠综合久久aⅴ
亚洲乱码视频在线观看
日韩在线第二页
亚洲精品无码专区在线播放
成人亚洲网站www在线观看
欧美三级一区二区
99久久精品免费看国产高清
91麻豆国产在线观看
最新日韩欧美不卡一二三区
成人在线观看不卡
日韩国产在线
在线亚洲精品
亚洲午夜久久久久中文字幕
国产精品成人久久久久久久
精品国产一区二区在线观看
欧美精品国产一区二区三区
中文在线播放
亚洲第一页在线视频
国产午夜精品福利久久
九色国产
精品国产九九
国产永久视频
久久精品人人做人人综合试看
国产一区二区三区免费观看
亚洲精品国产电影
9999热视频
国产精品资源在线
麻豆久久婷婷国产综合五月
国产精品免费一级在线观看
亚洲国产一区二区三区青草影视
中文在线播放
国产成人综合在线
国产在线观看色
国产亚洲三级
国产片一区二区三区
久久99精品久久久久久牛牛影视
亚洲欧美日韩国产
四虎永久免费网站
国产一毛片
国产精品视频在
九九热在线精品
99精品福利视频
色婷婷色99国产综合精品
97成人精品视频在线播放
精品久久久久久中文字幕
亚洲欧美一区二区三区孕妇
亚洲欧美成人网
日韩高清在线二区
国产尤物在线观看
在线不卡一区二区
91网站在线看
韩国精品福利一区二区
欧美日韩国产成人精品
99热精品久久
国产精品免费视频一区
高清视频一区
精品九九久久
欧美日韩在线观看免费
91欧美激情一区二区三区成人
99福利视频
亚洲国产精品91
久热国产在线
精品久久久久久中文字幕女
国产精品久久久久久久久99热
成人自拍视频网
国产精品视频久久久久久
久久影院国产
国产玖玖在线观看
99精品在线免费
亚洲欧美一区二区三区导航
久久久久久久综合
国产欧美日韩精品高清二区综合区
国产精品视频自拍
亚洲一级片免费
久久久久久九九
国产欧美自拍视频
视频一区二区在线观看
欧美日韩一区二区三区久久
中文在线亚洲
伊人热人久久中文字幕
日韩欧美亚洲国产一区二区三区
欧美亚洲国产成人高清在线
欧美日韩国产码高清综合人成
国产性大片免费播放网站
亚洲午夜综合网
91精品久久一区二区三区
国产无套在线播放
国产精品视频网站
国产成人亚洲精品老王
91在线网站
国产视频97
欧美黑人欧美精品刺激
国产一区二区三区免费在线视频
久久久国产精品免费看
99re6久精品国产首页
久久精品91
国产成人一级
国产成人精品曰本亚洲
日本福利在线观看
伊人成综合网
久久综合一本
国产综合久久久久久
久久精品成人免费看
久久福利
91精品国产91久久久久久麻豆
亚洲精品成人在线
亚洲伊人久久精品
欧美日本二区
国产永久视频
国产一区二
一区二区福利
国产一毛片
亚洲精品1区
毛片一区二区三区
伊人久久大香线蕉综合影
国产欧美在线观看一区
亚洲国产欧洲综合997久久
国产一区二区免费视频
国产91精品对白露脸全集观看
久久亚洲国产伦理
欧美成人伊人久久综合网
亚洲性久久久影院
久久99国产精一区二区三区!
91精品国产欧美一区二区
欧美日韩亚洲区久久综合
日韩精品一二三区
久久久夜色精品国产噜噜
国产在线精品福利91香蕉
久久久久久久亚洲精品
97se色综合一区二区二区
91国语精品自产拍在线观看性色
91久久国产综合精品女同我
日韩中文字幕a
国产成人亚洲日本精品
久久国产精品-国产精品
久久国产经典视频
久久国产精品伦理
亚洲第一页在线视频
国产精品久久久久三级
日韩毛片网
久久免费高清视频
麻豆国产在线观看一区二区
91麻豆国产福利在线观看
国产成人精品男人的天堂538
一区二区三区中文字幕
免费在线视频一区
欧美日韩国产成人精品
国产综合网站
国产资源免费观看
亚洲精品亚洲人成在线播放
精品久久久久久中文字幕专区
亚洲人成人毛片无遮挡
国产一起色一起爱
国产香蕉精品视频在
九九热免费观看
日韩亚洲欧美一区
九九热精品在线观看
精品久久久久久中文字幕专区
亚洲欧美自拍偷拍
国产精品每日更新
久久久久国产一级毛片高清板
久久天天躁狠狠躁夜夜中文字幕
久久精品片
日韩在线毛片
国产成人精品本亚洲
国产成人精品一区二区三区
九九热在线观看
国产r级在线观看
国产欧美日韩精品高清二区综合区
韩国电影一区二区
国产精品毛片va一区二区三区
五月婷婷伊人网
久久一区二区三区免费
一本色道久久综合狠狠躁篇
亚洲综合色站
国产尤物在线观看
亚洲一区亚洲二区
免费在线视频一区
欧洲精品视频在线观看
日韩中文字幕a
中文字幕日本在线mv视频精品
91精品在线免费视频
精品国产免费人成在线观看
精品a级片
中文字幕日本在线mv视频精品
日韩在线精品视频
婷婷丁香色
91精品国产高清久久久久
国产成人精品日本亚洲直接
五月综合视频
欧美日韩在线亚洲国产人
精液呈暗黄色
亚洲乱码一区
久久精品中文字幕不卡一二区
亚洲天堂精品在线
激情婷婷综合
国产免费久久精品久久久
国产精品亚洲二区在线
久久免费播放视频
五月婷婷丁香综合
在线亚洲欧美日韩
久久免费精品高清麻豆
精品久久久久久中文字幕
亚洲一区网站
国产精品福利社
日韩中文字幕免费
亚洲综合丝袜
91精品在线播放
国产精品18
亚洲日日夜夜
伊人久久大香线蕉综合影
亚洲精品中文字幕乱码影院
亚洲一区二区黄色
亚洲第一页在线视频
一区二区在线观看视频
国产成人福利精品视频
亚洲高清二区
国内成人免费视频
精品亚洲性xxx久久久
国产精品合集一区二区三区
97av免费视频
国产一起色一起爱
国产区久久
国产资源免费观看
99精品视频免费
国产成人一级
国产精品九九免费视频
欧美91精品久久久久网免费
99热国产免费
久久精品色
98精品国产综合久久
久久精品播放
中文字幕视频免费
国产欧美日韩一区二区三区在线
精品久久蜜桃
国产小视频精品
一本色道久久综合狠狠躁篇
91在线免费观看
亚洲精品区
伊人成综合网
伊人热人久久中文字幕
伊人黄色片
99国产精品热久久久久久夜夜嗨
久久免费精品视频
亚洲一区二区三区高清不卡
久久久久国产一级毛片高清板
国产片一区二区三区
久久狠狠干
99久久婷婷国产综合精品电影
国产99区
国产精品成人久久久久
久久狠狠干
青青国产在线观看
亚洲高清国产拍精品影院
国产精品一区二区av
九九热在线免费视频
伊人久久国产
国产精品久久久久久久久久一区
在线观看免费视频一区
国产精品自在在线午夜区app
国产精品综合色区在线观看
国产毛片久久久久久国产毛片
97国产免费全部免费观看
国产精品每日更新
国产尤物视频在线
九九视频这里只有精品99
一本一道久久a久久精品综合
久久综合给会久久狠狠狠
国产成人精品男人的天堂538
欧美一区二区高清
毛片一区二区三区
国产欧美日韩在线观看一区二区三区
在线国产二区
欧美不卡网
91在线精品中文字幕
在线国产福利
国内精品91久久久久
91亚洲福利
日韩欧美国产中文字幕
91久久精品国产性色也91久久
亚洲性久久久影院
欧美精品1区
国产热re99久久6国产精品
九九热免费观看
国产精品欧美日韩
久久久久国产一级毛片高清板
久久国产经典视频
日韩欧美亚洲国产一区二区三区
欧美亚洲综合另类在线观看
国产精品自在在线午夜区app
97中文字幕在线观看
视频一二三区
精品国产一区在线观看
国产欧美日韩在线一区二区不卡
欧美一区二三区
伊人成人在线观看
国内精品91久久久久
97在线亚洲
国产在线不卡一区
久久久全免费全集一级全黄片
国产精品v欧美精品∨日韩
亚洲毛片网站
在线不卡一区二区
99re热在线视频
久久激情网
国产毛片一区二区三区精品
久久亚洲综合色
中文字幕视频免费
国产视频亚洲
婷婷伊人久久
国产一区二区免费播放
久久99国产精品成人欧美
99国产在线视频
国产成人免费视频精品一区二区
国产不卡一区二区三区免费视
国产码欧美日韩高清综合一区
久久精品国产主播一区二区
国产一区电影
久久精品国产夜色
国产精品国产三级国产
日韩一区二区三区在线
久久97久久97精品免视看
久久国产免费一区二区三区
伊人久久大香线蕉综合电影网
99re6久精品国产首页
久久激情网
亚洲成人高清在线
国产精品网址
国产成人精品男人的天堂538
香蕉国产综合久久猫咪
国产专区中文字幕
91麻豆精品国产高清在线
久久国产经典视频
国产精品成人va在线观看
国产精品爱啪在线线免费观看
日本精品久久久久久久久免费
亚洲综合一区二区三区
久久五月网
精品国产网红福利在线观看
久久综合亚洲伊人色
亚洲国产精品久久久久久网站
在线日韩国产
99国产精品热久久久久久夜夜嗨
国产综合精品在线
国产区福利
精品亚洲综合久久中文字幕
国产制服丝袜在线
毛片在线播放网站
在线观看免费视频一区
国产精品久久久精品三级
亚洲国产电影在线观看
最新日韩欧美不卡一二三区
狠狠综合久久综合鬼色
日本精品1在线区
国产日韩一区二区三区在线播放
欧美日韩精品在线播放
亚洲欧美日韩国产一区二区三区精品
久久综合久久网
婷婷六月激情在线综合激情
亚洲乱码一区
国产专区91
97av视频在线观看
精品久久久久久中文字幕
久久五月视频
国产成人福利精品视频
国产精品网址
中文字幕视频在线
精品一区二区三区免费视频
伊人手机在线视频
亚洲精品中文字幕乱码
国产在线视频www色
色噜噜国产精品视频一区二区
精品亚洲成a人在线观看
国产香蕉尹人综合在线
成人免费一区二区三区在线观看
国产不卡一区二区三区免费视
欧美精品久久天天躁
国产专区中文字幕
久久精品国产免费中文
久久精品国产免费一区
久久无码精品一区二区三区
国产欧美另类久久久精品免费
欧美精品久久天天躁
亚洲精品在线视频
国产视频91在线
91精品福利一区二区三区野战
日韩中文字幕免费
国产精品99一区二区三区
欧美成人高清性色生活
国产精品系列在线观看
亚洲国产福利精品一区二区
国产成人在线小视频
国产精品久久久久免费
99re热在线视频
久久久久久久综合
一区二区国产在线播放
成人国产在线视频
亚洲精品乱码久久久久
欧美日韩一区二区综合
精品久久久久免费极品大片
中文字幕视频二区
激情粉嫩精品国产尤物
国产成人精品一区二区视频
久久精品中文字幕首页
亚洲高清在线
国产精品亚洲一区二区三区
伊人久久艹
中文在线亚洲
国产精品一区二区在线播放
国产精品九九免费视频
亚洲二区在线播放
亚洲狠狠婷婷综合久久久久网站
亚洲欧美日韩网站
日韩成人精品
亚洲国产一区二区三区青草影视
91精品国产福利在线观看
国产精品久久久久久久久99热
国产一区二区精品尤物
久碰香蕉精品视频在线观看
亚洲日日夜夜
在线不卡一区二区
国产午夜亚洲精品
九九热在线视频观看这里只有精品
伊人手机在线视频
91免费国产精品
日韩欧美中字
91精品国产91久久久久
国产全黄三级播放
视频一区二区三区免费观看
国产开裆丝袜高跟在线观看
国产成人欧美
激情综合丝袜美女一区二区
国产成人亚洲综合无
欧美精品一区二区三区免费观看
欧美亚洲国产日韩
日韩亚州
国产欧美日韩精品高清二区综合区
亚洲午夜国产片在线观看
精品久久久久久中文字幕
欧美精品1区
久久伊人久久亚洲综合
亚洲欧美日韩精品
国产成人精品久久亚洲高清不卡
久久福利影视
国产精品99精品久久免费
久久久久免费精品视频
国产日产亚洲精品
亚洲国产午夜电影在线入口
精品无码一区在线观看
午夜国产精品视频
亚洲一级片免费
伊人久久大香线蕉综合影
国产精品久久影院
久碰香蕉精品视频在线观看
www.欧美精品
在线小视频国产
亚洲国产天堂久久综合图区
欧美一区二区三区不卡
日韩美女福利视频
九九精品免视频国产成人
不卡国产00高中生在线视频
亚洲第一页在线视频
欧美日韩在线播放成人
99re视频这里只有精品
国产精品91在线
精品乱码一区二区三区在线
国产区久久
91麻豆精品国产自产在线观看一区
日韩精品成人在线
九九热在线观看
国产精品久久不卡日韩美女
欧美一区二区三区综合色视频
欧美精品免费一区欧美久久优播
国产精品网址
国产专区中文字幕
国产精品欧美亚洲韩国日本久久
日韩美香港a一级毛片
久久精品123
欧美一区二区三区免费看
99r在线视频
亚洲精品国产字幕久久vr
国产综合激情在线亚洲第一页
91免费国产精品
日韩免费小视频
亚洲国产精品综合一区在线
国产亚洲第一伦理第一区
在线亚洲精品
国产精品一区二区制服丝袜
国产在线成人精品
九九精品免视频国产成人
亚洲国产网
欧美日韩亚洲一区二区三区在线观看
在线亚洲精品
欧美一区二区三区高清视频
国产成人精品男人的天堂538
欧美日韩在线观看区一二
亚洲欧美一区二区久久
久久精品中文字幕首页
日本高清www午夜视频
久久精品国产免费
久久999精品
亚洲国产精品欧美综合
88国产精品视频一区二区三区
91久久偷偷做嫩草影院免费看
国产精品夜色视频一区二区
欧美日韩导航
国产成人啪精品午夜在线播放
一区二区视频在线免费观看
99久久精品国产自免费
精液呈暗黄色
久久99国产精品
日本精品久久久久久久久免费
精品国产97在线观看
99re视频这里只有精品
国产视频91在线
999av视频
亚洲美女视频一区二区三区
久久97久久97精品免视看
亚洲国产成人久久三区
99久久亚洲国产高清观看
日韩毛片在线视频
综合激情在线
91福利一区二区在线观看
一区二区视频在线免费观看
激情粉嫩精品国产尤物
国产成人精品曰本亚洲78
国产成人精品本亚洲
国产精品成人免费视频
国产成人啪精品视频免费软件
久久精品国产亚洲妲己影院
国产精品成人久久久久久久
久久大香线蕉综合爱
欧美一区二区三区高清视频
99热国产免费
在线观看欧美国产
91精品视频在线播放
国产精品福利社
欧美精品一区二区三区免费观看
国产一区二区免费视频
国产午夜精品一区二区
精品视频在线观看97
91精品福利久久久
国产一区福利
国产综合激情在线亚洲第一页
国产精品久久久久久久久久久不卡
九色国产
在线日韩国产
黄网在线观看
亚洲一区小说区中文字幕
中文字幕丝袜
日本二区在线观看
日本国产一区在线观看
欧美日韩一区二区三区久久
欧美精品亚洲精品日韩专
国产日产亚洲精品
久久综合九色综合欧美播
亚洲国产欧美无圣光一区
欧美视频区
亚洲乱码视频在线观看
久久无码精品一区二区三区
九九热精品免费视频
久久99精品久久久久久牛牛影视
国产精品成久久久久三级
国产一区福利
午夜国产精品视频
日本二区在线观看
99久久网站
国产亚洲天堂
精品国产一区二区三区不卡
亚洲国产日韩在线一区
国产成人综合在线观看网站
久久免费高清视频
欧美在线导航
午夜精品久久久久久99热7777
欧美久久综合网
国产小视频精品
国产尤物在线观看
亚洲国产精品综合一区在线
欧美一区二区三区不卡视频
欧美黑人欧美精品刺激
日本福利在线观看
久久国产偷
国产手机精品一区二区
国产热re99久久6国产精品
国产高清啪啪
欧美亚洲国产成人高清在线
国产在线第三页
亚洲综合一区二区三区
99r在线视频
99精品久久久久久久婷婷
国产精品乱码免费一区二区
国产在线精品福利91香蕉
国产尤物视频在线
五月婷婷亚洲
中文字幕久久综合伊人
亚洲精品一级毛片
99国产精品电影
在线视频第一页
久久99国产精品成人欧美
国产白白视频在线观看2
成人精品一区二区www
亚洲成人网在线观看
麻豆91在线视频
色综合合久久天天综合绕视看
久久精品国产免费高清
国产不卡一区二区三区免费视
欧美国产中文
99精品欧美
九九在线精品
国产中文字幕在线免费观看
国产一区中文字幕在线观看
国产成人一级
国产精品一区二区制服丝袜
国产一起色一起爱
亚洲精品成人在线
亚洲欧美精品在线
国产欧美自拍视频
99精品久久久久久久婷婷
久99视频
国产热re99久久6国产精品
视频一区亚洲
国产精品视频分类
国产精品成在线观看
99re6久精品国产首页
亚洲在成人网在线看
亚洲国产日韩在线一区
久久国产三级
日韩国产欧美
欧美在线一区二区三区
国产精品美女一级在线观看
成人午夜免费福利视频
亚洲天堂精品在线
91精品国产手机
欧美日韩视频在线播放
狠狠综合久久综合鬼色
九一色视频
青青视频国产
亚洲欧美自拍一区
中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97
日韩免费大片
996热视频
伊人成综合网
亚洲天堂欧美
日韩精品亚洲人成在线观看
久久综合给会久久狠狠狠
日韩精品亚洲人成在线观看
日韩国产欧美
亚洲成aⅴ人片在线影院八
亚洲精品1区
99久久精品免费
国产精品高清在线观看
国产精品久久久免费视频
在线亚洲欧美日韩
91在线看视频
国产精品96久久久久久久
欧美日韩国产成人精品
91在线亚洲
热久久亚洲
国产精品美女免费视频观看
日韩在线毛片
亚洲永久免费视频
九九免费在线视频
亚洲一区网站
日本高清二区视频久二区
精品国产美女福利在线
伊人久久艹
国产精品久久久久三级
欧美成人精品第一区二区三区
99久久精品国产自免费
在线观看日韩一区
国产中文字幕一区
成人免费午夜视频
欧美日韩另类在线
久久99国产精品成人欧美
色婷婷中文网
久久天天躁夜夜躁狠狠躁2020
欧美成人伊人久久综合网
国产精品福利资源在线
国产伦精品一区二区三区高清
国产精品亚洲综合色区韩国
亚洲一区欧美日韩
色综合视频
国语自产精品视频在线区
国产高清a
成人国内精品久久久久影
国产在线精品香蕉综合网一区
国产不卡在线看
国产成人精品精品欧美
国产欧美日韩综合精品一区二区三区
韩国电影一区二区
国产在线视频www色
91中文字幕在线一区
国产人成午夜免视频网站
亚洲综合一区二区三区
色综合视频一区二区观看
久久五月网
九九热精品在线观看
国产一区二区三区国产精品
99久热re在线精品996热视频
亚洲国产网
在线视频亚洲一区
日韩字幕一中文在线综合
国产高清一级毛片在线不卡
精品国产色在线
国产高清视频一区二区
精品日本久久久久久久久久
亚洲国产午夜精品乱码
成人免费国产gav视频在线
日韩欧美一区二区在线观看
欧美曰批人成在线观看
韩国电影一区二区
99re这里只有精品6
日韩精品一区二区三区视频
99re6久精品国产首页
亚洲欧美一区二区三区导航
欧美色图一区二区三区
午夜精品视频在线观看
欧美激情在线观看一区二区三区
亚洲热在线
成人国产精品一区二区网站
亚洲一级毛片在线播放
亚洲一区小说区中文字幕
亚洲午夜久久久久影院
国产自产v一区二区三区c
国产精品视频免费
久久调教视频
国产成人91激情在线播放
国产精品欧美亚洲韩国日本久久
久久亚洲日本不卡一区二区
91中文字幕网
成人国产在线视频
国产视频91在线
欧美成人精品第一区二区三区
国产精品福利在线
久久综合九色综合精品
欧美一区二区三区精品
久久国产综合尤物免费观看
久久99青青久久99久久
日韩精品免费
久久国产精品999
91亚洲视频在线观看
国产精品igao视频
色综合区
在线亚洲欧国产精品专区
国产一区二区三区在线观看视频
亚洲精品成人在线
一区二区国产在线播放
中文在线亚洲
亚洲精品第一国产综合野
国产一区二区精品久久
一区二区三区四区精品视频
99热精品久久
中文字幕视频二区
国产成人精品男人的天堂538
99精品影视
美女福利视频一区二区
久久午夜夜伦伦鲁鲁片
综合久久久久久久综合网
国产精品国产欧美综合一区
国产99视频在线观看
国产亚洲女在线精品
婷婷影院在线综合免费视频
国产亚洲3p一区二区三区
91成人爽a毛片一区二区
亚洲一区二区高清
国产欧美亚洲精品第二区首页
欧美日韩导航
亚洲高清二区
欧美激情观看一区二区久久
日韩毛片在线播放
亚洲欧美日韩高清中文在线
亚洲日本在线播放
国产精品一区二区制服丝袜
精品国产一区二区三区不卡
国产不卡在线看
国产欧美网站
四虎永久在线观看视频精品
国产黄色片在线观看
夜夜综合
一本色道久久综合狠狠躁篇
欧美亚洲综合另类在线观看
国产91在线看
伊人久久国产
欧美一区二区在线观看免费网站
国产精品久久久久三级
久久福利
日韩中文字幕a
亚洲午夜久久久久影院
91在线高清视频
国产亚洲一区二区三区啪
久久人精品
国产精品亚洲午夜一区二区三区
综合久久久久久
久久伊人一区二区三区四区
国产综合久久久久久
日韩一区精品视频在线看
国产精品日韩欧美制服
日本精品1在线区
99re视频
无码av免费一区二区三区试看
国产视频1区
日韩欧美中文字幕一区
日本高清中文字幕一区二区三区a
亚洲国产欧美无圣光一区
国产在线视频一区二区三区
欧美国产第一页
在线亚洲欧美日韩
日韩中文字幕第一页
在线不卡一区二区
伊人久久青青
国产精品一区二区在线播放
www.五月婷婷
麻豆久久婷婷国产综合五月
亚洲精品区
久久国产欧美另类久久久
99在线视频免费
伊人久久中文字幕久久cm
久久精品成人免费看
久久这里只有精品首页
88国产精品视频一区二区三区
中文字幕日本在线mv视频精品
国产在线精品成人一区二区三区
伊人精品线视天天综合
亚洲一区二区黄色
国产尤物视频在线
亚洲精品99久久久久中文字幕
国产一区二区三区免费观看
伊人久久大香线蕉综合电影网
国产成人精品区在线观看
日本精品一区二区三区视频
日韩高清在线二区
久久免费播放视频
一区二区成人国产精品
国产精品免费精品自在线观看
亚洲精品视频二区
麻豆国产精品有码在线观看
精品日本一区二区
亚洲欧洲久久
久久中文字幕综合婷婷
中文字幕视频在线
国产成人精品综合在线观看
91精品国产91久久久久福利
精液呈暗黄色
香蕉国产综合久久猫咪
国产专区精品
亚洲精品无码不卡
国产永久视频
亚洲成a人片在线播放观看国产
一区二区国产在线播放
亚洲一区二区黄色
欧美日韩在线观看视频
亚洲精品另类
久久国产综合尤物免费观看
国产一区二区三区国产精品
高清视频一区
国产精品igao视频
国产精品资源在线
久久综合精品国产一区二区三区
www.五月婷婷
精品色综合
99热国产免费
麻豆福利影院
亚洲伊人久久大香线蕉苏妲己
久久电影院久久国产
久久精品伊人
在线日韩理论午夜中文电影
亚洲国产欧洲综合997久久
伊人国产精品
久草国产精品
欧美一区精品二区三区
亚洲成人高清在线
91免费国产精品
日韩精品福利在线
国产一线在线观看
国产不卡在线看
久久99青青久久99久久
亚洲精品亚洲人成在线播放
99久久免费看国产精品
国产日本在线观看
青草国产在线视频
麻豆久久婷婷国产综合五月
国产中文字幕一区
91久久精品国产性色也91久久
国产一区a
国产欧美日韩成人
国产亚洲女在线精品
一区二区美女
中文字幕在线2021一区
在线小视频国产
久久这里只有精品首页
国产在线第三页
欧美日韩中文字幕
在线亚洲+欧美+日本专区
精品国产一区二区三区不卡
久久这里精品
欧美在线va在线播放
精液呈暗黄色
91精品国产手机
91在线免费播放
欧美视频亚洲色图
欧美国产日韩精品
日韩高清不卡在线
精品视频免费观看
欧美日韩一区二区三区四区
国产欧美亚洲精品第二区首页
亚洲韩精品欧美一区二区三区
国产精品视频免费
在线精品小视频
久久午夜夜伦伦鲁鲁片
国产无套在线播放
久热这里只精品99re8久
欧美久久久久
久久香蕉国产线看观看精品蕉
国产成人精品男人的天堂538
亚洲人成网站色7799在线观看
日韩在线第二页
一本色道久久综合狠狠躁篇
国产一区二区三区不卡在线观看
亚洲乱码在线
在线观看欧美国产
久久福利青草精品资源站免费
国产玖玖在线观看
在线亚洲精品
亚洲成aⅴ人在线观看
精品91在线
欧美一区二三区
日韩中文字幕视频在线
日本成人一区二区
日韩免费专区
国内精品在线观看视频
久久国产综合尤物免费观看
国产精品系列在线观看
一本一道久久a久久精品综合
亚洲免费播放
久久精品国产免费
久久人精品
亚洲毛片网站
亚洲成a人一区二区三区
韩国福利一区二区三区高清视频
亚洲精品天堂在线
一区二区三区中文字幕
亚洲国产色婷婷精品综合在线观看
亚洲国产成人久久笫一页
999国产视频
国产精品香港三级在线电影
欧美日韩一区二区三区四区
日韩国产欧美
国产精品99一区二区三区
午夜国产精品理论片久久影院
亚洲精品中文字幕麻豆
亚洲国产高清视频
久久免费手机视频
日韩a在线观看
五月婷婷亚洲
亚洲精品中文字幕麻豆
中文字幕丝袜
www国产精品
亚洲天堂精品在线
亚洲乱码一区
国产日韩欧美三级
久久999精品
伊人热人久久中文字幕
久热国产在线视频
国产欧美日韩在线观看一区二区三区
国产一二三区在线
日韩国产欧美
91精品国产91久久久久
亚洲一区小说区中文字幕
精品一区二区免费视频
国产精品视频免费
国产精品亚洲综合色区韩国
亚洲国产精品成人午夜在线观看
欧美国产日韩精品
中文字幕精品一区二区精品