一種構建測序用DNA文庫的方法與流程

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及構建測序用DNA文庫的方法，由該方法構建的測序用DNA文庫以及該測序用DNA文庫在測序中的應用。
背景技術：
：一般而言，二代DNA測序使用包含用于測序的雙鏈DNA的測序用DNA文庫來進行。所述用于測序的雙鏈DNA中，單個的待測序DNA片段被插入在5'序列與3'序列之間，所述5'序列與3'序列分別包含與測序引物匹配的堿基序列。由于二代DNA測序技術的限制，所述單個的待測序DNA片段的長度通常為約10bp～500bp。在使用上述測序用DNA文庫進行的二代DNA測序中，需要對每個包含單個的待測序DNA片段的用于測序的雙鏈DNA分別讀取數據，即，一個測序流程中只能獲得一個待測序DNA片段的數據，盡管現有的測序儀已經可以從雙鏈DNA的兩端同時讀取數據。使用這種傳統的測序用DNA文庫進行測序，測序試劑用量大、測序用時長，因而測序成本高、測序效率低。技術實現要素：鑒于上述現有技術中存在的不足，本發明的目的在于提供一種構建測序用DNA文庫的方法以及使用采用該構建測序用DNA文庫的方法構建的測序用DNA文庫進行測序的方法，其中，使用采用該構建測序用DNA文庫的方法構建的測序用DNA文庫進行測序能夠減少測序試劑用量、縮短測序用時，因而能夠降低測序成本、提高測序效率。本發明的發明人為解決上述技術問題進行了深入研究，結果發現：通過在傳統的構建測序用DNA文庫的方法中，將雙3'端加A的步驟變更為單3'端加A的步驟并增加平末端連接步驟，就能夠在用于測序的雙鏈DNA的5'序列與3'序列之間插入至少兩個以上的待測序DNA片段，這樣就能夠在測序步驟中從所述雙鏈DNA的兩端同時讀取兩個待測序DNA片段的數據，從而能夠減少測序試劑用量、縮短測序用時。即，基于上述認識的本發明包括：1.一種構建測序用DNA文庫的方法，其包括：步驟B-1：將平末端DNA片段中的至少一部分進行單3'端加A，得到單3'端加A的DNA片段；和步驟B-2：將步驟B-1中得到的單3'端加A的DNA片段進行平末端連接。2.根據項1所述的構建測序用DNA文庫的方法，其還包括：在所述步驟B之前進行的步驟A：將希望進行測序的DNA片段進行末端修復，得到平末端DNA片段；在所述步驟B-2之后或與所述步驟B-2同時進行的步驟C：將所述步驟B-2中的所述平末端連接的產物加接頭，得到加接頭DNA片段；和在所述步驟C之后進行的步驟D：將所述加接頭DNA片段進行PCR擴增，得到擴增產物。3.根據項1或2所述的構建測序用DNA文庫的方法，其還包括：在所述步驟D之后進行的步驟E：對所述擴增產物進行片段選擇。4.根據項1～3中任一項所述的構建測序用DNA文庫的方法，其還包括：在所述步驟E之后進行的步驟F：對經過片段選擇后的擴增產物進行純化。5.根據項1～4中任一項所述的構建測序用DNA文庫的方法，其還包括：在所述步驟C之后進行的步驟C1：對所述加接頭DNA片段進行片段選擇；且在所述步驟D中將經過片段選擇的加接頭DNA片段進行PCR擴增，得到擴增產物。6.根據項1～5中任一項所述的構建測序用DNA文庫的方法，其中，選擇出包含至少兩個以上的希望進行測序的DNA片段的擴增產物。7.一種測序用DNA文庫，其中，包含至少兩個以上希望進行測序的DNA片段的雙鏈DNA占全部雙鏈DNA的至少10mol％。8.根據項7所述的測序用DNA文庫，其是采用項1-6中任一項所述的構建測序用DNA文庫的方法構建的。9.一種測序方法，其中，以項7或8所述的測序用DNA文庫作為對象進行測序。10.根據項9所述的測序方法，其中，所述測序為雙端測序。11.根據項9或10所述的測序方法，其中，所述測序利用Illumina平臺進行。發明效果構建測序用DNA文庫的方法構建的測序用DNA文庫所包含的用于測序的雙鏈DNA中，5'序列與3'序列之間允許插入至少兩個以上的待測序DNA片段，這使得在采用雙端測序模式的情況下，能夠在一個測序流程中同時從用于測序的雙鏈DNA的兩端讀取數據，從而能夠減少測序試劑用量、縮短測序用時，因而能夠降低測序成本、提高測序效率。同時，單3'端加A技術節省了構建文庫使用的試劑，降低了構建DNA文庫及測序的成本。附圖說明圖1是本發明的文庫構建流程與傳統文庫構建流程的對比說明圖；圖2是實施例2采用安捷倫2100生物分析儀檢測DNA文庫片段大小結果示意圖；圖3是實施例3的雙端測序堿基分布圖；圖4是實施例3的單端測序堿基分布圖；圖5是實施例3的雙端測序質量分布圖；圖6是實施例3的單端測序質量分布圖。發明的具體實施方式首先，在一個方面中，本發明提供一種構建測序用DNA文庫的方法(本發明的構建測序用DNA文庫的方法)，其包括：步驟B-1：將平末端DNA片段進行單3'端加A，得到單3'端加A的DNA片段；和步驟B-2：將步驟B-1中得到的單3'端加A的DNA片段進行平末端連接。如圖1的右圖所示，在傳統的構建測序用DNA文庫的方法中，是將經過末端修復而得到的平末端DNA片段進行雙3'端加A，而本發明的構建測序用DNA文庫的方法與傳統不同的是：將經過末端修復而得到的平末端DNA片段進行單3'端加A，從而得到單3'端加A的DNA片段，而且，本發明的構建測序用DNA文庫的方法中還將得到的單3'端加A的DNA片段進行平末端連接。通過上述步驟，可以使進行平末端連接而得到的包含至少兩個希望進行測序的DNA片段的DNA片段在后續步驟中作為一個整體插入到用于測序的雙鏈DNA的5'序列與3'序列之間。上述平末端DNA片段的單3'端加A可以通過任何本領域技術人員已知的方法來實現，例如，可以通過使用具有上述功能的DNA聚合酶(例如缺失3'端到5'端外切酶活性的Klenow片段)來進行。本領域技術人員可以在常規的雙3'端加A的酶反應的基礎上，通過減少酶用量、降低反應溫度、和/或縮短反應時間容易地實現單3'端加A。上述單3'端加A的DNA片段的平末端連接可以通過任何本領域技術人員已知的方法來實現，例如，可以通過使用具有平末端連接功能的DNA連接酶(例如T4DNA連接酶、T3DNA連接酶)來進行。優選地，本發明的構建測序用DNA文庫的方法還包括：在所述步驟B之前進行的步驟A：將希望進行測序的DNA片段進行末端修復，得到平末端DNA片段；在所述步驟B-2之后或與所述步驟B-2同時進行的步驟C：將所述步驟B-2的平末端連接產物加接頭，得到加接頭DNA片段；和在所述步驟C之后進行的步驟D：將所述加接頭DNA片段進行PCR擴增，得到擴增產物。上述步驟A、C、D均可采用本
技術領域：
的常規方法來進行。需要說明的是，由于步驟B-2和步驟C均可通過使用一些DNA連接酶(例如T4DNA連接酶、T3DNA連接酶)來進行，所以可以使用上述DNA連接酶(例如T4DNA連接酶、T3DNA連接酶)將步驟B-2和步驟C同時進行。對于步驟A中的“希望進行測序的DNA片段”沒有特殊限制，從測序儀可接受的角度來看，優選是10～1000bp左右、更優選是20～800bp左右、更優選是30～750bp左右、更優選是40～700bp左右、更優選是50～650bp左右、更優選是100～600bp左右、更優選是150～550bp左右的DNA片段。優選地，本發明的構建測序用DNA文庫的方法還包括在所述步驟D之后進行的步驟E：對所述擴增產物進行片段選擇。優選地，在所述步驟C之后進行的步驟C1：對所述加接頭DNA片段進行片段選擇；且在所述步驟D中將經過片段選擇的加接頭DNA片段進行PCR擴增，得到擴增產物。該步驟C1和E中優選選擇出插入了至少兩個以上的希望進行測序的DNA片段的擴增產物(即盡量去除只插入了一個希望進行測序的DNA片段的、或未插入希望進行測序的DNA片段的擴增產物)。上述片段選擇可以采用本
技術領域：
的常規方法來進行，例如可以通過使用磁珠來進行。在通過使用磁珠進行片段選擇的情況下，可以例如根據要選擇出的擴增產物的大小調整磁珠的用量，從而獲得目的擴增產物。優選地，在本發明的構建測序用DNA文庫的方法的各個步驟之間例如步驟A與步驟B-1之間、步驟B-1與步驟C之間、步驟C與步驟C1之間、步驟C(或C1)與步驟D之間、步驟D與步驟E之間，和/或在步驟E之后可以加入對DNA片段進行純化的步驟。該純化步驟可以采用本
技術領域：
的常規方法來進行，例如可以通過使用純化磁珠來進行。本發明的構建測序用DNA文庫的方法與傳統方法的顯著區別在于其追求將至少兩個以上的希望進行測序的DNA片段整合在一個用于測序的雙鏈DNA中，而傳統方法則要避免這種情況。因此，在一個方面中，本發明提供一種測序用DNA文庫(本發明的測序用DNA文庫)，其中，包含至少兩個以上希望進行測序的DNA片段的雙鏈DNA占全部雙鏈DNA的比例顯著高于傳統的測序用DNA文庫，該比例可以為例如至少10mol％，優選至少20mol％，更優選至少30mol％，更優選至少40mol％，更優選至少50mol％，更優選至少60mol％，更優選至少70mol％，更優選至少80mol％，更優選至少90mol％。本發明的測序用DNA文庫可以采用例如本發明的構建測序用DNA文庫的方法來構建。此外，在一個方面中，本發明提供一種測序方法(本發明的測序方法)，其中，以本發明的測序用DNA文庫作為對象進行測序。除了以本發明的測序用DNA文庫作為對象之外，本發明的測序方法可以采用本
技術領域：
的常規方法來進行。優選地，本發明的測序方法可以采用雙端測序，例如利用Illumina平臺(例如HiSeq2500或NextSeq500)進行的雙端測序。實施例以下通過實施例對本發明進行更具體的說明。應當理解，此處所描述的實施例是用于解釋本發明，而非用于限定本發明。實施例1采用本發明的方法構建測序用DNA文庫(1)希望進行測序的DNA片段的準備本實施例中使用的希望進行測序的DNA片段是一些約300bp的DNA片段與一些約180bp的DNA片段的混合物，這些雙鏈DNA片段中的一些是平末端的，另一些包含3′或5′突出末端。(2)進行末端修復，得到平末端的DNA片段A.反應體系如下：步驟(1)得到的DNA片段42μLdNTPs的混合物(10mM)1μLT4DNA聚合酶1μLT4PNK(T4多核苷酸激酶)1μLPNK緩沖液5μL共有50μLB.在PCR儀孵育30分鐘，溫度20℃；C.用磁珠對反應后產物進行純化，用19.5μL的洗脫緩沖液EB(ElutionBuffer)洗脫，得到平末端DNA片段。(3)對平末端DNA片段進行單3'端加A處理反應體系如下：步驟(2)獲得的平末端DNA片段19.5μLKlenow緩沖液(10×)2.5μLdATP(1mM)2.5μLKlenow片段(缺失3′到5′外切酶活性)0.05μLddH2O0.45μL共有25μL在PCR儀孵育30分鐘，溫度37℃。(4)特異性接頭(Adapter)連接，純化；為了能夠在PCR中進行特異性擴增，需要在(3)中得到的單3'端加A片段兩端加上特異性接頭(Adapter)，連接反應所需接頭序列在使用時需等比例混合。接頭序列如下：接頭序列1：5'P-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3'接頭序列2：5'P-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'A.反應體系如下：步驟(3)中獲得的DNA片段25μLDNA連接酶緩沖液(2×)25μLT4DNA連接酶(1單位/μL)1μLAdapter(0.04pmol/μL)1μL共有52μLB.在PCR儀孵育15分鐘，溫度20℃。C.純化—用磁珠對反應后產物進行純化，用19μL的洗脫緩沖液EB(ElutionBuffer)洗脫，得到兩端加接頭的DNA片段。需要說明的是，在該步驟中將(3)中得到的單3'端加A片段進行了平末端連接。(5)對兩端連接接頭的DNA片段進行PCR擴增、純化對兩端加接頭的DNA片段進行PCR擴增，一方面在PCR的過程中將DNA片段兩端添加上與測序引物匹配的堿基序列，另一方面保證DNA片段有足夠的總量用來進行接下來的測序。PCR擴增中所用到的引物序列：PCR引物1：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'PCR引物2：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'A.反應體系如下：兩端加接頭的DNA片段17μL2×DNA聚合酶擴增混合物25μLPCR引物1(10pmol/μL)4μLPCR引物2(10pmol/μL)4μL共有50μLB.加樣之后放到PCR中，94℃保持2分鐘；(94℃15秒；62℃30秒；72℃30秒)17個循環；然后72℃保持10分鐘；最后將樣本保持在4℃保存。C.片段選擇純化用磁珠對反應得到的產物進行片段選擇純化(步驟如下述)，用一定量的洗脫緩沖液EB(ElutionBuffer)洗脫，從而完成了測序用DNA文庫制備，將該測序用DNA文庫保存在適當環境備用。a.室溫中將AmPure磁珠平衡30分鐘。b.根據待純化的樣本數量，取相同數量的1.5mLEP管標記為EP管。c.將a中平衡好的磁珠，渦旋混勻，并向b中的1.5mLEP管中分裝32.5μL磁珠。d.將PCR產物c中磁珠混合，吹打混勻，室溫靜置5分鐘。移到磁力架上靜止3分鐘，棄上清。e.將d中的1.5mLEP管轉移至磁力架上，靜置3分鐘，棄上清。f.向1.5mLEP管中加入300μL70％乙醇，反復吹打3～6次，棄上清。重復本步驟。吸凈乙醇，室溫晾干5分鐘。g.將1.5mLEP管從磁力架上移至EP管架上，向每個EP管中加入52μL洗脫液，反復吹打15～20次。室溫5分鐘，移到磁力架上，靜止1分鐘。h.上清即為經片段選擇純化后得到的文庫DNA，將上清轉移至新的EP管中，用于直接測序或存放于-20℃冰箱中。實施例2檢測測序用DNA文庫的質量將實施例1構建的DNA文庫采用安捷倫2100生物分析儀檢測文庫的片段大小。使用安捷倫2100生物分析儀檢測文庫，能夠了解構建的文庫片段是否符合上述文庫質量標準，檢測結果見圖2，從圖2中可以了解，①主要有480bp±10％和660bp±10％兩種不同大小的片段；②480bp±10％的片段所占比例約為50％～70％，660bp±10％的片段所占比例約為30％～50％。以上說明實施例1得到的DNA文庫構建合格。實施例3利用IlluminaNextSeq500對測序用DNA文庫進行測序將實施例1構建完成的測序用DNA文庫分別進行單端測序和雙端測序，測序所使用的試劑為NextSeqTM500HighOutputv2Kit，測序結果如圖3～6所示。從圖3和圖4的堿基分布圖能夠了解到：以上述測序用DNA文庫作為對象分別進行單端測序與雙端測序所得結果基本一致。從圖5和圖6的質量分布圖能夠了了解到：質量曲線平滑，無落點。還需要說明的是，在可實施且不明顯違背本發明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術方案的構成部分所描述的任一技術特征或技術特征的組合同樣也可以適用于其它技術方案；并且，在可實施且不明顯違背本發明的主旨的前提下，作為不同技術方案的構成部分所描述的技術特征之間也可以以任意方式進行組合，來構成其它技術方案。本發明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術方案，并且這些技術方案相當于記載在本說明書中。上述說明示出并描述了本發明的優選實施例，如前所述，應當理解本發明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域技術人員所進行的改動和變化不脫離本發明的精神和范圍，則都應在本發明所附權利要求的保護范圍內。工業實用性以采用本發明的構建測序用DNA文庫的方法構建的測序用DNA文庫進行測序，能夠降低測序成本、提高測序效率。當前第1頁1 2 3