從核糖核酸酶B中制備糖肽異構體的方法及糖肽異構體與流程

            文檔序號:12584561閱讀:592來源:國知局

            本發明涉及從蛋白中分離制備糖肽異構體的分離制備方法,具體的說是從核糖核酸酶B中酶解分離制備得到肽段為NLTK的糖肽異構體,含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,分子量為1852.75。



            背景技術:

            蛋白質糖基化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾,在真核生物,尤其是哺乳動物中約有一半以上的蛋白質是被糖基化的(Apweiler R,Hermjakob H,Sharon N,On the frequency of protein glycosylation,as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.Biochim Biophys Acta-Gen Subj,1999,1473,4-8)。糖基化作為一種主要的蛋白質翻譯后修飾形式,對蛋白質的結構和功能有著重要影響,糖蛋白的糖鏈在細胞間的識別、黏附、通信聯絡以及免疫應答等方面均起著重要作用。除此之外,蛋白質糖基化的異常與腫瘤、發育、免疫異常以及感染等疾病的發生發展和診斷治療也有密切關系。目前,已知腫瘤、類風濕等疾病會引起糖鏈結構的異常改變,因此,糖鏈被認為是一種潛在的疾病標志物和新疫苗的靶點(Ohtsubo K,Marth JD,Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.Cell 2006,126,855-867;Svarovsky SA,Joshi L,Cancer glycan biomarkers and their detection-past,present and future.Analytical Methods 2014,6,3918-3936.)。由于糖肽僅占所有酶解后肽段的小部分(2-5%),其質譜響應很容易被高豐度非糖肽抑制。同時,由于糖鏈的微觀不均一性,一個糖基化位點上的糖鏈類型可能多達幾十種,進一步降低了糖鏈的相對量而使得它們很難被檢測到。隨著研究的不斷深入,人們發現,在紛繁復雜的糖鏈里,由于異構體的存在,即相同分子量的糖鏈,其聚糖單元、連接順序、連接方式的不同,使糖鏈的結構和種類變得更加復雜。(Hua S,Nwosu CC,Strum JS,Site-specific protein glycosylation analysis with glycan isomer differentiation.Analytical and Bioanalytical Chemistry 2012,403,1291-1302.)。

            對于糖肽的分離,目前發展的方法有反相色譜法、親和色譜法、親水色譜法以及二維色譜法例如強陽離子交換/反相色譜法、反相色譜/石墨化碳法,但是目前這些方法僅是與質譜聯用,通過質譜特定分子量的提取對糖肽或糖肽異構體進行鑒定,不能對糖肽異構體進行分離制備。為了能夠在高純度糖肽基礎上,得到糖肽異構體,從而能夠獲得更加準確的疾病標志物信息,同時為了能夠得到糖肽異構體的標準品,需要發展一種高效、高通量的糖肽異構體分離制備方法。



            技術實現要素:

            本發明提供了一種利用二維液相色譜法從核糖核酸酶B中高效分離制備糖肽異構體的方法,其主要的成分是肽段為NLTK的糖肽異構體,含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,分子量為1852.75,純度大于80%。

            為實現上述目的,本發明采用的技術方案為:

            1)蛋白變性:核糖核酸酶B中樣品中加入尿素的緩沖溶液進行反應,反應產物中加入二硫蘇糖醇進行反應,產物中加入碘代乙酸,避光反應得到變性蛋白溶液;

            2)酶解:向步驟(1)得到的變性蛋白溶液中加入酶,進行酶解反應得到酶解反應產物;

            3)對步驟(2)得到的酶解反應產物進行二維液相色譜分離制備,收集的組分干燥后得到兩個分子量為1852.75的糖肽異構體。。

            步驟(1)中核糖核酸酶B中樣品在尿素的緩沖溶液中進行反應的條件為20-30℃溫育,緩沖溶液pH值為7-9,反應時間為1-5小時;加入二硫蘇糖醇后反應條件為35-40℃溫育,反應時間為1-5小時;加入碘代乙酸后的反應條件為避光20-30℃溫育,反應時間為10-60分鐘。

            步驟(1)緩沖溶液中尿素的濃度為4-10M;所使用的緩沖溶液為碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為30-80mM;緩沖溶液中加入的核糖核酸酶B中與尿素的質量比為1:1-1:40。

            所述二硫蘇糖醇,加入后其在體系中的終濃度為30-100mM,初始核糖核酸酶B中質量與二硫蘇糖醇的質量比為14:1-140:1;

            所述碘代乙酸,加入后其在體系中的終濃度為30-100mM,初始核糖核酸酶B質量與碘代乙酸的質量比為18:1-180:1。

            步驟(2)酶解反應之前,變性蛋白溶液用碳酸氫銨緩沖溶液稀釋5-10倍后再加入酶,上述碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為30-80mM;酶解反應pH值為7-9,溫度為35-40℃,反應時間為10-24小時;酶解后得到的酶解液在沸水中煮5-10分鐘使酶失活得到酶解反應產物。

            在步驟(2)中所述酶是胰蛋白酶;酶和初始核糖核酸酶B的質量比為1:10-1:50。

            步驟(3)以硅膠為基質的鍵合材料為色譜柱填料,Mal,XAmide或XIon(華譜新創有限公司)為一維親水填料,PGC(Thermo Fisher)為二維色譜填料。

            步驟(3)所述的二維液相色譜分離制備中一維制備采用的硅膠基質鍵合材料的粒徑為2-20微米,一維液相色譜制備采用的流動相為甲醇或乙腈中的一種或二種與水混合,其中甲醇或乙腈為有機相, 不含或含有0.1v%甲酸;水相中不含或含有0.1v%甲酸,或者含有鹽,鹽的濃度在1-20mM,上述鹽為甲酸銨或乙酸銨。洗脫條件按照有機相體積分數50-80%等度或5-70分鐘水相體積分數由5%提高到60%梯度進行;柱溫為25-40℃,洗脫液總流速為0.2-1.0mL/min,收集保留時間為30-70min的組分;二維制備采用PGC色譜柱,粒徑為3-10微米,采用乙腈作為有機相,不含或含有0.1v%甲酸,水作為水相,不含或含有0.1v%甲酸,洗脫條件按有機相體積分數10-50%等度或經5-30分鐘有機相體積分數由0-5%提高到20-50%梯度進行,柱溫為25-40℃,洗脫液總流速為0.2-1.0mL/min,收集保留時間為10-30的組分。

            所述一維制備,最佳流動相為乙腈與含有5mM甲酸銨的水混合,采用梯度方式,0-35分鐘,水相比例由40%線性提高到50%,35到70分鐘,水相比例保持在50%;二維制備最佳流動相為含有0.1v%甲酸的乙腈與含有0.1v%甲酸的水混合,采用梯度條件,含有或不含有0.1v%甲酸的乙腈體積濃度為0,保持5分鐘,再經5-20分鐘,其體積濃度梯度增加到35%-45%。

            按照上述方法制備的糖肽異構體其主要成分是4個氨基酸肽段的糖肽異構體,其肽段序列為NLTK,含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,分子量為1852.75,純度大于80%。

            本發明的優點:

            1.采用二維液相色譜分離技術,通過選用合適的色譜分離模式和色譜分離制備條件,對從核糖核酸酶B的酶解液進行除雜質蛋白、多肽、非糖肽,從核糖核酸酶B中得到了糖肽異構體。

            2.得到的糖肽異構體組分純度高,可以達到80%以上。

            3.本發明所涉及的從核糖核酸酶B中制備高純度糖肽異構體的方法,儀器自動化程度高,操作方便、簡單,常溫常壓下就可進行,適合大規模制備的需要。

            具體實施方式

            下面結合實例,對本發明做進一步說明。實例僅限于說明本發明,而非對本發明的限定。

            實施例1:

            稱取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,貨號R7884)1mg,加入167μL的4M尿素的30mM碳酸氫銨緩沖溶液中,20℃溫育1小時,緩沖溶液的pH為7。變性后的核糖核酸酶B蛋白加入15μL的30mM二硫蘇糖醇水溶液,35℃溫育1小時,還原變性后蛋白的二硫鍵,然后加入10μL的30mM的碘代乙酸水溶液,避光條件下30℃溫育10分鐘,將還原后的二硫鍵進行烷基化。

            將變性后的核糖核酸酶B加入960μL濃度為0.1M的碳酸氫銨緩沖溶液;加入0.1mg的Trypsin,酶解緩沖溶液的pH值為7,酶解反應溫度為35℃,酶解時間為10小時,酶解之后,酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮3倍(程序溫度15℃),得到酶解濃縮液。用粒徑2微米的XAmide(華譜新創有限公司)填料裝柱,柱徑3mm,柱長250mm,流動相選擇乙腈為有機相,水為水相,采用50%有機相等度洗脫,柱溫25℃,流動相流速為0.2mL/min,280nm紫外檢測,按照色譜峰收集30-35分鐘的洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍,得到一維組分。用粒徑3微米的PGC色譜柱,柱徑4.6mm,柱長150mm作為二維分離色譜柱,流動相采用乙腈(含0.1v%甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,采用10%有機相等度洗脫,柱溫35℃,流動相流速為0.2mL/min,280nm紫外檢測,收集27-28和28-30分鐘兩個洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮至干,即為分子量為1852.75的核糖核酸酶B糖肽異構體,分別含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,純度為70%。

            實施例2:

            稱取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,貨號R7884)10mg,加入100μL的8M尿素的50mM碳酸氫銨緩沖溶液中,30℃溫育5小時,緩沖溶液的pH為9。變性后的核糖核酸酶B加入15μL的30mM二硫蘇糖醇水溶液,40℃溫育5小時,還原變性后核糖核酸酶B的二硫鍵,然后加入6μL的50mM的碘代乙酸水溶液,避光條件下20℃溫育60分鐘,將還原后的二硫鍵進行烷基化。

            將變性后的核糖核酸酶B加入1210μL的碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為0.5M,加入0.2mg的Trypsin,酶解緩沖溶液的pH值為9,酶解反應溫度為40℃,酶解時間為24小時,酶解之后,酶解液在沸水中煮10分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮10倍(程序溫度15℃),得到酶解濃縮液。

            用粒徑20微米的XIon(華譜新創有限公司)填料裝柱,柱徑4.6mm,柱長150mm,流動相選擇甲醇(含0.1%v甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,含有5mM的甲酸銨,采用梯度洗脫方式:有機相體積濃度由5%經70分鐘提高到60%,柱溫40℃,流動相流速為1.0mL/min,280nm紫外檢測,收集65-70分鐘的洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍,得到一維組分。用粒徑20微米的PGC色譜柱,柱徑3mm,柱長150mm作為二維分離色譜柱,流動相選擇乙腈(含0.1%v甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,采用50%有機相等度洗脫,柱溫40℃,流動相流速為0.7mL/min,280nm紫外檢測,收集10-13和13-15分鐘兩個洗脫組 分,按上述離心濃縮條件離心濃縮至干,即為分子量為1852.75的核糖核酸酶B糖肽異構體,分別含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,純度為60%。

            實施例3:

            稱取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,貨號R7884)30mg,加入100μL的10M尿素的50mM碳酸氫銨緩沖溶液中,25℃溫育2小時,緩沖溶液的pH為7。變性后的核糖核酸酶B加入10μL的100mM二硫蘇糖醇水溶液,37℃溫育5小時,還原變性后核糖核酸酶B的二硫鍵,然后加入25μL的100mM的碘代乙酸水溶液,避光條件下30℃溫育20分鐘,將還原后的二硫鍵進行烷基化。

            將變性后的核糖核酸酶B加入1500μL的碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為5M,加入1mg的Trypsin,酶解緩沖溶液的pH值為8,酶解反應溫度為37℃,酶解時間為24小時,酶解之后,酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮5倍(程序溫度15℃),得到酶解濃縮液。

            用粒徑5微米的Mal(華譜新創有限公司)填料裝柱,柱徑4.6mm,柱長250mm,流動相選擇乙腈為有機相,水為水相,采用80%有機相等度洗脫,柱溫25℃,流動相流速為1mL/min,280nm紫外檢測,收集55-60分鐘的洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍,得到一維組分。用粒徑5微米的PGC色譜柱,柱徑4.6mm,柱長250mm作為二維分離色譜柱,流動相選擇乙腈為有機相,水為水相,采用梯度洗脫方式:有機相濃度由0%經30分鐘提高到50%,柱溫30℃,流動相流速為1.0mL/min,280nm紫外檢測,收集15-16和17-18分鐘兩個洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮至干,即為分子量為1852.75的核糖核酸酶B糖肽異構體,分別含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,純度為90%。

            實施例4:

            稱取核糖核酸酶B蛋白(Sigma-Aldrich,貨號R7884)10mg,加入200μL的8M尿素的50mM碳酸氫銨緩沖溶液中,25℃溫育2小時,緩沖溶液的pH為8。變性后的核糖核酸酶B加入40μL的400mM二硫蘇糖醇50mM碳酸氫銨緩沖溶液,35℃溫育1小時,還原變性后核糖核酸酶B的二硫鍵,然后加入10μL的100mM的碘代乙酸50mM碳酸氫銨緩沖溶液,避光條件下25℃溫浴10分鐘,將還原后的二硫鍵進行烷基化。

            將變性后的核糖核酸酶B加入9000μL的碳酸氫銨緩沖溶液,濃度為0.05M,加入0.25mg的Trypsin,酶解緩沖溶液的pH值為8,酶解反應溫度為37℃,酶解時間為20小時,酶解之后,酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮 10倍(程序溫度15℃),得到酶解濃縮液。

            用粒徑5微米的XIon(華譜新創有限公司)填料裝柱,柱徑3.0mm,柱長150mm,流動相選擇乙腈(含0.1%v甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,含有10mM乙酸銨,采用梯度洗脫方式:水相濃度由30%經30分鐘提高到50%,柱溫30℃,流動相流速為0.4mL/min,280nm紫外檢測,收集12-15分鐘的洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍,得到一維組分。用粒徑3微米的PGC色譜柱,柱徑2.1mm,柱長150mm作為二維分離色譜柱,流動相選擇乙腈(含0.1%v甲酸)為有機相,水(含0.1%v甲酸)為水相,采用梯度洗脫方式:有機相濃度由0%經5分鐘提高到20%,柱溫30℃,流動相流速為0.2mL/min,280nm紫外檢測,收集18-20和20-22分鐘兩個洗脫組分,按上述離心濃縮條件離心濃縮至干,即為分子量為1852.75的核糖核酸酶B糖肽異構體,分別含有2個N-乙酰葡萄糖胺和5個甘露糖,純度為65%。

            當前第1頁1 2 3 
            網友詢問留言 已有0條留言
            • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
            1
            婷婷六月激情在线综合激情,亚洲国产大片,久久中文字幕综合婷婷,精品久久久久久中文字幕,亚洲一区二区三区高清不卡,99国产精品热久久久久久夜夜嗨 ,欧美日韩亚洲综合在线一区二区,99国产精品电影,伊人精品线视天天综合,精品伊人久久久大香线蕉欧美
            亚洲精品1区 国产成人一级 91精品国产欧美一区二区 亚洲精品乱码久久久久久下载 国产精品久久久久久久伊一 九色国产 国产精品九九视频 伊人久久成人爱综合网 欧美日韩亚洲区久久综合 欧美日本一道免费一区三区 夜夜爽一区二区三区精品 欧美日韩高清一区二区三区 国产成人av在线 国产精品对白交换绿帽视频 国产视频亚洲 国产在线欧美精品 国产精品综合网 国产日韩精品欧美一区色 国产日韩精品欧美一区喷 欧美日韩在线观看区一二 国产区精品 欧美视频日韩视频 中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97 视频一二三区 欧美高清在线精品一区二区不卡 国产精品揄拍一区二区久久 99久久综合狠狠综合久久aⅴ 亚洲乱码视频在线观看 日韩在线第二页 亚洲精品无码专区在线播放 成人亚洲网站www在线观看 欧美三级一区二区 99久久精品免费看国产高清 91麻豆国产在线观看 最新日韩欧美不卡一二三区 成人在线观看不卡 日韩国产在线 在线亚洲精品 亚洲午夜久久久久中文字幕 国产精品成人久久久久久久 精品国产一区二区在线观看 欧美精品国产一区二区三区 中文在线播放 亚洲第一页在线视频 国产午夜精品福利久久 九色国产 精品国产九九 国产永久视频 久久精品人人做人人综合试看 国产一区二区三区免费观看 亚洲精品国产电影 9999热视频 国产精品资源在线 麻豆久久婷婷国产综合五月 国产精品免费一级在线观看 亚洲国产一区二区三区青草影视 中文在线播放 国产成人综合在线 国产在线观看色 国产亚洲三级 国产片一区二区三区 久久99精品久久久久久牛牛影视 亚洲欧美日韩国产 四虎永久免费网站 国产一毛片 国产精品视频在 九九热在线精品 99精品福利视频 色婷婷色99国产综合精品 97成人精品视频在线播放 精品久久久久久中文字幕 亚洲欧美一区二区三区孕妇 亚洲欧美成人网 日韩高清在线二区 国产尤物在线观看 在线不卡一区二区 91网站在线看 韩国精品福利一区二区 欧美日韩国产成人精品 99热精品久久 国产精品免费视频一区 高清视频一区 精品九九久久 欧美日韩在线观看免费 91欧美激情一区二区三区成人 99福利视频 亚洲国产精品91 久热国产在线 精品久久久久久中文字幕女 国产精品久久久久久久久99热 成人自拍视频网 国产精品视频久久久久久 久久影院国产 国产玖玖在线观看 99精品在线免费 亚洲欧美一区二区三区导航 久久久久久久综合 国产欧美日韩精品高清二区综合区 国产精品视频自拍 亚洲一级片免费 久久久久久九九 国产欧美自拍视频 视频一区二区在线观看 欧美日韩一区二区三区久久 中文在线亚洲 伊人热人久久中文字幕 日韩欧美亚洲国产一区二区三区 欧美亚洲国产成人高清在线 欧美日韩国产码高清综合人成 国产性大片免费播放网站 亚洲午夜综合网 91精品久久一区二区三区 国产无套在线播放 国产精品视频网站 国产成人亚洲精品老王 91在线网站 国产视频97 欧美黑人欧美精品刺激 国产一区二区三区免费在线视频 久久久国产精品免费看 99re6久精品国产首页 久久精品91 国产成人一级 国产成人精品曰本亚洲 日本福利在线观看 伊人成综合网 久久综合一本 国产综合久久久久久 久久精品成人免费看 久久福利 91精品国产91久久久久久麻豆 亚洲精品成人在线 亚洲伊人久久精品 欧美日本二区 国产永久视频 国产一区二 一区二区福利 国产一毛片 亚洲精品1区 毛片一区二区三区 伊人久久大香线蕉综合影 国产欧美在线观看一区 亚洲国产欧洲综合997久久 国产一区二区免费视频 国产91精品对白露脸全集观看 久久亚洲国产伦理 欧美成人伊人久久综合网 亚洲性久久久影院 久久99国产精一区二区三区! 91精品国产欧美一区二区 欧美日韩亚洲区久久综合 日韩精品一二三区 久久久夜色精品国产噜噜 国产在线精品福利91香蕉 久久久久久久亚洲精品 97se色综合一区二区二区 91国语精品自产拍在线观看性色 91久久国产综合精品女同我 日韩中文字幕a 国产成人亚洲日本精品 久久国产精品-国产精品 久久国产经典视频 久久国产精品伦理 亚洲第一页在线视频 国产精品久久久久三级 日韩毛片网 久久免费高清视频 麻豆国产在线观看一区二区 91麻豆国产福利在线观看 国产成人精品男人的天堂538 一区二区三区中文字幕 免费在线视频一区 欧美日韩国产成人精品 国产综合网站 国产资源免费观看 亚洲精品亚洲人成在线播放 精品久久久久久中文字幕专区 亚洲人成人毛片无遮挡 国产一起色一起爱 国产香蕉精品视频在 九九热免费观看 日韩亚洲欧美一区 九九热精品在线观看 精品久久久久久中文字幕专区 亚洲欧美自拍偷拍 国产精品每日更新 久久久久国产一级毛片高清板 久久天天躁狠狠躁夜夜中文字幕 久久精品片 日韩在线毛片 国产成人精品本亚洲 国产成人精品一区二区三区 九九热在线观看 国产r级在线观看 国产欧美日韩精品高清二区综合区 韩国电影一区二区 国产精品毛片va一区二区三区 五月婷婷伊人网 久久一区二区三区免费 一本色道久久综合狠狠躁篇 亚洲综合色站 国产尤物在线观看 亚洲一区亚洲二区 免费在线视频一区 欧洲精品视频在线观看 日韩中文字幕a 中文字幕日本在线mv视频精品 91精品在线免费视频 精品国产免费人成在线观看 精品a级片 中文字幕日本在线mv视频精品 日韩在线精品视频 婷婷丁香色 91精品国产高清久久久久 国产成人精品日本亚洲直接 五月综合视频 欧美日韩在线亚洲国产人 精液呈暗黄色 亚洲乱码一区 久久精品中文字幕不卡一二区 亚洲天堂精品在线 激情婷婷综合 国产免费久久精品久久久 国产精品亚洲二区在线 久久免费播放视频 五月婷婷丁香综合 在线亚洲欧美日韩 久久免费精品高清麻豆 精品久久久久久中文字幕 亚洲一区网站 国产精品福利社 日韩中文字幕免费 亚洲综合丝袜 91精品在线播放 国产精品18 亚洲日日夜夜 伊人久久大香线蕉综合影 亚洲精品中文字幕乱码影院 亚洲一区二区黄色 亚洲第一页在线视频 一区二区在线观看视频 国产成人福利精品视频 亚洲高清二区 国内成人免费视频 精品亚洲性xxx久久久 国产精品合集一区二区三区 97av免费视频 国产一起色一起爱 国产区久久 国产资源免费观看 99精品视频免费 国产成人一级 国产精品九九免费视频 欧美91精品久久久久网免费 99热国产免费 久久精品色 98精品国产综合久久 久久精品播放 中文字幕视频免费 国产欧美日韩一区二区三区在线 精品久久蜜桃 国产小视频精品 一本色道久久综合狠狠躁篇 91在线免费观看 亚洲精品区 伊人成综合网 伊人热人久久中文字幕 伊人黄色片 99国产精品热久久久久久夜夜嗨 久久免费精品视频 亚洲一区二区三区高清不卡 久久久久国产一级毛片高清板 国产片一区二区三区 久久狠狠干 99久久婷婷国产综合精品电影 国产99区 国产精品成人久久久久 久久狠狠干 青青国产在线观看 亚洲高清国产拍精品影院 国产精品一区二区av 九九热在线免费视频 伊人久久国产 国产精品久久久久久久久久一区 在线观看免费视频一区 国产精品自在在线午夜区app 国产精品综合色区在线观看 国产毛片久久久久久国产毛片 97国产免费全部免费观看 国产精品每日更新 国产尤物视频在线 九九视频这里只有精品99 一本一道久久a久久精品综合 久久综合给会久久狠狠狠 国产成人精品男人的天堂538 欧美一区二区高清 毛片一区二区三区 国产欧美日韩在线观看一区二区三区 在线国产二区 欧美不卡网 91在线精品中文字幕 在线国产福利 国内精品91久久久久 91亚洲福利 日韩欧美国产中文字幕 91久久精品国产性色也91久久 亚洲性久久久影院 欧美精品1区 国产热re99久久6国产精品 九九热免费观看 国产精品欧美日韩 久久久久国产一级毛片高清板 久久国产经典视频 日韩欧美亚洲国产一区二区三区 欧美亚洲综合另类在线观看 国产精品自在在线午夜区app 97中文字幕在线观看 视频一二三区 精品国产一区在线观看 国产欧美日韩在线一区二区不卡 欧美一区二三区 伊人成人在线观看 国内精品91久久久久 97在线亚洲 国产在线不卡一区 久久久全免费全集一级全黄片 国产精品v欧美精品∨日韩 亚洲毛片网站 在线不卡一区二区 99re热在线视频 久久激情网 国产毛片一区二区三区精品 久久亚洲综合色 中文字幕视频免费 国产视频亚洲 婷婷伊人久久 国产一区二区免费播放 久久99国产精品成人欧美 99国产在线视频 国产成人免费视频精品一区二区 国产不卡一区二区三区免费视 国产码欧美日韩高清综合一区 久久精品国产主播一区二区 国产一区电影 久久精品国产夜色 国产精品国产三级国产 日韩一区二区三区在线 久久97久久97精品免视看 久久国产免费一区二区三区 伊人久久大香线蕉综合电影网 99re6久精品国产首页 久久激情网 亚洲成人高清在线 国产精品网址 国产成人精品男人的天堂538 香蕉国产综合久久猫咪 国产专区中文字幕 91麻豆精品国产高清在线 久久国产经典视频 国产精品成人va在线观看 国产精品爱啪在线线免费观看 日本精品久久久久久久久免费 亚洲综合一区二区三区 久久五月网 精品国产网红福利在线观看 久久综合亚洲伊人色 亚洲国产精品久久久久久网站 在线日韩国产 99国产精品热久久久久久夜夜嗨 国产综合精品在线 国产区福利 精品亚洲综合久久中文字幕 国产制服丝袜在线 毛片在线播放网站 在线观看免费视频一区 国产精品久久久精品三级 亚洲国产电影在线观看 最新日韩欧美不卡一二三区 狠狠综合久久综合鬼色 日本精品1在线区 国产日韩一区二区三区在线播放 欧美日韩精品在线播放 亚洲欧美日韩国产一区二区三区精品 久久综合久久网 婷婷六月激情在线综合激情 亚洲乱码一区 国产专区91 97av视频在线观看 精品久久久久久中文字幕 久久五月视频 国产成人福利精品视频 国产精品网址 中文字幕视频在线 精品一区二区三区免费视频 伊人手机在线视频 亚洲精品中文字幕乱码 国产在线视频www色 色噜噜国产精品视频一区二区 精品亚洲成a人在线观看 国产香蕉尹人综合在线 成人免费一区二区三区在线观看 国产不卡一区二区三区免费视 欧美精品久久天天躁 国产专区中文字幕 久久精品国产免费中文 久久精品国产免费一区 久久无码精品一区二区三区 国产欧美另类久久久精品免费 欧美精品久久天天躁 亚洲精品在线视频 国产视频91在线 91精品福利一区二区三区野战 日韩中文字幕免费 国产精品99一区二区三区 欧美成人高清性色生活 国产精品系列在线观看 亚洲国产福利精品一区二区 国产成人在线小视频 国产精品久久久久免费 99re热在线视频 久久久久久久综合 一区二区国产在线播放 成人国产在线视频 亚洲精品乱码久久久久 欧美日韩一区二区综合 精品久久久久免费极品大片 中文字幕视频二区 激情粉嫩精品国产尤物 国产成人精品一区二区视频 久久精品中文字幕首页 亚洲高清在线 国产精品亚洲一区二区三区 伊人久久艹 中文在线亚洲 国产精品一区二区在线播放 国产精品九九免费视频 亚洲二区在线播放 亚洲狠狠婷婷综合久久久久网站 亚洲欧美日韩网站 日韩成人精品 亚洲国产一区二区三区青草影视 91精品国产福利在线观看 国产精品久久久久久久久99热 国产一区二区精品尤物 久碰香蕉精品视频在线观看 亚洲日日夜夜 在线不卡一区二区 国产午夜亚洲精品 九九热在线视频观看这里只有精品 伊人手机在线视频 91免费国产精品 日韩欧美中字 91精品国产91久久久久 国产全黄三级播放 视频一区二区三区免费观看 国产开裆丝袜高跟在线观看 国产成人欧美 激情综合丝袜美女一区二区 国产成人亚洲综合无 欧美精品一区二区三区免费观看 欧美亚洲国产日韩 日韩亚州 国产欧美日韩精品高清二区综合区 亚洲午夜国产片在线观看 精品久久久久久中文字幕 欧美精品1区 久久伊人久久亚洲综合 亚洲欧美日韩精品 国产成人精品久久亚洲高清不卡 久久福利影视 国产精品99精品久久免费 久久久久免费精品视频 国产日产亚洲精品 亚洲国产午夜电影在线入口 精品无码一区在线观看 午夜国产精品视频 亚洲一级片免费 伊人久久大香线蕉综合影 国产精品久久影院 久碰香蕉精品视频在线观看 www.欧美精品 在线小视频国产 亚洲国产天堂久久综合图区 欧美一区二区三区不卡 日韩美女福利视频 九九精品免视频国产成人 不卡国产00高中生在线视频 亚洲第一页在线视频 欧美日韩在线播放成人 99re视频这里只有精品 国产精品91在线 精品乱码一区二区三区在线 国产区久久 91麻豆精品国产自产在线观看一区 日韩精品成人在线 九九热在线观看 国产精品久久不卡日韩美女 欧美一区二区三区综合色视频 欧美精品免费一区欧美久久优播 国产精品网址 国产专区中文字幕 国产精品欧美亚洲韩国日本久久 日韩美香港a一级毛片 久久精品123 欧美一区二区三区免费看 99r在线视频 亚洲精品国产字幕久久vr 国产综合激情在线亚洲第一页 91免费国产精品 日韩免费小视频 亚洲国产精品综合一区在线 国产亚洲第一伦理第一区 在线亚洲精品 国产精品一区二区制服丝袜 国产在线成人精品 九九精品免视频国产成人 亚洲国产网 欧美日韩亚洲一区二区三区在线观看 在线亚洲精品 欧美一区二区三区高清视频 国产成人精品男人的天堂538 欧美日韩在线观看区一二 亚洲欧美一区二区久久 久久精品中文字幕首页 日本高清www午夜视频 久久精品国产免费 久久999精品 亚洲国产精品欧美综合 88国产精品视频一区二区三区 91久久偷偷做嫩草影院免费看 国产精品夜色视频一区二区 欧美日韩导航 国产成人啪精品午夜在线播放 一区二区视频在线免费观看 99久久精品国产自免费 精液呈暗黄色 久久99国产精品 日本精品久久久久久久久免费 精品国产97在线观看 99re视频这里只有精品 国产视频91在线 999av视频 亚洲美女视频一区二区三区 久久97久久97精品免视看 亚洲国产成人久久三区 99久久亚洲国产高清观看 日韩毛片在线视频 综合激情在线 91福利一区二区在线观看 一区二区视频在线免费观看 激情粉嫩精品国产尤物 国产成人精品曰本亚洲78 国产成人精品本亚洲 国产精品成人免费视频 国产成人啪精品视频免费软件 久久精品国产亚洲妲己影院 国产精品成人久久久久久久 久久大香线蕉综合爱 欧美一区二区三区高清视频 99热国产免费 在线观看欧美国产 91精品视频在线播放 国产精品福利社 欧美精品一区二区三区免费观看 国产一区二区免费视频 国产午夜精品一区二区 精品视频在线观看97 91精品福利久久久 国产一区福利 国产综合激情在线亚洲第一页 国产精品久久久久久久久久久不卡 九色国产 在线日韩国产 黄网在线观看 亚洲一区小说区中文字幕 中文字幕丝袜 日本二区在线观看 日本国产一区在线观看 欧美日韩一区二区三区久久 欧美精品亚洲精品日韩专 国产日产亚洲精品 久久综合九色综合欧美播 亚洲国产欧美无圣光一区 欧美视频区 亚洲乱码视频在线观看 久久无码精品一区二区三区 九九热精品免费视频 久久99精品久久久久久牛牛影视 国产精品成久久久久三级 国产一区福利 午夜国产精品视频 日本二区在线观看 99久久网站 国产亚洲天堂 精品国产一区二区三区不卡 亚洲国产日韩在线一区 国产成人综合在线观看网站 久久免费高清视频 欧美在线导航 午夜精品久久久久久99热7777 欧美久久综合网 国产小视频精品 国产尤物在线观看 亚洲国产精品综合一区在线 欧美一区二区三区不卡视频 欧美黑人欧美精品刺激 日本福利在线观看 久久国产偷 国产手机精品一区二区 国产热re99久久6国产精品 国产高清啪啪 欧美亚洲国产成人高清在线 国产在线第三页 亚洲综合一区二区三区 99r在线视频 99精品久久久久久久婷婷 国产精品乱码免费一区二区 国产在线精品福利91香蕉 国产尤物视频在线 五月婷婷亚洲 中文字幕久久综合伊人 亚洲精品一级毛片 99国产精品电影 在线视频第一页 久久99国产精品成人欧美 国产白白视频在线观看2 成人精品一区二区www 亚洲成人网在线观看 麻豆91在线视频 色综合合久久天天综合绕视看 久久精品国产免费高清 国产不卡一区二区三区免费视 欧美国产中文 99精品欧美 九九在线精品 国产中文字幕在线免费观看 国产一区中文字幕在线观看 国产成人一级 国产精品一区二区制服丝袜 国产一起色一起爱 亚洲精品成人在线 亚洲欧美精品在线 国产欧美自拍视频 99精品久久久久久久婷婷 久99视频 国产热re99久久6国产精品 视频一区亚洲 国产精品视频分类 国产精品成在线观看 99re6久精品国产首页 亚洲在成人网在线看 亚洲国产日韩在线一区 久久国产三级 日韩国产欧美 欧美在线一区二区三区 国产精品美女一级在线观看 成人午夜免费福利视频 亚洲天堂精品在线 91精品国产手机 欧美日韩视频在线播放 狠狠综合久久综合鬼色 九一色视频 青青视频国产 亚洲欧美自拍一区 中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97 日韩免费大片 996热视频 伊人成综合网 亚洲天堂欧美 日韩精品亚洲人成在线观看 久久综合给会久久狠狠狠 日韩精品亚洲人成在线观看 日韩国产欧美 亚洲成aⅴ人片在线影院八 亚洲精品1区 99久久精品免费 国产精品高清在线观看 国产精品久久久免费视频 在线亚洲欧美日韩 91在线看视频 国产精品96久久久久久久 欧美日韩国产成人精品 91在线亚洲 热久久亚洲 国产精品美女免费视频观看 日韩在线毛片 亚洲永久免费视频 九九免费在线视频 亚洲一区网站 日本高清二区视频久二区 精品国产美女福利在线 伊人久久艹 国产精品久久久久三级 欧美成人精品第一区二区三区 99久久精品国产自免费 在线观看日韩一区 国产中文字幕一区 成人免费午夜视频 欧美日韩另类在线 久久99国产精品成人欧美 色婷婷中文网 久久天天躁夜夜躁狠狠躁2020 欧美成人伊人久久综合网 国产精品福利资源在线 国产伦精品一区二区三区高清 国产精品亚洲综合色区韩国 亚洲一区欧美日韩 色综合视频 国语自产精品视频在线区 国产高清a 成人国内精品久久久久影 国产在线精品香蕉综合网一区 国产不卡在线看 国产成人精品精品欧美 国产欧美日韩综合精品一区二区三区 韩国电影一区二区 国产在线视频www色 91中文字幕在线一区 国产人成午夜免视频网站 亚洲综合一区二区三区 色综合视频一区二区观看 久久五月网 九九热精品在线观看 国产一区二区三区国产精品 99久热re在线精品996热视频 亚洲国产网 在线视频亚洲一区 日韩字幕一中文在线综合 国产高清一级毛片在线不卡 精品国产色在线 国产高清视频一区二区 精品日本久久久久久久久久 亚洲国产午夜精品乱码 成人免费国产gav视频在线 日韩欧美一区二区在线观看 欧美曰批人成在线观看 韩国电影一区二区 99re这里只有精品6 日韩精品一区二区三区视频 99re6久精品国产首页 亚洲欧美一区二区三区导航 欧美色图一区二区三区 午夜精品视频在线观看 欧美激情在线观看一区二区三区 亚洲热在线 成人国产精品一区二区网站 亚洲一级毛片在线播放 亚洲一区小说区中文字幕 亚洲午夜久久久久影院 国产自产v一区二区三区c 国产精品视频免费 久久调教视频 国产成人91激情在线播放 国产精品欧美亚洲韩国日本久久 久久亚洲日本不卡一区二区 91中文字幕网 成人国产在线视频 国产视频91在线 欧美成人精品第一区二区三区 国产精品福利在线 久久综合九色综合精品 欧美一区二区三区精品 久久国产综合尤物免费观看 久久99青青久久99久久 日韩精品免费 久久国产精品999 91亚洲视频在线观看 国产精品igao视频 色综合区 在线亚洲欧国产精品专区 国产一区二区三区在线观看视频 亚洲精品成人在线 一区二区国产在线播放 中文在线亚洲 亚洲精品第一国产综合野 国产一区二区精品久久 一区二区三区四区精品视频 99热精品久久 中文字幕视频二区 国产成人精品男人的天堂538 99精品影视 美女福利视频一区二区 久久午夜夜伦伦鲁鲁片 综合久久久久久久综合网 国产精品国产欧美综合一区 国产99视频在线观看 国产亚洲女在线精品 婷婷影院在线综合免费视频 国产亚洲3p一区二区三区 91成人爽a毛片一区二区 亚洲一区二区高清 国产欧美亚洲精品第二区首页 欧美日韩导航 亚洲高清二区 欧美激情观看一区二区久久 日韩毛片在线播放 亚洲欧美日韩高清中文在线 亚洲日本在线播放 国产精品一区二区制服丝袜 精品国产一区二区三区不卡 国产不卡在线看 国产欧美网站 四虎永久在线观看视频精品 国产黄色片在线观看 夜夜综合 一本色道久久综合狠狠躁篇 欧美亚洲综合另类在线观看 国产91在线看 伊人久久国产 欧美一区二区在线观看免费网站 国产精品久久久久三级 久久福利 日韩中文字幕a 亚洲午夜久久久久影院 91在线高清视频 国产亚洲一区二区三区啪 久久人精品 国产精品亚洲午夜一区二区三区 综合久久久久久 久久伊人一区二区三区四区 国产综合久久久久久 日韩一区精品视频在线看 国产精品日韩欧美制服 日本精品1在线区 99re视频 无码av免费一区二区三区试看 国产视频1区 日韩欧美中文字幕一区 日本高清中文字幕一区二区三区a 亚洲国产欧美无圣光一区 国产在线视频一区二区三区 欧美国产第一页 在线亚洲欧美日韩 日韩中文字幕第一页 在线不卡一区二区 伊人久久青青 国产精品一区二区在线播放 www.五月婷婷 麻豆久久婷婷国产综合五月 亚洲精品区 久久国产欧美另类久久久 99在线视频免费 伊人久久中文字幕久久cm 久久精品成人免费看 久久这里只有精品首页 88国产精品视频一区二区三区 中文字幕日本在线mv视频精品 国产在线精品成人一区二区三区 伊人精品线视天天综合 亚洲一区二区黄色 国产尤物视频在线 亚洲精品99久久久久中文字幕 国产一区二区三区免费观看 伊人久久大香线蕉综合电影网 国产成人精品区在线观看 日本精品一区二区三区视频 日韩高清在线二区 久久免费播放视频 一区二区成人国产精品 国产精品免费精品自在线观看 亚洲精品视频二区 麻豆国产精品有码在线观看 精品日本一区二区 亚洲欧洲久久 久久中文字幕综合婷婷 中文字幕视频在线 国产成人精品综合在线观看 91精品国产91久久久久福利 精液呈暗黄色 香蕉国产综合久久猫咪 国产专区精品 亚洲精品无码不卡 国产永久视频 亚洲成a人片在线播放观看国产 一区二区国产在线播放 亚洲一区二区黄色 欧美日韩在线观看视频 亚洲精品另类 久久国产综合尤物免费观看 国产一区二区三区国产精品 高清视频一区 国产精品igao视频 国产精品资源在线 久久综合精品国产一区二区三区 www.五月婷婷 精品色综合 99热国产免费 麻豆福利影院 亚洲伊人久久大香线蕉苏妲己 久久电影院久久国产 久久精品伊人 在线日韩理论午夜中文电影 亚洲国产欧洲综合997久久 伊人国产精品 久草国产精品 欧美一区精品二区三区 亚洲成人高清在线 91免费国产精品 日韩精品福利在线 国产一线在线观看 国产不卡在线看 久久99青青久久99久久 亚洲精品亚洲人成在线播放 99久久免费看国产精品 国产日本在线观看 青草国产在线视频 麻豆久久婷婷国产综合五月 国产中文字幕一区 91久久精品国产性色也91久久 国产一区a 国产欧美日韩成人 国产亚洲女在线精品 一区二区美女 中文字幕在线2021一区 在线小视频国产 久久这里只有精品首页 国产在线第三页 欧美日韩中文字幕 在线亚洲+欧美+日本专区 精品国产一区二区三区不卡 久久这里精品 欧美在线va在线播放 精液呈暗黄色 91精品国产手机 91在线免费播放 欧美视频亚洲色图 欧美国产日韩精品 日韩高清不卡在线 精品视频免费观看 欧美日韩一区二区三区四区 国产欧美亚洲精品第二区首页 亚洲韩精品欧美一区二区三区 国产精品视频免费 在线精品小视频 久久午夜夜伦伦鲁鲁片 国产无套在线播放 久热这里只精品99re8久 欧美久久久久 久久香蕉国产线看观看精品蕉 国产成人精品男人的天堂538 亚洲人成网站色7799在线观看 日韩在线第二页 一本色道久久综合狠狠躁篇 国产一区二区三区不卡在线观看 亚洲乱码在线 在线观看欧美国产 久久福利青草精品资源站免费 国产玖玖在线观看 在线亚洲精品 亚洲成aⅴ人在线观看 精品91在线 欧美一区二三区 日韩中文字幕视频在线 日本成人一区二区 日韩免费专区 国内精品在线观看视频 久久国产综合尤物免费观看 国产精品系列在线观看 一本一道久久a久久精品综合 亚洲免费播放 久久精品国产免费 久久人精品 亚洲毛片网站 亚洲成a人一区二区三区 韩国福利一区二区三区高清视频 亚洲精品天堂在线 一区二区三区中文字幕 亚洲国产色婷婷精品综合在线观看 亚洲国产成人久久笫一页 999国产视频 国产精品香港三级在线电影 欧美日韩一区二区三区四区 日韩国产欧美 国产精品99一区二区三区 午夜国产精品理论片久久影院 亚洲精品中文字幕麻豆 亚洲国产高清视频 久久免费手机视频 日韩a在线观看 五月婷婷亚洲 亚洲精品中文字幕麻豆 中文字幕丝袜 www国产精品 亚洲天堂精品在线 亚洲乱码一区 国产日韩欧美三级 久久999精品 伊人热人久久中文字幕 久热国产在线视频 国产欧美日韩在线观看一区二区三区 国产一二三区在线 日韩国产欧美 91精品国产91久久久久 亚洲一区小说区中文字幕 精品一区二区免费视频 国产精品视频免费 国产精品亚洲综合色区韩国 亚洲国产精品成人午夜在线观看 欧美国产日韩精品 中文字幕精品一区二区精品