DT1蛋白在調控植物氣孔密度和提高植物抗旱性中的應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域，具體涉及DT1蛋白在調控植物氣孔密度和提高植物抗旱性中的應用。

背景技術：

干旱是影響作物產量的一個重要原因。當植物根系所吸收的水分不夠蒸騰所需時，就會使得植物缺水。植物缺水會降低細胞膨壓，限制細胞膨大，減小葉面積和光合源，因此降低生物量和產量。

降低植物的蒸騰速率可以減少土壤水分的消耗，是一種有效的提高植物抗旱性的方法。

氣孔開度和氣孔密度都可以調控水分的蒸騰和利用。降低氣孔密度能提高水分利用效率和植物抗旱性。

技術實現要素：

本發明的目的是提供DT1蛋白在調控植物氣孔密度和提高植物抗旱性中的應用。

本發明提供了一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟：將編碼DT1蛋白的基因導入出發植物，得到抗旱能力高于所述出發植物的轉基因植物；

所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱能力相關的由序列1衍生的蛋白質。

本發明還保護一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟：將編碼DT1蛋白的基因導入出發植物，得到葉片氣孔密度低于所述出發植物的轉基因植物；

所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱能力相關的由序列1衍生的蛋白質。

本發明還保護一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟：將編碼DT1蛋白的基因導入出發植物，得到葉片蒸騰速率低于所述出發植物的轉基因植物；

所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱能力相關的由序列1衍生的蛋白質。

以上任一所述“編碼DT1蛋白的基因”具體可為如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：

(1)編碼區如序列表的序列2自5’末端第5至1162位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(3)在嚴格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗旱相關蛋白的DNA分子；

(4)與(1)或(2)限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且編碼植物抗旱相關蛋白的DNA分子。

上述嚴格條件可為：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO4和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述嚴格條件也可為：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

所述“編碼DT1蛋白的基因”可通過重組表達載體導入所述出發植物。所述重組表達載體可為將所述“編碼DT1蛋白的基因”插入表達載體得到的重組質粒。所述重組表達載體具體可為將所述“編碼DT1蛋白的基因”插入質粒pMDC32的AttR位點得到的重組質粒。

本發明還保護一種提高植物抗旱性的方法，是通過提高所述植物中編碼DT1蛋白的基因的表達來提高所述植物的抗旱性。

本發明還保護一種降低植物葉片氣孔密度的方法，是通過提高所述植物中編碼DT1蛋白的基因的表達來降低所述植物的葉片氣孔密度。

本發明還保護一種降低植物葉片蒸騰速率的方法，是通過提高所述植物中編碼DT1蛋白的基因的表達來降低植物葉片的蒸騰速率。

本發明還保護DT1蛋白的應用，為如下(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)：(Ⅰ)降低植物葉片的氣孔密度；(Ⅱ)降低植物葉片的蒸騰速率；(Ⅲ)提高植物的抗旱能力。

本發明還保護編碼DT1蛋白的基因的應用，為如下(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)：(Ⅰ)降低植物葉片的氣孔密度；(Ⅱ)降低植物葉片的蒸騰速率；(Ⅲ)提高植物的抗旱能力。

以上任一所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱能力相關的由序列1衍生的蛋白質。

以上任一所述“編碼DT1蛋白的基因”具體可為如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：

(1)編碼區如序列表的序列2自5’末端第5至1162位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(3)在嚴格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗旱相關蛋白的DNA分子；

(4)與(1)或(2)限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且編碼植物抗旱相關蛋白的DNA分子。

上述嚴格條件可為：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO4和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述嚴格條件也可為：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

以上任一所述植物可為如下①、②或③：①單子葉植物；②雙子葉植物；③擬南芥。

所述氣孔密度減少具體體現為葉片氣孔數目減少。

所述氣孔具體為所述植物葉片表皮的氣孔。

本發明的發明人發現在擬南芥中提高DT1基因的表達水平能夠有效的降低葉片表皮的氣孔密度，從而降低轉基因植株的蒸騰速率，進而提高了植物的抗旱性。本發明對于控制植物葉片的氣孔密度及提高植物抗旱能力有重要作用。

附圖說明

圖1為部分T1代抗性植株的PCR鑒定結果。

圖2為部分T3代植株中DT1基因和eIF4a基因的表達量。

圖3為提高DT1基因表達能降低擬南芥子葉氣孔密度。

圖4為提高DT1基因表達能降低擬南芥真葉氣孔密度。

圖5為提高DT1基因表達能降低擬南芥離體葉片失水速率。

圖6為提高DT1基因表達能降低擬南芥蒸騰速率。

圖7為提高DT1基因表達能提高擬南芥抗旱能力。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

質粒pMDC32：參考文獻：Zhang,M.,Henquet,M.,Chen,Z.,Zhang,H.,Zhang,Y.,Ren,X.,van der Krol,S.,Gonneau,M.,Bosch,D.,and Gong,Z.(2009).LEW3,encoding a putative alpha-1,2-mannosyltransferase(ALG11)in N-linked glycoprotein,plays vital roles in cell-wall biosynthesis and the abiotic stress response in Arabidopsis thaliana.Plant J 60,983-999.。

哥倫比亞生態型擬南芥(Col-0，在附圖中用Col表示)：參考文獻：Wang,L.,Hua,D.,He,J.,Duan,Y.,Chen,Z.,Hong,X.,and Gong,Z.(2011).Auxin Response Factor2(ARF2)and its regulated homeodomain gene HB33mediate abscisic acid response in Arabidopsis.PLoS genetics 7,e1002172.；在文獻中的名稱為“Arabidopsis thaliana，Columbia ecotype”。

根癌農桿菌C58：參考文獻：Steven J.Clough and Andrew F.Bent(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal 16(6),735–743.。

Gateway克隆入門試劑盒(pENTR^TM/TEV/D-Cloning Kit)：Life Technologies公司，產品目錄號為k2525-20。

Gateway克隆表達試劑盒(LRII Enzyme mix)：Life Technologies公司，產品目錄號為11791-020。

DT1蛋白如序列表的序列1所示，其編碼序列如序列表的序列2自5’末端第5位至第1162位核苷酸所示。

實施例1、重組質粒的構建

一、引物的設計和合成

F1：5'-CACCATGATACATTACGAACAAAACA-3'；

R1：5'-TCACTCGCATTCTCCTTCAGT-3'。

1、提取哥倫比亞生態型擬南芥的總RNA并反轉錄為cDNA。

2、以步驟1得到的cDNA為模板，采用F1和R1組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物(經測序，PCR擴增產物如序列表的序列2所示)。

3、取步驟2得到的PCR擴增產物，采用Gateway克隆入門試劑盒并按試劑盒說明書操作，得到入門克隆(將所述PCR擴增產物導入了所述試劑盒中的pENTR/TEV/D-vector，得到入門克隆)。

4、取入門克隆，采用Gateway克隆表達試劑盒并按試劑盒說明書操作，將序列2所示的DNA分子插入質粒pMDC32的attR1位點和attR2位點之間，得到表達克隆，將其命名為重組質粒pMDC32-DT1。

實施例2、DT1基因過表達植株的獲得

一、DT1基因過表達植株的獲得

1、將重組質粒pMDC32-DT1導入根癌農桿菌C58，得到重組農桿菌。

2、取步驟1得到的重組農桿菌，采用花序浸泡法將重組質粒pMDC32-DT1導入哥倫比亞生態型擬南芥，收獲種子。

3、將步驟2得到的種子播種于含60mg/L潮霉素的MS固體培養基，篩選抗性植株(T1代植株)。

4、提取T1代植物的基因組DNA，進行PCR鑒定。

PCR鑒定的引物對如下(F2對應載體骨架，R1對應DT1基因)：

F2：5'-AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACC-3'；

R1：5'-TCACTCGCATTCTCCTTCAGT-3'。

如果PCR鑒定為陽性(PCR擴增得到約1266bp的擴增產物)，該植株即為轉基因植株。部分T1代植物的PCR鑒定結果見圖1。每個植株的后代即為一個株系。

5、將步驟4中PCR鑒定為陽性的植株自交并收獲種子(T2代種子)。

6、將步驟5得到的種子培育為植株(T2代植株)并單株收種子(T3代種子)。

7、將T3代種子播種到含60mg/L潮霉素的MS固體培養基，篩選抗性不分離的純合單株(即篩選其T3代種子不發生抗性分離的T2代植株，該植株為純合的轉基因植株)，將其種子(T3代種子)進行實施例3的各項檢測和鑒定。

二、轉空載體植株的獲得

用質粒pMDC32代替重組質粒pMDC32-DT1進行步驟一，得到轉空載體植株。

實施例3、DT1基因過表達植株的鑒定

一、DT1基因表達水平檢測

待測種子如下：L4株系(30粒T3代種子)、L6株系(30粒T3代種子)、L9株系(30粒T3代種子)、L10株系(30粒T3代種子)、L11株系(30粒T3代種子)、L13株系(30粒T3代種子)、L14株系(30粒T3代種子)，L15株系(30粒T3代種子)、L16株系(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態型擬南芥(30粒種子)。

在MS固體培養基上播種待測種子并培養，種子萌發8天后提取RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用F1和R1組成的引物對進行PCR擴增，檢測DT1基因的表達量。采用eIF4a基因為內參基因。

DT1基因和eIF4a基因的表達量如圖2所示。結果表明，哥倫比亞生態型擬南芥中，DT1基因的本底表達非常低。與哥倫比亞生態型擬南芥相比，轉基因株系L4、L6、L9、L11、L13和L15中DT1基因的表達量都顯著增高。

二、DT1基因對植物氣孔密度的影響

1、DT1過表達植株的子葉氣孔密度統計

待測種子如下：L4株系(30粒T3代種子)、L6株系(30粒T3代種子)、L9株系 (30粒T3代種子)、L10株系(30粒T3代種子)、L11株系(30粒T3代種子)、L13株系(30粒T3代種子)、L14株系(30粒T3代種子)，L15株系(30粒T3代種子)、L16株系(30粒T3代種子)、轉空載體植株(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態型擬南芥(30粒種子)。

在MS固體培養基上播種待測種子并培養，種子萌發8天后測量子葉下表皮的氣孔密度。結果見圖3。結果表明，與哥倫比亞生態型擬南芥相比，L4株系、L6株系、L9株系、L11株系、L13株系、L15株系植株的子葉下表皮的氣孔密度均顯著降低。轉空載植株與哥倫比亞生態型擬南芥沒有顯著差異。

2、DT1過表達植株的真葉氣孔密度統計

待測種子如下：L4株系(30粒T3代種子)、L15株系(30粒T3代種子)、轉空載體植株(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態型擬南芥(30粒種子)。

在MS固體培養基上播種待測種子并培養，種子萌發30天后，測量第六片蓮座葉上表皮的氣孔密度和下表皮的氣孔密度。

結果見圖4。結果表明，與哥倫比亞生態型擬南芥相比，L4株系和L15株系真葉上表皮及真葉下表皮氣孔密度均顯著降低。轉空載植株與哥倫比亞生態型擬南芥沒有顯著差異。

三、DT1基因過表達對植物葉片蒸騰速率及抗旱性的影響

1、DT1基因過表達對植物葉片失水速率的影響

待測種子如下：L4株系(30粒T3代種子)、L15株系(30粒T3代種子)、轉空載體植株(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態型擬南芥(30粒種子)。

在裝有土的花盆中播種待測種子并培養，種子萌發35天后，取蓮座葉并測定離體葉片失水速率(檢測葉片失水速率的參考文獻：Xiao Feng Zhou,Yin Hua Jin,Chan Yul Yoo,Xiao-Li Lin,Woe-Yeon Kim,Dae-Jin Yun,Ray A.Bressan,Paul M.Hasegawa,and Jing Bo Jin(2009).CYCLIN H；1Regulates Drought Stress Responses and Blue Light-Induced Stomatal Opening by Inhibiting Reactive Oxygen Species Accumulationin Arabidopsis.Plant PhysiolVol162,1030-41.)。

結果見圖5。結果表明，與哥倫比亞生態型擬南芥相比，L4株系和L15株系的失水速率均顯著降低。轉空載植株與哥倫比亞生態型擬南芥沒有顯著差異。

2、DT1基因過表達對植物蒸騰速率的影響

待測種子如下：L15株系(30粒T3代種子)、轉空載體植株(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態型擬南芥(30粒種子)。

在裝有土的花盆中播種待測種子并培養，種子萌發35天后，用保鮮膜包裹花盆，在天平上連續測定蒸騰速率(將所有花盆放到天平上連續記錄72小時，每五分鐘記錄 一次重量，減少的重量即為蒸騰失水量)。檢測植物蒸騰速率的參考文獻：Chan Yul Yoo,Heather E.Pence,Jing Bo Jin,Kenji Miura,Michael J.Gosney,Paul M.Hasegawa and Michael V.Mickelbart(2010).The Arabidopsis GTL1Transcription Factor Regulates Water Use Efficiency and Drought Tolerance by Modulating Stomatal Density via Transrepression of SDD1.Plant Cell 2010；22；4128-4141.)。

結果見圖6(縱坐標中的cm^-2指的是每平方厘米葉片)。結果表明，與哥倫比亞生態型擬南芥相比，L15株系的蒸騰速率顯著降低。轉空載植株與哥倫比亞生態型擬南芥沒有顯著差異。

3、DT1基因過表達對植物抗旱性的影響

待測種子如下：L4株系(100粒T3代種子)、L15株系(100粒T3代種子)、轉空載體植株(100粒T3代種子)和哥倫比亞生態型擬南芥(100粒種子)。

在裝有相同重量土的花盆中播種待測種子并培養，從播種開始計時，第1至14天正常管理，第15至25天干旱處理(干旱處理即持續不澆水)，第26天開始正常管理(恢復澆水，簡稱復水)。分別于第24天結束時、第25天結束時、第26天結束時(復水1天后)、第28天結束時(復水3天后)拍照，第28天結束時(復水3天后)統計存活率。

照片見圖7。

哥倫比亞生態型擬南芥的存活率為5％，轉空載植株的存活率為6％，L4株系的存活率為100％，L15株系的存活率為100％。結果表明，與哥倫比亞生態型擬南芥相比，L4株系和L15株系的抗旱性顯著增加。