本發明涉及一種提高乙酰氨基葡萄糖胞外分泌量的重組枯草芽孢桿菌，屬于遺傳工程領域。
背景技術：
：氨基葡萄糖是葡萄糖的一個羥基被氨基取代后的化合物，是一種重要的功能單糖，也是第一個被確認結構的氨基單糖。N-乙酰氨基葡萄糖是氨基葡萄糖的衍生物具有重要的生理功能，在保健食品和醫藥領域具有廣泛應用，如能特異性地作用于關節軟骨，有效治療風濕性關節炎；可抑制白血病細胞K562的生長，是新型抗癌藥物氯脲霉素的主要成分；可參與肝腎解毒，發揮抗炎、護肝的作用等。氨基葡萄糖的生產方法可分為三種：甲殼素水解法、生物轉化法和微生物發酵法，其中甲殼素水解是目前生產氨基葡萄糖的主要方法。甲殼素水解是利用強酸強堿將蝦殼或蟹殼中的甲殼素水解，再經過過濾和脫色處理，最后蒸餾結晶得到成品。水解法存在很多缺點，如原料來源受到一定的地域和季節限制，環境污染嚴重，部分消費者服用后會過敏等。生物轉化法是指利用微生物的甲殼素水解酶將甲殼素進行酶解得到單體氨基葡萄糖。相對于水解法，生物轉化法對環境的污染較小，但由于甲殼素水解酶的價格較高，目前僅限于實驗室研究階段。雖然用含有甲殼素水解酶的微生物細胞直接進行生物轉化可降低生產成本，但轉化時間很長，生產強度很低。在這種背景下，近幾年人們對微生物發酵法生產氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖產生了濃厚的興趣。相對于水解法和生物轉化法，微生物發酵法具有以下優點:1)發酵時間較短，生產強度較高；2)原料來源不受地域和季節限制，產品無魚腥味；3)對環境污染小；4)產品來自微生物，消費者服用后不會出現過敏。氨基葡萄糖乙酰化酶屬于GCN5相關的GNAT蛋白質超家族，催化N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸的生成，將乙酰輔酶A中的乙酰基轉移到葡萄糖胺-6-磷酸的氨基上，是N-乙酰氨基葡萄糖合成途徑上的關鍵性酶。對氨基葡萄糖乙酰化酶的改造對在重組枯草芽孢桿菌積累乙酰氨基葡萄糖有重要作用，以下三件專利文件中嘗試了對氨基葡萄糖乙酰化酶的改造。中國專利CN103045527A公開了一種積累乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌，其含有外源的氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因GNA1，外源基因來自釀酒酵母，該專利可實現乙酰氨基葡萄糖在胞外積累，其濃度可達到115mg/L.中國專利CN103060252A公開了一種高產乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌工程菌，是對CN103045527A的進一步改進，即將釀酒酵母S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因GNA1克隆到枯草芽孢桿菌，同時敲除該枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因nagA、乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB及乙酰氨基葡萄糖轉運蛋白編碼基因nagP構建而成的枯草芽孢桿菌工程菌。該專利可實現乙酰氨基葡萄糖在胞外積累濃度達到415mg/L。中國專利CN102978149B公開了一種高產乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌，也是對CN103045527A的進一步改進，即將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因GNA1克隆到枯草芽孢桿菌，同時敲除該枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖轉運蛋白編碼基因nagP構建而成的重組枯草芽孢桿菌；將氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因連接到表達載體pP43NMK上；所述枯草芽孢桿菌為Bacillussubtilis168。該專利可實現乙酰氨基葡萄糖在胞外積累濃度達到1.23g/L。從上述專利文件公開內容可知，改造后的重組枯草芽孢桿菌，乙酰氨基葡萄糖在胞外積累濃度雖然有所增加，但仍有提升的空間。另外，重組枯草芽孢桿菌培養時，還存在連續好幾次發酵，接種后遲遲不生長；以及培養基的配方在實驗室搖瓶可以，上罐就不能獲得理想的乙酰氨基葡萄糖在胞外積累濃度等技術問題。技術實現要素：針對上述技術問題，本發明的第一個目的是構建一種積累乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌，該重組枯草芽孢桿菌以枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)為出發菌株，表達了白色念珠菌(Candidaalbicans)來源的氨基葡萄糖乙酰化酶基因(CaGNA1)。本發明優選的白色念珠菌為CandidaalbicansSC5314。下面是更具體地表述敲除非必需區域skin的重組枯草芽孢桿菌。將枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)敲除基因組片段skin，基因組片段skin為枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)基因組上2655129—2700742非必需區域。進一步對基因組片段skin進行了優選，基因組片段skin為枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)基因組上2655903—2700742非必需區域。進一步對基因組片段skin進行了優選，基因組片段skin為枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)基因組上2655129—2699959非必需區域。本發明的氨基葡萄糖乙酰化酶(CaGNA1)的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發明的枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)基因組如NC_000964.3所示。本發明的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因，是在白色念珠菌來源的如NCBIGenBank:XM_715990.1所示的核苷酸序列的基礎上，進行枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優化得到的。為了構建一種積累乙酰氨基葡萄糖的重組枯草芽孢桿菌，本發明的另外重要改進是：出發菌株是改造枯草芽孢桿菌(表示為BSGN6-PxylA-glmS)，改造枯草芽孢桿菌168是以枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)為基礎，基因型作如下改造：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72，并以木糖誘導啟動子PxylA調控表達氨基葡萄糖合成酶基因glmS。本發明的枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)的部分基因在基因組的位置如下表：基因NCBIGeneID在基因組上的位置nagP938418254907,256802gamP(nagP)938418254907,256802gamA(nagBB)938425256814,257572nagA9366213595356,3596546nagB(nagBA)9366193596543,3597271ldh938348329774,330739pta(eutD)9365813865355,3866326以改造枯草芽孢桿菌(BSGN6-PxylA-glmS)為出發菌株，敲除出發菌株基因組上非必需區域skin，得到缺失skin改造枯草芽孢桿菌(表示為BSGN6Δskin-PxylA-glmS)，然后以P43啟動子控制表達氨基葡萄糖乙酰化酶基因(CaGNA1)，獲得優選的重組枯草芽孢桿菌(表示為BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1)。本發明的改造枯草芽孢桿菌BSGN6-PxylA-glmS的構建方法大體可參考文獻：ModularpathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamineproduction.YanfengLiu,etal.MetabolicEngineering,23(2014)p42-52.本發明的第二個目的是提供一種所述重組枯草芽孢桿菌的構建方法，包括：1)構建重組質粒克隆白色念珠菌的氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因CaGNA1，連接到pP43NMK上；2)構建產乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌將上述重組質粒轉化BSGN6-PxylA-glmS或者BSGN6-Δskin-PxylA-glmS，得到產乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌。本發明的第三個目的是提供一種提高乙酰氨基葡萄糖胞外分泌量的方法，該方法是以重組枯草芽孢桿菌BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1或者BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1為生產菌株發酵生產乙酰氨基葡萄糖。本發明的表達是將氨基葡萄糖乙酰化酶(CaGNA1)基因克隆于表達載體上，再轉化到出發菌株中進行表達，優選用表達載體pP43NMK表達氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因。本發明的表達載體pP43NMK的構建方法參見：High-LevelExpressionandSecretionofMethylParathionHydrolaseinBacillussubtilisWB800.Xiao-ZhouZhang,etal.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,71(4102-4103).本發明的第四個目的是提供一種應用重組枯草芽孢桿菌發酵生產乙酰氨基葡萄糖的方法，方法具體為：將37℃、200rpm下培養12h的重組枯草芽孢桿菌以5％的接種量轉入發酵培養基，于37℃、200rpm條件下發酵30h；發酵培養基按g/L計含有：胰蛋白胨20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，微量元素15ml/L；微量元素溶液按g/L計含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，含5MHCl。為了進一步解決本發明所提出的技術問題，本發明還提供了一種發酵方法，具體為：將37℃、200rpm下培養12h的重組枯草芽孢桿菌以5％的接種量轉入發酵培養基，OD600達到0.3-0.5時，添加木糖至終濃度5g/L誘導，于37℃、200rpm條件下發酵25h；發酵培養基按g/L計含有：胰蛋白胨20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，葡萄糖20，胰蛋白胨10，NaCl10，瓊脂粉20，微量元素15ml/L,吲哚丁酸0.1-0.3,萬古霉素0.2-0.5,非達霉素0.1-0.6；微量元素溶液按g/L計含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，NiCl2·6H2O0.01，Na2SeO4·2H2O0.01，含5MHCl。更優選的本發明發酵培養基按g/L計含有：胰蛋白胨20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，葡萄糖20，胰蛋白胨10，NaCl10，瓊脂粉20，微量元素15ml/L,吲哚丁酸0.2,萬古霉素0.4,非達霉素0.4；微量元素溶液按g/L計含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，NiCl2·6H2O0.01，Na2SeO4·2H2O0.01，含5MHCl。本發明的有益效果：枯草芽孢桿菌168(Bacillussubtilis168)中推測出大量非必需基因區域，這些非必需基因是在不斷變化的環境中獲得的。系統研究覆蓋全基因組的單基因擾亂發現，在豐富培養基中，一定條件下破壞這些非必需基因區域不會影響其生長能力，可有利于產物的合成。本發明通過敲除相對包含大量功能同源基因的非必需基因區域skin，降低維持這些基因表達的物質代謝和能量代謝，底物消耗可以直接用于合成必須基因和期望產物。另外通過改造代謝途徑，實現乙酰氨基葡萄糖的積累；與過表達釀酒酵母來源GNA1基因的對照菌株相比，本發明表達白色念珠菌來源的CaGNA1的重組菌BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1、BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1的乙酰氨基葡萄糖胞外積累量分別提高了94％、21％，重組枯草芽孢桿菌產量可達14.6g/L。本發明為進一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產氨基葡萄糖奠定了基礎。本發明提供的重組枯草芽孢桿菌構建方法簡單，便于使用，具有很好地應用前景。重組枯草芽孢桿菌培養簡單，不存在需要連續發酵并且接種后遲遲不生長的問題，即使上罐后也能有很好的乙酰氨基葡萄糖胞外積累量。具體實施方式重組枯草芽孢桿菌種子培養：種子培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。乙酰氨基葡萄糖的測定方法：高效液相色譜(HPLC)檢測法：Agilent1200，RID檢測器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流動相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱溫30℃，進樣體積為10μL。實施例1：敲除基因組上非必需區域skin根據NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis168，購自美國典型微生物保藏中心,ATCCNo.27370)基因組序列，設計敲除框同源臂擴增引物，左臂上下游引物分別為：skin-L-F(序列如SEQIDNO.2所示)和skin-L-R(序列如SEQIDNO.3所示)；右臂上下游引物分別為：skin-R-F(序列如SEQIDNO.4所示)和skin-R-R(序列如SEQIDNO.5所示)。運用上述引物從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis168)基因組中擴增敲除框中包含的左臂和右臂。根據NCBI上公布的p7Z6質粒序列(NCBIaccessionno.EU541492)，設計引物，擴增博來霉素抗性基因(zeo)，上下游引物分別為：skin-Z-F(序列如SEQIDNO.6所示)和skin-Z-R(序列如SEQIDNO.7所示)。通過融合PCR方法，將敲除框左、右臂及抗性基因融合為敲除框。通過測序確認skin敲除框構建成功。構建好的敲除框轉化枯草芽孢桿菌BSGN6-PxylA-glmS，通過博來霉素抗性平板篩選、菌落PCR驗證，確認skin敲除成功，得到重組枯草芽孢桿菌(表示為BSGN6Δskin-PxylA-glmS)。引物序列如下(5’-3’)：skin-L-F：GGTCCCTCGATGATTATCACTTTCATAAAATGCskin-L-R：ctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcGATTGCTGTAGCTGTTGGTGTATTTGGAATTCskin-R-F：gtcgtgactgggaaaaccctggcCTTAGACGCATTTTCCTATGAAAAAAGTCTTGATTTCskin-R-R：CGCTTTTCCTTCTCTGCCCGATAAAACTskin-Z-F：gaattccaaatacaccaacagctacagcaatcGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGskin-Z-R：gaaatcaagacttttttcataggaaaatgcgtctaagGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC實施例2：重組質粒的構建根據NCBI上公布的白色念珠菌(CandidaalbicansSC5314)中氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(CaGNA1)核苷酸序列如NCBIGenBank:XM_715990.1所示，進行枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優化，核苷酸序列如SEQIDNO.1，并由上海生工生物工程股份有限公司合成基因序列。設計引物CaGNA1-F(序列如SEQIDNO.8所示):5’-GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGCTGCTGCCACAAGGTTATACAT-3’，CaGNA1-R(序列如SEQIDNO.9所示)：5’-CCCAAGCTTTTAAAAGCGGCATACCATTTCTACG-3’。使用上述引物從合成的序列核苷酸序列SEQIDNO.1中擴增氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(CaGNA1)。擴增片段經KpnI和HindIII雙酶切后連接至pP43NMK表達載體。酶切驗證并測序，確認重組質粒pP43-CaGNA1構建成功。實施例3：重組枯草芽孢桿菌的構建將構建好的表達載體pP43-CaGNA1轉化重組枯草芽孢桿菌BSGN6-Δskin-PxylA-glmS和BSGN6-PxylA-glmS。采用CaGNA1-F及CaGNA1-R引物挑選轉化子進行菌落PCR，出現450bp條帶，驗證重組枯草芽孢桿菌構建成功，分別得到重組枯草芽孢桿菌BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1和BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1。實施例4：發酵生產乙酰氨基葡萄糖將37℃、200rpm下培養12h的種子以5％的接種量轉入發酵培養基，于37℃、200rpm條件下培養30h。最終發酵上清液中，BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1和BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1的乙酰氨基葡萄糖含量分別達到14.6g/L、9.1g/L。對照菌株以BSGN6-PxylA-glmS為出發菌株，過量表達來源于釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeS288C)的氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因GNA1(核苷酸序列如GenBank:NM_001179949)，相同培養條件下最終發酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量僅為7.5g/L。與表達了釀酒酵母來源GNA1基因的對照菌株比較，僅表達白色念珠菌來源的CaGNA1基因的重組枯草芽孢桿菌發酵上清液中乙酰氨基葡萄糖產量提高了21％，同時敲除skin和表達CaGNA1的重組菌產量提高了94％。本發明通過量表達氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(CaGNA1)，或同時敲除skin，實現了乙酰氨基葡萄糖在重組枯草芽孢桿菌胞外的積累。實施例5：發酵生產乙酰氨基葡萄糖將37℃、200rpm下培養12h的的重組枯草芽孢桿菌以5％的接種量轉入發酵培養基，OD600達到0.3-0.5時，添加木糖至終濃度5g/L誘導，于37℃、200rpm條件下發酵25h；發酵培養基按g/L計含有：胰蛋白胨20，酵母粉20，K2HPO4·3H2O12.5，KH2PO42.5，CaCO35，葡萄糖20，胰蛋白胨10，NaCl10，瓊脂粉20，微量元素15ml/L,吲哚丁酸0.2,萬古霉素0.4,非達霉素0.4；微量元素溶液按g/L計含有：MnSO4·5H2O1.0，CoCl2·6H2O0.4，NaMoO4·2H2O0.2，ZnSO4·7H2O0.2，AlCl3·6H2O0.1，CuCl2·H2O0.1，H3BO40.05，NiCl2·6H2O0.01，Na2SeO4·2H2O0.01，含5MHCl。本實施例結果表明，發酵培養基引入吲哚丁酸、萬古霉素、非達霉素的試驗組，10批次發酵，接種后無一批次發生不生長現象；無論在實驗室搖瓶還是上罐，最終發酵上清液中，BSGN6Δskin-PxylA-glmS-P43-CaGNA1和BSGN6-PxylA-glmS-P43-CaGNA1的乙酰氨基葡萄糖含量分別達到14.1-15.8g/L、9.0-10.1g/L，同時發酵時間縮短4-6小時。以上所述實施例僅僅是本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。當前第1頁1 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