本發明涉及一類JAK激酶抑制劑的新化合物，包括其藥學上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，其可用于調節蛋白激酶活性以便調節細胞活性如信號轉導、增殖和細胞因子分泌。此外，本發明涉及包含所述化合物的藥物組合物，可用于預防或治療Janus激酶(JAK) 相關疾病的JAK抑制劑，并可作為Janus激酶(JAK)抑制劑應用在醫學、藥學、生物學、生理學、生化學等實驗中。所述JAK相關疾病包括炎性疾病、自身免疫性疾病、增殖性疾病、增生性疾病等。
背景技術：
蛋白激酶(PK)是調控多種重要生物過程的一組酶，所述生物過程尤其包括細胞激酶催化蛋白質、脂質、糖、核苷和其他細胞代謝物的磷酸化并在真核細胞生理學的所有方面起關鍵作用。特別地，蛋白激酶和脂質激酶參與信號傳導事件，該事件控制對細胞外調節物或刺激物( 如生長因子、細胞因子或趨化因子) 響應的細胞的激活、生長、分化和存活。
Janus激酶（Janus kinase,JAK)是一類非跨膜型非受體型蛋白酪氨酸激酶家族，在細胞因子信號傳遞過程中起重要作用。JAK激酶既能磷酸化與其相結合的細胞因子受體，又能磷酸化多個含特定Src同源2結構域（Src homology 2 domain，SH2)的信號分子。目前有四種已知的哺乳動物JAK 家族成員：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。它們在結構上有7個JAK同源結構域（JAK homology domain, JH），其中JH1結構域為激酶區，功能是編碼激酶蛋白； JH2結構域是“假”激酶區，對JH1的活性起調節作用；JH3-JH7組成一個四合一結構域，調節JAK與受體的結合。JAK3分布于骨髓和淋巴系統中，而JAK1、JAK2、TYK2廣泛分布于多種組織細胞中。JAK激酶參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的生物學過程。
信號轉導子和轉錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT)是JAK的底物。信號轉導和轉錄激活（STATs)蛋白家族中包括STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b及STAT6等7個成員。JAKs與STATs之間的相互作用在細胞因子受體信號通路中起著重要作用（O'SULLIVAN LA,LIONGUE C,LEWIS RS,et al.Cytokine receptor signaling through the Jak Stat pathway in disease[J].MolImmunol,2007,44{10)：2497-2506.)。當細胞因子與其靶細胞上的特異性受體結合后可使JAK活化，繼而催化受體上的酪氨酸殘基發生磷酸化,并形成相應的STAT與受體復合物結合的“停泊位點”（docking site)。最后JAK激酶催化STAT蛋白磷酸化,活化的STAT形成同源或異源二聚體后進人細胞核內與特定的靶基因結合，調控目的蛋白表達（LVASHKIV LB,HU XY.Signaling by STATs[J].Arthritis Res Ther,2004,6(4):159-168.）此途徑即JAK/STAT信號通路。JAK/STAT信號轉導途徑的異常活化與腫瘤、白血病等多種疾病的發生、發展和預后密切相關。
JAK/STAT信號通路是近年來新發現的一條與細胞因子密切相關的細胞內信號轉導通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的生理學過程，對機體免疫應答、免疫細胞分化發育及炎癥反應等有重要影響，在腫瘤、炎癥及多種自身免疫等疾病的發生、發展中起重要作用。JAK/STAT信號通路的異常激活與多種腫瘤發生和發展密切相關。
JAK/STAT信號通路是一條由多種細胞因子受體刺激的信號轉導通路，這些因子包括白介素類(如IL-2～7，IL-9，IL-10，IL-15，IL-21等）、干擾素類(包括IFN-α，IFN-β，IFN-γ等）、促紅細胞生成素(EPO)、粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、促生長素（GH)、催乳素（PRL)、促血小板生成素（TPO)、血小板衍生因子（PDGF)以及表皮細胞生長因子（EGF)等，其在參與免疫調節、免疫細胞增殖等生物學過程中起關鍵作用（GHORESCHI K，LAURENCE A,O'SHEA JJ.Janus kinases in immune cell signaling [J].Immunol Rev,2009,228(1)：273-287.）。不同受體可激活不同亞型的JAK激酶，從而表現差異化的生物學功能。
在小鼠模型上的JAK1基因敲除實驗表明該酶在調節上述多種細胞因子受體的生物學效應中起著關鍵作用（KISSELEVA T,BHATTACHARYA S，BRAUNSTEIN J，et al.Signaling through the JAK/STAT pathway,recent advances and future challenges[J].Gene,2002,285 (1-2):1-24.）。
在小鼠模型中敲除JAK2可導致貧血引起的動物死亡（SCHINDLER C，LEVY DE，DECKER T.JAK-STAT signaling：from interferons to cytokines[J].J Biol Chem,2007,282(28):20059-20063.）。人體中的JAK2基因上的一個堿基突變JAK2V617F,其與骨髓增生性疾病中的真性紅細胞增多癥（PV)、特發性血小板增多癥（ET)、特發性骨髓纖維化（IMF)、慢性粒細胞白血病（CML)等的發生密切相關（GHORESCHI K，LAURENCE A,O'SHEA JJ.Janus kinases in immune cell signaling [J].Immunol Rev,2009,228(1)：273-287.）。JAK2 抑制劑已描述適用于骨髓增殖性疾病(Santos 等人,Blood,2010,115:1131；Barosi G.和Rosti V.，Curr.Opin.Hematol.,2009,16:129；Atallah E.和Versotvsek S.，2009Exp.Rev.Anticancer Ther.9:663)。
JAK3缺陷首次在患有常染色體隱性重度聯合免疫缺陷(SCID) 的人中被識別(Macchi等，1995.Nature377(6544) ：65-68)。JAK3 敲除小鼠也顯示SCID 但未顯示非免疫性缺陷，表明JAK3抑制劑作為免疫抑制劑將在體內具有相關效應并因此成為用于免疫抑制的有前景的藥物(Papageorgiou 和Wikman2004，Trends in Pharmacological Sciences25(11) ：558-62)。酪氨酸激酶JAK3的抑制劑已被描述適用作免疫抑制劑(例如美國專利6,313,129；Borie 等人,Curr.Opin.Investigational Drugs，2003，4:1297)。
TYK2是JAK家族中的第1個成員，其可被IF-Ns，IL-10,IL-6，IL-12，IL-23，IL-27等多種受體激活。在小鼠中，TYK2功能缺失會引起多種細胞因子受體的信號通路發生缺陷，進而導致病毒感染、抗菌免疫功能下降并增加了肺部感染的可能性等（KISSELEVA T,BHATTACHARYA S,BRAUNSTEIN J,et al.Signaling through the JAK/STAT pathway,recent advances and future challenges[J].Gene,2002,285 (1-2):1-24.）。另外,Lamer AC小組的研究表明TYK2可有助于抑制乳腺癌的生長和轉移（ZHANG Q,STURGILL JL,KMIECIAK M et al.The role of Tyk2 in regulation of breast cancer growth[J].J Intetferon Cytokine Res,2011,31(9)：671-677.）
綜上所述，JAK 激酶的水平上阻斷信號轉導有望開發治療或預防Janus 激酶(JAK) 相關疾病，如免疫、炎癥、自身免疫、增殖性疾病如癌癥、增生性疾病、過敏病癥或疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、干眼癥等。
美國輝瑞（Pfizer）公司研發的JAK抑制劑Tofacitinib能選擇性抑制JAK3激酶，于2012年11月6日被FDA批準用于治療成人活動期及對甲氨蝶呤反應不佳的中至重度類風濕性關節炎（RA）。Tofacitinib 的主要副作用有嚴重感染率和低密度脂蛋白水平提高，最常見的不良反應為上呼吸道感染、頭痛、腹瀉、鼻充血、咽喉痛和鼻咽炎。除肝脂肪變性、周圍水腫外，Tofacitinib的其他大部分不良反應，單抗類藥物也都存在。Tofacitinib作為JAK抑制劑，批準說明書中的警告和注意事項與抗TNF 單抗藥物基本相同。由于部分抑制了Jak2活性并干擾紅細胞生成素和集落刺激因子等細胞因子發揮效應，因而也有臨床研究報道， Tofacitinib可引起貧血和中性粒細胞減少癥等副作用。此外，臨床試驗顯示，Tofacitinib并不會致使T淋巴細胞總數減少，但會導致CD8+T細胞減少及自然殺傷細胞（NK細胞）輕微減少，因此服用Tofacitinib時還存在某些不確定的風險。[用于治療類風濕性關節炎的 JAK 抑制劑，薛鋒，劉飛，吳剛，尤啟冬，《藥學進展》2014，38（4）：264－273]
盡管目前已公開了一系列的JAK激酶抑制劑，但這些已上市或正處于研究階段的JAK激酶抑制劑在療效和安全性方面還有改進的空間，仍需要開發更好藥效和安全性的新化合物。本發明的化合物作為Janus激酶(JAK)抑制劑，表現出良好的活性和安全性。
技術實現要素：
本發明涉及作為JAK激酶抑制劑的一類新化合物，該化合物為式（I）化合物及其藥學上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，及包含所述化合物的藥物組合物，可用于預防或治療在人體患者、哺乳動物患者中治療、控制、延遲或預防一種或多種選自與Janus激酶(JAK)相關的疾病和病癥的疾病狀態的方法；及其可作為Janus激酶(JAK)抑制劑應用在醫學、藥學、生物學、生理學、生化學等實驗中。
一種式（I）的新化合物：
（I）
包括其藥學上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，其中：
Y1、Y2是（CR10R11）n；
n是0或1；
R10、R11是R3；
環A、環B為C3-7環烷基、C5-7芳香環基、C5-7芳香雜環基、C7-11芳香雙環基、C7-11芳香雜雙環基、C11-15三元環基，其中環A、環B任選被一個或多個相同或不同的R1、R2所取代；
R1、R2是H、鹵素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個或多個相同或不同的R4取代；C3-7環烷基、C5-7芳香環基、C5-7芳香雜環基、C7-11芳香雙環基、C7-11芳香雜雙環基，其中這些環上任選被一個或多個相同或不同的R5取代；
R3是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR5、CONR6 R6’、SONR7 R7’、COR8、R9OH、鹵素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個或多個相同或不同的R4取代；C3-7環烷基、C5-7芳香環基、C5-7芳香雜環基、C7-11芳香雙環基、C7-11芳香雜雙環基，其中這些環上任選被一個或多個相同或不同的R5取代；
R4是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR5、CONR6 R6’、SONR7 R7’、COR8、R9OH、鹵素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個或多個相同或不同的R4取代；C3-7環烷基、C5-7芳香環基、C5-7芳香雜環基、C7-11芳香雙環基、C7-11芳香雜雙環基，其中這些環上任選被一個或多個相同或不同的R5取代；
R5是H、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個或多個相同或不同的R4取代；C3-7環烷基、C5-7芳香環基、C5-7芳香雜環基、C7-11芳香雙環基、C7-11芳香雜雙環基，其中這些環上任選被一個或多個相同或不同的R5取代；
R6、R6’分別是H、CN、NO2、CF3、COOR5、CONR6R6’、COR8、R9OH、鹵素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個或多個相同或不同的R4取代；C3-7環烷基、C5-7芳香環基、C5-7芳香雜環基、C7-11芳香雙環基、C7-11芳香雜雙環基，其中這些環上任選被一個或多個相同或不同的R5取代；
R7、R7’分別是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR5、CONR6R6’、COR8、R9OH、鹵素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個或多個相同或不同的R4取代；C3-7環烷基、C5-7芳香環基、C5-7芳香雜環基、C7-11芳香雙環基、C7-11芳香雜雙環基，其中這些環上任選被一個或多個相同或不同的R5取代；
R8是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR5、CONR6R6’、SONR7R7’、COR8、R9OH、鹵素、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個或多個相同或不同的R4取代；C3-7環烷基、C5-7芳香環基、C5-7芳香雜環基、C7-11芳香雙環基、C7-11芳香雜雙環基，其中這些環上任選被一個或多個相同或不同的R5取代；
R9是H、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個或多個相同或不同的R4取代；C3-7環烷基、C5-7芳香環基、C5-7芳香雜環基、C7-11芳香雙環基、C7-11芳香雜雙環基，其中這些環上任選被一個或多個相同或不同的R5取代；
本發明中所述的式（I）化合物，進一步優選如下所示的式（II）、（Ⅲ）、（Ⅳ）、（Ⅴ）化合物；
（II）
（Ⅲ） （Ⅳ）
（Ⅴ）
其中，各字母和基團的定義均同前所述。
本發明的含義內，如下使用術語：
“鹵素”是指F、Cl、Br、I、At。
“C3-7環烷基”是指具有3-7個碳原子的環烷基鏈，例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環己烯基、環庚基。環烷基碳的每個氫可被進一步規定的取代基替換。
“C5-7芳香雜環基”是指具有具有5-7個碳原子的芳香雜環基，例如咪唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶等。芳香雜環基的每個氫可被進一步規定的取代基替換。
“C7-11芳香雙環基”是指具有具有7-11個碳原子的芳香雙環基，例如萘、茚等。芳香雙環基的每個氫可被進一步規定的取代基替換。
“C7-11芳香雜雙環基”是指具有具有7-11個碳原子的芳香雜雙環基，例如喹啉、異喹啉、苯并噻唑等。芳香雜雙環基的每個氫可被進一步規定的取代基替換。
“Cl-8烷基”是指具有1-8個碳原子的烷基鏈，例如：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基。Cl-8烷基碳的每個氫可被進一步規定的取代基替換。
“C2-8烯基”是指具有2-8個碳原子的烯基鏈，例如：-CH=CH，一CH=CH-CH3，-CH2-CH=CH2，-CH=CH-CH2-CH3，-CH=CH-CH=CH2。C2-8烯基碳的每個氫可被進一步規定的取代基替換。
“C2-8炔基”是指具有2-8個碳原子的炔基鏈，例如：-C - CH，-CH.,-C - CH，CH2-CH2-C三CH，CH2-C - C-CH3。C2-6炔基碳的每個氫可被進一步規定的取代基替換。
式（I）的化合物選自：
2-[2-(4-{1-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-乙基氨基}-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
2-[2-(7-{1-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-乙基氨基}-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
2-[2-(4-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-氨基}-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
2-[2-(7-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-氨基}-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
2-{2-[甲基-(4-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-氨基}-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基)-氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-{2-[甲基-(7-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-氨基}-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)-氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-[2-(甲基-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基}-氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
2-[2-(甲基-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基}-氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
2-[2-(7-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-氨基}-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
2-[2-(7-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-氨基}-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
N7-[1-(2,2-二氟-乙基)-1H-吡唑-4-基]-N4-[1-(5-氟-嘧啶-2-基)-乙基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
式（II）的化合物選自：
N4-(1-乙基-1H-吡唑-4-甲基)-N7-(5-氟-吡啶-2-甲基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N4-(6-氟-3H-茚--4-甲基)-N7-(5-氟-嘧啶-2-甲基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N4-(1-環戊基甲基-4,5-二氫-1H-吡唑-4-甲基)-N7-(5-氟-嘧啶-2-甲基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-芐-N4-（環戊烷-1,3-二烯-1-基-甲基）-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-吡嗪-2-甲基-N4-(3H-吡唑-4-甲基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-(5-氟-吡啶-2-甲基)-N4-(3H-吡唑-4-甲基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-(5-氟-嘧啶-2-甲基)-N4-(3H-茚--4-甲基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-(5-氟-嘧啶-2-甲基)-N4-異丁基-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-(5H-環戊烷嘧啶-2-甲基)-N4-(1-甲基-4,5-二氫-1H-吡唑-4-甲基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
式（Ⅲ）的化合物選自：
1-{4-[3-({7-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-乙酮
2-(2-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{4-[3-氟-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{4-[3-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{4-[(3H-苯并咪唑-4-甲基)-氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{4-[(2,9-二氫-嘌呤-3-甲基)-氨基]-4a,7a-二氫-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{4-[(9-羥甲基-2,9-二氫-嘌呤-3-甲基)-氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
(2-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-甲基磺酰胺
(2-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙酸
(2-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙酸甲基酯
(2-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-甲醇
(3-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-甲基磺酰胺
(3-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-乙酸
(3-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-乙酸甲基酯
(3-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-甲醇
{4-[3-({7-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-甲基磺酰胺
{4-[3-({7-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-乙酸
{4-[3-({7-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-乙酸甲基酯
(5-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-1-基)-甲基磺酰胺
(5-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸
(5-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸甲基酯
(5-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-1-基)-甲醇
N-(4-{[7-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-甲基}-環己基)-乙酰胺
N4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-N7-(4-甲基-4H-[1,2,4]三唑-3-基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-N7-(2-甲基-2H-[1,2,4]三唑-3-基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-N4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
式（Ⅳ）的化合物選自：
1-{4-[3-({4-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-乙酮
2-(2-{7-[3-氟-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{7-[3-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{7-[(1H-苯并咪唑-4-甲基)-氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{7-[(2,7-二氫-嘌呤-3-甲基)-氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{7-[(7-羥甲基-2,7-二氫-嘌呤-3-甲基)-氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{7-[3-(1-羥甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
(2-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-甲基磺酰胺
(2-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙酸
(2-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙酸甲基酯
(2-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-甲醇
(3-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-甲基磺酰胺
(3-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-乙酸
(3-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-乙酸甲基酯
(3-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-甲醇
(3-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-甲基磺酰胺
{4-[3-({4-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-甲基磺酰胺
{4-[3-({4-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-乙酸
{4-[3-({4-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-乙酸甲基酯
N-(4-{[4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基]-甲基}-環己基)-丙烯酰胺
N4-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-N7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-N4-(4-甲基-4H-[1,2,4]三唑-3-基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
式（Ⅴ）的化合物選自：
2-{2-[7-(吡啶[2,3-d]嘧啶-6-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-(2-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{4-[3-氟-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{7-[3-氟-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{4-[3-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-5-氟-苯基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-(2-{7-[3-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-苯基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
2-{2-[4-(1H-苯并咪唑-5-基氨基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-{2-[7-(1H-苯并咪唑-5-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-{2-[4-(吡啶[2,3-d]嘧啶-6-基氨基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-{2-[7-(吡啶[2,3-d]嘧啶-6-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-{2-[4-(6,9-二氫-嘌呤-1-基氨基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-{2-[7-(2,9-二氫-嘌呤-1-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-{2-[4-(9-羥甲基-6,9-二氫-嘌呤-1-基氨基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
2-{2-[7-(9-羥甲基-2,9-二氫-嘌呤-1-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
3-環戊烷-3-{4-[4-(2-氧-2,3-二氫-吡啶-4-基氨基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基]-吡唑-1-基}-丙腈
3-環戊烷-3-{4-[7-(2-氧-2,3-二氫-吡啶-3-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-吡唑-1-基}-丙腈
3-{4-[7-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-哌啶-1-基}-3-氧-丙腈
N-(3-{4-[1-(3-哌啶-1-基-丙基)-1H-吡唑-4-基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-苯基)-丙烯酰胺
N-(3-{7-[1-(3-哌啶-1-基-丙基)-1H-吡唑-4-基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-苯基)-丙烯酰胺
N4-[1-(3-二甲氨基-丙基)-1H-吡唑-4-基]-N7-(4-嗎啉-4-基-苯基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-N4-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-環己基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
N7-[1-(3-二甲氨基-丙基)-1H-吡唑-4-基]-N4-(4-嗎啉-4-基-苯基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺。
“前藥”是指通過與酶、胃酸等在生理條件下在活體內例如通過各自在酶催化下進行的氧化、還原、水解等反應轉化為本發明化合物的衍生物。
“代謝物”是指在細胞或有機體優選人中源自本發明任意化合物的所有分子。
“同位素衍生物”是指與構成化合物之一或多個原子處以非天然比例含有同位素的所述的化合物。例如氘(2H或D)、碳-13(13C)、氮-15(15N) 等。
“溶劑合物”是指通常通過溶劑分解反應與溶劑物理結合的化合物形式。此物理結合包含氫鍵結合。常規溶劑包含水、乙醇、甲醇、乙酸等。式（I）化合物可以結晶形式制備且可呈溶劑合物形式（例如水合形式）。適宜溶劑合物包含藥學可接受的溶劑合物( 例如水合物)，且進一步包含化學計量溶劑合物及非化學計量溶劑合物。在某些情形下，例如當一個或多個溶劑分子納入結晶固體的晶格中時，溶劑合物將能夠解離。“溶劑合物”涵蓋溶液相及可解離溶劑合物。代表性溶劑合物包含水合物、乙醇合物及甲醇合物等。
對于式(I)化合物，本發明還包括所有比例的所有互變異構體和立體異構體形式及一起以任意比例作為其混合物，及其藥學上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，及包含所述化合物的藥物組合物。
對于式(I)的化合物可通過本領域公知的方法例如通過液相色譜分離異構體。適用于通過使用例如手性固定相的對映異構體。另外，對映異構體可通過將其轉化為非對映異構體來分離，即與對映異構體純的輔助化合物偶聯，隨后分離所得非對異構體并裂解輔助殘基。或者，可使用光學純的起始材料從立體選擇性合成獲得式(I)化合物的任意對映異構體。
式(I)化合物可以晶體或無定形形式存在。此外，式(I)化合物的某些晶體形式可以多晶型形式存在，其包括在本發明范圍內。可以使用許多常規分析技術包括但不限于單晶X-射線粉末衍射(XRPD)圖、紅外(IR)光譜、拉曼光譜、差示掃描量熱法(DSC)、熱重分析(TGA)和固體核磁共振(ssNMR)表征來區分式(I)化合物的多晶型。
式(I)化合物的藥學可接受的鹽，包含一個或多個堿性或酸性基團，本發明還包括其相應的藥學上或毒理學上可接受的鹽，特別是其藥學上可利用的鹽。因此，包含酸性基團的式(I)化合物能根據本發明使用，例如作為堿金屬鹽、堿土金屬鹽或作為銨鹽。這樣的鹽的更精確的實例包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或與氨或有機胺如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸的鹽。可存在并可根據本發明以其與無機酸或有機酸的加成鹽的形式使用包含一個或多個堿性基團，即能被質子化的基團的式(I)化合物。適當酸的實例包括鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乳酸、蘋果酸、馬來酸、苯甲酸、酒石酸、草酸、對甲苯磺酸等以及本領域技術人員已知的其他酸。如果式(I)化合物在分子內同時包含酸性和堿性基團，本發明還包括除了提及的鹽形式之外的內鹽或內銨鹽（兩性離子）。式(I)的各個鹽能由本領域技術人員已知的常規方法獲得，例如通過使這些與有機或無機酸或堿在溶劑或分散劑中接觸獲得，或通過與其他鹽進行陰離子交換或陽離子交換獲得。本發明還包括式(I)化合物的所有鹽，其由于低生理學相容性不直接適用于藥物，但是其可例如用作化學反應的中間體或用于制備藥學上可接受的鹽。
在本發明中，術語“藥學上可接受的”是指相應的化合物、載體或分子適于給予人。優選地，該術語是指由管理機構例如CFDA（中國）、EMEA（歐洲）、FDA (美國)等任意國家管理機構認證的用于哺乳動物優選人。
“藥物組合物”在用作藥物時，本發明式（I）化合物及式（I）化合物的鹽、同位素衍生物、代謝物、前藥、溶劑合物與具有生物活性和或不具有生物活性物質組成的組合物作為JAK抑制劑在治療或預防免疫、自身免疫性或變應性病癥、增生疾病或增殖性疾病、炎癥、過敏病癥、移植排斥、免疫介導中的應用。
本發明的藥物組合物可以含有一種或多種藥學上可接受的載體，可用作制成注射和非注射給藥途徑的藥物制劑和藥物劑型。所述載體包括藥學領域所有的可用于制成注射和非注射給藥途徑的藥物制劑，例如稀釋劑、潤濕劑、填充劑、粘合劑、濕滑劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、阻滯劑、吸附劑、助懸劑、絮凝劑、反絮凝劑、乳化劑、常用基質、增溶劑、助溶劑、潛溶劑、防腐劑、矯味劑、著色劑、抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑、等滲調節劑、PH調節劑、金屬離子絡合劑、硬化劑、增稠劑、吸收促進劑等。
本發明式(I)化合物和藥物組合物可制成注射或非注射給藥途徑的藥物制劑和藥物劑型。適于皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、口服、肺部（鼻或口腔吸入）、直腸、局部、腸胃外、關節內、眼部、鼻腔給藥等，雖然在任意給定情況下最適當的途徑將依賴于要治療的疾病狀態的性質和嚴重程度以及活性成分性質。它們可以方便地存在于單一劑型中，并且由藥學領域公知的任意方法制備。
本發明中Janus激酶(JAK)相關的疾病和病癥為免疫、炎癥、自身免疫、增殖性疾病如癌癥、增生性疾病、過敏病癥或疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、干眼癥等。
自身免疫疾病為至少部分由身體對抗自身組分例如蛋白質、脂質或DNA 的免疫反應引發的疾病。器官特異性自身免疫病癥的實例為影響胰腺的胰島素依賴性糖尿病(I 型)、影響甲狀腺的橋本甲狀腺炎和格雷夫斯病、影響胃的惡性貧血、影響腎上腺的庫欣病和愛迪生氏病、影響肝的慢性活動性肝炎；多囊卵巢綜合征(PCOS)、乳糜瀉、牛皮癬、炎性腸病(IBD) 和強直性脊柱炎。非器官特異性自身免疫病癥的實例為類風濕性關節炎、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡和重癥肌無力。
炎癥性腸病(IBD)是一組免疫介導的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎（UC)和克羅恩病（CD),是胃腸道炎癥性疾病的重要類型之一。克羅恩病最常涉及末端回腸和結腸，并且是透壁的和不連續的。相反，在潰瘍性結腸炎中，炎癥是連續的并且限于直腸和結腸粘膜層。在限定至回腸和結腸的大約10%的情況下，克羅恩病或潰瘍性結腸炎的確定分類不能被做出，并且被稱為“不確定的結腸炎”。兩種疾病都包括皮膚、眼睛或關節的腸外炎癥。中性粒細胞誘導的傷害可通過使用中性粒細胞遷移抑制劑而預防(Asakura 等，2007，World J Gastroenterol.13(15) ：2145-9)。
系統性紅斑狼瘡(SLE)是由T-細胞介導的B-細胞激活產生的慢性炎性疾病，其導致血管球性腎炎和腎衰竭。人SLE在早期的特征為持久的自身反應性CD4+記憶細胞的擴張(D'Cruzetal.,2007, Lancet 369 (9561):587-596)。
類風濕關節炎（RA）是一種以對稱性、多關節炎為主要表現的慢性、全身性自身免疫疾病，病變主要累及關節的滑膜關節和關節外的表現廣泛而多變，最終導致關節結構破壞、功能喪失致殘率較高。據統計，全世界患病率平均1％左右，美國為3.0%，日本為0.3%，我國初步流行病學調查為0.29%。
細胞凋亡不足及增生過度被認為是RA發病的主要機制之一，因此STAT1和STAT3的平衡對發病過程有重要調控作用。（用于治療類風濕性關節炎的JAK抑制劑，薛鋒等，藥學進展，2014，38（4）：264～273）。（中國和日本類風濕性關節炎的比較研究，張鳳山，趙育松，ILAR－北京國際風濕性疾病研討會資料，1993）。
類風濕關節炎目前驗證最全面、療效確切的一類，包括TNF拮抗劑（依那西普、英夫利昔單抗、阿達木單抗）、IL-1R拮抗劑、IL-6單抗、CTL-4融合蛋白、抗CD20單抗等目前，我國RA患者應用TNF拮抗劑的比例不斷增加，2007年，一項全國16家大型綜合性三甲醫院關于RA用藥的多中心調查結果顯示，694例患者中使用生物制劑的比例為1.16%；2009年一項全國18家三甲醫院關于RA過去1年內用藥情況的多中心調查結果顯示，435例患者中使用生物制劑的比例為9%。TNF拮抗劑的出現使得RA患者的生活質量得到了顯著提高；但西班牙風濕病學會的學者對2000年2月正式推出的西班牙風濕病學會生物制品資料庫（BIOBADASER數據庫）中不同TNF拮抗劑長期使用的安全性、結核發生情況進行了分析，結果顯示：TNF拮抗劑治療的RA患者，其結核病患病率增加了12-20倍。
那么是什么原因造成這樣的結果呢？研究發現，生理情況下TNF-α可提高巨噬細胞的吞噬能力并殺死結核分枝桿菌，能夠促進結核分枝桿菌感染后周圍肉芽腫的形成，阻斷其播散。當TNF-α的作用被阻斷后，這些保護作用減弱或消失，因此應用TNF拮抗劑治療可能增加結核病的發生風險。（文獻報導：使用TNF拮抗劑會增加結核感染風險，白毅，中國醫藥報2015-06-03）
多發性硬化（Multiple sclerosis，MS)是中樞神經系統白質炎癥性脫髓鞘性自身免疫性疾病，髓鞘脫失與浸潤的淋巴細胞（CD4+ T)介導的細胞免疫有關。SOCS1能抑制JAK2誘導的STAT3的磷酸化,使用JAK2 抑制劑(AG490)可以模擬SOCS1對JAK2-STAT3的抑制作用。（SOCS1-JAK2-STAT3信號通路在C57BL/6小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型中作用機制探討，董梅等，中國免疫學雜志，2014，30（4）：459～463）。
I型糖尿病由自身反應性T細胞對分泌胰島素的胰島β細胞的選擇性進攻而繼發。在這種疾病中以JAK3為靶標是基于這樣的觀察：已知通過JAK途徑傳導信號的多種細胞因子參與β細胞的T細胞介導的自身免疫性損傷。事實上，JAK3 抑制劑，JANEX-1在I型糖尿病的NOD小鼠模型中顯示預防自發的自身免疫性糖尿病的發展。
增生疾病尤其是癌癥的方法。癌癥包含一組特征在于異常細胞的失控生長和擴散的疾病。通常，癌癥分類為實體瘤的癌癥 ( 如，前列腺癌、腎癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、頭頸部癌、甲狀腺癌、膠質母細胞瘤、卡波濟氏肉瘤、卡斯特萊曼病、黑色素瘤等)，血液癌癥 ( 如，淋巴瘤、白血病，諸如急性成淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病(AML) 或多發性骨髓瘤)，皮膚癌（諸如皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL) 和皮膚B細胞淋巴瘤以及示例性皮膚T細胞），淋巴瘤（包括塞澤里綜合征(Sezary syndrome)和蕈樣肉芽腫病）等。
移植排斥（同種異體移植排斥）包括但不限于例如腎、心臟、肝、肺、骨髓、皮膚和角膜的移植之后的急性和慢性同種異體排斥。已知T細胞在同種異體排斥的特異性免疫反應中起關鍵作用。超急性、急性和慢性器官移植排斥可以治療。超急性排斥發生在移植的幾分鐘內。急性排斥通常發生在移植的六至十二個月之內。超急性和急性排斥通常是可逆的，其中用免疫抑制劑治療。特征為器官功能的逐漸損失的慢性排斥是移植接受者持續關心的，因為其可在移植后的任何時間發生。
移植物抗宿主病(GVDH)是異源骨髓移植(BMT)的主要并發癥。GVDH由識別組織相容性復雜系統中的接受者差異并且對其作出反應的供體T細胞引起，這導致了顯著的發病率和死亡率。JAK3在誘導GVHD中起關鍵作用，用JAK3押制劑JANEX-1進行治療顯示出削弱GVHD嚴重性(綜述在Cetkovic-Cvrlje and Ucken，2004)。
干眼癥(DES，也稱為干燥性角膜結膜炎) 是眼科醫生治療的最常見問題之一。有時DES 被稱為淚液功能不全綜合征(Jackson，2009.Canadian Journal Ophthalmology44(4)，385-394)。DES影響最高達10%的年齡在20至45歲之間的人口，且百分比隨年齡增長。盡管可利用許多種類的人工淚液產品，但這些產品僅提供癥狀的暫時緩解。因此，需要治療干眼的制劑、組合物和治療方法。干眼有時也稱為干燥性角膜結膜炎，干眼癥的治療包括改善干眼癥的特定癥狀，如眼部不適、視覺障礙、淚膜不穩定、眼淚高滲透壓和眼球表面的炎癥。
因此，本發明的化合物及其藥學上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，及包含所述化合物的藥物組合物，用于預防或治療免疫、炎癥、自身免疫、增殖性疾病如癌癥、增生性疾病、過敏病癥或疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、干眼癥等的方法。
本發明有益的效果
通過本發明技術方案的實施，結果表明本發明所述的化合物式（I）具有良好的抑制JAK活性和藥代動力學性質，與Tofacitinib具有生物相似性，無細胞毒性，大鼠單次口服灌胃給藥未見明顯毒性。
具體實施方式
實施例1：將本發明式（I）、式（II）、式（I）、式（Ⅲ）、式（Ⅳ）、式（Ⅴ）優選的化合物、Tofacitinib和Decernotinib分別與JAK3進行分子對接，觀察其與JAK3靶標的結合情況。結合度好的化合物優選作為實施例2-31的化合物。結果見表1。
表1.與JAK3靶標的結合實驗結果
注：1.（A）80＜與JAK3靶標的結合度＜100；
2.（B）100＜與JAK3靶標的結合度＜120；
3.（C）120＜與JAK3靶標的結合度＜140；
4.（D）與JAK3靶標的結合度＞140；
5.Tofacitinib的結構式：
實施例2：N7-[1-(2,2-二氟-乙基)-1H-吡唑-4-基]-N4-[1-(5-氟-嘧啶-2-基)-乙基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
化合物結構：
合成路線：
合成方法：
取一定量的吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺一乙酰放置到三口燒瓶中，加2－5倍量的二氯甲烷，攪拌均勻，將2-2ˊ-氯乙基-5-氟嘧啶溶于2－10倍量二氯甲烷的溶液，然后慢慢加入到三口燒瓶中，加完后，－10度至80度反應1小時－10小時，放至室溫，蒸餾去除二氯甲烷至固體，三氯甲烷重結晶，得白色產物N7-[乙酰胺]-N4-[1-(5-氟-嘧啶-2-基)-乙基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，產率50％－60％。
取一定量的N7-[乙酰胺]-N4-[1-(5-氟-嘧啶-2-基)-乙基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，放置到三口燒瓶中，加3－10倍量的碳酸氫鈉溶液，攪拌均勻，通過雙排管技術排空反應體系的空氣，并充以氮氣，50度至100度反應2小時－7小時，冷卻后，加入二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉混合溶液，攪拌30min后，有機相蒸干，柱色譜純化得白色產物N4-[1-(5-氟-嘧啶-2-基)-乙基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，產率50％－80％。
取一定量的N4-[1-(5-氟-嘧啶-2-基)-乙基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，放置到三口燒瓶中，加2－3倍量二氯甲烷，攪拌溶解，加入1-(2,2-二氟-乙基)、4-氯咪唑，60度至100度反應5小時－10小時，放置室溫，蒸干二氯甲烷，柱色譜純化得白色產物N7-[1-(2,2-二氟-乙基)-1H-吡唑-4-基]-N4-[1-(5-氟-嘧啶-2-基)-乙基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，產率40％－70％。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.02(1H), δ7.02(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.8(3H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH)
實施例3：2-[2-(4-{1-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-乙基氨基}-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
化合物結構：
合成路線：
合成方法：
取一定量的吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺一乙酰放置到三口燒瓶中，加2－5倍量的二氯甲烷，攪拌均勻，將1-羥乙基、2氯、咪唑溶于2－10倍量二氯甲烷的溶液，然后慢慢加入到三口燒瓶中，加完后，30度至100度反應4小時－10小時，放至室溫，蒸餾去除二氯甲烷至固體，三氯甲烷重結晶，得白色產物N7-[乙酰胺]-N4-[1-羥乙基、2-咪唑]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，產率50％－60％。
取一定量的N7-[乙酰胺]-N4-[1-羥乙基、2-咪唑]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，放置到三口燒瓶中，加3－10倍量的碳酸氫鈉溶液，攪拌均勻，通過雙排管技術排空反應體系的空氣，并充以氮氣，50度至100度反應2小時－7小時，冷卻后，加入二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉混合溶液，攪拌30min后，有機相蒸干，柱色譜純化得白色產物N4-[1-羥乙基、2-咪唑]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，產率45％－80％。
取一定量的N4-[1-羥乙基、2-咪唑]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，放置到三口燒瓶中，加2－3倍量二氯甲烷，攪拌溶解，加入3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-氯乙基，60度至120度反應4小時－10小時，放置室溫，蒸干二氯甲烷，柱色譜純化得白色產物2-[2-(4-{1-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-乙基氨基}-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇，產率40％－60％。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.08(1H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1H), δ7.08(1H), δ7.27(1H), δ7.30(1H), δ7.34(1H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ3.80(3H), δ1.38(3H)
實施例4：2-[2-(7-{1-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-乙基氨基}-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3：
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ2.0(1-NH), δ4.08(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1H), δ7.34(1H), δ7.3(1H), δ7.27(1H), δ7.08(1H),δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ1.38(3H), δ3.80(3H)
實施例5：2-[2-(7-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-氨基}-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3：
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ6.65(1H), δ6.80(1H), δ7.10(1H), δ6.39(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.80(3H), δ2.78(3H)
實施例6：2-{2-[甲基-(4-{ [3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-甲氨基}-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基)-氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
化合物結構：
合成路線：
合成方法：
取一定量的吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺一乙酰放置到三口燒瓶中，加2－5倍量的二氯甲烷，攪拌均勻，將1-羥乙基、2氯、咪唑溶于2－10倍量二氯甲烷的溶液，然后慢慢加入到三口燒瓶中，加完后，30度至100度反應4小時－10小時，放至室溫，蒸餾去除二氯甲烷至固體，三氯甲烷重結晶，得白色產物N7-[乙酰胺]-N4-[1-羥乙基、2-咪唑]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，產率50％－60％。
取一定量的N7-[乙酰胺]-N4-[1-羥乙基、2-咪唑]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，放置到三口燒瓶中，加3－10倍量的碳酸氫鈉溶液，攪拌均勻，通過雙排管技術排空反應體系的空氣，并充以氮氣，50度至100度反應2小時－7小時，冷卻后，加入二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉混合溶液，攪拌30min后，有機相蒸干，柱色譜純化得白色產物N4-[1-羥乙基、2-咪唑]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，產率45％－80％。
取一定量的N4-[1-羥乙基、2-咪唑]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺，放置到三口燒瓶中，加2－3倍量二氯甲烷，攪拌溶解，加入3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-氯乙基，60度至120度反應4小時－10小時，放置室溫，蒸干二氯甲烷，柱色譜純化得白色產物2-[2-(4-{1-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-乙基氨基}-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇，產率40％－60％。
取一定量的2-[2-(4-{1-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-乙基氨基}-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇，放置到三口燒瓶中，加2－4倍量氯甲烷，攪拌，60度至120度反應4小時－10小時，放置室溫，蒸干二氯甲烷，乙醇重結晶純化得白色產物2-{2-[甲基-(4-{ [3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]- 甲氨基}-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基)-氨基]-咪唑-1-基}-乙醇，產率40％－60％。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.32(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ7.28(1H), δ7.29(1H), δ7.20(1H), δ7.02(1H), δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.8(3H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ2.47(3H), δ2.47(3H)
實施例7：2-{2-[甲基-(7-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-氨基}-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)-氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例6。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ3.81(2H), δ7.28(1H), δ7.29(1H), δ7.20(1H), δ7.02(1H), δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.80(3H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ2.47(3H), δ2.47(3H)
實施例8：2-[2-(甲基-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基}-氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例6。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ2.0(1-NH), δ3.91(2H), δ7.28(1H), δ7.29(1H), δ7.20(1H), δ7.02(1H), δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.80(3H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ2.47(3H)
實施例9：2-[2-(甲基-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基}-氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例6。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ7.28(1H), δ7.29(1H), δ7.20(1H), δ7.02(1H), δ8.20(1H), δ8.34(1H),δ3.80(3H),δ7.0(1H),δ7.0(1H),δ3.92(2H), δ4.01(2H),δ2.0(1-OH), δ2.47(3H)
實施例10：2-[2-(7-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-氨基}-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例6。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H),δ4.0(1-NH),δ6.6(1H),δ6.1(1H),δ3.81(2H),δ7.28(1H),δ7.29(1H),δ7.20(1H),δ7.02(1H),δ8.20(1H),δ8.34(1H),δ3.80(3H),δ7.0(1H),δ7.0(1H),δ3.92(2H),δ4.01(2H),δ2.0(1-OH), δ2.47(3H)
實施例11：N-(4-{[4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基]-甲基}-環己基)-丙烯酰胺
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
394.22
實施例12：2-(2-{7-[(2,7-二氫-嘌呤-3-甲基)-氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3：
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ2.0(1-NH), δ4.42(2H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ3.1(2H), δ7.50(1H),δ13.4(1-NH), δ7.7(1H)
實施例13：1-{4-[3-({4-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-乙酮
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ2.0(1-NH), δ3.91(2H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H),δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ7.28(1H), δ7.29(1H),δ7.20(1H), δ7.02(1H), δ8.4(1H), δ8.4(1H),δ2.2(3H)
實施例14：N4-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-N7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-吡咯[2,3-d]嘧啶e-4,7-二胺
化合物結構：
合成方法參照實施例3
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ2.0(1-NH), δ3.91(2H), δ7.0(1H), δ6.9(1H), δ3.63(3H), δ7.28(1H), δ7.29(1H), δ7.20(1H), δ7.02(1H),δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.80(3H)
實施例15：(3-{7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-乙酸甲基酯
化合物結構：
合成方法參照實施例3.
MS:458.19
實施例16：N7-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-N4-(4-甲基-4H-[1,2,4]三唑-3-基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
化合物結構：
合成方法參照實施例3.
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ2.0(1-NH), δ3.91(2H), δ8.0(1H), δ3.63(3H), δ7.28(1H), δ7.29(1H), δ7.20(1H), δ7.02(1H), δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.80(3H)
實施例17：2-(2-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.28(1H), δ7.29(1H), δ7.20(1H), δ7.02(1H), δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.80(3H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH)
實施例18：2-(2-{4-[(3H-苯并咪唑-4-甲基)-氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.06(1H), δ7.14(1H), δ7.51(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ8.08(1H), δ5.0(1-NH)
實施例19：2-(2-{4-[(2,9-二氫-嘌呤-3-甲基)-氨基]-4a,7a-二氫-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
395.19
實施例20：2-(2-{4-[(9-羥甲基-2,9-二氫-嘌呤-3-甲基)-氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.83(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ3.1(2H), δ7.50(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH),δ7.4(1H), δ5.97(2H), δ2.0(1-OH)
實施例21：2-{2-[7-(吡啶[2,3-d]嘧啶-6-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ7.88(1H), δ8.75(1H),δ8.78(1H), δ9.26(1H)
實施例22：N7-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-N4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H),δ7.28(1H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ7.0(1H),δ6.9(1H), δ3.63(3H), δ3.80(3H)
實施例23：(3-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-甲基磺酰胺
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
Δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ8.0(1H),δ3.80(3H), δ5.85(2H), δ2.0(2-NH)
實施例24：N4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-N7-(2-甲基-2H-[1,2,4]三唑-3-基)-吡咯[2,3-d]嘧啶-4,7-二胺
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ8.1(1H),δ3.80(3H), δ3.63(3H)
實施例25：(5-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-[1,2,4]三唑-1-基)-甲醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ8.1(1H),δ3.8(3H), δ5.97(2H), δ2.0(1-OH)
實施例26：N-(3-{4-[1-(3-哌啶-1-基-丙基)-1H-吡唑-4-基氨基]-吡咯[2,3-d]嘧啶-7-基氨基}-苯基)-丙烯酰胺
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.5(1H), δ7.4(1H), δ3.73(2H), δ1.87(2H), δ2.36(2H), δ2.24(2H), δ1.50(2H), δ1.50(2H),δ1.50(2H), δ2.24(2H), δ6.84(1H), δ7.00(1H),δ6.99(1H), δ6.20(1H), δ8.0(1-NH), δ6.48(H),δ6.17(H), δ5.71(H)
實施例27：3-{4-[7-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-哌啶-1-基}-3-氧-丙腈
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH),δ2.63(1H),δ2.6(1H),δ6.6(1H),δ6.1(1H),δ4.0(1-NH),δ1.69(2H), δ3.34(2H), δ3.34(2H), δ1.69(2H), δ3.30(2H), δ7.3(1H),δ7.5(1H), δ3.8(3H)
實施例28：N-(3-{7-[1-(3-哌啶-1-基-丙基)-1H-吡唑-4-基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-苯基)-丙烯酰胺
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ7.4(1H), δ7.5(1H), δ3.73(2H), δ1.87(2H), δ2.36(2H), δ6.84(1H), δ7.00(1H), δ6.99(1H), δ6.20(1H), δ8.0(1-NH), δ2.24(2H), δ1.50(2H), δ1.50(2H), δ1.50(2H), δ2.24(2H), δ6.48(H), δ6.17(H), δ5.71(H)
實施例29：2-(2-{7-[3-氟-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基氨基]-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH),δ6.45(1H), δ6.55(1H), δ6.13(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H),δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ8.20(1H), δ8.34(1H),δ3.80(3H)
實施例30：2-{2-[7-(1H-苯并咪唑-5-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ6.46(1H), δ7.45(1H), δ6.90(1H), δ7.0(1H) , δ7.0(1H), δ5.0(1-NH), δ8.08(1H) , δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH)
實施例31：2-{2-[7-(吡啶[2,3-d]嘧啶-6-基氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
化合物結構：
合成方法參照實施例3。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ8.39(1H), δ4.0(1-NH), δ6.6(1H), δ6.1(1H), δ4.0(1-NH), δ8.53(1H), δ7.26(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ9.26(1H),δ8.78(1H)
實施例32：對JAK的抑制作用
研究化合物對純化的重組JAK活性的影響,是從酶學水平研究化合物對JAK的抑制活性。其實驗原理為采用一種發光法激酶檢測方法，用于檢測JAK與底物Poly (4:1 Glu, Tyr)肽反應產生的ADP含量：ADP轉化為ATP后，ATP 即可作為Ultra-Glo熒光素酶催化反應的底物，產生光信號。發光信號與ADP的量和激酶活性正相關。因此，通過觀察化合物對JAK與底物反應產生的發光信號來確定其對重組的JAK的抑制效果，用IC50表示。
實驗方法：10個不同濃度的化合物分別在37℃與JAK1、JAK2和JAK3孵育60分鐘，然后加入底物及ATP混合，37℃反應50分鐘后加入25μlADP-Glo?混合2分鐘，室溫反應50分鐘。再加入50μl檢測試劑混合2分鐘，室溫孵育50分鐘，用化學發光儀檢測。結果見表2。
表2 對JAK的抑制作用實驗結果
注：1.（A）20nM 或更小；
2.（B）>20nM 至100nM；
3.（C）> 100nM
實施例33：對p-STAT5的抑制作用
JAK-STAT信號傳遞通路主要發生在白細胞中，因此參與免疫調節。 IL-3 激活細胞膜上的受體后導致JAK2發生自身磷酸化并激活。STAT蛋白結合在磷酸化的受體上并被JAK磷酸化。磷酸化的STAT與另外一個磷酸化的STAT蛋白結合形成二聚體并向細胞核轉移。在細胞核，STAT與DNA結合并促進基因轉錄，引起免疫反應。因此，通過觀察化合物對IL-3介導的STAT5（如下表所示）的磷酸化來確定其對JAK2的抑制效果。
實驗方法：將化合物按照11個不同濃度用DMSO稀釋，取200μl稀釋后的化合物加入24孔板；將TF-1細胞（ATCC TIB-202）用0.5%的血清饑餓過夜，然后將其調整到2×106 /ml，取200μl細胞加入到上述已經加入化合物的24孔板中，混勻后，37℃細胞培養箱孵育60分鐘；60分鐘后，每孔加入12ng的IL-3，37℃細胞培養箱再刺激60分鐘；刺激60分鐘后， 2%PFA室溫固定30分鐘；將固定后的細胞加入到BD流式管中，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入500μl甲醇，4℃孵育60分鐘穿膜；4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；每管加入5μl STAT5（pY694）抗體（562077），室溫避光孵育60分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm，5分鐘；每管加入300μlFACS buffer重懸，用流式細胞儀檢測，觀察化合物對p-STAT5的抑制作用，用IC50表示。結果見表3。
表3 對p-STAT5的抑制作用實驗結果
注：1.（A）200nM 或更小；
2.（B）>200nM 至2000nM；
實施例34 ：對p-STAT6的抑制作用
IL-4誘導STAT6的磷酸化是檢測抑制劑在JAK1-JAK3通路的細胞水平活性的關鍵實驗。
實驗方法：將化合物按照11個不同濃度用DMSO稀釋，取200μl稀釋后的化合物加入24孔板；將THP1細胞（ATCC TIB-202）調整到2×106 /ml，取200μl細胞加入到上述已經加入化合物的24孔板中，混勻后，37℃細胞培養箱孵育60分鐘；60分鐘后，每孔加入8ng的IL-4，37℃細胞培養箱再刺激60分鐘；刺激60分鐘后，用2%PFA室溫固定30分鐘；將固定后的細胞加入到BD流式管中，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入500μl甲醇，4℃孵育60分鐘穿膜；4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；每管加入5μlSTAT6（pY641）抗體（562078），室溫避光孵育60分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；每管加入300μlFACS buffer重懸，用流式細胞儀檢測，觀察化合物對p-STAT6的抑制作用，用IC50表示。結果見表4。
表4 對p-STAT6的抑制作用實驗結果
注：1.（A）200nM 或更小；
2.（B）>200nM 至2000nM；
實施例35 ：對膠原蛋白誘發的小鼠類風濕關節炎的影響
在膠原蛋白誘發的小鼠類風濕關節炎（CIA）模型中，研究選擇的化合物的抑制活性。Ⅱ型膠原蛋白（CII）大多存在于關節軟骨中，是一種與免疫系統隔絕的蛋白質，但在病理條件下可作為一種自身抗體呈現出來，50％類風濕關節炎（RA）患者血清中存在抗CII的自身抗體，這表明CII可誘導產生關節炎性質的自身免疫反應。
用10周齡雄性DBA-1小鼠進行二次免疫，初次免疫（在第０日）：酒精棉球消毒小鼠尾根部皮膚，于小鼠尾根部2-3cm處皮下注射乳化好的膠原蛋白100μl（CII與CFA體積比為1:1）（含CII 150μg和熱滅活的分枝桿菌50μg）；二次免疫（在第21日）：酒精棉球消毒小鼠尾根部皮膚，于小鼠尾根部2-3cm處皮下注射乳化好的膠原蛋白50μl（CII與IFA體積比為1:1）（含CII 75μg）。二次免疫后小鼠隨機分組，分為對照組(助溶劑組)和試驗組。試驗組將化合物懸浮于1%甲基纖維素的水懸浮液，在第23日開始給藥至第41日結束給藥，藥物劑量為30mg/kg，每次灌胃200μl，每天2次；對照組同法給予助溶劑。每日測評臨床炎癥癥狀分數。評分標準如下：0分：無紅斑和水腫；1分：兩只足小趾關節紅斑水腫；2分：全部趾關節或前腳掌紅斑水腫；3分：踝關節以下延伸到趾關節紅斑水腫；4分：踝關節至全爪紅腫或關節畸形。每只小鼠四肢評分相加總評分為小鼠關節炎指數，總分為16分。分別觀測對照組和試驗組小鼠炎癥癥狀，計算臨床炎癥癥狀分值，采用雙側、非配對t-檢驗法比較試驗組與對照組的臨床炎癥癥狀分值，評價化合物對膠原蛋白誘發的小鼠類風濕關節炎的影響，用P值表示。結果見表5。
表5 對膠原蛋白誘發的小鼠類風濕關節炎的影響
注：1.P＜0.05，試驗組與對照組小鼠臨床炎癥癥狀分值統計學分析比較差異有顯著性；
2.P＜0.01，試驗組與對照組小鼠臨床炎癥癥狀分值統計學分析比較差異有極顯著性。
實施例36 ：對人腫瘤細胞體外增殖的抑制作用
取人胃癌細胞SNU-5、肝癌細胞Hep-G2、肺癌細胞EBC-1、胃癌細胞BGC-823、腦星形膠質母細胞瘤U87MG、宮頸癌細胞Hela、乳腺癌細胞Bcap-37，將化合物用DMSO配制成20mM的溶液，將系列化合物和紫杉醇（儲液0.2mM）用DMSO 3倍梯度稀釋（10個濃度）；分別取5μl梯度稀釋好的化合物溶液和紫杉醇加入到495μl含有10% FBS的培養基中，配制成2X待測化合物。
取100μl含2X待測化合物、紫杉醇加到96孔板相應孔中，二氧化碳細胞培養箱培養72小時。
去除培養基，每孔加入XTT工作液（0.3mg/ml XTT；0.00265mg/ml PMS）150μl，二氧化碳培養箱中放置2小時，微孔板振蕩器震蕩5分鐘，酶標儀450nm讀取吸光值，計算化合物對人腫瘤細胞的抑制率（%），求得IC50值（μM）。結果見表6。
表6 對人腫瘤細胞體外增殖的抑制作用（IC50，μM）
實施例37 ：細胞毒性試驗
實驗原理：CCK8中的wst-8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產物（formazan）。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值，間接反映活細胞的數量，用于測定化合物的細胞毒性。
實驗方法：根據實驗過程中流式細胞儀及顯微鏡的形態觀察，各化合物毒性非常小。為了進一步定量確認化合物毒性，用CCK-8的方法檢測了HELA細胞的增殖，詳細方法如下：將化合物按照10個不同濃度用DMSO稀釋，取100ml稀釋后的化合物加入96孔板；將HELA細胞調整到2×105/ml，取100ml細胞加入到上述已經加入化合物的96孔板中，混勻后，37℃細胞培養箱孵育24小時；向每孔加入20μl CCK溶液；將培養板在培養箱內孵育4小時；用酶標儀測定在450nm處的吸光度。
實驗結果：各化合物均沒有濃度依賴性地改變細胞數量，表明這些化合物對HELA細胞無毒性。結果見表7。
表7 細胞毒性實驗結果
實施例38：大鼠急性毒性試驗
取化合物，觀察大鼠單次口服灌胃給藥急性毒性，計算LD50。結果見表8。
表8 大鼠單次口服灌胃給藥急性毒性實驗結果
注：1.（A）LD50＜10mg/kg；
2.（B）10mg/kg＜LD50＜50mg/kg；
3.（C）50mg/kg＜LD50＜100mg/kg；
4.（D）100mg/kg＜LD50＜500mg/kg；
5.（E）500mg/kg＜LD50＜1000mg/kg；
6.（F）LD50＞1000mg/kg。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。