番茄黃化曲葉病抗病基因ty?5的分子標記引物及其應用的制作方法與工藝

番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物及其應用技術領域本發明屬于生物技術領域，涉及分子標記技術領域，具體涉及一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物及其應用。

背景技術：
番茄(Solanumlycopersicum)是世界上重要的蔬菜作物，在促進農業經濟發展、農民增收方面發揮著巨大的作用。種植過程中易受到多種病害的影響，導致產量下降，選育抗病品種十分重要。番茄黃化曲葉病(TomatoyellowleafcurldiseaseTYLCD)是番茄的重要病害，該病害是由雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)的番茄黃化曲葉病毒(TomatoyellowleafcurlvirusTYLCV)引起，主要通過煙粉虱(Bemisiatabaci)傳播。該病害最早報道于以色列，隨著國際貿易往來的深入，TYLCV逐漸向全球范圍擴展，20世紀90年代，該病害傳入我國，目前已經遍布我國所有的番茄主產區，對番茄生產造成嚴重危害，造成巨大的經濟損失。TYLCV危害番茄后，通過農業防治、化學防治不僅效果差，甚至還會對生態環境造成破壞，選育和種植抗病品種是最經濟、有效、環保的防治方法。由于TYLCV自身的變異，使得只含有Ty-1和Ty-2的番茄材料在一些區域喪失了抗性，而目前國內市場的番茄品種中均不含有ty-5基因，為了加快ty-5基因分子標記輔助育種(marker-assistedselection，MAS)的進程，開發與ty-5緊密連鎖的標記，選育含有ty-5基因的材料具有重要的意義。目前在ty-5連鎖標記研究方面，只確定1個CAPS標記SlNAC1連鎖，連鎖距離尚不明確；(參見HuttonSF，ScottJW，SchusterDJ.RecessiveResistancetoTomatoyellowleafcurlvirusfromtheTomatoCultivarTykingIsLocatedintheSameRegionasTy-5onChromosome4.Hortscience，2012，47(3)：324-327)，并且該標記類型在進行檢測時，需要對PCR產物進行酶切，實驗成本高，操作繁瑣。

技術實現要素：
為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物，用于篩選與TYLCV抗性基因ty-5緊密連鎖的分子標記。為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物，該分子標記引物包括上游引物從5’端到3’端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC；下游引物5’端到3’端為：GTCTCCGAAACGTAATCC。本發明另一個目的在于提供了一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記，解決常規育種中，抗性鑒定工作量大、周期長、成本高的問題；番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記為InDel標記類型，是利用上述茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物，經過PCR擴增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DNA分子標記，該分子標記的核苷酸序列為SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。本發明的第三個目的在于提供一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記分子標記方法，克服ty-5標記需要酶切的缺陷，應用分子生物學方法，以含有ty-5基因番茄自交系AVTO1227為材料，篩選與TYLCV抗性基因ty-5緊密連鎖的分子標記。番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記方法，包括以下步驟：1)提取番茄基因組DNA；2)以上述番茄基因組DNA為模板與上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物進行PCR擴增，對PCR反應的產物進行分離、鑒定、顯色后，檢測判斷番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5。進一步的，上述分子標記方法所述的步驟2)中，PCR反應體系為：10ng/μL模板DNA1μL；4pmmol/L分子標記引物1.0μL；10×PCRBuffer1.0μL；25mmol/LMgCl21.0μL；10mmol/LdNTPs0.25μL；5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL；ddH2O5.65μL；PCR反應擴增程序為：94℃預變性5min；每個循環94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個循環，最后72℃延伸7min。本發明的第四個目的在于提供番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因ty-5的檢測中和在ty-5基因的分子標記輔助育種中應用。番茄黃化曲葉病毒病抗性基因ty-5檢測方法：以番茄基因組DNA為模板與上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物進行PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，對電泳后條帶進行記錄，根據條帶大小確定是否含有ty-5基因；其中PCR反應體系為：反應體系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子標記引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmo1/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反應擴增程序為：94℃預變性5min；每個循環94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個循環，最后72℃延伸7min。相比現有技術，本發明的有益效果在于：1.本發明所述的分子標記引物能TYLCV抗性基因ty-5緊密連鎖，可以用TYLCV抗性基因ty-5的篩選和檢測；2.本發明所述的分子標記是一種InDel標記，利用一種廣泛分布在作物基因組上，根據堿基序列插入或缺失設計的標記，為共顯性標記，其在基因組上的分布廣泛，與CAPS標記相比，不需要經過酶切就可以進行多態性的分析，操作方便、簡潔，實驗成本小；3.本發明通過開發與ty-5連鎖的InDel標記，在分離群體中篩選與ty-5緊密連鎖的標記，以實現TYLCV分子標記輔助育種，加速對含有ty-5基因的番茄品種選育進程；4.本發明的分子標記可以與其他的連鎖標記結合，確定ty-5在染色體上的位置，為該基因的精細定位和此后對該基因的克隆奠定了基礎；5.本發明的分子標記應用于對ty-5基因抗性材料的選育，可降低生產過程中化學農藥的施用，減輕病害的傳播流行，節約生產成本，保障番茄生產的順利開展，提高番茄產業的經濟效益。附圖說明下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細說明；圖1InDel標記ty5-17在親本和極抗、極感單株的擴增圖譜；其中M：100bpMarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；1-5：F2極抗病單株；6-10：F2極感病單株；圖2InDel標記ty5-17在親本和任意37株F2單株的擴增圖譜；其中M：100bpmarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；F2單株；由moneymaker×AVTO1227的F1自交獲得的任意37株F2單株；圖3InDel標記ty5-17在不同番茄材料及品種組合中的擴增圖譜；其中，M：100bpmarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；1：1106-7-0；2∶9210；3∶9320；4：FJ-1；5：CLN2026D；6：CLN2777A；7：金陵美玉；8：金陵寶玉9：蘇粉11號；10：蘇粉14號；11：moneymaker×AVTO1227。具體實施方式番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物，該分子標記引物包括上游引物從5’端到3’端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC(SEQIDNo.1)；下游引物5’端到3’端為：GTCTCCGAAACGTAATCC(SEQIDNo.2)。具體的，番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物為InDel標記類型，能與ty-5基因緊密連鎖。本發明另一個目的在于提供了一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記，解決常規育種中，抗性鑒定工作量大、周期長、成本高的問題；番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記為InDel標記類型，是利用上述茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物，經過PCR擴增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DNA分子標記，該分子標記的核苷酸序列為SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。本發明的第三個目的在于提供一種番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記分子標記方法，克服ty-5標記需要酶切的缺陷，應用分子生物學方法，以含有ty-5基因番茄自交系AVTO1227為材料，篩選與TYLCV抗性基因ty-5緊密連鎖的分子標記。番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記方法，包括以下步驟：1)提取番茄基因組DNA；2)以上述番茄基因組DNA為模板與上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物進行PCR擴增，對PCR反應的產物進行分離、鑒定、顯色后，檢測判斷番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5。進一步的，上述分子標記方法所述的步驟2)中，PCR反應體系為：10ng/μL模板DNA1μL；4pmmol/L分子標記引物1.0μL；10×PCRBuffer1.0μL；25mmol/LMgCl21.0μL；10mmol/LdNTPs0.25μL；5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL；ddH2O5.65μL；PCR反應擴增程序為：94℃預變性5min；每個循環94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個循環，最后72℃延伸7min。本發明的第四個目的在于提供番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因ty-5的檢測中和在ty-5基因的分子標記輔助育種中應用。番茄黃化曲葉病毒病抗性基因ty-5檢測方法：以番茄基因組DNA為模板與上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物進行PCR擴增，對擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，對電泳后條帶進行記錄，根據條帶大小確定是否含有ty-5基因；其中PCR反應體系為：反應體系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子標記引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmol/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反應擴增程序為：94℃預變性5min；每個循環94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個循環，最后72℃延伸7min。以下是本發明具體的實施例，在下述實施例中除了給出說明的原料或試劑的來源外，其他材料及試劑均為現有的材料和試劑，可以通過購買方式獲得；在下述實施例中本發明所述的番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物簡稱為ty5-17。實施例1番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記，為InDel標記類型，是利用下述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物：上游引物從5’端到3’端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC下游引物5’端到3’端為：GTCTCCGAAACGTAATCC；經過PCR擴增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DNA分子標記；PCR反應體系為：反應體系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子標記引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmol/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反應擴增程序為：94℃預變性5min；每個循環94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個循環，最后72℃延伸7min；該分子標記的核苷酸序列為SEQIDNo.3。實施例2番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記，為InDel標記類型，是利用上述番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物：上游引物從5’端到3’端為：TAACAAAGCCCTCAAAGC下游引物5’端到3’端為：GTCTCCGAAACGTAATCC；經過PCR擴增得到的與ty-5緊密連鎖的共顯性DNA分子標記；PCR反應體系為：反應體系共10μL，10ng/μL模板DNA1.0μL；4pmmol/L分子標記引物1.0μL、10×PCRBuffer1.0μL、25mmol/LMgCl21.0μL、10mmol/LdNTPs0.25μL、5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL、ddH2O5.65μL；PCR反應擴增程序為：94℃預變性5min；每個循環94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30，共38個循環，最后72℃延伸7min；該分子標記的核苷酸序列為SEQIDNo.4所示。應用實施例1采用本發明所述的番茄黃化曲葉病抗病基因ty-5的分子標記引物鑒定不同品種的番茄是否含有ty-5基因：1.供試材料父本(P1)：抗番茄黃化曲葉病材料AVTO1227(王銀磊，楊瑪麗，趙麗萍，etal.含Ty-5基因番茄材料的引進、評價及利用.西南農業學報，2014，(05)：2090-2094)；母本(P2)：感番茄黃化曲葉病材料moneymaker；群體：moneymaker×AVTO1227雜交制備F1，F1單株自交獲得F1代分離群體；具體的材料及品種組合見詳見表1。2.鑒定步驟如下：1)抗病性鑒定：對4葉1心的幼苗進行攜帶TYLCVD煙粉虱的人工接種，接種一周后噴施殺蟲劑，之后將接種后的番茄幼苗定植于大棚；定植4周后調查植株發病情況，按照發病嚴重程度分為0-4級：0級，無任何感病癥狀；1級，頂端葉邊緣微微變黃化；2級，頂端小葉稍微變黃并發生很小的卷曲；3級，大范圍的葉片變黃，卷曲嚴重，植株生長量小；4級，癥狀非常嚴重，植株矮化，基本停止生長；2)基因組DNA的提取：番茄葉片研磨后立即加入271μL的DNA提取混合液，271μL核裂解液和108μL十二烷基肌氨酸鈉，混勻后置于65℃的培養箱45min；加入600μL的氯仿-異戊醇(24∶1)，輕輕翻轉，使兩者混合均勻，放入離心機中10000rpm離心6min；吸取上清夜，轉入新離心管，加入600μL預冷異丙醇，輕輕搖勻，12000rpm離心10min，棄上清液；加入200μL的70％乙醇，漂洗2次，將試管置于室溫下晾干；加入200μLT1/10E溶液，使DNA溶解，置于-20℃保存；3)InDel分子標記引物ty5-17的分析：A.極抗極感單株的選取通過對F2群體進行煙粉虱接種，鑒定單株對番茄黃化曲葉病的抗性，根據發病的嚴重程度進行分級；選取無發病癥狀，病級記錄為0的5個任意單株作為極抗病單株；選取植株矮化，生長受到嚴重抑制，葉片黃化卷曲嚴重，病級記錄為4的5個任意單株作為極感病單株；B.InDel連鎖標記的分析在番茄4號染色體SlNAC1附近選取新的InDEL位點進行分析，確定分子標記引物ty5-17與ty-5基因具有連鎖關系，利用ty5-17標記引物進行標記，標記方法中PCR反應體系為：模板DNA10ng/μL1μL；4pmmol/L子標記引物ty5-171.0μL；10×PCRBuffer1.0μL；25mmol/LMgCl21.0μL；10mmol/LdNTPs0.25μL；5U/μLrTaqDNAPolymerase0.1μL；ddH2O5.65μL；PCR反應擴增程序為：94℃預變性5min；每個循環94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，共38個循環，最后72℃延伸7min。PCR產物在6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行分離鑒定，銀染顯色，然后在可見投射儀上觀察、記錄實驗結果；3)鑒定結果通過對244株F2單株進行抗性鑒定，將病情≤2的記為抗病植株，病情≥3的記為感病植株，抗病植株共計59株，感病植株共計185株，符合3∶1的分離比例(χ2＝0.09)，ty-5為單隱性遺傳；分子標記引物ty5-17在抗病親本AVTO1227、感病親本moneymaker以及極抗和極感單株間進行擴增，AVTO1227和所有的極抗單株均只擴增出大小為172bp的條帶；moneymaker擴增出187bp的條帶；5個極感單株中4株擴增出大小為187bp的條帶，1株擴增出172和187大小的雜合帶型，結果參見圖1，其中M：100bpMarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；1-5：F2極抗病單株；6-10：F2極感病單株。對兩個親本擴增產物進行測序分析，證實15bp的核苷酸片段插入到moneymaker材料，導致多態性的產生，插入的15個堿基為5’-ATAAGTACGTATTGG-3’。InDel標記ty5-17在抗病親本AVTO1227、感病親本moneymaker以及任意37株F2單株間進行擴增，鑒定為抗病的單株均只擴增出大小為172bp的條帶；鑒定為感病的單株擴增出大小為172bp的條帶，或172和187大小的雜合帶型。表型和基因型完全吻合。結果參見圖2，其中M：100bpmarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；F2單株；由moneymaker×AVTO1227的F1自交獲得的任意37株F2單株。InDel分子標記引物ty5-17進一步應用于對番茄材料和品種組合的鑒定。從圖3可見，其中，M：100bpmarker；P1：抗病親本AVTO1227；P2：感病親本moneymaker；1∶1106-7-0；2∶9210；3∶9320；4：FJ-1；5：CLN2026D；6：CLN2777A；7：金陵美玉；8：金陵寶玉9：蘇粉11號；10：蘇粉14號；11：moneymaker×AVTO1227。所有不合有ty-5基因的番茄材料或品種，均只擴增到單一的187bp大小的條帶；AVTO1227與moneymaker的F1雜交種擴增出172和187大小的雜合帶型。由此說明，分子標記引物ty5-17可以應用于ty-5基因的分子標記輔助育種中。不同品種的番茄是否含有ty-5基因檢測結果見表1。表1：番茄材料及品種組合材料名稱抗病基因型AVTO1227ty-5/ty-5moneymaker無1106-7-0Ty-3/Ty-39210無9320無FJ-1無CLN2026Dty-2/ty-2CLN2777ATy-2/Ty-2金陵美玉無金陵寶玉無蘇粉11號Ty-3/ty-3蘇粉14號Ty-3/ty-3moneymaker×AVTO1227Ty-5/ty-5上述實施方式僅為本發明的優選實施方式，不能以此來限定本發明保護的范圍，本領域的技術人員在本發明的基礎上所做的任何非實質性的變化及替換均屬于本發明所要求保護的范圍。