一種檢測陰溝腸桿菌O20型的引物及方法與流程

本發明涉及生物檢測
技術領域：
，具體涉及一種檢測陰溝腸桿菌O20型的引物及方法。
背景技術：
：陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)作為一種革蘭氏陰性粗短桿菌，廣泛存在于自然界中，在土壤、植物、昆蟲及人和動物的糞便中均可檢出，是人和動物腸道正常菌種之一，同時它也是一種重要的條件致病菌。近年來，由于第三、四代頭孢菌素、碳青酶烯類等超廣譜抗菌藥物在臨床上的廣泛使用，該菌的耐藥菌株日益增多，使得臨床上對該菌引起的感染性疾病的治療趨于復雜化。耐藥菌株的出現的主要原因是未能在第一時間辨明病原菌，在不明病原菌的情況下，濫用藥物。80年代以來，陸續有文獻報道了對陰溝腸桿菌進行血清型分型、噬菌體分型、細菌素分型，以及生物型分型等手段。但以上分型方法只能聯合使用，由于單獨使用一種方法分型的重現性不理想和分型能力弱，不能很好地將陰溝腸桿菌進行準確分型。因此，臨床上迫切需要一種快速、精準的檢測手段，識別病原體，從而進行針對性治療。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種針對陰溝腸桿菌O20型的檢測引物及方法。該方法可用于陰溝腸桿菌O20型的PCR檢測，具有檢測時間短，成本低，檢測結果特異性高，結果易判斷，實用性強。本發明的技術目的是通過以下的技術方案實現的。一種檢測陰溝腸桿菌O20型的引物為下述兩組核苷酸序列之一，每組核苷酸序列由正向引物和反向引物組成：第一組核苷酸序列：正向引物(SEQIDNO.1)5’—AGAATCTTACACTGGCTTA—3’；反向引物(SEQIDNO.2)5’—CTTAATACACCTGGCACA—3’；第二組核苷酸序列：正向引物(SEQIDNO.3)5’—TTTGGCTATGGCCGTATT—3’；反向引物(SEQIDNO.4)5’—GTGCAGATGCCTGATGAA—3’。上述引物在檢測陰溝腸桿菌O20型中的應用，即檢測陰溝腸桿菌O20型的方法，首先提取待檢測樣品的DNA，并以樣品DNA為模板，利用第一組核苷酸序列或者第二核苷酸序列作為引物進行PCR擴增，然后將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷樣品中是否含有陰溝腸桿菌O20型。在上述的檢測方法中，采用第一組核苷酸序列作為引物時，若電泳結果在459bp位置出現單一條帶，則說明樣品中含有陰溝腸桿菌O20型；反之，則樣品中不含陰溝腸桿菌O20型。在上述的檢測方法中，采用第二組核苷酸序列作為引物時，若電泳結果在246bp位置出現單一條帶，則說明樣品中含有陰溝腸桿菌O20型；反之，則樣品中不含陰溝腸桿菌O20型。在上述檢測方法中，進行PCR擴增的反應體系為30μL的反應體系，具體為：10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL；2.5mmol/L的dNTP1μL；Taq酶1.5-2.25U；10μmol/L的引物(即檢測陰溝腸桿菌O20型的引物，第一組核苷酸序列代表的引物對或者第二組核苷酸序列代表的引物對)0.1-0.3μL；10-300ng/μL的樣品DNA(即模板DNA)1μL；最后用滅菌超純水補至30μL。在上述檢測方法中，進行PCR擴增時，PCR反應程序為：95℃5min，1個循環；94℃30s,58℃-65℃45s,68℃1min，共35個循環；72℃7min，1個循環；4℃保存。在上述檢測方法中，10μLPCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在檢測時從PCR擴增產物中進行取樣檢測，即PCR擴增的反應體系為PCR檢測體系。與現有技術相比，本發明具有如下優點：采用本發明的檢測方法檢測陰溝腸桿菌O20型所需時間短、特異性強、靈敏度高。本發明避免了采用傳統鑒定方法操作繁瑣、耗時長、準確性低、檢出率低等缺點。同時，本發明所涉及的儀器設備、試劑等較為常用，一般基層實驗室即可開展檢測工作，實用性更強。本發明所檢測的靶點具有單一性，檢測結果特異，易于判定，所需時間短、降低了檢測成本，提高了檢測效率。附圖說明圖1為實施例中PCR檢測方法特異性評估實驗凝膠電泳結果圖。圖2為實施例中PCR檢測方法靈敏度評價實驗凝膠電泳結果圖。圖3為實施例中臨床樣品檢測凝膠電泳結果圖。具體實施方式下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術方案。實施例中未注明具體條件的實施方法，通常按照常規條件例如Sambrook等分子克隆，實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHaborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實驗試劑蒸餾水Milli-Q系統，MilliporeCo.,USA10×PCRBuffer(含Mg2+)寶生物工程(大連)有限公司2.5mmol/L的dNTP寶生物工程(大連)有限公司Taq酶寶生物工程(大連)有限公司DL1000分子量標準寶生物工程(大連)有限公司100bpDNALadder分子量標準寶生物工程(大連)有限公司1％瓊脂糖凝膠GenviewCo.,USA實驗儀器恒溫搖床上海世平實驗設備有限公司分光光度計德國Eppendorf公司，BioPhotometer凝膠成像系統上海Tanon公司,GIS2010超純水儀MilliporeCo.,USA離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司公司H1650-W實驗菌種菌名來源菌種原始編號陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeO20株NCTC11589大腸桿菌EscherichiacoliO22CMCC44182沙門氏菌SalmonellatyphiO67株CMCC50071-9痢疾志賀氏菌ShigelladysenteriaeO1株CMCC51491鮑氏志賀氏菌ShigellaboydiiO2株CMCCC2CMCC：中國醫學微生物菌種保藏管理中心，即中國醫學細菌保藏管理中心，北京市東城區天壇西里2號；NCTC：NationalCollectionofTypeCultures,CentralPublicHealthLaboratory,London,UnitedKingdom英國國立標準菌種收藏中心。步驟一，設計針對陰溝腸桿菌O20型的特異性引物對，并由Invitrogen英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。第一組核苷酸序列：正向引物5’—AGAATCTTACACTGGCTTA—3’；反向引物5’—CTTAATACACCTGGCACA—3’；第二組核苷酸序列：正向引物5’—TTTGGCTATGGCCGTATT—3’；反向引物5’—GTGCAGATGCCTGATGAA—3’。步驟二，DNA模板制備將陰溝腸桿菌O20型接種于5mL營養肉湯液體培養基(制備方法參考J.Sambrook等《分子克隆實驗指南(第二版)》909頁)中，于35℃恒溫搖床中震蕩培養12h增菌后，取1mL菌液，放入1.5mL無菌離心管中；12000r/min離心15min，棄盡上清液，加入500μL滅菌超純水，用移液器輕輕吹打，重懸菌體，12000r/min離心15min，棄盡上清液，收集細菌；加入100μL滅菌超純水，用移液器輕輕吹打，重懸菌體，置于沸水中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min。隨后35℃解凍，12000r/min離心15min，取上清液放置4℃備用或-20℃保存。步驟三，陰溝腸桿菌O20型特異性PCR檢測方法建立PCR檢測體系為30μL(即進行PCR擴增的反應體系)，反應體系具體為：10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL，2.5mmol/L的dNTP1μL，Taq酶1.5U,10μmol/L的引物0.3μL(第一組核苷酸序列或者第二組核苷酸序列),100ng/μL的模板DNA(步驟2進行制備)1μL，最后用滅菌超純水補至30μL；PCR檢測反應程序為：95℃5min，1個循環；94℃30s,60℃45s,68℃1min，共35個循環；72℃7min，1個循環；4℃保存。步驟四，PCR擴增結果凝膠電泳判定所述判定方法具體為：取10μLPCR擴增產物，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈照射下觀察電泳結果：采用第一組核苷酸序列作為引物時，若電泳結果在459bp位置出現單一條帶，則說明樣品中含有陰溝腸桿菌O20型；反之，則樣品中不含陰溝腸桿菌O20型。采用第二組核苷酸序列作為引物時，若電泳結果在246bp位置出現單一條帶，則說明樣品中含有陰溝腸桿菌O20型；反之，則樣品中不含陰溝腸桿菌O20型。PCR檢測方法特異性評估實驗按照上述DNA模板制備與PCR檢測方法，對保存的陰溝腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌進行PCR擴增反應，并對擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，特異性檢測結果見圖1。圖中：泳道M為100bpDNALadder分子量標準；泳道1和7均為模板為滅菌超純 水的陰性對照；采用第一組核苷酸序列作為引物，檢測結果如泳道2-6所示，分別為陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeO20株、大腸桿菌EscherichiacoliO22株、沙門氏菌SalmonellatyphiO67株、痢疾志賀氏菌ShigelladysenteriaeO1株、鮑氏志賀氏菌ShigellaboydiiO2株，只有陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeO20株在459bp處出現特異條帶，而其他菌種未出現特異條帶；采用第二組核苷酸序列作為引物，檢測結果如泳道8-12所示，分別為陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeO20株、大腸桿菌EscherichiacoliO22株、沙門氏菌SalmonellatyphiO67株、痢疾志賀氏菌ShigelladysenteriaeO1株、鮑氏志賀氏菌ShigellaboydiiO2株，只有陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeO20株在246bp處出現特異條帶，而其他菌種未出現特異條帶。PCR檢測方法靈敏度評價實驗PCR檢測方法的靈敏度通過每個反應中能檢測到的最低DNA質量來表示(即在進行PCR擴增后反應體系中樣品DNA的質量)。取純培養物的基因組DNA提取液，用分光光度計測定DNA濃度，以滅菌超純水進行不同倍數的梯度稀釋(即濃度稀釋)，得到1000ng/μL,100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL梯度的DNA(即陰溝腸桿菌EnterobactercloacaeO20株)，將上述不同濃度的DNA在相同條件下進行PCR擴增(以1μL梯度稀釋液為模板進行PCR擴增)，凝膠電泳檢測擴增產物，紫外燈照射下觀察凝膠電泳結果，如圖2所示。圖2中：泳道M為DL1000分子量標準；泳道1-4為陰溝腸桿菌O20型模板量1000ng、100ng、10ng、1ng的PCR擴增結果，采用第一組核苷酸序列作為引物；泳道5-8為陰溝腸桿菌O20型模板量1000ng、100ng、10ng、1ng的PCR擴增結果，采用第二組核苷酸序列作為引物。由圖2可知，無論采用本發明的第一組核苷酸序列，或者第二組核苷酸序列，檢測方法可檢測的最低DNA模板量為10ng，本法具有較好的靈敏度。臨床疑似菌株檢測利用上述方法建立的陰溝腸桿菌O20型特異性PCR檢測方法對從臨床分離到的2株疑似菌株進行檢測。檢測結果見圖3，圖中泳道M為100bpDNALadder分子量標準；泳道1為陰溝腸桿菌O20型陽性對照，泳道2-3為2株疑似菌株，泳道4為模板為滅菌超純水的陰性對照，泳道1-4均利用第一組核苷酸序列作為引物；泳道5為陰溝腸桿菌O20型陽性對照，泳道6-7為2株疑似菌株，泳道8為模板為滅菌超純水的陰性對照，泳道5-8均利用第二組核苷酸序列作為引物。圖中可知，2株臨床疑似菌株均呈陰性結果。以上對本發明做了示例性的描述，應該說明的是，在不脫離本發明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領域技術人員能夠不花費創造性勞動的等同替換均落入本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3