使用基于膜的細胞截留系統增強重組蛋白的表達的制作方法

本申請基于2014年2月17日提交的US 61/940,493，并要求其優先權。

技術領域

已經使用細胞培養程序來生產重組蛋白，按分批或者按照連續的(灌注)模式來操作所述細胞培養程序。因為相較于分批模式的操作而言，灌注模式能夠維持更高的細胞密度，因此灌注模式產生更高的體積產量(每體積每天所產生的產物量)。

背景技術：

在工業中，灌注操作已被用來生產重組生物制品，比如單克隆抗體、血液因子包括凝血蛋白、酶和其他治療性蛋白。對于使用灌注系統的主要驅動在于在生物反應器中保留細胞，從而顯著提高了每體積生物反應器所生產的產物量。市場上有多種類型的細胞截留裝置，已成功實現了實驗室和商業規模的生產。據我們所知，盡管在文獻中已證實了細胞密度的增加，卻未曾報道過由于采用了外部細胞截留膜的灌注系統對細胞生產率的提高。

這方面值得注意的兩篇文獻是：1)S.S.Ozturk和D.S.Kompala,Optimization of High cell Density Perfusion Bioreactors,in Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,Sadettin S.Ozturk和Wei-Shou Hu主編,CRC出版社，2005,387-416頁；以及2)W.M.Woodside、B.D.Bowen和J.M.Piret,Mammalian Cell Retention Devices for Stirred Perfusion Bioreactors,Cytotechnology,1998,November；28(1-3):163-175。

上述第一個文獻，Ozturk等人2005討論了對比恒化器生物反應器，高細胞密度灌注生物反應器的好處，以及操作這種生物反應器的方法。灌注系統涉及養分的持續流入以及舊介質的流出，而細胞完全或者部分保留在生物反應器中。灌注生物反應器的主要優點之一是高的蛋白生產率。有許多灌注生物反應器的內部和外部的細胞截留的方法。用于異源培養的這樣的系統，詳見于這篇文獻中，并且包括固定(固定化的)床、陶瓷基體(matrix)固定、中空纖維反應器、微包囊和大孔基體流化系統。用于均質培養的細胞截留系統常用于工業中的哺乳動物細胞培養，是因為由于所用懸浮培養中可見的一致性環境，而相對容易規模化、監測和控制。

對用于哺乳動物細胞培養的一些細胞截留裝置進行了討論，包括旋轉過濾器(在生物反應器內部)和外部過濾，比如交替切向流、細胞沉降(包括垂直沉降和傾斜沉降)、離心、超聲波分離和水力旋流器(hydro cyclone)。

平板和中空纖維筒(cartridge)已用于外部過濾。裝置的堵塞可成為問題，但是當堵塞使流體降低至可接受的限度以下時，可以更換外部過濾器，一般在每5至7天之間。

上述第二篇文獻，Woodside等人1998，Cytology也討論了用于攪拌型灌注生物反應器的哺乳動物細胞截留裝置。Woodside指出灌注反應器設計和操作的顯著問題在于細胞截留裝置的可靠性，因為細胞培養系統中的變化會導致大的治療性蛋白中不一致的翻譯后修飾，這使得有必要證明工藝性能和產品質量的一致性，以獲得蛋白上市的監管部門批準。

中空纖維和平板筒是錯流(cross-flow)過濾器類型。在使用中，懸浮液從生物反應器泵至外部筒，并且在流經膜時進行濃縮。濃縮的懸浮液流循環至反應器，而無細胞的滲透液形成排放(effluent)流(參見Woodside，164-166頁)。

除了上述那些文獻被認為和本方法相關以外，本發明人還注意到其它的三篇文獻。1)US2009/0263866，受讓予Novo Nordisk,Inc.的US專利申請，2)WO2011/012727，受讓予Baxter Healthcare SA和Baxter International Inc.的國際申請，以及3)瑞典FSACT 2001上WAVE BioTech的陳述。

USSN'866針對哺乳動物細胞中重組FVII的工業規模無血清生產。該申請概述了所用的細胞培養的各種方法，包括分批、補料分批和灌注。一些細胞截留裝置建議用在培養容器中，包括外部沉頭(settling head)、內部沉頭、連續離心機、內部或者外部旋轉過濾器、外部過濾器或者中空纖維筒、超聲波細胞分離裝置和一段培養容器內的管(7頁，0106-0113)。所用細胞系是CHO。該申請主要關注的是將微載體用作細胞截留系統。

WO'725針對在連續細胞培養中生產感興趣的多肽或者病毒的方法。該申請中描述了“恒化器樣”連續細胞培養系統，其結合了灌注開放系統和恒化器開放系統的優勢。這種混合系統用于培養哺乳動物細胞。提到的細胞截留系統是大孔微載體，例如纖維素基顆粒。

感興趣的具體多肽是解聚素樣的以及金屬肽酶，和1型血小板反應蛋白基序13(ADAMTS 13)蛋白。

WAVE Biotech的陳述公開了一次性生物反應器中的灌注細胞培養，并尤其涉及“新概念-浮濾器(floating filter)”。這種灌注浮濾器隨著內部的波動而移動。

在所有這些文獻中，主要的焦點在于使用灌注來提高細胞密度，因此達到更高體積生產率。還討論了灌注的優勢是為了更好的產物質量和一致性。利用本發明來提高細胞生產率，這通過采用并操作聯合了灌注細胞培養系統的基于膜的外部細胞截留系統而實現。

技術實現要素：

本文提供一種提高哺乳動物細胞的細胞表達的方法，其包括使用和灌注生物反應器聯合的基于膜的外部細胞截留系統。優選的哺乳動物細胞是CHO、BHK以及人細胞。重組蛋白是利用基于膜的細胞截留系統來進行表達的尤其有利的候選者。這種系統可用于灌注細胞培養來生產凝血蛋白，所述凝血蛋白選自：重組因子IX(rFIX)、重組因子VIII(rFVIII)、B結構域缺失的重組VIII(BDD rFVIII)、重組因子FVII以及重組因子VIIa(rFVII/rFVIIa)。通過應用一次性灌注系統來優化方法，其中所述一次性灌注系統包含一次性生物反應器以及一次性基于膜的外部細胞截留系統。優選的基于膜的細胞截留系統由中空纖維組成。

附圖說明

圖1在x軸上顯示天，以及在y軸上顯示產物BDD rFVIII的相對(歸一化的)滴度。圖2在x軸上顯示天，以及在y軸上顯示(歸一化的)特定的生產率。

具體實施方式

膜系統獲自Refine Technologies(Pine Brook,NJ)。各個圖中的實心方塊顯示常規的、非-基于膜的細胞截留系統(獲自Applikon(福斯特市，CA)的BioSep)的結果。各個圖中的空心圈顯示獲自Refine Technologies(Pine Brook,NJ)的基于膜的細胞截留系統的結果。對于CHO細胞系，在相同條件下運行生物反應器，CHO細胞系能夠產生感興趣的重組蛋白，B結構域缺失的rFVIII。

當使用基于膜的截留系統，并且和常規的、非-基于膜的細胞截留系統比較，于2012年獲得本數據。圖顯示基于膜的截留系統中細胞的滴度和特定生產率明顯加倍。使用相同的細胞、介質運行這些生物反應器，并且使用相同的pH、溫度等進行操作。

細胞生產率(每個細胞每天產生的產物量)是細胞的固有性質，預期不隨著操作模式而變化。在此處，我們提出了一種灌注細胞培養系統，通過控制生物反應器中的細胞環境和細胞生理狀態，其能夠真正地直接影響細胞的蛋白表達。通過利用外部細胞截留膜和灌注系統的聯合，本發明提供了改善的細胞生產率，尤其在哺乳動物細胞中，所述外部細胞截留膜不僅截留細胞，還有培養物中源自細胞的因子。本發明適用于很多哺乳動物細胞培養，比如CHO、BHK以及人細胞系，尤其是CHO，還適用于表達多種重組蛋白，例如抗體和凝血蛋白，比如重組因子IX(rFIX)、重組因子VIII(rFVIII)、B結構域缺失的重組FVIII(BDD rFVIII)、重組因子VII以及重組因子VIIa(rFVII/rFVIIa)。細胞截留膜可以是平的膜，或者，優選中空纖維膜。

在和合作者討論的過程中，在2011年提出了基于膜的細胞截留系統用于重組蛋白細胞培養的用途。一些專家不屑于這一想法，但是對比另一種(非-膜)細胞截留系統進行了測試，證實基于膜的細胞截留系統提供了至少50％至高達100％(兩倍)的生產率顯著改善。

在優選的模式中，生物反應器以及細胞截留膜系統由一次性材料制成，提供了單次的使用，沒有清洗、沒有蒸汽也沒有硬質管路系統。優選的細胞截留膜在生物反應器外部，并且由中空纖維組成。

能夠用作生物反應器的適合的一次性容器可購自一些商業來源，比如GE Healthcare，商品名為Wave或者Xcellerex；以及來自ThermoFisher，商品名為Hyclone SUB；以及來自Sartorius，商品名為Biostat STR。

平板細胞膜以及中空纖維膜用于外部細胞截留筒，可源自GE Healthcare(Boston,MA)、Spectrum Labs(Rancho Dominguez,CA)、Refine Technologies(Pine Brook,NJ)或者Pall Corporation(Port Washington,NY)。

實施例

在相同條件下(pH、溫度、細胞密度、溶解氧、體積流速(volumetric flow rate)、介質、細胞系等)操作兩套灌注生物反應器，一個用基于膜的灌注系統(生物反應器運行3D53)，一個用非-膜系統(生物反應器運行3D51)。這些生物反應器中的細胞密度控制在相同水平，監測生物反應器每日的生產率，測量滴度(產物濃度)。基于細胞密度和生物反應器生產率，計算細胞特定的(細胞)生產率。

膜系統獲自Refine Technologies(Pine Brook,NJ)。常規的非-膜系統BIOSEP獲自Applikon(福斯特市，CA)。

圖顯示基于膜的截留系統中細胞的滴度和特定生產率明顯翻倍。圖1和2中的實心方塊顯示常規的、非-基于膜的細胞截留系統(獲自Applikon(福斯特市，CA)的BioSep)的結果。各個圖中的空心圈顯示獲自Refine Technologies(Pine Brook,NJ.)的基于膜的細胞截留系統的結果。

考慮到以上公開，認為本領域技術人員將進行眾多變化。因此，意圖上述公開和實施例應當解釋為僅僅是示例性的，并且本發明的范圍應當僅受限于隨后的權利要求。