一種與植物光合作用相關(guān)的PSF蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與植物光合作用相關(guān)的PSF蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：光合作用是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)，光合作用分子機(jī)制的研究，將為提高作物光能轉(zhuǎn)化效率、為開辟太陽能利用的新途徑提供理論依據(jù)，從而促進(jìn)和推動(dòng)農(nóng)業(yè)和能源科學(xué)與技術(shù)的發(fā)展及新興產(chǎn)業(yè)的形成。葉綠體是高等植物進(jìn)行光合作用的非常重要的細(xì)胞器。葉綠體基因組編碼包括光合作用、基因表達(dá)、其他必需的細(xì)胞器功能等所必需的蛋白。由藍(lán)藻為祖先內(nèi)共生進(jìn)化而來的葉綠體，結(jié)合了真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的共同特征。葉綠體基因的表達(dá)調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后修飾，這些過程受到核基因多層次的調(diào)控作用。葉綠體基因表達(dá)同葉綠體發(fā)育過程密切相關(guān)，葉綠體基因表達(dá)受到影響的植株個(gè)體導(dǎo)致葉綠體發(fā)育缺陷，進(jìn)而表現(xiàn)出光合功能受損。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為 不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：A1)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述相關(guān)生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗 膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系不包括繁殖材料。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料的新用途。本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在調(diào)控植物光合作用活性中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物光合作用活性是通過調(diào)控植物光系統(tǒng)活性體現(xiàn)的。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為提高。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在培育光合作用活性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種培育光合作用活性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育光合作用活性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括將上述蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的光合作用活性高于所述受體植物。上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因是通過重組載體導(dǎo)入受體植物的；所述重組載體為將序列表中序列1所示的DNA分子插入pSN1301載體的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)間，且保持pSN1301載體的其他序列不變得到的載體。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的光合作用活性高于所述受體植物體現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植物的Fv/Fm值高于受體植物。上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。本發(fā)明從擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與植物光合功能相關(guān)的PSF基因，該基因編碼一個(gè)定位于葉綠體的可溶性蛋白，PSF基因的缺失突變體表現(xiàn)出生長遲緩、葉色黃綠、光合效率明顯降低、土壤中不能實(shí)現(xiàn)自養(yǎng)成活等特征。本發(fā)明通過對(duì)PSF基因的分離和基因功能的鑒定分析，證明了PSF蛋白具有調(diào)控植物的光合作用的功能。附圖說明圖1為突變體psf和野生型擬南芥培養(yǎng)基萌發(fā)10天的生長表型。圖2為突變體psf和野生型擬南芥的葉綠素激發(fā)熒光成像。圖3為突變體psf和野生型擬南芥的葉綠素慢誘導(dǎo)曲線。其中，圖3A為突變體psf 的葉綠素慢誘導(dǎo)曲線；圖3B為野生型擬南芥的葉綠素慢誘導(dǎo)曲線。圖4為PSF蛋白的定位。圖5為互補(bǔ)植株的表型及葉綠素激發(fā)熒光成像。圖6為互補(bǔ)植株、突變體植株和野生型擬南芥的葉綠素慢誘導(dǎo)曲線。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的野生型和突變體材料均為擬南芥哥倫比亞生態(tài)學(xué)(Col-0)。下述實(shí)施例中的農(nóng)桿菌C58在文獻(xiàn)“Jose′-AntonioDaro`sandRicardoFlores*(2004)，ArabidopsisthalianahastheenzymaticmachineryforreplicatingrepresentativeviroidspeciesofthefamilyPospiviroidae.PNASVol.101No.17；6792–6797”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。實(shí)施例1、PSF基因的獲得一、突變體的獲得及表型1、突變體的獲得將野生型擬南芥和突變體種子(從NASC種質(zhì)資源庫中訂購的T-DNA插入突變體，種子標(biāo)號(hào)為salk_037487和salk_072637)進(jìn)行低溫春化(浸水后4℃避光處理)處理，處理72h后用10％次氯酸鈉消毒10min，無菌水清洗4遍，播種到含有2％蔗糖和0.8％瓊脂的MS培養(yǎng)基上，置于溫度為22℃、光強(qiáng)為100umolm-2s-1、光周期為12h/12h(光/暗)的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到野生型擬南芥幼苗(WT)、突變體植株(psf-1)和突變體植株(psf-2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與野生型植株相比，突變體植株(psf-1)和突變體植株(psf-2)的葉色發(fā)黃，且生長遲緩，無法在土壤中自養(yǎng)生長(圖1)。2、植物熒光成像觀察植物吸收光能后會(huì)有部分能量以熒光形式散發(fā)出來，正常生長的植物熒光發(fā)射量很低，但當(dāng)植物類囊體膜結(jié)構(gòu)或功能出現(xiàn)異常時(shí)，電子傳遞受阻，葉綠素吸收的光能不能及時(shí)傳遞下去轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，此時(shí)植物熒光發(fā)射量就會(huì)升高。利用植物熒光成像技術(shù)對(duì)野生型擬南芥植株(WT)和突變體植株(psf-1)進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖2所示：與野生型幼苗相比，突變體植株(psf-1)的熒光發(fā)射量升高，說明突變體植株(psf-1)中的光合電子傳遞鏈?zhǔn)茏琛?、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)分析利用PAM2000對(duì)野生型擬南芥植株(WT)和突變體植株(psf-1)進(jìn)行葉綠素?zé)? 光動(dòng)力學(xué)分析。葉綠素?zé)晒饴T導(dǎo)測定時(shí)，葉片在暗適應(yīng)20min后，施加一次飽和脈沖(3000umolm-2s-1)時(shí)，PSII暫時(shí)達(dá)到飽和，PSII電子受體QA被完全還原，葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量由基態(tài)(F0)上升到最大值(Fm)。通過計(jì)算可以得到PSII最大光化學(xué)效率Fv/Fm＝(Fm-F0)/Fm。野生型擬南芥植株(WT)和突變體植株(psf-1)的葉綠素慢誘導(dǎo)曲線如圖3所示：野生型擬南芥植株(WT)的Fv/Fm值為0.786，而突變體植株(psf-1)的Fv/Fm值為0.347，光系統(tǒng)II最大光化學(xué)效率約為野生型的一半，表明突變體植株中熒光穩(wěn)定在一個(gè)非常高的水平，化學(xué)淬滅沒有被激活，預(yù)示光系統(tǒng)II以后的電子通路沒有被打開，葉綠素?zé)晒鉄o法回落到一個(gè)穩(wěn)定的水平(Ft)，突變體植株(psf-1)為光合功能缺陷突變體。4、純合突變體植株(psf-1)的獲得通過T-DNA元件中攜帶的Bar基因?qū)σ吧蛿M南芥植株(WT)和突變體植株(psf-1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，確認(rèn)突變體植株(psf-1)中確實(shí)有T-DNA插入并篩選到純合突變體植株(psf-1)。PCR驗(yàn)證的引物序列如下：SALK_037487-LP:ATCCCCAAGTTTGACTTGAGC；SALK_037487-RP:GTGTTGTGGTTTCGGGTAATG；LBb1.3：ATTTTGCCGATTTCGGAAC。若引物SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴(kuò)增出大小為1042bp的條帶，且SALK_037487-RP和LBb1.3擴(kuò)增出大小為848bp的條帶的為雜合突變體植株；若引物SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴(kuò)增出大小為1042bp的條帶，且SALK_037487-RP和LBb1.3擴(kuò)增無條帶的為純合突變體植株。二、PSF基因的獲得提取擬南芥(Col-0生態(tài)型，購自擬南芥生物資源中心)的基因組DNA，以獲得的基因組DNA為模板，采用引物PSF-pSN1301-BamHI-s和PSF-pSN1301-KpnI-a進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物切膠純化后連接T-easy載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,篩選陽性克隆，進(jìn)行PCR酶切、測序。引物序列如下：PSF-pSN1301-BamHI-s:5'–GCCGGATCCATGCAAACGCTTCTCTGTCA-3'；PSF-pSN1301-KpnI-a:5'-GGCGGTACCTCACTGACTCTCGAACTTGA-3'。測序結(jié)果表明：PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為PSF基因，PSF基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。三、PSF蛋白的定位分析1、pPUC18-GFP中間載體的構(gòu)建(1)以質(zhì)粒pCmGFP(來源NCBIGeneID:7011691)為模板，采用引物： 5’-GCCTCTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’和5’-AAGCTTCTCGAGTTGTATAGTTCATCC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，即為GFP基因。(2)用XbaI和HindIII雙酶切PCR產(chǎn)物和pPUC18載體(購于Taraka公司，貨號(hào)D3218)。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，得到pPUC18-GFP中間載體。2、以序列1所示的DNA分子為模板，采用引物：5'-GCCGTCGACATGCAAACGCTTCTCTGTCA-3'和5'-GGCCCATGGGCTGACTCTCGAACTTGAAC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，即為PSF基因。用SalI和NcoI雙酶切PCR產(chǎn)物及步驟1獲得的pPUC18-GFP中間載體，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，得到pPUC18-PSF-GFP。3、用SalI和NcoI酶切步驟2獲得的pPUC18-PSF-GFP，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定出陽性克隆。并將pPUC18-PSF-GFP轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體。4、用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM510META，Zeiss)觀察葉肉細(xì)胞中GFP的表達(dá)，觀察時(shí)物鏡放大倍數(shù)為40倍，激發(fā)光波長為488nm，帶通BP505～530nm，長通LP560nm。結(jié)果如圖4所示：PSF蛋白定位于葉綠體。實(shí)施例2、互補(bǔ)植株的獲得及其光合作用活性分析一、互補(bǔ)植株的獲得1、將序列表中序列1所示的DNA分子插入pSN1301載體(購自BioVector質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞基因保藏中心，產(chǎn)品貨號(hào)Biovector105802)的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)間，且保持pSN1301載體的其他序列不變，得到重組載體。2、將步驟1獲得的重組載體轉(zhuǎn)化到C58農(nóng)桿菌中，得到重組菌。3、采用花粉管通道法用步驟2獲得的重組菌侵染實(shí)施例1的步驟一中的4獲得的純合突變體植株(psf-1)。4、收到種子后，在添加潮霉素的MS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行陽性苗篩選。并進(jìn)行PCR驗(yàn)證(PCR驗(yàn)證的引物如下：SALK_037487-LP:ATCCCCAAGTTTGACTTGAGC；SALK_037487-RP:GTGTTGTGGTTTCGGGTAATG；LBb1.3：ATTTTGCCGATTTCGGAAC)。具體步驟如下：SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴(kuò)增出大小為1042bp的條帶，SALK_037487-RP和LBb1.3擴(kuò)增出大小為848bp的條帶的為雜合突變體；SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴(kuò)增出大小為1042bp的條帶，SALK_037487-RP和LBb1.3擴(kuò)增無條帶的為純合突變體。5、驗(yàn)證出的雜合突變體，單株收種子。每株數(shù)約100粒，播種于添加潮霉素的MS培養(yǎng)基平板上。若全部長出陽性苗，則證明上一代的雜合突變體為農(nóng)桿菌侵染后得到的純合體。6、將上一步得到的農(nóng)桿菌侵染后的純合體進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物同步驟4中的PCR驗(yàn)證的引物，SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴(kuò)增無條帶，SALK_037487-RP和LBb1.3擴(kuò)增出大小為848bp的條帶的為陽性互補(bǔ)苗，將其命名為互補(bǔ)植株(Psf-互補(bǔ)苗)。將上述步驟中的重組載體替換成pSN1301載體，其他步驟不變，得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株。二、互補(bǔ)植株的獲得及其光合作用活性分析1、利用植物熒光成像技術(shù)對(duì)上述步驟一獲得的互補(bǔ)植株(Psf-互補(bǔ)苗)、野生型擬南芥植株和轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖5所示：從圖5中可以看出，互補(bǔ)植株(Psf-互補(bǔ)苗)的熒光和野生型擬南芥植株無顯著差異，而轉(zhuǎn)空載體植株不能恢復(fù)正常的熒光。2、利用PAM2000對(duì)野生型擬南芥植株、psf突變體(psf-1)及互補(bǔ)植株(Psf-互補(bǔ)苗)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)分析。分析方法參照實(shí)施例1的步驟一中的2。結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看出：互補(bǔ)植株(Psf-互補(bǔ)苗)的熒光和野生型擬南芥植株無顯著差異，在熒光激發(fā)后回落到穩(wěn)態(tài)水平Fv/Fm值約為0.8，說明互補(bǔ)植株恢復(fù)正常光合功能。上述結(jié)果說明PSF基因具有調(diào)控植物光合作用的功能。當(dāng)前第1頁1 2 3