帶安全開關的嵌合抗原受體免疫細胞及其制備方法與應用與流程

本發明涉及生物醫藥領域，具體本發明涉及一種攜帶安全機制的基因修飾嵌合抗原受體(CAR)免疫效應細胞的主要結構以及其制備方法和應用。所述的攜帶安全機制的CAR細胞編碼帶安全開關的CAR的核酸序列，該核酸序列結構包括識別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原的嵌合抗原受體結構域、跨膜-刺激結構域、CD3ζ刺激信號傳導區、整合的自殺基因區。
背景技術：
：手術、放療、化療和姑息治療等作為惡性腫瘤的傳統治療方法，在抗腫瘤治療中一直占據著主導地位。近十年來，隨著對腫瘤發生發展的內在機制及其外在微環境研究的不斷深入，免疫治療尤其是細胞免疫治療在腫瘤治療中的應用逐漸從幕后走到了前臺。免疫治療具有突破腫瘤耐藥的遺傳學和細胞系機制、靶向腫瘤細胞的同時極少損傷正常組織的特點。近五年來，可以激活機體T細胞殺傷功能的單克隆抗體和經基因修飾后可直接識別腫瘤細胞的效應細胞，在臨床抗腫瘤試驗中體現出明顯強于既往研究的顯著療效，在腫瘤治療領域中引發了轉化研究的新高潮。以色列科學家ZeligEshhar團隊在1989年模擬TCR的組分，將可特異識別TNP抗原的抗體編碼的輕鏈和重鏈基因分別克隆并組裝成免疫球蛋白-TCR嵌合受體，轉導入T細胞后，使得T細胞不僅具有特異性識別抗原的能力，而且通過嵌合受體傳遞的跨膜-刺激信號也同時活化了T細胞。隨后，在1993年，StevenRosenberg和ZeligEshhar團隊一起合作，將可以特異識別卵巢癌的抗體序列構建為嵌合抗原受體(CAR)，轉導至TIL表面，利用體外實驗證實其可以特異識別并裂解卵巢癌細胞。此后，LaurenceCooper團隊與CarlJune團隊在第一代CAR-T構建的基礎上，在抗體序列和TCR胞內部分之間加入了一個或多個共刺激信號分子，大大提高了CAR-T細胞的存活能力和抗腫瘤效果，形成了第二代、第三代CAR-T技術。2011年，CarlJune團隊在兩本不同的高影響力雜志上幾乎同時發表了利用第三代CD19CAR-T技術治療三名B細胞急性淋巴細胞白血病患者的數據，其中兩名達到完全緩解，一名部分緩解，立即引起大量腫瘤學家重新正視細胞免疫治療，宣告癌癥免疫治療時代已經來臨。淋巴瘤是由B、T和NK等淋巴細胞發生的惡性腫瘤，根據世界衛生組織(WHO)的最新分類，淋巴瘤主要分為霍奇金和非霍奇金淋巴瘤兩大類，其中非霍奇金淋巴瘤比例約為90％。在非霍奇金淋巴瘤中，源自B細胞的淋巴瘤/白血病為最常見的亞型，所占比例大致為85％。隨著診斷和治療模式的不斷改進，尤其是自針對CD20陽性B細胞淋巴瘤/白血病的利妥昔單抗的上市以來，源自成熟B細胞的淋巴瘤/白血病患者接受經含利妥昔單抗免疫化療為主的綜合治療后，完全緩解率可達76％。雖然，B細胞淋巴瘤/白血病經當前普遍采用的規范化治療后有著較高的緩解率，但是仍有20％～30％患者死于腫瘤耐藥所致的復發和難治。因此，復發和難治B細胞淋巴瘤/白血病也就成為了當前淋巴瘤基礎和轉化研究領域中的重點和焦點問題之一。針對CD19的CAR-T治療已經取得了舉世矚目的成果，但仍有相當大一部分淋巴瘤或白血病患者為CD19陰性，因此無法得到救治。CD20作為B細胞淋巴瘤與白血病的另一個重要的表面標志物，也是作為嵌合抗原受體細胞識別的潛在靶標之一。應用CD20作為靶標，可以很好的填補CD19陰性、CD20陽性淋巴瘤與白血病患者的救治問題，也可以作為雙陽性患者在長期使用CD19CAR-T后無效的后備療法或聯合治療的選擇。雖然CAR-T技術已被大多數國內外前期臨床研究證實具有較高的有效性，但是與常規淋巴瘤/白血病放、化療治療過程類似，副作用依然不容小覷；并且，與大多數細胞過繼輸入治療相類似，CAR-T細胞應用過程中需要配合使用細胞因子及其他相關處理方式，寒戰、發熱、白細胞減少、腫瘤溶解綜合征、細胞因子風暴、B細胞缺乏引起的低免疫球蛋白血癥等為常見的不良反應；此外，外源基因的整合也有導致細胞產生突變甚或癌變的風險。因此，CAR-T技術面臨的首要重要問題就是安全性，對現有的CAR-T細胞技術做安全可控性處理，不僅有利于控制多種不良反應，還有利于防止CAR-T細胞潛在的癌變風險。技術實現要素：本發明涉及一種攜帶安全機制的基因修飾嵌合抗原受體(CAR)免疫效應細胞及其制備方法和應用。具體地，一方面，本發明提供了一種編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列，該核酸序列結構包括識別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原的嵌合抗原受體結構域、跨膜-刺激結構域、CD3ζ刺激信號傳導區、自殺基因區。另一方面，本發明還提供了一種帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)免疫細胞，其包含編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列。即，本發明的攜帶安全機制的CAR細胞包括識別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原的嵌合抗原受體結構域、跨膜-刺激結構域、CD3ζ刺激信號傳導區、整合的自殺基因區。本發明是在第二代、第三代CAR技術上進行改造，整合了自殺基因區域。不同種類的免疫效應細胞經擴增和轉導攜帶自殺機制的CAR序列后可獲得CAR免疫細胞，通過CAR識別腫瘤細胞相應的抗原后，CAR免疫細胞可對腫瘤細胞產生特異性殺傷作用。使用時按梯度輸注CAR免疫細胞并監測相關細胞因子水平的動態變化，需要時可利用藥物啟動自殺基因而清除效應免疫細胞，以取得安全性與療效的最佳平衡，從而在最大程度上保證該技術在臨床腫瘤治療應用上的安全性。根據本發明的具體實施方案，本發明的編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列中，所述的腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原選自CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、CD171/L1-CAM、WT1、CEA、GD2、FR、PSMA、gp100、CA9、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、c-Met、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、GPC3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、SCC、AFU、EBV-VCA、TSGF、POA、β2-MG和PROGRP中的一種和其任何組合。在本發明的一個實施例中，選擇CD20作為嵌合抗原受體靶標抗原。CD20作為B細胞來源的淋巴瘤與白血病的有效標志物已經得到很多文獻證據的證明，針對CD20的單克隆抗體藥物也已經被證明在臨床使用上是有效的，因此將CD20作為抗原嵌合受體的靶向抗原具備治療相關淋巴瘤和白血病的可能。根據本發明的具體實施方案，本發明的編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列中，所述跨膜-刺激結構域包括跨膜結構域與共刺激信號分子的胞內結構域。所述跨膜-刺激結構域選自CD8、CD27、CD28、CD137/4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、CD80、CD86、PD-1、LCK、ICOS、LFA-1、DAP10、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3分子的全部或部分片段。選擇CD3ζ作為刺激信號傳導區。在本發明的一個實施例中，選擇CD28的跨膜結構域與共刺激信號分子的胞內結構域作為跨膜-刺激結構域。根據本發明的具體實施方案，本發明的編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核 酸序列中，所述整合的自殺基因區選自HSVTK、VZVTK、EC-CD、Caspase1、Caspase8、Caspase9。啟動自殺基因的前藥包括丙氧鳥苷(GCV)、無環鳥苷(ACV)、溴乙烯脫氧尿苷(BVDU)、6-甲氧基嘌呤阿拉伯核苷(AraTP)、5-氟胞嘧啶(5-Fc)、AP20187、AP1903、他莫昔芬、他克莫司。另一方面，本發明還提供了所述的編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列或所述的帶安全開關的嵌合抗原受體免疫細胞在制備治療哺乳動物與升高的/異常表達的腫瘤抗原表達相關的疾病、紊亂或病癥的藥物中的應用。換而言之，本發明還提供了一種治療哺乳動物與升高的/異常表達的腫瘤抗原表達相關的疾病、紊亂或病癥的方法。該方法包括施予哺乳動物有效量的本發明所述的編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列或所述的帶安全開關的嵌合抗原受體免疫細胞。另一方面，本發明還提供了所述的編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列或所述的帶安全開關的嵌合抗原受體免疫細胞在制備用于治療患者淋巴細胞白血病/淋巴瘤的藥物中的應用。換而言之，本發明還提供了一種治療患者淋巴細胞白血病/淋巴瘤的方法。該方法包括施予患者有效量的本發明所述的編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列或所述的帶安全開關的嵌合抗原受體免疫細胞。在本發明的一些實施方案中，其中所述患者至少對一種化療藥劑具有抗性。在本發明的一些實施方案中，其中所述的淋巴細胞白血病/淋巴瘤為難治型的CD20+淋巴瘤和白血病。本發明上述的治療方法還可包括患者輸注后產生如細胞因子風暴、危及生命的輸液反應、過敏反應，或其它臨床判斷可能對患者產生不利影響的副作用，則可使用啟動自殺基因的前藥，以清除體內基因工程改造以表達CAR的免疫效應細胞。在本發明的一個實施例中，鑒于輸注針對CD20的CAR-T進行治療后的淋巴瘤患者會因B細胞缺乏而導致免疫能力下降，臨床常伴有巨細胞病毒感染導致的肺炎等疾病，且因EB病毒易誘發淋巴瘤，因此部分淋巴瘤患者為EB病毒攜帶者，在免疫能力下降時易誘發單核細胞增多癥。針對以上原因，本發明創造性的選擇HSVTK作為自殺基因區，選擇丙氧鳥苷(更昔洛韋\GCV)作為自殺基因啟動前藥，在患者經針對CD20的CAR-T治療后達痊愈或因并發癥需中止治療時，選擇更昔洛韋啟動CAR-T自殺基因，在清除CAR-T細胞的同時，可針對巨細胞病毒感染、EB病毒感染起到治療和預防的作用。在本發明中，監測治療過程中的細胞因子風暴的方法為使用ELISA方法，所用試劑盒可以為市售試劑盒，檢測目標包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、 MCP-1和IL-8等。在本發明的一個實施例中，使用上述細胞因子檢測方法，如發現細胞因子風暴風險，即使用連續3天給予更昔洛韋6mg/kg，啟動自殺基因，使基因修飾的嵌合抗原受體免疫效應細胞凋亡。根據本發明的具體實施方案，本發明的編碼帶安全開關的嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列中，所述識別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原的嵌合抗原受體結構域為可以和所述腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原、膜受體特異性識別并結合的分子，如蛋白、多肽、單克隆抗體、單鏈抗體(ScFv)、Fab片段或抗體等，在本發明的一個實施方案中，嵌合抗原受體結構域為單鏈抗體(ScFv)。本發明的載體可以使用真核表達質粒以及重組病毒；所述真核表達質粒可以為pcDNA3.1、pCI和pVAX1、轉座子質粒等常用質粒；所述重組病毒例如可以為重組逆轉錄病毒、重組慢病毒、腺病毒，本發明的一個實施方案中，所述載體為Plenti-CMV。本發明將上述載體搭載CAR片段后導入免疫反應細胞，使其表達嵌合抗原受體。導入方法包括電轉法、病毒轉導法、轉染法、基因槍法。在本發明的一個實施例中，使用病毒轉導法作為導入方法。本發明中所述的免疫效應細胞包括自體或異體的骨髓、外周血、組織來源。所述免疫反應細胞可選自直接提取的或由其他細胞分化擴增而來的T細胞、單核細胞、自然殺傷細胞、中性粒細胞、CIK細胞；其中所述T細胞例如可以為細胞毒性T淋巴細胞、NKT細胞、γδT細胞、輔助T細胞、或抑制/和調節性T細胞。在一個實施例中，選擇自體外周血來源的單個核細胞分化擴增而來的細胞毒性T淋巴細胞作為免疫反應細胞。本發明中所述的導入CAR結構的免疫效應細胞，其中當所述嵌合抗原受體結構域結合它相應的抗原時，所述細胞顯示抗腫瘤免疫。本發明中所述的腫瘤抗原與實體瘤相關，所述的實體瘤例如為肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、鼻咽癌、卵巢癌、宮頸癌、結腸癌、大腸癌、腎癌、黑色素瘤、腦神經膠質瘤、胰腺癌或前列腺癌等。本發明中所述的腫瘤抗原與淋巴瘤及惡性血液病相關。所述的淋巴瘤及惡性血液病例如彌漫性大細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、B細胞急性淋巴細胞白血病、B細胞慢性淋巴細胞白血病、幼淋巴細胞白血病。在本發明中的一個實施例中，通過基因克隆技術，將針對CD20的嵌合抗原受體、CD28的跨膜段與胞內段，CD3ζ段，HSVTK基因克隆到以CMV為啟動子的慢病毒多 克隆位點上，應用慢病毒包裝質粒，通過轉染293FT細胞包裝成具備轉導能力的基因工程載體實現CAR的構建。將通過采集得到的患者單個核細胞加入到專用的無血清培養基中，并加入IL-2與CD3抗體激活，加入包含上述CAR的載體，培養7日，即形成針對CD20的具備安全機制的CAR-T細胞。依照1×105/kg～10×107/kg計算治療用總細胞量，以占總量的10％、30％、60％進行每天或隔天給予梯度細胞輸注，以保障治療的安全性與有效性的平衡。如發現細胞因子風暴風險，即使用連續3天給予更昔洛韋(GCV)6mg/kg，啟動自殺基因，確保治療安全性。本發明中所述的搭載CAR結構序列的載體、轉染、導入、制備過程中涉及的常用試劑、免疫反應細胞以及相關的說明書可組合成為試劑盒。發明中涉及到的一些名詞解釋：術語“嵌合抗原受體”是人工改造嵌合受體，能夠將識別腫瘤抗原的特異性分子(如抗體)穩定表達在在免疫效應細胞(如T細胞)膜表面上，使免疫細胞識別腫瘤抗原并殺死腫瘤細胞。術語“共刺激信號分子”(Co-stimulatingmolecule)是指免疫效應細胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通過與其相應的配體結合，可以激活免疫細胞的第二信號，增強免疫細胞的增殖存活能力及殺傷功能。術語“腫瘤特異性抗原”(tumorspecificantigen,TSA)是腫瘤細胞特有的或只存在于某種腫瘤細胞而不存在于正常細胞的一類抗原。術語“腫瘤相關抗原”(tumor-associatedantigen,TAA)是指非腫瘤細胞所特有的、正常細胞和其他組織上也存在的抗原，但其表達量在腫瘤細胞中明顯升高的一類抗原。術語“單鏈抗體”(single-chainantibodyvariableregionfragment,scFv)是指由抗體VL區氨基酸序列和VH區氨基酸序列經Linker連接而成，具有結合抗原能力的抗體片段。術語“自殺基因”(suicidegene)是指將某些病毒或細菌的基因導入靶細胞中，其表達的酶可催化無毒的藥物前體轉變為細胞毒物質，從而導致攜帶該基因的受體細胞被殺死，此類基因稱為自殺基因。本發明中，所述多肽通常是指長度在1～100個氨基酸的肽鏈分子；蛋白通常是指長度大于100個氨基酸的肽鏈分子。在本發明中所述“選自”是指選自所列項目中的一種或數種。技術優勢：本發明在國際上最為流行的第二代、第三代CAR技術上進行改造，加入了自殺基因區域，可以在保障治療效果的同時，通過臨床廣泛應用的對患者無副作用或不對腫瘤治療產生影響的藥物，啟動自殺基因，從而避免了傳統第二代、第三代CAR免疫效應細胞產生的細胞過量、細胞因子風暴、脫靶殺傷正常組織、異體免疫效應細胞導致的急性GVHD等安全隱患。同時，隨著安全機制的引入，為臨床同時使用多種針對不同靶點的CAR改造細胞聯合治療打下基礎。本發明同時適用于任何可被CAR技術改造的免疫效應細胞，極大的提高CAR技術的臨床有效性及安全性。附圖說明圖1：攜帶安全機制的針對CD20的嵌合抗原受體結構圖。圖2：攜帶安全機制的針對CD20的嵌合抗原受體表達載體模式圖。(pLenti-CMV-anti-hCD20scFv-CD28z-IRES2-HSVTK)。圖3：CAR20-T細胞的體外致瘤性試驗結果。圖4：經過基因修飾的針對CD20的T細胞(CAR20-T)與未經基因修飾的T細胞(CAR0-T)對Raji細胞及Namalwa(CD20淋巴瘤細胞系)的識別與殺傷作用。圖5：CAR20-T與對照組CAR0-T對Namalwa淋巴瘤小鼠模型的治療作用實驗結果。其中，圖片A：BALB/c裸鼠接種Namalwa細胞5×106觀察25d后，可見皮下發生巨大腫瘤包塊。圖片B：BALB/c裸鼠接種Namalwa細胞5×106后第二天注射CAR0-T,25d后仍可觀察到小鼠皮下產生巨大腫塊。圖片C：BALB/c裸鼠接種Namalwa細胞5×106后第二天注射CAR20-T,25d后觀察可見小鼠外表未見任何腫瘤或包塊。圖片D：CAR20-T治療組經解剖后可見皮下未存在任何可見腫瘤或由于CAR20-T治療而產生的腫瘤。圖片E1：Namalwa細胞5×106小鼠腫瘤。圖片E2：Namalwa細胞5×106+CAR0-T5×106小鼠腫瘤。圖6：更昔洛韋啟動CAR20-T自殺基因體外實驗結果。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者， 均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1：CAR表達框體的合成與表達載體的構建根據構成CAR各組分的氨基酸序列與編碼序列，拼接成整個融合的氨基酸序列與編碼DNA表達框，全長序列中含有anti-hCD20scFv(SEQIDNO:2或SEQIDNO:6)和人CD28跨膜及胞內段(SEQIDNO:3或SEQIDNO:7)，CD3ζ鏈(SEQIDNO:4或SEQIDNO:8)以及HSVTK自殺基因(SEQIDNO:5或SEQIDNO:9)，合稱為anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK序列(如圖1所示)，序列的兩端引入了XbaI和SalI限制性內切酶酶切位點的編碼序列。本發明中對anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK采取了人工合成全長序列，委托華大基因有限公司有償合成。選用第三代慢病毒載體pLenti-CMV，其5'和3'端均含有自失活序列，以確保不能包裝成完整的具有復制能力的慢病毒，啟動子為CMV啟動子。其后利用XbaI和SalI限制性內切酶同時酶切合成的序列和載體，經回收后連接，經轉化感受態大腸桿菌后，利用氨芐青霉素抗性篩選經篩選獲得陽性克隆，首先利用PCR鑒定陽性克隆并隨后擴增陽性菌，使用Qiagen公司的質粒純化試劑盒提取并純化質粒，獲得各重組表達載體的高品質質粒,成功獲得pLenti-CMV-anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK慢病毒質粒(如圖2所示)。SEQIDNO:#指代片段SEQIDNO:1pLenti-CMV-anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK轉移載體(核酸序列)SEQIDNO:2hCD20scFv(核酸序列)SEQIDNO:3hCD28z(核酸序列)SEQIDNO:4hCD3ζ(核酸序列)SEQIDNO:5HSVTK(核酸序列)SEQIDNO:6hCD20scFv(氨基酸序列)SEQIDNO:7hCD28z(氨基酸序列)SEQIDNO:8hCD3ζ(氨基酸序列)SEQIDNO:9HSVTK(氨基酸序列)SEQIDNO:10CMV啟動子(核酸序列)SEQIDNO:11PRE(核酸序列)實施例2：包含CAR結構的病毒包裝采用293FT為包裝細胞，待長至90％融合度時，換為無血清DMEM培養基，轉染試劑采用Lipofectamine3000，對于一個六孔板，轉染用的質粒各自用量分別為，vsv-G 0.37μg+tat0.19μg+rev0.19μg+gag0.19μg+vector(pLenti-CMV-anti-hCD20scFv-CD28z-CD3ζ-HSVTK)2μg，按照Lipofectamine3000說明書操作，配制好轉染液之后，加入至無血清培養基培養的293FT中，6小時后換為10％胎牛血清DMEM完全培養基，繼續培養48-72小時后收集病毒液，過濾后按轉速90,000gx2小時離心，加入500μlPBS/管，凍存于-80℃備用。實施例3：anti-hCD20-CAR-T(CAR20-T)的制備采用50ml注射器，一次性采集淋巴瘤患者50ml外周血，利用PBS按1:2稀釋之后，緩慢加入至Ficoll分離液上，比例為2：1。室溫下1500rpm離心10分鐘，可見分為三層，中間一層白色的為淋巴細胞；輕輕吸取淋巴細胞層到6ml～8mlRPMI1640中洗脫；1500rpm離心10分鐘；去掉上清，加入2mlRPMI1640，計數后按0.5x106/ml加入至OpTmizerTMT-cellExpansionSFM培養基中，培養過夜。將上一步驟中獲得的病毒液按MOI5、polybrene10μg/ml/、1000IU/ml重組人白介素2(rhIL-2)混合加入至過夜培養后的T細胞，細胞濃度為0.5x106/ml，培養過夜后換用含1000IU/mlrhIL-2的OpTmizerTMT-cellExpansionSFM培養基，培養3～7日后，選用山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體為一抗和APC標記的驢抗山羊抗體為二抗，對照為加入經空載體包裝獲得的病毒同步感染的T細胞，檢測所得的APC陽性細胞即為陽性的anti-hCD20-CAR-T細胞(CAR20-T)。為進一步證明CAR20-T細胞特異識別人CD20序列，還利用人CD20-Fc融合蛋白(acrobiosystems公司)加APC標記的anti-Fc抗體進行檢測。本實施例的研究結果表明，陽性細胞比率為40～60％。實施例4：anti-hCD20-CAR-T細胞(CAR20-T)特異識別與殺傷CD20陽性B細胞淋巴瘤細胞株實驗B細胞淋巴瘤細胞株選用Raji細胞與Namalwa細胞株，按10μMCFSE標記。CAR20-T細胞按1uMCFSE標記。將CAR20-T細胞和Raji、Namalwa細胞分別按效靶比1:1和10:1比例進行混合，對照(CAR0-T)為加入經空載體包裝獲得的病毒同步感染擴增培養的T細胞。設置殺傷時間為8小時，收集后使用流式檢測觀察其識別與殺傷效率。實驗結果(圖3)顯示未經基因修飾的T細胞對Namalwa細胞株幾乎沒有殺傷效果，反而經過培養后Namalwa細胞產生了一定的增長，在1:1與10:1組分別增長了8.2％與1.38％；未經修飾的T細胞對Raji細胞的殺傷效率在1:1與10:1組中分別為7.9％與1.29％。經過基因修飾的CAR20-T細胞對Namalwa細胞與Raji細胞均產生了識別與特異性殺傷。在針對Namalwa細胞的1:1殺傷實驗中，CAR20-T殺傷了4.7％的Namalwa 細胞，與對照組中細胞反而增殖相比，共抑制了12.9％的腫瘤細胞生長，10:1組殺傷了1.29％的腫瘤細胞，與對照組相比，共降低了2.67％的腫瘤生長。CAR20-T細胞對Raji細胞1:1的試驗中，共殺傷了15％的腫瘤細胞，與對照組相比，比未經修飾的T細胞多殺傷了7.1％的腫瘤細胞，10:1組中殺傷了4.36％的腫瘤細胞，與對照組相比，增加殺傷效率3.07％。上述結果顯示CAR20-T可特異性識別CD20抗原，并對細胞產生殺傷作用，且殺傷效率優于未經基因修飾的T細胞。實施例5：CAR20-T細胞致瘤性實驗配制低熔點瓊脂，高壓滅菌后待用。配置如下培養基：1.未加因子的培養基：45mLDMEM+5mL的FBS(10％)，混勻后置于4℃保存(10％FBS+DMEM)。2.1x因子培養液(上層液)：5mL的FBS+42.5mL的DMEM+剩余體積加入1x因子(EGF+GLU)，混勻，4℃保存。3.中層液的配制：10mLFBS+37.5mL的DMEM剩余體積加入2倍體積因子(20％FBS+DMEM+2x因子)。選用HEPG2作為對照細胞，與CAR20-T細胞按細胞數量“100-200-400”逐孔進行，方法：將含有60℃水的燒杯放入安全柜內操作，燒杯中放入一直溫度計，隨時監測溫度的變化，分別向含細胞的15mL離心管內，快速加入400ul0.5％瓊脂/管，每次加瓊脂均更換槍頭，充分混勻，避免產生氣泡，然后小心垂直加入至含1.5％瓊脂的12孔板內。當溫度接近40℃時，將燒杯放入60℃水浴鍋內，重新恢復溫度，然后重復操作，加完為止。放置10分鐘后，轉移至37℃培養箱中培養，次日補充上層培養液500～800ul/孔，然后2～3天換液一次，500uL/次。待陽性孔內的腫瘤細胞呈現大面積的細胞集落生長時，可用結晶紫染色后，用三維掃描儀掃描。結果(如圖4顯示)顯示HEPG2形成腫瘤集落，而CAR20-T沒有集落形成，證明CAR20-T不具備致瘤性。實施例6：CAR20-T細胞在BALB/c裸鼠體內對腫瘤預防性的治療作用取6-8周的SPF級雌性BALB/c裸鼠(軍事醫學科學院實驗動物中心)9只。培養腫瘤細胞Namalwa至對數生長期，PBS洗滌后，用胎盤藍染色法計算細胞活力，PBS重懸。將腫瘤細胞5×106接種于每只裸鼠右前肢背部皮下，將接種后的小鼠隨機分為3組，每組3只，為腫瘤對照組、腫瘤細胞+空載體T細胞組(CAR0-T)、腫瘤細胞+CAR20-T組，即后兩組在接種后第二天分別在接種處注射5×106的對照用空載體T細胞(CAR0-T)與CAR20-T，共觀察25d。試驗結果如圖5所示，試驗證明經過照射后的裸鼠直接皮下 注射Namalwa細胞株可成功建立淋巴瘤模型，并成功觀察到腫瘤；未經基因修飾的T細胞在淋巴瘤動物模型中未能識別并殺傷腫瘤，腫瘤持續生長，與未治療組基本一致；經過基因修飾的針對CD20的T細胞產生了很好的識別與殺傷效果，全部試驗小鼠經解剖后未發現任何腫瘤組織或由于CAR-T細胞導致的成瘤組織。在實際臨床治療中，依照1×105/kg～10×107/kg計算總細胞量，以占總量的10％、30％、60％進行每天或隔天給予梯度細胞輸注，以取得安全性與療效的最佳平衡。實施例7：CAR20-T的自殺基因有效性試驗按照實驗步驟制備CAR20-T細胞與CAR0-T細胞，將CAR20-T細胞與CAR0-T細胞分別按照1x104/cm2的密度接種到六孔板中，其中各自再分為2組，設為給藥組和不給藥組，給藥組給予更昔洛韋1μg/ml；培養72h后，鏡下觀察細胞存活狀態。培養72小時后，鏡下觀察，結果如圖6所示，CAR20-T給藥組細胞出現大量死亡，但為給藥組并未出現以上情況；而用空載體轉染的對照組(CAR0-T)，給藥組與為給藥組細胞均存活，且生長情況一致。在實際臨床治療中，可依據患者體重，給予6mg/kg連續3天以達到上述效果。當前第1頁1 2 3