本發明屬于醫療產品
技術領域：
，具體而言，涉及一種特異性檢測結核分枝桿菌感染的蛋白。
背景技術：
：我國體外診斷產業現正處于快速增長時期。然而巨大的市場需求與我國診斷試劑行業相對落后的自主研發能力的存明顯的差距。如何從源頭上開展自主創新，如何在診斷試劑原材料供應上不受制于個別境外醫藥巨頭，如何將現有的生物醫藥領域的科研成果轉化為產品是我國政府、科研院所和醫藥行業在近年來都非常關注的熱點。并且現今市場上對更靈敏、高效的診斷試劑提出了剛性需求，能夠快速準確的確診結核病患者對于醫務工作者和病人本人都具有重要意義。近年來數據調查結果顯示，有結核病癥狀的患者76.6％接受過結核病病前相關檢查，但是僅有35.8％被診斷為肺結核患者，提高病人發現率仍是當前結核病防治工作的重點也是難點。利用抗原特異性T細胞的細胞免疫反應進行病原微生物感染的體外診斷，是今年發展起來的一種新的檢測方法。我們通過分離新鮮全血中的外周血單核細胞并進行刺激培養，然后利用ELISPOT檢測能夠分泌IFN-γ的細胞的數量。該方法目前主要應用于結核分枝桿菌感染的診斷。目前臨床普遍采用的結核診斷主要依賴于臨床癥狀、影響學診斷和病原學診斷，對結核分枝桿菌潛伏性感染的診斷不敏感。同時，在結核病篩查過程中，直接檢測病原體或檢測結核分枝桿菌抗體的靈敏度和特異性也不理想。技術實現要素：針對上述臨床實際工作情況，我們篩選了結核分枝桿菌來源的蛋白片段，提供了一種檢測結核病的結核分枝桿菌標識物抗原，通過該抗原來體外檢測特異性T細胞免疫反應，可以作為診斷結核病患者的參照，用于診斷患者是否被結核分枝桿菌感染。同時，進一步動物實驗表明，該蛋白抗原能夠誘導針對結核分枝桿菌的免疫反應，具有制備相應的疫苗的功能。具體而言，本發明首先涉及一種結核分枝桿菌的特異性蛋白抗原Rv2465c，所述的抗原氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列結構為：編碼所述蛋白抗原Rv2465c的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，其DNA序列結構為：本發明還涉及所述的Rv2465c蛋白抗原作為檢測結核分枝桿菌的免疫原的應用，所述的應用包括，(1)將該Rv2465c蛋白抗原單獨用于檢測結核分枝桿菌；或(2)將該Rv2465c抗原與現有結核分枝桿菌檢測抗原聯用，用于檢測結核分枝桿菌。本發明還涉及所述的Rv2465c蛋白抗原在制備結核分枝桿菌檢測試劑盒中的應用，所述的應用為，(1)將所述的Rv2465c蛋白抗原單獨作為檢測抗原制備檢測試劑盒；或(2)將所述Rv2465c蛋白抗原和現有結核分枝桿菌檢測抗原協同聯用，增加現有抗原免疫檢測準確度。所述的現有結核分枝桿菌檢測抗原為結核分枝桿菌來源的ESAT-6抗原、CFP10抗原、PPD抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。本發明還涉及由所述的Rv2465c蛋白抗原制備的單一抗原型結核分枝桿菌檢測試劑盒，所述試劑盒包含，(1)檢測有效量濃度(優選濃度為75ug/ml)的Rv2465c蛋白抗原；(2)必要的檢測試劑及顯色試劑。本發明還涉及包含所述的Rv2465c蛋白抗原的多抗原聯用型結核分枝桿菌檢測試劑盒，所述試劑盒包含，(1)檢測有效量濃度(優選濃度為75ug/ml)的Rv2465蛋白抗原，以及檢測有效量的其他抗原；(2)必要的檢測試劑及顯色試劑。本發明還涉及所述的單一型或聯用型結核分枝桿菌檢測試劑盒的應用，其特征在于，所述的檢測方法為，(1)檢測樣品為由待測患者血樣制備得到的抗凝全血或PBMC細胞；(2)Rv2465c蛋白抗原作為免疫原與抗凝全血或者PBMC細胞孵育20-30個小時，優選20-24個小時(3)檢測受到Rv2465c蛋白抗原刺激分泌的細胞因子，與陽性參照對比確定檢測結果，所述的細胞因子為IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-10和IL-12，優選IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta，進一步優選IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13，最優選IFN-gamma。本發明還涉及所述Rv2465c抗原在制備抗結核分枝桿菌的疫苗中的應用。附圖說明圖1.Rv2465c蛋白質SDS-PAGE檢測圖，左側為Marker(單位Kd)，具體實施方式1、儀器試劑1.1抗生素與IPTG名稱縮寫分子量儲液工作液溶劑卡那霉素Kan58.2830mg/ml30ug/ml水異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG238.301M0.05mM水1.2培養基的配制LB培養基：10g蛋白胨、5g酵母膏、10g氯化鈉(1L的量)加單蒸水至1L，檢測PH＝6.8-7.2左右。如果PH偏差大于0.5，需要用NaOH或者HCl調節。固體的LB培養基多增加15-20％的瓊脂1.3純化bufferlysisbuffer：20mMTris-HCl、500mM氯化鈉、10％甘油、pH7.5Washbuffer：20mMTris-HCl、20mM咪唑、500mM氯化鈉、10％甘油、pH7.5Elutionbuffer：20mMTris-HCl、250mM咪唑、500mM氯化鈉、10％甘油、pH7.5離子交換緩沖液A：10mMPB、50mMNaCl、pH7.5離子交換緩沖液B：10mMPB、0.5MNaCl、、pH7.5PBS:1.8mMKH2PO4、10mMNa2HPO4、140mMNaCl、2.7mMKCl、pH7.4其他試劑固化Ni+層析樹脂Novagen，Ni-NTAHis，(Cat.NO70691-5，北京華美；2-8度保存)；蛋白結合能力大于5mg/mlresin層析柱(玻璃或者聚丙烯)PMSF(根據蛋白性質選擇是否添加)HiTrapTMQHP：(GE)實施例1.Rv2465c-pDEST17表達載體構建基礎流程以LREnzymemix催化Rv2465c的入門載體(美國CraigVentorInstitute下設的PFGRC所免費提供)和17載體重組生成Rv2465c的表達載體。具體方法：A.克隆反應體系：Rv2465c的入門載體1.5μL，17載體1μL，BPIIEnzymemix2.5μL；反應條件：25℃，過夜反應。B.轉化方法：反應體系中加入100μL大腸桿菌DH5α感受態(自制)，冰浴30min后，42℃熱激90s，體系冰上放置10min，加入200μLLB培養基復性后，涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養基上，37℃培養20h。C.質粒提?。阂訬96高純度質粒小提試劑盒(DP114)提取質粒，獲得Rv2465c的表達載體。D.酶切驗證：以BsrG1酶切試劑盒(R0575SNEB)酶切質粒驗證克隆是否完成，結果顯示，酶切片段大小約為1200bp，質粒構建成功。實施例2.目標蛋白Rv2465c的表達及復性1.蛋白表達a)LB平板劃線活化(加入kan)，37℃靜置過夜(16h左右)。b)將轉化了實施例1制備獲得的整合了Rv2465c的表達載體的大腸桿菌宿主細胞接種于5ml液體LB培養基(加入5ulkan)37℃200rpm，培養至OD大于0.6-0.8(大約3h)。c)按接種量5ml接種于300mlLB液體培養基中，37℃，200rpm培養至OD600≈0.6-0.8(大約2h)。降溫到16℃，加入終濃度0.04mMIPTGd)16℃，200rpm培養培養16h，4℃，4000rpm離心10min收集菌體。2.蛋白純化a)菌體重懸：每1L培養基所收集的菌體用40ml左右lysisbuffer重懸(加入1％蛋白酶抑制劑PMSF，則終濃度為1mM)b)菌體破碎：超聲6s每次、功率為38％，超聲20min。(懸濁液透亮為標準，酌情調整超聲工作總時間)。c)去除細菌碎片：4℃，12000g離心30分鐘。d)Ni柱處理：3mlNi柱先用水處理10cv(10倍柱體積)，再用10cvlysisbuffer作為平衡液平衡，流速為30cm/h。e)上樣：破菌離心上清以30cm/ml的流速進行上樣，收集流穿峰。f)平衡：樣品上樣后用平衡液平衡6cv。g)洗滌：用washbuffer洗滌6cvh)洗脫：用elutionbuffer洗脫，分管收集。用bradford試劑檢測洗脫液，了解蛋白是否完全洗脫。如含有蛋白，則繼續洗脫，直至完全。i)透析：洗脫蛋白裝入7KD的透析袋中放入裝有100倍洗脫蛋白體積的離子交換緩沖液A的燒杯中進行透析過夜。離心取上清。j)分子篩層析層析柱：HiTrapTMQHP(根據樣品的量來確定層析介質的體積)流速；60cm/h層析過程：先用水處理5cv，再用0.5MNaOH處理半小時，在用離子交換緩沖液A平衡層析，直至層析柱電導和pH流出液與離子交換緩沖液A一致。透析離心上清作為樣品上樣，離子交換緩沖液A平衡3cv，線性洗脫0-50％B走10cv，收集洗脫峰。k)檢測：SDS-PAGE檢測目的蛋白是否存在，純度是否大于90％，蛋白濃度和內毒素是否合格。蛋白儲存緩沖液：10mMPB+50mMNaCl結果如圖1所示，SDS-PAGE電泳結果顯示，提純后的蛋白的分子量約為20KD，純度大于90％，蛋白濃度和內毒素合格。實施例3.目標蛋白Rv2465c的免疫原性測試為了檢測Rv2465c的免疫原性及其對于現有抗原檢測試劑盒的增強效果，對于來自北京胸科醫院臨床確診的多個病例進行了進一步的抗原檢測篩選。測試血樣：來自北京胸科醫院就診患者陽性對照試劑與耗材：T-SPOT試劑盒(ESAT-6和CFP10雙抗原試劑盒)，Oxfordimmunotec(英國)產品，陰性對照：Rv2327蛋白抗原，隨機選取的另一段來源于結核分枝桿菌的已知蛋白片段Rv2327，其氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQIDNO.3及SEQIDNO.4所示SEQIDNo.3SEQIDNo.4實驗方法及評價方法如下：1)肝素抗凝血，抗凝血樣本按體積1:1與RPMI1640混勻；按2-3:1比例小心將血樣加在Ficoll淋巴細胞分離液上層；2)1000g離心22分鐘；水平轉子，緩升緩降；3)將單核細胞層(位于離心管中間層，為一層較薄的白膜狀)從Ficoll分離管中轉移到已加10mlAIM-V培養液的無菌15ml離心管，輕輕混勻，室溫600g離心7min；4)小心去除上清，加入1mlAIM-V，輕緩重懸細胞，加入AIM-V培養液至10ml,350g離心7min；5)小心棄上清，加入1mlAIM-V培養液重懸細胞；6)細胞計數及稀釋，取10μl細胞懸液加入40μl的1％trypanblue，制備1：5細胞稀釋液，進行活細胞計數，計算細胞稀釋需要的體積并加入相應的AIM-V無血清培養液制備細胞稀釋液，試劑盒檢測要求加入每孔(24孔PVDF膜板)細胞數量2.5×105；7)將培養板從鋁封袋中取出，按順序加入：50μlAIMV至陰性對照孔；50μl抗原ESAT-6至抗原A孔；50μl抗原CFP10至抗原B孔；50μl陽性對照至陽性對照孔；在上述4孔中分別加入已制備細胞稀釋工作液100μl。50μl實施例2制備獲得的Sampleprotein(初始濃度為60ug/ml)加入到樣品孔中，隨后加入培養基和細胞，樣品孔中Sampleprotein的終濃度為初始濃度的1/3。8)將培養板放入37℃，5％CO2培養箱孵育16-20hrs。9)用無菌PBS按1:200制備新鮮酶標抗體工作液。從培養箱取出培養板，棄去孔內液體。以200μl/well無菌PBS洗滌4遍。10)加入50μl/well酶標抗體工作液，將培養板在2-8℃孵育1小時。用PBS洗滌4遍去除未結合酶標抗體。11)每孔加入室溫平衡過的底物工作液50μl，室溫反應7分鐘。以蒸餾水沖洗終止反應，在37℃2-3hrs或室溫過夜干燥培養板。免疫原測試結果和分析：免疫原性測試在胸科醫院分子生物學實驗室進行，測試選用一定數量的已臨床確診的結核病患者，通過使用各種蛋白抗原檢測上述已確診患者的血樣，并由此結果分析Rv2465c蛋白抗原的免疫原性及應用方向，具體的檢測結果統計見下表1所示，表1.Rv2465c抗原對住院已確診結核病患者的結核分枝桿菌檢測結果*注：無反應應答患者不同于T-spot試劑盒檢測無應答對象。相比于與市售T-spot試劑盒的檢測結果，Rv2465c蛋白抗原的檢測效果顯示，有兩例樣本是T-SPOT試劑盒檢測為陰性，而Rv2465c免疫原能夠檢測出結果；可見，Rv2465c免疫原靈敏度要高于市場上的T-SPOT試劑盒，但是信號強度一般，因此，該Rv2465c免疫原可以單獨使用或是用來和其它市售免疫原聯合使用，從而更有效的提高檢出率。最后需要說明的是，以上實施例僅供本領域技術人員理解本發明的實質，并不用作對本法保護范圍的限定。當前第1頁1 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