本發明涉及從蛋白中分離制備糖肽異構體的分離制備方法,具體的說是從核糖核酸酶B中酶解分離制備得到肽段為NLTK的糖肽異構體,含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,分子量為1852.75。
背景技術:
蛋白質糖基化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾,在真核生物,尤其是哺乳動物中約有一半以上的蛋白質是被糖基化的(Apweiler R,Hermjakob H,Sharon N,On the frequency of protein glycosylation,as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.Biochim Biophys Acta-Gen Subj,1999,1473,4-8)。糖基化作為一種主要的蛋白質翻譯后修飾形式,對蛋白質的結構和功能有著重要影響,糖蛋白的糖鏈在細胞間的識別、黏附、通信聯絡以及免疫應答等方面均起著重要作用。除此之外,蛋白質糖基化的異常與腫瘤、發育、免疫異常以及感染等疾病的發生發展和診斷治療也有密切關系。目前,已知腫瘤、類風濕等疾病會引起糖鏈結構的異常改變,因此,糖鏈被認為是一種潛在的疾病標志物和新疫苗的靶點(Ohtsubo K,Marth JD,Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.Cell 2006,126,855-867;Svarovsky SA,Joshi L,Cancer glycan biomarkers and their detection-past,present and future.Analytical Methods 2014,6,3918-3936.)。由于糖肽僅占所有酶解后肽段的小部分(2-5%),其質譜響應很容易被高豐度非糖肽抑制。同時,由于糖鏈的微觀不均一性,一個糖基化位點上的糖鏈類型可能多達幾十種,進一步降低了糖鏈的相對量而使得它們很難被檢測到。隨著研究的不斷深入,人們發現,在紛繁復雜的糖鏈里,由于異構體的存在,即相同分子量的糖鏈,其聚糖單元、連接順序、連接方式的不同,使糖鏈的結構和種類變得更加復雜。(Hua S,Nwosu CC,Strum JS,Site-specific protein glycosylation analysis with glycan isomer differentiation.Analytical and Bioanalytical Chemistry 2012,403,1291-1302.)。
對于糖肽的分離,目前發展的方法有反相色譜法、親和色譜法、親水色譜法以及二維色譜法例如強陽離子交換/反相色譜法、反相色譜/石墨化碳法,但是目前這些方法僅是與質譜聯用,通過質譜特定分子量的提取對糖肽或糖肽異構體進行鑒定,不能對糖肽異構體進行分離制備。為了能夠在高純度糖肽基礎上,得到糖肽異構體,從而能夠獲得更加準確的疾病標志物信息,同時為了能夠得到糖肽異構體的標準品,需要發展一種高效、高通量的糖肽異構體分離制備方法。
技術實現要素:
本發明提供了一種利用二維液相色譜法從核糖核酸酶B中高效分離制備糖肽異構體的方法,其主要的成分是肽段為NLTK的糖肽異構體,含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,分子量為1852.75,純度大于80%。
為實現上述目的,本發明采用的技術方案為:
1)蛋白變性:核糖核酸酶B中樣品中加入尿素的緩沖溶液進行反應,反應產物中加入二硫蘇糖醇進行反應,產物中加入碘代乙酸,避光反應得到變性蛋白溶液;
2)酶解:向步驟(1)得到的變性蛋白溶液中加入酶,進行酶解反應得到酶解反應產物;
3)對步驟(2)得到的酶解反應產物進行二維液相色譜分離制備,收集的組分干燥后得到兩個分子量為1852.75的糖肽異構體。。
步驟(1)中核糖核酸酶B中樣品在尿素的緩沖溶液中進行反應的條件為20-30℃溫育,緩沖溶液pH值為7-9,反應時間為1-5小時;加入二硫蘇糖醇后反應條件為35-40℃溫育,反應時間為1-5小時;加入碘代乙酸后的反應條件為避光20-30℃溫育,反應時間為10-60分鐘。
步驟(1)緩沖溶液中尿素的濃度為4-10M;所使用的緩沖溶液為碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為30-80mM;緩沖溶液中加入的核糖核酸酶B中與尿素的質量比為1:1-1:40。
所述二硫蘇糖醇,加入后其在體系中的終濃度為30-100mM,初始核糖核酸酶B中質量與二硫蘇糖醇的質量比為14:1-140:1;
所述碘代乙酸,加入后其在體系中的終濃度為30-100mM,初始核糖核酸酶B質量與碘代乙酸的質量比為18:1-180:1。
步驟(2)酶解反應之前,變性蛋白溶液用碳酸氫銨緩沖溶液稀釋5-10倍后再加入酶,上述碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為30-80mM;酶解反應pH值為7-9,溫度為35-40℃,反應時間為10-24小時;酶解后得到的酶解液在沸水中煮5-10分鐘使酶失活得到酶解反應產物。
在步驟(2)中所述酶是胰蛋白酶;酶和初始核糖核酸酶B的質量比為1:10-1:50。
步驟(3)以硅膠為基質的鍵合材料為色譜柱填料,Mal,XAmide或XIon(華譜新創有限公司)為一維親水填料,PGC(Thermo Fisher)為二維色譜填料。
步驟(3)所述的二維液相色譜分離制備中一維制備采用的硅膠基質鍵合材料的粒徑為2-20微米,一維液相色譜制備采用的流動相為甲醇或乙腈中的一種或二種與水混合,其中甲醇或乙腈為有機相, 不含或含有0.1v%甲酸;水相中不含或含有0.1v%甲酸,或者含有鹽,鹽的濃度在1-20mM,上述鹽為甲酸銨或乙酸銨。洗脫條件按照有機相體積分數50-80%等度或5-70分鐘水相體積分數由5%提高到60%梯度進行;柱溫為25-40℃,洗脫液總流速為0.2-1.0mL/min,收集保留時間為30-70min的組分;二維制備采用PGC色譜柱,粒徑為3-10微米,采用乙腈作為有機相,不含或含有0.1v%甲酸,水作為水相,不含或含有0.1v%甲酸,洗脫條件按有機相體積分數10-50%等度或經5-30分鐘有機相體積分數由0-5%提高到20-50%梯度進行,柱溫為25-40℃,洗脫液總流速為0.2-1.0mL/min,收集保留時間為10-30的組分。
所述一維制備,最佳流動相為乙腈與含有5mM甲酸銨的水混合,采用梯度方式,0-35分鐘,水相比例由40%線性提高到50%,35到70分鐘,水相比例保持在50%;二維制備最佳流動相為含有0.1v%甲酸的乙腈與含有0.1v%甲酸的水混合,采用梯度條件,含有或不含有0.1v%甲酸的乙腈體積濃度為0,保持5分鐘,再經5-20分鐘,其體積濃度梯度增加到35%-45%。
按照上述方法制備的糖肽異構體其主要成分是4個氨基酸肽段的糖肽異構體,其肽段序列為NLTK,含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,分子量為1852.75,純度大于80%。
本發明的優點:
1.采用二維液相色譜分離技術,通過選用合適的色譜分離模式和色譜分離制備條件,對從核糖核酸酶B的酶解液進行除雜質蛋白、多肽、非糖肽,從核糖核酸酶B中得到了糖肽異構體。
2.得到的糖肽異構體組分純度高,可以達到80%以上。
3.本發明所涉及的從核糖核酸酶B中制備高純度糖肽異構體的方法,儀器自動化程度高,操作方便、簡單,常溫常壓下就可進行,適合大規模制備的需要。
具體實施方式
下面結合實例,對本發明做進一步說明。實例僅限于說明本發明,而非對本發明的限定。
實施例1:
稱取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,貨號R7884)1mg,加入167μL的4M尿素的30mM碳酸氫銨緩沖溶液中,20℃溫育1小時,緩沖溶液的pH為7。變性后的核糖核酸酶B蛋白加入15μL的30mM二硫蘇糖醇水溶液,35℃溫育1小時,還原變性后蛋白的二硫鍵,然后加入10μL的30mM的碘代乙酸水溶液,避光條件下30℃溫育10分鐘,將還原后的二硫鍵進行烷基化。
將變性后的核糖核酸酶B加入960μL濃度為0.1M的碳酸氫銨緩沖溶液;加入0.1mg的Trypsin,酶解緩沖溶液的pH值為7,酶解反應溫度為35℃,酶解時間為10小時,酶解之后,酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮3倍(程序溫度15℃),得到酶解濃縮液。用粒徑2微米的XAmide(華譜新創有限公司)填料裝柱,柱徑3mm,柱長250mm,流動相選擇乙腈為有機相,水為水相,采用50%有機相等度洗脫,柱溫25℃,流動相流速為0.2mL/min,280nm紫外檢測,按照色譜峰收集30-35分鐘的洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍,得到一維組分。用粒徑3微米的PGC色譜柱,柱徑4.6mm,柱長150mm作為二維分離色譜柱,流動相采用乙腈(含0.1v%甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,采用10%有機相等度洗脫,柱溫35℃,流動相流速為0.2mL/min,280nm紫外檢測,收集27-28和28-30分鐘兩個洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮至干,即為分子量為1852.75的核糖核酸酶B糖肽異構體,分別含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,純度為70%。
實施例2:
稱取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,貨號R7884)10mg,加入100μL的8M尿素的50mM碳酸氫銨緩沖溶液中,30℃溫育5小時,緩沖溶液的pH為9。變性后的核糖核酸酶B加入15μL的30mM二硫蘇糖醇水溶液,40℃溫育5小時,還原變性后核糖核酸酶B的二硫鍵,然后加入6μL的50mM的碘代乙酸水溶液,避光條件下20℃溫育60分鐘,將還原后的二硫鍵進行烷基化。
將變性后的核糖核酸酶B加入1210μL的碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為0.5M,加入0.2mg的Trypsin,酶解緩沖溶液的pH值為9,酶解反應溫度為40℃,酶解時間為24小時,酶解之后,酶解液在沸水中煮10分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮10倍(程序溫度15℃),得到酶解濃縮液。
用粒徑20微米的XIon(華譜新創有限公司)填料裝柱,柱徑4.6mm,柱長150mm,流動相選擇甲醇(含0.1%v甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,含有5mM的甲酸銨,采用梯度洗脫方式:有機相體積濃度由5%經70分鐘提高到60%,柱溫40℃,流動相流速為1.0mL/min,280nm紫外檢測,收集65-70分鐘的洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍,得到一維組分。用粒徑20微米的PGC色譜柱,柱徑3mm,柱長150mm作為二維分離色譜柱,流動相選擇乙腈(含0.1%v甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,采用50%有機相等度洗脫,柱溫40℃,流動相流速為0.7mL/min,280nm紫外檢測,收集10-13和13-15分鐘兩個洗脫組 分,按上述離心濃縮條件離心濃縮至干,即為分子量為1852.75的核糖核酸酶B糖肽異構體,分別含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,純度為60%。
實施例3:
稱取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,貨號R7884)30mg,加入100μL的10M尿素的50mM碳酸氫銨緩沖溶液中,25℃溫育2小時,緩沖溶液的pH為7。變性后的核糖核酸酶B加入10μL的100mM二硫蘇糖醇水溶液,37℃溫育5小時,還原變性后核糖核酸酶B的二硫鍵,然后加入25μL的100mM的碘代乙酸水溶液,避光條件下30℃溫育20分鐘,將還原后的二硫鍵進行烷基化。
將變性后的核糖核酸酶B加入1500μL的碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為5M,加入1mg的Trypsin,酶解緩沖溶液的pH值為8,酶解反應溫度為37℃,酶解時間為24小時,酶解之后,酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮5倍(程序溫度15℃),得到酶解濃縮液。
用粒徑5微米的Mal(華譜新創有限公司)填料裝柱,柱徑4.6mm,柱長250mm,流動相選擇乙腈為有機相,水為水相,采用80%有機相等度洗脫,柱溫25℃,流動相流速為1mL/min,280nm紫外檢測,收集55-60分鐘的洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍,得到一維組分。用粒徑5微米的PGC色譜柱,柱徑4.6mm,柱長250mm作為二維分離色譜柱,流動相選擇乙腈為有機相,水為水相,采用梯度洗脫方式:有機相濃度由0%經30分鐘提高到50%,柱溫30℃,流動相流速為1.0mL/min,280nm紫外檢測,收集15-16和17-18分鐘兩個洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮至干,即為分子量為1852.75的核糖核酸酶B糖肽異構體,分別含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,純度為90%。
實施例4:
稱取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,貨號R7884)10mg,加入200μL的8M尿素的50mM碳酸氫銨緩沖溶液中,25℃溫育2小時,緩沖溶液的pH為8。變性后的核糖核酸酶B加入40μL的400mM二硫蘇糖醇50mM碳酸氫銨緩沖溶液,35℃溫育1小時,還原變性后核糖核酸酶B的二硫鍵,然后加入10μL的100mM的碘代乙酸50mM碳酸氫銨緩沖溶液,避光條件下25℃溫浴10分鐘,將還原后的二硫鍵進行烷基化。
將變性后的核糖核酸酶B加入9000μL的碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為0.05M,加入0.25mg的Trypsin,酶解緩沖溶液的pH值為8,酶解反應溫度為37℃,酶解時間為20小時,酶解之后,酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮 10倍(程序溫度15℃),得到酶解濃縮液。
用粒徑5微米的XIon(華譜新創有限公司)填料裝柱,柱徑3.0mm,柱長150mm,流動相選擇乙腈(含0.1%v甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,含有10mM乙酸銨,采用梯度洗脫方式:水相濃度由30%經30分鐘提高到50%,柱溫30℃,流動相流速為0.4mL/min,280nm紫外檢測,收集12-15分鐘的洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍,得到一維組分。用粒徑3微米的PGC色譜柱,柱徑2.1mm,柱長150mm作為二維分離色譜柱,流動相選擇乙腈(含0.1%v甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,采用梯度洗脫方式:有機相濃度由0%經5分鐘提高到20%,柱溫30℃,流動相流速為0.2mL/min,280nm紫外檢測,收集18-20和20-22分鐘兩個洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮至干,即為分子量為1852.75的核糖核酸酶B糖肽異構體,分別含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,純度為65%。