睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體及其修飾型突變體和應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體、DNA、重組表達載體、遺傳工程宿主細胞、修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體、所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體以及修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體的應(yīng)用、藥物組合物。

背景技術(shù)：

睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary neurotrophic factor,簡稱CNTF)因為最初是從雞的睫狀體中提取出來，并可維持雞副交感神經(jīng)節(jié)的存活而得名。CNTF全長由200個氨基酸組成，第17位有Cys，無分子內(nèi)二硫鍵，無糖基化位點。CNTF全長分子量在23KD左右。在體內(nèi)以兩個二聚體形式進行儲存，經(jīng)過酶解成單體后發(fā)生生物學(xué)作用。CNTF可以促進包括：運動神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元、交感神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元等多種神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長和分化。90年代，在將CNTF用于治療肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，對一組ALS患者進行臨床研究發(fā)現(xiàn)病人的體重大大降低，使用藥物組體重比安慰劑組明顯降低。而且這一結(jié)果持續(xù)整個研究過程。針對這一結(jié)果在肥胖癥領(lǐng)域進行實驗，結(jié)果表明CNTF在體內(nèi)可與下丘腦的特異性受體結(jié)合，激活抑制食欲的關(guān)鍵信號通路，抑制進食欲望且使機體不會產(chǎn)生饑餓感，從而使體重減輕。研究發(fā)現(xiàn)，CNTF具有多種功能，能促使多種神經(jīng)細胞的存活、營養(yǎng)肌肉、促進糖、脂代謝和調(diào)節(jié)能量平衡以及攝食行為。在神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉系統(tǒng)，肥胖癥極其相關(guān)疾病的治療中具有重要意義和廣闊的臨床前景。

CNTF是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常使用CNTF突變體解決CNTF的生物活性不高以及表達量低的問題。因此，目前現(xiàn)有技術(shù)中已開發(fā)出了多種CNTF的突變體(或稱變異體)，多種重組人睫狀神 經(jīng)營養(yǎng)因子是市售的。CNTF突變體或變異體的制備方法在現(xiàn)有技術(shù)中也是已知的，例如中國專利CN1687413A公開了一種CNTF突變體(hCNTF)，第17位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼幔坏?3位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?；?4位的組氨酸突變?yōu)楸彼?；并去除了C末端1-30個氨基酸。CN1760205A公開了一種CNTF突變體(hCNTF)，第17位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，并去除了C端的16個氨基酸；而且第53位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第35位的蘇氨酸突變?yōu)榈鞍彼幔?78位的苯丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸。CN1844392也公開了睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的突變體。

但上述CNTF的突變體或變異體仍存在體內(nèi)的作用時間短，要求反復(fù)多次給藥；免疫原性強副反應(yīng)嚴重，給病人帶來巨大的經(jīng)濟壓力和精神壓力的缺點。因此，目前選擇使用PEG修飾后的蛋白，其有以下優(yōu)勢：分子量增大、半衰期延長、免疫原性降低。PEG擁有獨特的親-疏水平衡：當(dāng)偶聯(lián)到藥物分子表面時，將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物，改變它們在水溶液中的生物分配行為和溶解性，在其修飾的藥物周圍產(chǎn)空間屏障，減少藥物的酶解。覆蓋蛋白表面的抗原決定簇，降低蛋白的免疫原性。這樣，可以增加蛋白的分子量和體積，減少腎小球的濾過作用，使蛋白在體內(nèi)作用時間更長。聚乙二醇(PEG)于1940年首次商業(yè)生產(chǎn)化。PEG的使用通過了美國FDA認證，符合美國藥典(USP)、國家處方集(NF)、食品化學(xué)法典(FCC)標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、個人護理品、化學(xué)、醫(yī)藥化工等生產(chǎn)生活領(lǐng)域。

利用PEG類修飾劑修飾CNTF或CNTF突變體的最大的問題在于，修飾位點不穩(wěn)定，如在20種構(gòu)成CNTF的常見氨基酸中，具有極性的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團都能夠進行化學(xué)修飾，包括賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等；而且以上幾種極性氨基酸的N-端氨基和C-端羧基也可以進行修飾，這樣會使得很難獲得穩(wěn)定的修飾位點和修飾方式，導(dǎo)致修飾的專一性降低與修飾的穩(wěn)定性下降。而且修飾位點往往處于蛋白質(zhì)的活性中心部位，因此修飾后蛋白活性損失較大。

另外，根據(jù)2015版藥典的質(zhì)量要求，治療性蛋白的PEG修飾需專一位點的修飾。然而，無論是天然的全長CNTF還是上述專利申請開發(fā)的CNTF突變體，均無法提供唯一的修飾位點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體、DNA、重組表達載體、遺傳工程宿主細胞、修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體、所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體以及修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體的應(yīng)用、藥物組合物。

具體而言，本發(fā)明提供了：

(1)一種睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體是在天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的氨基酸序列的基礎(chǔ)上發(fā)生突變得到的，所述突變包括：第26位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄蛄涟彼帷⒌?6位的賴氨酸突變?yōu)榫彼?、?60位的賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊虻鞍彼?；并且其中所述睫狀神?jīng)營養(yǎng)因子突變體保留了天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子第40位的賴氨酸。

(2)根據(jù)(1)所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述突變包括：第26位的賴氨酸突變?yōu)榱涟彼?、?6位的賴氨酸突變?yōu)榫彼帷⒌?60位的賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０贰?/p>

(3)根據(jù)(1)或(2)所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述突變還包括：第17位半胱氨酸突變?yōu)楸彼帷⒌?3位谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?、以及去除天然睫狀神?jīng)營養(yǎng)因子C末端的15個氨基酸。

(4)根據(jù)(1)所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

(5)一種DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列為編碼根據(jù)(1)至(4)中任一項所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體的核苷酸序列。

(6)根據(jù)(5)所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

(7)一種重組表達載體，其中，所述重組表達載體含有(5) 或(6)所述的核苷酸序列。

(8)根據(jù)(7)所述的重組表達載體，其中，所述重組表達載體為PET24a+/CNTFnew/Clys3表達載體。

(9)一種遺傳工程宿主細胞，其中，所述宿主細胞含有(7)或(8)所述的重組表達載體。

(10)根據(jù)(9)所述的遺傳工程宿主細胞，其中，所述宿主細胞為CNTFnew/Clys3工程菌。

(11)一種修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子是通過對根據(jù)(1)至(4)中任一項所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體的第40位賴氨酸進行定點修飾而得到的，所述定點修飾是通過在所述的第40位賴氨酸上結(jié)合化學(xué)修飾劑而實現(xiàn)的。

(12)根據(jù)(11)所述的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述化學(xué)修飾劑為聚乙二醇或聚乙二醇類聚合物。

(13)根據(jù)(11)所述的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述的化學(xué)修飾劑選自：聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、甲氧基聚乙二醇-丙醛、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺-α-甲基丁酸酯、甲氧基聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺、甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺或甲氧基聚乙二醇-乙醛。

(14)根據(jù)(11)所述的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述化學(xué)修飾劑為甲氧基聚乙二醇-乙醛。

(15)根據(jù)(1)至(4)中任一項所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體在制備用于治療和/或預(yù)防肥胖癥或與肥胖癥相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。

(16)根據(jù)(11)至(14)中任意一項所述的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體在制備用于治療和/或預(yù)防肥胖癥或與肥胖癥相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。

(17)一種用于治療和/或預(yù)防肥胖癥及肥胖相關(guān)疾病的藥物組合物，其中，所述的藥物組合物包含根據(jù)(1)至(4)中任一項所述 的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體和/或根據(jù)(11)至(14)中任意一項所述的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和積極效果：

1.本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)將化學(xué)修飾劑定點修飾在CNTF第40位賴氨酸的ε氨基上，同時將CNTF第26位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄蛄涟彼帷⒌?6位的賴氨酸突變?yōu)榫彼?、以及將?60位的賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊虻鞍彼?，可以在保持蛋白質(zhì)原有結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的同時，獲得修飾專一性高的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，從而克服隨機修飾帶來的如修飾結(jié)果不穩(wěn)定等一系列問題。

2.本發(fā)明的重組基因工程CNTF與原始CNTF蛋白序列與結(jié)構(gòu)最為接近，使重組CNTF突變體蛋白穩(wěn)定性、可溶性和生物學(xué)活性高于天然蛋白。

3.本發(fā)明獲得的CNTF突變體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，與天然蛋白相比具有更高的生物學(xué)活性和可溶性，并且修飾型CNTF與未修飾型CNTF相比具有長效作用，從而能達到治療或預(yù)防肥胖癥及其相關(guān)疾病的顯著效果。

附圖說明

圖1為CNTF突變體表達載體PET24a+/CNTFnew/Clys3的構(gòu)建圖。

圖2為CNTF突變體CNTFnew/Clys3的編碼序列PCR鑒定圖；其中，M：marker；1：陰性對照；2-6：隨機挑選的5個CNTFnew/Clys3工程菌的菌落。

圖3為NedI和EcorI雙酶切鑒定的結(jié)果圖；其中，M：marker；1-5：隨機挑選的5個CNTFnew/Clys3工程菌菌落。

圖4為CNTF突變體CNTFnew/Clys3的全基因序列測定結(jié)果圖。

圖5為目的蛋白CNTFnew/Clys3的表達結(jié)果圖；其中，M：marker；1：陰性對照；2-6：隨機挑選的5個CNTFnew/Clys3工程菌菌落。

圖6為CNTFnew/Clys3蛋白SDS-PAGE電泳圖；其中泳道M為 Marker，泳道2為CNTFnew/Clys3蛋白。

圖7為CNTFnew/Clys3蛋白的N端15個氨基酸序列的序列比對圖。

圖8為小鼠體重變化圖。

圖9為小鼠體重增長抑制率圖。

圖10為CNTFnew/Clys3蛋白與ALD-mPEG分子結(jié)合的示意圖。

圖11為用支鏈的ALD-mPEG修飾CNTFnew/Clys3的結(jié)果的電泳圖；其中，泳道M為Marker，泳道2為修飾前的CNTFnew/Clys3蛋白，泳道3為修飾反應(yīng)混合液。

圖12為純化后的支鏈ALD-mPEG修飾CNTFnew/Clys3蛋白電泳圖，其中泳道M為Marker，泳道2為ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3。

圖13為ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3和CNTFnew/Clys3蛋白免疫印跡電泳圖，其中泳道M為Marker，泳道2為ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3，泳道3為CNTFnew/Clys3。

具體實施方式

以下通過具體實施方式的描述并參照附圖對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的目的在于提供一種睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體與一種修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，以在提高睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的治療效果的前提下，獲得修飾后性狀均一的修飾型的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。

通過對CNTF氨基酸序列(SEQ ID NO:2)進行系統(tǒng)的理論分析和設(shè)計并且進行大量的試驗，本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)在使用PEG或PEG類聚合物對CNTF或CNTF突變體進行修飾時，將化學(xué)修飾劑定點修飾在CNTF第40位賴氨酸上，同時將CNTF第26位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄蛄涟彼?、將?6位的賴氨酸突變?yōu)榫彼?、以及將?60位的賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊虻鞍彼幔梢栽诒３值鞍踪|(zhì)原有結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的同時，獲得修飾專一性高的修飾型睫狀神經(jīng) 營養(yǎng)因子，從而克服隨機修飾帶來的如修飾結(jié)果不穩(wěn)定等一系列問題。

基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明一個方面提供了一種睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體是在天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的氨基酸序列的基礎(chǔ)上發(fā)生突變得到的，所述突變包括：第26位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄蛄涟彼帷⒌?6位的賴氨酸突變?yōu)榫彼?、?60位的賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊虻鞍彼?；并且其中所述睫狀神?jīng)營養(yǎng)因子突變體保留了天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子第40位的賴氨酸。

優(yōu)選地，所述第26位的賴氨酸被突變?yōu)榱涟彼?、?6位的賴氨酸被突變?yōu)榫彼帷⒌?60位的賴氨酸被突變?yōu)楣劝滨０贰?/p>

本發(fā)明人通過實驗進一步發(fā)現(xiàn)，在上述重組基因工程CNTF的基礎(chǔ)上，使用常規(guī)突變CNTF的方法，例如將第17位半胱氨酸突變?yōu)楸彼帷⒌?3位谷氨酰胺突變成精氨酸、去除C末端的15個氨基酸等，也不會影響CNTF突變體在化學(xué)修飾中的穩(wěn)定性，可以形成修飾均一的修飾型CNTF突變體，并獲得與天然蛋白相比更高的生物學(xué)活性和長效作用，從而能達到治療或預(yù)防肥胖癥及其相關(guān)疾病的顯著效果。

因此，在本發(fā)明的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體中，所述突變還可以包括：第17位半胱氨酸突變?yōu)楸彼?、?3位谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?、以及去除天然睫狀神?jīng)營養(yǎng)因子C末端的15個氨基酸。

優(yōu)選地，所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本發(fā)明所述的CNTF突變體與原始CNTF蛋白序列和結(jié)構(gòu)最為接近，使CNTF突變體蛋白穩(wěn)定性、可溶性和生物學(xué)活性高于天然蛋白。

可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法獲得CNTF突變體。這些方法在(例如)專利申請CN1687413A中有所介紹。也可以采用全基因序列合成的方法獲得本發(fā)明的CNTF突變體。

本發(fā)明第二方面提供了一種DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列為編碼本發(fā)明所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體的核苷酸序列。

優(yōu)選的是，所述DNA的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示的核苷 酸序列。

本發(fā)明第三方面提供了一種重組表達載體，其中，所述重組表達載體含有本發(fā)明所述DNA的核苷酸序列。

優(yōu)選的是，所述重組表達載體為如圖1所示的PET24a+/CNTFnew/Clys3表達載體。

本發(fā)明第四方面提供了一種遺傳工程宿主細胞，其中，所述宿主細胞含有本發(fā)明所述的重組表達載體。

優(yōu)選的是，所述宿主細胞為CNTFnew/Clys3工程菌。

本發(fā)明第五方面提供了一種修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體，其中，所述的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子是通過對本發(fā)明所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體的第40位賴氨酸進行定點修飾而得到的，所述定點修飾是通過在所述的第40位賴氨酸上結(jié)合化學(xué)修飾劑而實現(xiàn)的。

定點修飾的方法可采用本領(lǐng)域已知的方法，例如張霖琳等,聚乙二醇單修飾重組人粒細胞集落刺激因子的研究,生物工程學(xué)報，2005，21(6)中公開的方法，其在4℃條件下將待修飾蛋白置于不同pH值的緩沖液中,以保證其生物學(xué)活性。Lowry法測定蛋白濃度,將蛋白稀釋到實驗所需的各個濃度,按摩爾配比(修飾劑:蛋白質(zhì))加入修飾劑,混合均勻,按正交試驗設(shè)計的溫度進行反應(yīng),反應(yīng)時間為2-16小時。

所述的化學(xué)修飾劑可以使用在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域中常用的化學(xué)修飾劑(包括高分子、聚合物修飾劑等)，只要能夠與賴氨酸的ε氨基相結(jié)合，獲得均一的修飾后產(chǎn)物即可。在本文中，“均一”是指沒有同分異構(gòu)體，純度在95％以上。

優(yōu)選的是，所述化學(xué)修飾劑為聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇類聚合物。

在本文中，所述的“聚乙二醇類聚合物”指的是聚乙二醇衍生物，在聚乙二醇的應(yīng)用中，端基起著決定性的作用，不同端基的聚乙二醇具有不同的用途。在實際應(yīng)用中，聚乙二醇高分子鏈端不僅僅局限于鏈端羥基，其它反應(yīng)性更強的功能化基團,如對甲苯磺酸酯基、氨基、羧基、醛基等亦可被引入到聚乙二醇鏈的兩端。這些功能化基團的引 入擴大了聚乙二醇的應(yīng)用范圍，使它在有機合成、多肽合成、高分子合成及藥物的緩釋控釋、靶向施藥等多方面均具有廣闊的應(yīng)用前景。

更優(yōu)選的是，本發(fā)明的用于修飾的聚乙二醇或聚乙二醇類聚合物的分子量為20kD～40kD。

優(yōu)選的是，所述的化學(xué)修飾劑選自：聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、甲氧基聚乙二醇-丙醛、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺-α-甲基丁酸酯、甲氧基聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺、甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺或甲氧基聚乙二醇-乙醛。

更優(yōu)選地，所述化學(xué)修飾劑為甲氧基聚乙二醇-乙醛。

本發(fā)明第六方面提供了所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體在制備用于治療和/或預(yù)防肥胖癥或與肥胖癥相關(guān)的疾病(如Ⅱ型糖尿病和脂肪肝)的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明第七方面提供了所述的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體在制備用于治療和/或預(yù)防肥胖癥或與肥胖癥相關(guān)的疾病(如Ⅱ型糖尿病和脂肪肝)的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明第八方面提供了一種用于治療和/或預(yù)防肥胖癥及肥胖相關(guān)疾病的藥物組合物，其中，所述的藥物組合物包含本發(fā)明所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體和/或本發(fā)明所述的修飾型睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體。

所述肥胖相關(guān)疾病包括II型糖尿病和脂肪肝。

優(yōu)選的是，所述的藥物組合物還包含藥用輔料。用于本發(fā)明的藥用輔料可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的那些。

以下通過實施例的方式進一步解釋或說明本發(fā)明內(nèi)容，但這些實施例不應(yīng)被理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。

實施例1.CNTF突變體的全基因序列合成

根據(jù)天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)DNA序列(SEQ ID NO：1)與天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)氨基酸序列(SEQ ID NO：2)， 全基因序列合成重組睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF突變體)的DNA序列SEQ ID NO：3(由上海捷銳生物科技有限公司完成)，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO：4。

其中，CNTF突變體為將天然睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的第26位的賴氨酸突變?yōu)榱涟彼帷⒌?6位的賴氨酸突變?yōu)榫彼?、?60位的賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０贰⒌?7位半胱氨酸突變成丙氨酸、第63位谷氨酰胺突變成精氨酸，并且去除C末端的15個氨基酸而形成的CNTF突變體——CNTFnew/Clys3突變體。

實施例2.CNTF突變體CNTFnew/Clys3表達載體的構(gòu)建與工程菌的鑒定

(1)CNTF突變體CNTFnew/Clys3表達載體的構(gòu)建

全基因序列合成后，取合成片段5μL，加入限制性內(nèi)切酶NedI1μL和EcorI 1μL(限制性內(nèi)切酶購于TAKARA公司)。加入限制性內(nèi)切酶緩沖液2μL，加雙蒸水11μL，成為20μL體系。37℃水浴，酶切1小時。同時，取pET24a+質(zhì)粒(購于Novagen公司)5μL，加入相同的限制性內(nèi)切酶NedI 1μL和EcorI 1μL(限制性內(nèi)切酶購于TAKARA公司)，加雙蒸水11μL，成為20μL體系。37℃水浴，酶切1小時，酶切載體pET24a+。

酶切完成后，進行1％的瓊脂糖凝膠電泳。切割下帶有目的條帶的膠，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購于天根生化科技有限公司)對酶切后的目的片段和載體片段進行回收。

取酶切后的合成目的片段5μL、酶切后的載體pET24a+5μL，加入1μL T4DNA連接酶(購于TAKARA公司)，加入10×連接酶緩沖液2μL，加入雙蒸水7μL，成為20μL的連接反應(yīng)體系。16℃連接過夜。連接成表達載體，命名為PET24a+/CNTFnew/Clys3，具體的載體構(gòu)建過程可以參看圖1。

(2)將表達載體PET24a+/CNTFnew/Clys3轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21(DE3)(購于天根生化科技有限公司)中，制備出CNTFnew/Clys3工程菌。

具體步驟：取連接后的表達載體PET24a+/CNTFnew/Clys3共2μL，加入到一支感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，輕敲后放置于冰上30分鐘，42℃水浴熱激60秒后，迅速至于冰上2分鐘。加入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基300μL,至于搖床中，37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)1小時。經(jīng)過培養(yǎng)后的菌液涂于含50μg/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，得到帶有PET24a+/CNTFnew/Clys3質(zhì)粒的單個菌落。

隨機挑取單個菌落，接種到5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘過夜培養(yǎng)。得到工程菌，命名為CNTFnew/Clys3工程菌。

(3)經(jīng)過PCR鑒定、雙酶切鑒定、全基因序列測定三種方法確定CNTFnew/Clys3工程菌中包含有目的蛋白CNTFnew/Clys3的編碼序列。

3.1)PCR鑒定過程：取過夜培養(yǎng)的CNTFnew/Clys3工程菌的菌液1μL，加入引物1(序列為：ATG GCT TTC ACA GAG CAT TC)1μL、引物2(序列為：GTC ATG GAT GGA CCT TAC TG)1μL、DNA Polymerase(購自TAKARA公司)1μL、2×PCR緩沖液10μL、雙蒸水6μL，成為20μL的PCR反應(yīng)體系。

放入PCR儀中，溫度循環(huán)為：第一步：94℃5分鐘。第二步：94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘，共30個循環(huán)。第三步：72℃10分鐘。第四步：4℃恒溫后取出。

PCR結(jié)束后對樣品進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

PCR鑒定的結(jié)果參見圖2，其中，M：marker；1：陰性對照；2-6：隨機挑選的5個CNTFnew/Clys3工程菌菌落的結(jié)果。

PCR鑒定結(jié)果為：隨機挑取的5個工程菌菌落均為陽性菌落。

3.2)雙酶切鑒定過程：

取過夜培養(yǎng)的CNTFnew/Clys3工程菌的菌液5ml，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒(購于Axeygen公司)提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒取5μL，限制性內(nèi)切酶NedI和EcorI各1μL，限制性內(nèi)切酶緩沖液2μL，雙蒸水11μL，成為20μL的雙酶切體系，于37℃水浴，酶切1小時，之后進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

雙酶切鑒定的結(jié)果參見附圖3，其中，M:marker；1-5：隨機挑選的5個CNTFnew/Clys3工程菌菌落的結(jié)果。

雙酶切鑒定結(jié)果為：隨機挑取的5個工程菌菌落均為陽性菌落。

3.3)CNTFnew/Clys3的全基因序列測定由北京諾賽基因組研究中心完成。具體結(jié)果見圖4。

實施例3.目的蛋白CNTFnew/Clys3的表達。

1)制備LB瓊脂平板：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g，瓊脂10g、加水定容至1L(pH為7.2±0.1)，高溫高壓滅菌，當(dāng)溫度降到50℃左右時加入卡那霉素，至終濃度為50μg/ml，取20ml倒培養(yǎng)皿，凝固后即成LB瓊脂平板。

2)培養(yǎng)CNTFnew/Clys3工程菌：將CNTFnew/Clys3工程菌劃線接種于LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜。從培養(yǎng)基過夜的LB平板上挑選生長狀態(tài)良好的單個菌落，接種于含LB的試管中，37℃培養(yǎng)10小時。然后轉(zhuǎn)種至含有200ml LB液體培養(yǎng)液(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g，加水定容至1L(pH為7.2±0.1)，高壓滅菌，分裝三角瓶，每瓶200ml)的三角瓶中，37℃培養(yǎng)過夜制得種子液。將種子液按1％比例接種于含30L 2YT培養(yǎng)液的50L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基為2YT(胰蛋白胨480g、酵母提取物300g、NaCl 50g，加入蒸餾水溶解，5N NaOH調(diào)節(jié)PH至7.0，定容到30L，0.12Mpa、121℃、30分鐘，高壓滅菌)?？刂瓢l(fā)酵溫度37℃、轉(zhuǎn)速250-450r/分鐘、通氣量30-50L/分鐘、pH7.3，培養(yǎng)至A600＝1.2左右后，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1.0mM進行誘導(dǎo)。繼續(xù)培養(yǎng)4.5小時，終止發(fā)酵，收集菌體，儲存于-30℃冰箱中備用。取表達目的蛋白后的菌體，進行SDS-PAGE電泳，觀察目的蛋白CNTFnew/Clys3的表達結(jié)果見圖5，其中，M:marker；1:陰性對照；2-6：隨機挑選的5個CNTFnew/Clys3工程菌菌落的結(jié)果。

實施例4.目的蛋白CNTFnew/Clys3的復(fù)性與純化。

從-30℃冰箱中取出發(fā)酵菌體，按1％比例用0.02mol、pH7.2的 磷酸鹽溶液重新懸浮菌體，通過高壓勻漿破碎菌體，5000r/分鐘離心15分鐘，收集包涵體沉淀，再經(jīng)變性〔每克包涵體使用400ml變性液(8M鹽酸胍、50mMTris-Hcl、pH8.0)處理4小時〕、復(fù)性(通過透析法復(fù)性，透析液為50mMTris-Hcl、pH8.0，透析時間為24小時)、Q-Sepharose HP(購自GE公司)層析步驟進行純化而獲得CNTFnew/Clys3。所述層析步驟簡述如下：A液50mM Tris-Hcl，pH8.0；B液50mM Tris-Hcl，1M NaCl,pH8.0；層析柱以A液平衡后，樣品以1.8mg/ml上樣，A液清洗后，用10％B洗脫，用第一個收集目的蛋白峰做SDS-PAGE，并用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進行成像，用AlphaDigiDoc純度分析軟件對CNTFnew/Clys3泳道進行掃描純度分析，結(jié)果純度可達95％以上。純化結(jié)果見圖6，其中泳道M為Marker，泳道2為純化的CNTFnew/Clys3蛋白。

實施例5.CNTFnew/Clys3蛋白的N端15個氨基酸序列測定。

序列比對為將CNTFnew/Clys3蛋白的N端15個氨基酸序列與天然CNTF的N端測序結(jié)果進行比對，測定結(jié)果見圖7。結(jié)果說明CNTFnew/Clys3蛋白的N端15個氨基酸序列的測序結(jié)果與預(yù)先設(shè)計完全相同。

實施例6.CNTFnew/Clys3體外活性鑒定。

TF-1CN5a1細胞是一個依賴于GM-CSF的細胞系，其細胞表面具有rhCNTF高親和力受體，所以CNTF能促進TF-1CN5a1細胞的增殖。將不同濃度的CNTFnew/Clys3加入TF-1CN5a1細胞培養(yǎng)物中，觀察細胞的生長情況，以測定CNTFnew/Clys3體外活性，具體方法如下：

將TF-1CN5a1細胞(購自美國ATCC，貨號為CRL-2512TM)，常規(guī)培養(yǎng)于GM-CSF條件(100ml RPMI1640中含有500ng的GM-CSF)的培養(yǎng)液中，實驗時收集對數(shù)生長期的細胞，用無血清的RPMI 1640(購自invitrogen公司)洗液洗滌3遍，然后用10％小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)為1.0×10⁶，每孔加50μl細胞懸液， 使用實施例4中獲得的CNTFnew/Clys3蛋白從初始濃度200n g/ml按4倍系列稀釋后，每孔加入50μl。以50μl無血清RPMI 1640培養(yǎng)基作為陰性對照，以CNTF標(biāo)準(zhǔn)品(購自英國國家生物制品檢定所NIBSC，貨號：94/684)為陽性對照，初始濃度為200ng/ml，進行4倍系列稀釋后，每孔加入50μl。培養(yǎng)板在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)48小時后，每孔加入50mg/ml的WST-8(購自碧云天生物技術(shù)研究所，貨號：C0038)溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)8小時后，加入酸性異丙醇(異丙醇-HCL，pH4.0)溶液，混勻后在酶標(biāo)儀上比色，測定波長為570nm，參比波長為630nm。每個實驗取3次實驗的平均結(jié)果。結(jié)果為CNTFnew/Clys3蛋白的體外活性：7.9×10⁶IU/mg。實驗同時設(shè)置了未突變的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對照組(購自sigma，C3710-10UG)，在相同的方法和條件下測定，實驗結(jié)果證實未突變的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的體外活性約為8.57×10⁴IU/mg，經(jīng)過定點突變的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體的生物學(xué)活性高于未突變的天然分子。

實施例7.CNTFnew/Clys3在小鼠體內(nèi)活性的測定。

實驗用小鼠使用雄性昆明鼠(得自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，體重18g-22g。分為陽性對照組，陰性對照組和實驗組，每組6只。用生理鹽水溶解CNTF標(biāo)準(zhǔn)品(購自英國國家生物制品檢定所NIBSC，貨號：NIBSC94/684)作為陽性對照，樣品為CNTFnew/Clys3(實施例4所得蛋白)，同樣以生理鹽水溶解并稀釋為12.5μg/ml。以每只小鼠125μg/kg/天的量，經(jīng)過計算取不同的體積進行皮下注射。陰性對照即生理鹽水。注射前分別稱量每組每只小鼠的體重。連續(xù)五天給藥，稱量小鼠的體重，觀察小鼠的體重變化。

(1)流程：

表1.CNTF對小鼠減重作用測定流程

注：實驗時間以給藥前一天為-1天，首次給藥當(dāng)天為0天。

△：根據(jù)前一操作完成情況，可提前或推后，但盡量保持每天在同一時間。

(2)測量指標(biāo)：

體重增加值＝某組實驗前體重-某組實驗?zāi)橙阵w重

體重增長抑制率(％)＝(對照組某日體重-對照組d0體重)-(受試組某日體重-該組d0體重)/(對照組某日體重-對照組d0體重)×100％

結(jié)果：

表2.小鼠體重變化

與表2對應(yīng)的小鼠體重變化圖見圖8。

由表2可知：在給藥之后，實驗組體重一直下降，而陽性對照組和陰性對照組體重均增加，提示CNTFnew/Clys3具有很強的體重控制活性。

表3.小鼠體重增長抑制率

與表3對應(yīng)的小鼠體重增長抑制率圖見圖9。

由表3可知，CNTFnew/Clys3體重增長抑制率高于陽性對照(CNTF標(biāo)準(zhǔn)品)的體重增長抑制率。

實施例8.CNTFnew/Clys3蛋白的修飾以及純化：

本實施例中利用支鏈的mPEG-ALD對上面步驟獲得的CNTFnew/Clys3蛋白進行修飾。

支鏈40KD的mPEG-ALD購于北京凱正科技有限公司，商品代號：Y-ALD-40K。分子式見下：

CNTFnew/Clys3蛋白與ALD-mPEG分子結(jié)合的示意圖見圖10。

將純化的CNTFnew/Clys3蛋白與分子量40KD的ALD-mPEG按摩爾比1:5的比例混合，反應(yīng)在100mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH8.0，含1mmol/L的EDTA)中進行，置4℃反應(yīng)16小時。修飾反應(yīng)結(jié)果見圖11。泳道M為Marker，泳道2為修飾前的CNTFnew/Clys3蛋白，泳道3為修飾反應(yīng)混合液。采用陰離子交換介質(zhì)Q FF(購自美國GE公司，型號：Hiprep16/10 Q FF)對修飾反應(yīng)混合液進行修飾劑、未修飾蛋白及修飾產(chǎn)物的分離。平衡緩沖液為50mM Tris-HCl，pH8.0，5個柱體積內(nèi)用緩沖液B(50mM Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl)進行梯度洗脫，收集目的蛋白洗脫峰，進行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖12。泳道M為Marker,泳道2為ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3。

實施例9.修飾后蛋白體外活性的測定。

TF-1CN5a1細胞是一個依賴于GM-CSF的細胞系，其細胞表面具有rhCNTF高親和力受體，所以CNTF能促進TF-1CN5a1細胞的增殖。將不同濃度的ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3加入TF-1CN5a1細胞培養(yǎng)物中，觀察細胞的生長情況，以測定ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3體外活性，具體方法如下：

將TF-1CN5a1細胞(購自美國ATCC，貨號為CRL-2512TM)，常規(guī)培養(yǎng)于GM-CSF條件(100ml RPMI 1640中含有500ng的GM-CSF)的培養(yǎng)液中，實驗時收集對數(shù)生長期的細胞，用無血清的RPMI1640(購自invitrogen公司)洗液洗滌3遍，然后用10％小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)為1.0×106，每孔加50μl細胞懸液，使用實施例8獲得的ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3蛋白，起始濃度為200ng/ml，按4倍系列稀釋后，每孔加入50μl。以50μl無血清RPM1640培養(yǎng)基作為陰性對照，以CNTF標(biāo)準(zhǔn)品(購自英國國家生物制品檢定所NIBSC，貨號：94/684)為陽性對照，初始濃度為200ng/ml，進行4倍系列稀釋后，每孔加入50μl。培養(yǎng)板在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)48小時后，每孔加入50mg/ml的WST-8(購自碧云天生物技術(shù)研究所。貨號：C0038)溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)8小時后，加入酸性異丙醇(異丙醇-HCL，pH4.0)溶液，混勻后在酶標(biāo)儀上比色，測定波長為570nm，參比波長為630nm。每個實驗取3次實驗的平均結(jié)果。測定方法同實施例6的未修飾的CNTF蛋白，結(jié)果為：

支鏈40K的ALD-mPEG修飾的CNTFnew/Clys3蛋白的體外活性為：3.9×10⁶IU/mg(為平均結(jié)果)。上述結(jié)果說明經(jīng)40K的PEG修飾后，經(jīng)過定點突變的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體的體外生物學(xué)活性有所降低，修飾產(chǎn)物活性保留率為49％，但體外活性均遠高于陽性對照組8×10⁵IU/mg(p<0.05)。

實施例10 ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3在小鼠體內(nèi)活性的測定

實驗用小鼠使用雄性昆明鼠(得自北京維通利華實驗動物技術(shù)有 限公司)，體重18-22g。分為陽性對照組、陰性對照組和實驗組，每組8只。用生理鹽水溶解CNTF標(biāo)準(zhǔn)品(購自英國國家生物制品檢定所NIBSC，貨號：NIBSC94/684)作為陽性對照，實驗組樣品為ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3(實施例8獲得)，以生理鹽水溶解并稀釋為0.5mg/ml。以每只小鼠100μg/kg/天的量進行皮下注射。陰性對照即生理鹽水。注射前分別稱量每組每只小鼠的體重。連續(xù)五天給藥，稱量小鼠的體重，觀察小鼠的體重變化。另同時設(shè)置每周注射組，分為修飾樣品組，未修飾樣品組，陽性對照組及陰性對照組，以每只小鼠200μg/kg/天的量進行皮下注射。陰性對照即生理鹽水。注射前分別稱量每組每只小鼠的體重。為了證明ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3具有長效性，給藥方式分兩種，一種是每天給藥，連續(xù)給藥五天，另一種是每周給藥一次，并分別稱量小鼠的體重，觀察小鼠的體重變化。

(1)流程如下表4：

表4.CNTF對小鼠減重作用測定流程(每天)

注：實驗時間以給藥前一天為-1天，首次給藥當(dāng)天為0天。

^△：根據(jù)前一操作完成情況，可提前或推后，但盡量保持每天在同一時間。

表5.CNTF對小鼠減重作用測定流程(每周)

注：實驗時間以給藥前一天為-1天，首次給藥當(dāng)天為0天。

^△：根據(jù)前一操作完成情況，可提前或推后，但盡量保持每天在同一時間。

(2)測量指標(biāo)：體重變化率

體重變化率＝(某組給藥后體重-某組給藥前體重)/給藥前體重×100％；

體重增長抑制率(％)＝(對照組某日體重-對照組d0體重)-(受試組某日體重-該組d0體重)/(對照組某日體重-對照組d0體重)×100％

小鼠體重變化結(jié)果見表6和表7：

表6小鼠體重變化表(連續(xù)5天給藥)

由表6可知：樣品ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3,CNTFnew/Clys3 兩組注射后的小鼠，體重均有所增長，但是小鼠體重增長均小于陰性對照組(p<0.05)，同時小于陽性對照(CNTF標(biāo)準(zhǔn)品)組(p<0.05)。

表7 小鼠體重變化表(每周給藥1次)

由表7可知：對于每周1次給藥組，三組注射后的小鼠，體重均有所增長，但是修飾樣品組的小鼠體重增長小于陰性對照組(p<0.05)，同時小于陽性對照(CNTF標(biāo)準(zhǔn)品)組(p<0.05)。

研究證實PEG修飾藥物與未修飾藥物相比較具有長效作用。

(2)小鼠體重增長抑制率見下表8：

表8 小鼠體重增長抑制率(連續(xù)5天給藥)

由表8可知ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3對小鼠的體重增長抑制率高于陽性對照(CNTF標(biāo)準(zhǔn)品)的體重增長抑制率(p<0.05)。

表9 小鼠體重增長抑制率(每周給藥1次)

由表9可知在每周給藥一次的情況下，ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3對小鼠的體重增長抑制率與對照組比較有顯著差異(p<0.01)，特別是ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3樣品每周給藥一次即可達到CNTFnew/Clys3每天給藥效果，而CNTFnew/Clys3每周給藥一次不能有效抑制小鼠體重的增長。說明ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3有長效的抑制小鼠體重的效果。

實施例11.CNTFnew/Clys3以及ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3的免疫反應(yīng)性

以CNTF的單克隆抗體作為特異性抗體進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，研究免疫反應(yīng)性。

用CNTF的單克隆抗體(購自Abcam公司)作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為酶標(biāo)二抗。首先將CNTFnew/Clys3和ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3做SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為4％，上樣量為15μl，恒壓110V，電泳1.5小時，終止電泳，將凝膠轉(zhuǎn)入NC膜上，分別與一抗和二抗孵育后顯色。具 體結(jié)果見圖13，泳道M為Marker,泳道2為ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3，泳道3為CNTFnew/Clys3。結(jié)果顯示CNTFnew/Clyss3與ALD-mPEG-CNTFnew/Clys3均能夠與CNTF的單克隆抗體特異性結(jié)合，說明位點突變并且經(jīng)過PEG修飾后仍具有與天然CNTF相似的免疫反應(yīng)性，沒有改變蛋白與特異性抗體結(jié)合的能力。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。