本發明屬于生物化工領域，更具體地，本發明涉及一種酶法合成阿糖腺苷的方法。
背景技術：
：阿糖腺苷(adenosinearabinoside，簡稱araa)是一種天然抗病毒化合物，具有廣譜的抗病毒活性，臨床上已廣泛應用于治療巨細胞病毒、乙型肝炎病毒和皰疹病毒引起的疾病。現有技術中，阿糖腺苷的合成方法包括化學法合成和生物轉化法合成。化學法工藝復雜，反應條件苛刻，原料成本高，使用重金屬試劑，污染環境。生物轉化法的基本原理是阿糖尿苷和磷酸根離子在尿苷磷酸化酶(ec2.4.2.3)的作用下生成阿糖1-磷酸和相應堿基；阿糖1-磷酸和腺嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶(ec2.4.2.1)的作用下生成阿糖腺苷和磷酸根離子。生物轉化方法具有反應條件溫和，反應步驟簡單，不使用有毒有害試劑，不污染環境的等優點。20世紀90年代起國內已開始嘗試利用生物轉化合成阿糖腺苷。華東理工大學馮萬祥、周興明用大腸桿菌b23生物轉化合成阿糖腺苷，其得率對應腺嘌呤的轉化率34％，對應阿糖尿苷的轉化率12％[工業微生物，1994，24(4):11-14]；郭勇莉等人通過優化產氣腸桿菌的發酵培養基配方并用胞苷或胞苷酸來誘導菌體的尿苷磷酸化酶表達，希望提高轉化率[生物技術，2006， 16(1):32-35][中國醫藥工業雜志，2010，41(6):255-258]，其反應得率對應腺嘌呤的轉化率75％，對應阿糖尿苷的轉化率為25％。魏曉琨、丁慶豹等人通過對產氣腸桿菌atcc13048誘變使其嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的活力提高[中國專利申請號200710043257.5]，其反應得率對應腺嘌呤的轉化率90％，對應阿糖尿苷的轉化率為30％。以上工作中均采用兩種酶混合使用并一步合成目標物的方法，雖然解決了化學合成所帶來的污染問題，但這種方法存在逆反應—即當反應一端的物質達到一定濃度后會向反方向進行，從而導致不等摩爾的底物用量，即上述反應中，腺嘌呤的摩爾濃度是阿糖尿苷的3倍；底物消耗大；目標物轉化率低的缺點，無法從根本上取代化學合成。因此，本領域需要進一步地優化阿糖腺苷的合成方法，以期進一步地合理的底物用量配比，提高阿糖腺苷轉化率，提高產量。技術實現要素：本發明旨在解決上述問題，提供了一種酶法合成阿糖腺苷的方法。在本發明的第一方面，提供一種制備阿糖腺苷的方法，所述方法包括：(1)在含磷酸根離子的水溶液中，使阿糖尿苷與尿苷磷酸化酶(較佳地為ec2.4.2.3)反應，獲得含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液1；(2)處理(1)獲得的含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液，去除其中的尿苷磷酸化酶和磷酸根離子，獲得含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液2；(3)在(2)獲得的含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液2中，加入腺嘌呤和嘌呤核苷磷酸化酶(較佳地為ec2.4.2.1)，反應，獲得阿糖腺苷產物。在一個優選例中，步驟(1)中，阿糖尿苷完全消耗后進行步驟(2)。在另一優選例中，步驟(3)之前，還包括稀釋步驟(2)獲得的含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液2的步驟。在另一優選例中，步驟(2)中，通過加入金屬離子結合磷酸根，形成溶解度低的磷酸鹽沉淀去除磷酸根離子包括；較佳地，通過過濾、超濾或離心的方法過濾去除沉淀。在另一優選例中，所述的金屬離子包括但不限于：鈣離子，鎂離子，鋇 離子，銀離子；較佳地，所述的金屬離子包括但不限于下列鹽在溶液中形成的金屬離子：氯化鈣，氯化鎂，溴化鎂，氯化鋇；更佳地為氯化鈣，氯化鎂。在另一優選例中，金屬離子的終濃度是5-1000mm；較佳為100-1000mm，最佳為300-800mm。在另一優選例中，步驟(2)中，通過超濾的方法去除其中的尿苷磷酸化酶。較佳地，所述的超濾為低溫超濾。在另一優選例中，在2～20℃(較佳地為4～15℃，如6、8、10、12、14℃)的溫度下進行超濾。在另一優選例中，所述的磷酸根離子包括但不限于下列鹽配成的水溶液所產生的磷酸根離子：磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，磷酸鈉，磷酸鉀，磷酸氫銨，磷酸二氫銨。在另一優選例中，所述的含磷酸根離子的水溶液的ph6.0-9.0；較佳地為ph6.0-8.0。在另一優選例中，步驟(1)中，磷酸根離子的水溶液中，磷酸根的濃度5-1000mm；較佳為100-1000mm，最佳為300-600mm。在另一優選例中，阿糖尿苷的濃度為10-1000mm；較佳為10-500mm，最佳為30-200mm。在另一優選例中，步驟(1)中，所述的尿苷磷酸化酶是純酶或由微生物表達的尿苷磷酸化酶；較佳地，所述的尿苷磷酸化酶在反應體系中的濃度20-1000u/ml；更佳地為20-500u/ml；如50、100、200、300u/ml。在另一優選例中，步驟(3)中，所述的嘌呤核苷磷酸化酶是純酶或由微生物表達的嘌呤核苷磷酸化酶；較佳地，所述的嘌呤核苷磷酸化酶在體系中的濃度20-1000u/ml；更佳地為100-700u/ml；如150、200、300、500u/ml。在另一優選例中，步驟(3)中，腺嘌呤的濃度2-400mm；較佳為5-200mm，最佳為10-70mm；如10、20、50、70mm。在另一優選例中，步驟(1)或步驟(3)中，反應溫度為30℃～80℃；較佳地為40-65℃；更佳地為45-60℃。在另一優選例中，步驟(1)中，混合液在55±1℃下振搖反應8±1小時；步驟(3)中，混合液在50±1℃下振搖反應4±1小時。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。具體實施方式本發明人致力于優化阿糖腺苷的合成方法，經過深入的研究，首次意外地發現，含阿糖尿苷和磷酸根離子的水溶液中單獨加入含尿苷磷酸化酶的菌體，在阿糖尿苷完全消耗后去除尿苷磷酸化酶和磷酸根離子，使阿糖-1-磷酸穩定，之后再加入腺嘌呤和嘌呤核苷磷酸化酶反應，獲得阿糖腺苷，該方法可顯著地促進底物的反應完全以及提高產物阿糖腺苷的轉化率。本發明旨在突破酶反應生產阿糖腺苷的方法中產生的腺嘌呤和目標物之間的平衡，充分利用尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的不同作用使反應往一個方向進行，消除逆反應的發生。從而使底物被充分消耗且產物的轉化率達到較高水平。基于以上宗旨，本發明提供了一種新的阿糖腺苷酶法合成的方法，所述方法見反應式(i)和反應式(ii)，包括步驟：(1)在磷酸根離子的水溶液中加入阿糖尿苷和尿苷磷酸化酶，進行如反應式(i)的反應；式(i)中：ara-u表示阿糖尿苷；ec2.4.2.3表示尿苷磷酸化酶；p表示磷酸根離子；uracil表示尿嘧啶；ara-1-p表示阿糖-1-磷酸；(2)在阿糖尿苷完全消耗后，去除尿苷磷酸化酶和磷酸根離子，使阿糖-1-磷酸穩定；(3)在(2)獲得的含阿糖1-磷酸和尿嘧啶的溶液2中，加入腺嘌呤和嘌呤核苷磷酸化酶，進行如式(ii)的反應，獲得阿糖腺苷產物；式(ii)中：adenine表示腺嘌呤；ec2.4.2.1表示嘌呤核苷磷酸化酶；ara-a表示阿糖腺苷；p表示磷酸根離子。步驟(2)中，可以采用多種方法去除磷酸根離子，本領域中各種可在溶液中去除磷酸根離子的方法皆可被應用于本發明中。作為本發明的優選方式，采用加入金屬離子的方法，使得金屬離子結合磷酸根，形成溶解度低的磷酸化鹽而發生沉淀。金屬離子和磷酸根離子結合形成磷酸鹽沉淀，沉淀可通過離心或超濾的方式去除。所述的金屬離子包括但不限于：鈣離子，鎂離子，鋇離子，銀離子；較佳地，所述的金屬離子包括但不限于下列鹽在溶液中形成的金屬離子：氯化鈣，氯化鎂，溴化鎂，氯化鋇；更佳地為氯化鈣，氯化鎂。步驟(2)中，可以采用多種方法去除尿苷磷酸化酶。作為本發明的優選方式，采用低溫超濾的方法。本發明人發現，低溫超濾有利于使阿糖-1-磷酸穩定，更好地應用于后續的反應，獲得更高的轉化率。此外，通過多種生物學方法可以使得細胞及其表達的酶失活(例如調節溫度至細胞或酶活性受影響的溫度，調節ph值至細胞或酶活性受影響的ph值，一些重金屬也能使酶失活)，這些方法也可被包含在本發明的方法中，只要它們不影響本發明的方法的后 續步驟。作為本發明的優選方式，超濾過程的溶液溫度控制2℃～20℃；較佳為2℃～15℃，最佳為6℃～12℃。本發明中，所述的尿苷磷酸化酶可以是純酶，或可以是由菌體表達的酶。其可以是以游離狀態存在于反應體系中的，也可以是固定化的酶。只要具有較好的酶活性，各種存在形式的尿苷磷酸化酶均可應用于本發明中。作為本發明的優選方式，所述的酶是由菌體表達的酶。本發明中，所述的磷酸根離子可以是下列鹽配成的水溶液所產生的：磷酸二氫鈉，磷酸鈉，磷酸氫銨，磷酸二氫銨等，所述的磷酸鹽配成的水溶液具有較為穩定的ph值，作為本發明的優選方式，所述的磷酸鹽水溶液ph6.0-9.0；較佳地為ph6.0-8.0。本發明人還優化了反應體系中各原料的濃度，以提高反應的效率。作為本發明的優選方式，阿糖尿苷的濃度為10-1000mm；較佳為10-500mm，最佳為30-200mm。作為本發明的優選方式，磷酸根離子的水溶液中，磷酸根的濃度5-1000mm；較佳為100-1000mm，最佳為300-600mm。作為本發明的優選方式，尿苷磷酸化酶在體系中的濃度20-1000u/ml；較佳為20-500u/ml，如50、100、200、300u/ml。最佳為50-200u/ml。作為本發明的優選方式，去除磷酸根離子所加入的金屬離子最終濃度是5-1000mm；較佳為100-1000mm，最佳為300-800mm。作為本發明的優選方式，腺嘌呤的濃度2-400mm；較佳為5-200mm，最佳為10-70mm。作為本發明的優選方式，嘌呤核苷磷酸化酶在體系中的濃度20-1000u/ml；較佳為100-700u/ml，最佳為200-400u/ml。作為本發明的優選方式，在尿苷磷酸化酶反應中的溫度30℃～80℃；較佳為40℃～70℃，最佳為50℃～60℃。作為本發明的優選方式，在嘌呤核苷磷酸化酶反應中的溫度30℃～80℃；較佳為40℃～70℃，最佳為50℃～60℃。本發明的式i中產生的阿糖-1-磷酸含量測定方法使用高效液相測定(elsd)，通過定量標準曲線和實測峰面積計算具體含量。本發明的式ii中生成的阿糖腺苷含量測定方法使用高效液相測定(uv)，通過定量標準曲線和實測峰面積計算具體含量。除非另外說明，本發明中所提到的阿糖腺苷轉化率指，通過高效液相(uv)標準定量方法測得反應液中阿糖腺苷的摩爾量，然后除以投入的阿糖尿苷的摩爾量。應理解，可應用于測定物質含量的其它測定設備及測定方法也可被應用于本發明中。本發明提到的上述特征，或實例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形成并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發明的主要優點在于：(a)本發明提供的兩步酶合成方法成本低，所需設備均是生物品生產中常用設備。(b)本發明提供的兩步酶合成方法使阿糖腺苷的轉化率達到90％以上。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅做示范之用。本發明中所涉及的酶活力單位、各原料的濃度單位是本領域技術人員所熟知的。以下實施例所用的菌體是表達尿苷磷酸化酶的重組大腸桿菌(根據biosci.biotech.biochem.,59(10),1987-1990,1995克隆所得)和表達嘌呤磷酸化酶的重組大腸桿菌(根據biosci.biotech.biochem.,59(10),1987-1990,1995 克隆所得)。本發明下述實施例中的高效液相(elsd)條件：儀器：waters2695+waters2420elsd檢測器(蒸發光散射)，分析柱：ymc-aq250*4.6mm，流速：0.8ml/min，柱溫：5℃。梯度條件：時間(min)0.01m磷酸緩沖液(ph6.0)甲醇0100％0％2100％0％1080％20％1580％20％42100％0％50100％0％標準曲線：y＝3100168.94*x+33400.24(r2＝1.00)，y—峰面積；x—摩爾；檢測有效范圍：0.0049摩爾～0.0295摩爾；本發明下述實施例中的高效液相(uv)條件：儀器：waters2695+waters996uv檢測器，分析柱：ymc-aq150*4.6mm，流速：1.0ml/min，檢測波長：260nm；梯度條件：標準曲線：y＝3188562.59*x-27005.28(r2＝1.00)，y—峰面積；x—摩爾；檢測有效范圍：0.8876毫摩爾～6.1357毫摩爾；實施例1、兩步法反應1反應分兩步進行，具體如下：反應一：向1000mlph6.8的300mm磷酸鈉溶液中加入0.04摩爾的阿糖尿苷使其濃度達到40mm，然后加入1.56g菌體(每克含尿苷磷酸化酶32200u)使尿苷磷酸化酶的濃度達到50u/ml；將此混合液置于搖床內，在55℃下振搖8小時。取出反應液并冷卻至10℃，加入無水氯化鈣固體34g，并攪拌30分鐘，超濾去除析出的尿嘧啶、磷酸鈣和其他不溶物，該不溶物包括含尿苷磷酸化酶的菌體，保持超濾溶液5-10℃，收集超濾溶液，完成后用500ml雙蒸水洗膜，洗出殘留在膜包中的剩余反應液，合并超濾液體和洗膜液體(這兩部分液體均含有產物，合并可使得率更高)，共得到1420ml液體。超濾得到液體稀釋3倍后經高效液相(elsd)定量分析，阿糖-1-磷酸的峰面積為73185.74，將這個數字代入標準曲線公式中計算得到：在此溶液中含阿糖-1-磷酸0.0385摩爾，除以0.04摩爾的阿糖尿苷后其轉化率為96.3％。反應二：反應一得到的溶液中加入1580ml雙蒸水稀釋，然后加入0.04摩爾的腺嘌呤使其濃度達到13.3mm；加入21.6g菌體(每克含嘌呤核苷磷酸化酶27800u)使嘌呤核苷磷酸化酶的濃度達到200u/ml；將此混合液置于搖床內，在50℃下振搖4小時。反應液稀釋10倍后經高效液相(uv)定量分析，阿糖腺苷的峰面積為11961990.05，將這個數字代入標準曲線公式中計算得到：在此溶液中含阿糖 腺苷0.0376摩爾，除以0.04摩爾的阿糖尿苷后其轉化率為94％。實施例2、兩步法反應2反應分兩步進行，具體如下：反應一：向1000mlph6.8的600mm磷酸鈉溶液中加入0.2摩爾的阿糖尿苷使其濃度達到200mm，然后加入6.21g菌體(每克含尿苷磷酸化酶32200u)使尿苷磷酸化酶的濃度達到200u/ml；將此混合液置于搖床內，在55℃下振搖8小時。取出反應液并冷卻至10℃，加入1000ml的雙蒸水稀釋反應液；加入無水氯化鈣固體68g，并攪拌30分鐘，超濾去除析出的尿嘧啶、磷酸鈣和其他不溶物，該不溶物包括含尿苷磷酸化酶的菌體；保持超濾溶液5-10℃，完成后用500ml雙蒸水洗膜，洗出殘留在膜包中的剩余反應液，合并超濾液體和洗膜液體，共得到2390ml液體。超濾得到液體稀釋10倍后經高效液相(elsd)定量分析，阿糖-1-磷酸的峰面積為69992.87，將這個數字代入標準曲線公式中計算得到：在此溶液中含阿糖-1-磷酸0.1855摩爾，除以0.2摩爾的阿糖尿苷后其轉化率為92.75％。反應二：反應一得到的溶液中加入610ml雙蒸水稀釋，然后加入0.2摩爾的腺嘌呤使其濃度達到66.6mm；加入43g菌體(每克含嘌呤核苷磷酸化酶27800u)使嘌呤核苷磷酸化酶的濃度達到398u/ml；將此混合液置于搖床內，在50℃下振搖4小時。反應液稀釋50倍后經高效液相(uv)定量分析，阿糖腺苷的峰面積為10902381.78，將這個數字代入標準曲線公式中計算得到：在此溶液中含阿糖腺苷0.1836摩爾，除以0.2摩爾的阿糖尿苷后其轉化率為91.8％。實施例3、比較例1采用實施例1相同的方法，不同點主要在于“反應一”中“在55℃下振搖8小時”之后，直接加入腺嘌呤進行反應二，不包括“反應一”中低溫超濾和“反應二”中雙蒸水稀釋的步驟。反應分兩步進行，具體如下：反應一：向1000mlph6.8的300mm磷酸鈉溶液中加入0.04摩爾的阿糖尿苷使其濃度達到40mm，然后加入1.56g菌體(每克含尿苷磷酸化酶32200u)使尿苷磷酸化酶的濃度達到50u/ml；將此混合液置于搖床內，在55℃下振搖8小時。上述得到的混合液稀釋3倍后經高效液相(elsd)定量分析，阿糖-1-磷酸的峰面積為72974.04，將這個數字代入標準曲線公式中計算得到：在此溶液中含阿糖-1-磷酸0.0381摩爾，除以0.04摩爾的阿糖尿苷后其轉化率為95.3％。反應二：反應一得到的溶液中加入0.04摩爾的腺嘌呤使其濃度達到40mm；加入21.6g菌體(每克含嘌呤核苷磷酸化酶27800u)使嘌呤核苷磷酸化酶的濃度達到600u/ml；將此混合液置于搖床內，在50℃下振搖4小時。反應液稀釋10倍后經高效液相(uv)定量分析，阿糖腺苷的峰面積為8774560.76，將這個數字代入標準曲線公式中計算得到：在此溶液中含阿糖腺苷0.00884摩爾，除以0.04摩爾的阿糖尿苷后其轉化率為22.1％。雖然反應一中阿糖-1-磷酸的得率高達95.3％，但是沒有去除的磷酸根離子，在反應二中大幅度的抑制了阿糖腺苷的生成，尿苷磷酸化酶的存在，使得產生阿糖尿苷的逆反應通路仍舊存在。實施例4、比較例2向1000mlph6.8的300mm磷酸鈉溶液中加入0.04摩爾的阿糖尿苷使其濃度達到40mm，然后加入0.04摩爾的腺嘌呤使其濃度達到40mm，然后加1.56g菌體(每克含尿苷磷酸化酶32200u)使尿苷磷酸化酶的濃度達到50u/ml，加入21.6g菌體(每克含嘌呤核苷磷酸化酶27800u)使嘌呤核苷磷酸化酶的濃度達到600u/ml；將此混合液置于搖床內，在50℃下振搖12小時。反應液稀釋10倍后經高效液相(uv)定量分析，阿糖腺苷的峰面積為8624233.32，將這個數字代入標準曲線公式中計算得到：在此溶液中含阿糖腺苷0.0084摩爾，除以0.04摩爾的阿糖尿苷后其轉化率為21.3％。一步法反應體系存在底物未利用完之前，反應卻已平衡的缺點。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用以限定本發明的實質技術內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權力要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。當前第1頁12