用于治療CEA陽性表達腫瘤的雙特異納米抗體的制作方法

本發明涉及雙特異抗體藥物，特別涉及抗人腫瘤相關抗原CEA和抗人自然殺傷細胞的特異性抗原CD16的雙特異抗體藥物。
背景技術：
：腫瘤免疫治療中，雙特異抗體（bispecificantibody,bsAb）在其中起到了非常重要的作用。雙特異抗體是含有兩種特異性抗原結合位點的人工抗體，通過結合位點，可同時結合效應細胞與靶細胞表面的特異性抗原，激活靜止狀態的效應細胞并募集到靶細胞周圍，介導靶細胞的凋亡或裂解。已開發出多種靶向不同免疫效應細胞和腫瘤細胞的bsAb，其中在腫瘤免疫治療中的主要免疫效應細胞為T細胞、NK細胞和巨噬細胞等。NK細胞和T細胞是目前研究較多的效應細胞。在T細胞表面具有引發作用的分子，包括CD2、CD3、CD28等，因此在構建用于腫瘤治療的雙特異抗體時，通常都包括識別這些分子的特異性，其中基于CD3和CD28的雙特異抗體研究較多。BiTE（（bispecificTcellengager，雙特異T細胞募集者）是一種雙特異抗體的形式，能通過抗CD3的單鏈抗體片段最大程度的介導T細胞靠近腫瘤細胞，進而發揮裂解腫瘤的作用。當前，有幾種靶向BiTE正在研發之中，比如CD19（針對B細胞癌）、上皮細胞粘附分子（EpCAM，CD326），前列腺特異膜抗原（PSMA），以及CEA。自然殺傷細胞（naturalkillercell,NK）是體內免疫中的重要組成部分，在天然免疫中識別外界抗原，進而直接清除。其殺傷作用具有MHC非限制性，多種腫瘤細胞對NK細胞介導的殺傷作用敏感。其表面特異性分子CD16，是一種分布于NK細胞，中性粒細胞和單核細胞、巨噬細胞等表面的低親和力Fc受體。CD16通過結合IgG的Fc區域，可以激活NK細胞產生抗體依賴性的細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC）。bsAb分子上的抗CD16抗體結合位點，可以在兩個方面增加NK細胞基礎上的免疫治療作用，1.作為腫瘤部位的錨定分子，募集NK細胞，使得局部NK細胞數量增加，延長腫瘤細胞與NK的接觸時間，增強NK細胞的殺傷作用，2.在腫瘤部位激活NK細胞，進而殺傷腫瘤細胞。目前已有多種結合CD16與腫瘤相關抗原的雙特異抗體在研究之中，比如靶向Her2、CD33、CD20等。其中靶向CD30和CD16的雙特異抗體AFM13，用于治療頑固性和/或再發性霍奇金淋巴瘤已經進入臨床試驗（clinicaltrials.govidentifier:NCT01221571）。CEA是一種分子量約180-200kd的高度糖基化的癌胚蛋白，參與細胞粘附，在正常的胎兒胃腸組織表達。也存在于95%的結腸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤細胞表面。目前，常作為一種廣泛使用的腫瘤相關抗原，其血清CEA水平被用于疾病發生發展、監測和某些腫瘤的預后指標。同時，腫瘤CEA在免疫診斷和免疫治療上也是一種很有用的靶標。FDA已經同意了幾個放射標記的抗CEA抗體或抗體片段用于體內影像，比如由Immunomedics公司開發的99mTc標記的CEA抗體Artitumomab。MEDI-565，又名MT111或AMG211，是一種BiTE抗體，能介導T細胞殺傷表達CEA的腫瘤細胞，且與腫瘤細胞系的突變狀態無關。現在該藥物正處于臨床I期實驗（ClinicalTrails.gov,NCT02291614）中，用于治療晚期結腸腺癌。技術實現要素：本發明的一個目的在于提供一種抗CEA-CD16的雙特異抗體，其能夠特異性地與這兩者結合，引導NK細胞靠近CEA表達陽性細胞，進而通過ADCC效應，殺傷或抑制腫瘤的生長。為實現上述目的，本發明的一個方面提供一種雙特異納米抗體，其包含：（a）與人CEA特異性結合的第一結合結構域，所述第一結合結構域包含抗人CEAVHH，以及（b）與人CD16特異性結合的第二結合結構域，所述第二結合結構域包含抗人CD16VHH。在一個實施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的N末端。在另一個實施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的C末端。在一個實施方式中，所述抗人CEAVHH的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。在另一個實施方式中，所述抗人CD16VHH的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示在一個實施方式中，所述第一結合結構域通過連接肽與所述第二結合結構域連接。在優選的實施方式中，所述連接肽的氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。本發明的另一個方面提供一種治療患有CEA陽性表達腫瘤的患者的藥物組合物，所述藥物組合物包含所述雙特異納米抗體以及藥用輔料。在另一個實施方式中，所述藥物組合物包含所述雙特異納米抗體以及第二種抗癌劑。在一個實施方式中，所述CEA陽性表達腫瘤為結直腸癌、胰腺癌、食道癌、胃腺癌、乳腺癌或肺癌。在另一個實施方式中，所述腫瘤為進行性腫瘤、晚期腫瘤、或遷移腫瘤。在另一個實施方式中，所述患者具有超過100ng/ml的CEA血清濃度。本發明的另一個方面提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含核酸序列，所述核酸序列編碼本發明所述的雙特異納米抗體。本發明的另一個方面提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含載體，所述載體包含上述核酸序列。本發明的另一個方面提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含宿主，所述宿主使用上述核酸序列或載體轉化或轉染。本發明運用基因工程等技術手段，將識別CD16和識別CEA的納米抗體片段構建在同一抗體分子中，能夠特異性地與這兩者結合，引導NK細胞靠近CEA表達陽性細胞，進而通過ADCC效應，殺傷或抑制腫瘤的生長。該抗體分子能在原核表達系統中可溶性表達，有利于后續的分離純化，并且具有較好的熱穩定性和高度可溶性。此外，本發明使用的抗體片段為來自駱駝重鏈抗體的可變區序列，與抗原具有高結合親和性，同時與人免疫球蛋白的重鏈可變區序列具有較高的同源性，抗原性弱。附圖說明圖1示意性地顯示本發明雙特異抗體的一個實施方式的結構示意圖。（A）結構域示意圖；（B）模塊化示意圖。圖2顯示本發明的雙特異抗體的表達與純化過程中的電泳圖。（A）Ni-NTA純化過程分析電泳圖；（B）Q-sepharoseHP純化的SDS-PAGE電泳分析圖。圖3顯示流式細胞術分析雙特異抗體與CEA的結合。圖4顯示WesternBlot分析雙特異抗體對CEA的結合，其中Lane1：HT29，Lane2：LS174T，Lane3：SKOV3，Lane4：SKOV3/CEA。圖5顯示體外細胞毒性試驗的結果。圖6顯示體外EC50實驗的結果，其中HT29的EC50值為0.16nM，LS174T的EC50值為0.01nM。結果代表至少3次試驗的平均值。圖7為CEA表達陰性細胞系SKOV3的anti-CEAVHH（A）及anti-CD16VHH（B）對雙特異抗體介導的細胞毒性干擾試驗結果。圖8為CEA表達陽性細胞系LS174T的anti-CEAVHH（A）及anti-CD16VHH（B）對雙特異抗體介導的細胞毒性干擾試驗結果。圖9為可溶性CEA對雙特異抗體介導的細胞毒性干擾（LS174T）試驗結果。圖10顯示雙特異抗體對人結腸癌LS174NOD/SCID小鼠移植瘤生長的抑制作用。具體實施方式納米抗體Hamers等在1993年偶然發現駱駝體內存在天然缺失整個輕鏈和重鏈恒定區CH1的重鏈抗體（heavychainantibody,hcAb）。重鏈抗體的可變區（variabledomainsoftheHcAb,VHH）是迄今為止發現的具有抗原結合功能的最小分子量抗體片段，分子量為15kD，僅為常規抗體的1/10，其分子高度約4.8nm，直徑約2.2nm，故又被稱為納米抗體（nanobody）或單域抗體（singledomainantibody,sdAb）。納米抗體的抗原結合區僅由VHH的3個超變區（H1-H3）組成，在空間上形成了與常規抗體典型結構不同的抗原結合域。其中H3的平均長度比常規抗體長，在空間上可呈突出的指狀結構，因而可以結合一些常規抗體無法接近的抗原表位。雙特異納米抗體在本發明中，“雙特異納米抗體”、“抗CD16-CEA雙特異納米抗體”、“bsAb”或“雙特異抗體”是指包含兩個結合結構域的單個多肽鏈，其中每個“結合結構域”包含一個納米抗體VHH，其中第一結合結構域的VHH特異性地結合第一分子CEA，第二結合結構域的VHH特異性地結合第二分子CD16。兩個結合結構域任選地通過短的間隔多肽（連接肽）彼此連接。在一個實施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的N末端。在另一個實施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的C末端。在本發明中，“在N末端”或在“C末端”是相對而言的，并非雙特異抗體的絕對N末端或C末端。作為一個非限制性的例子，“位于第二結合結構域的N末端”的第一結合結構域僅表示第一結合結構域是位于雙特異抗體內第二結合結構域的氨基端，并且不排除額外序列（例如如上所述的標簽、或另一蛋白質或費蛋白質類的化合物，例如放射性同位素）位于雙特異抗體的最終N末端的可能。雙特異抗體的第一和/或第二結合結構域可以是非人源性的，例如可以衍生自鼠單克隆抗體。但是，當將其施用于人患者時，衍生自鼠抗體的雙特異性單鏈抗體可能被人體識別為異物。因此，優選地，雙特異性單鏈抗體的第一和/或第二結合結構域為人源性的，即衍生自人的序列。例如，可通過基于噬菌體展示的技術來鑒定特異性結合人CEA或人CD16的結合結構域。或者，其中一個結合結構域是人源性的，另一個是非人源性的，從而產生嵌合的雙特異納米抗體。在本發明的一個實施方式中，所述雙特異抗體通過人工合成方法得到核酸序列，通過原核細胞表達和純化而制得。可以預期到的是，本發明的雙特異抗體的結合結構域可帶有用于例如蛋白質表達、純化、檢測或富集的“標簽”，例如Flag-標簽、c-myc-標簽、GST-標簽或His-標簽。例如，對于Flag-標簽，目前應用最廣泛的是親水性八肽DYKDDDDK。這些標簽可以位于雙特異抗體的N末端或C末端。還可以預期到的是，本發明的雙特異抗體的結合結構域可帶有信號肽，其通常位于分泌蛋白的N端，一般由15～30個氨基酸組成。當信號肽序列合成后，被信號識別顆粒(SRP)所識別，蛋白質合成暫停或減緩，信號識別顆粒將核糖體攜帶至內質網上，蛋白質合成重新開始。在信號肽的引導下，新合成的蛋白質進入內質網腔，而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除。如終止轉運序列存在于新生肽鏈的C端，也可以不被信號肽酶切除，如卵清蛋白含有內部信號肽。它的前體與成熟形式都沒有被信號肽酶切除的過程。一個示例性的信號肽序列為MGKKIWLALAGLVLAFSASA。術語“特異性地結合”或“與…特異地結合”是指所述雙特異抗體的第一和/或第二結合結構域分辨各自第一和/或第二分子至某種程度的能力，從而在來自可能作為結合配體的多種不同分子的庫中，僅所述各自的第一和/或第二分子能夠被結合或被顯著的結合。可以在例如Biacore儀器上，通過ELISA、FACS分析等常規的方法來測定這種結合。具體而言，本發明的雙特異抗體的第一結合結構域結合于人CEA（癌胚抗原、癌胚抗原相關的細胞粘附分子5、CEACAM5、CD66e），而第二結合結構域結合于人CD16。“特異性結合”是指本發明的雙特異抗體能夠特異性地與各人靶標分子的至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多氨基酸相互作用。抗體的“特異性結合”主要由兩個參數來表征：定性參數（結合表位或抗體結合位置）和定量參數（結合親和力或結合強度）。抗體結合表位可通過FACS法、肽點表位作圖法、質譜法或肽ELISA法測定。Biacore法和/或ELISA法可測定抗體與特定表位的結合強度。通常將信噪比作結合特異性的代表性測定計算方法。在這樣的信噪比中，信號代表抗體結合至目標表位的強度，而噪聲代表抗體與其他非目標表位結合的強度。優選地，對于目標表位的信噪比為約50時可以認為所評估的抗體以特異性方式結合至目標表位，即“特異性結合”。CEA陽性表達腫瘤“CEA陽性表達腫瘤”或“CEA陽性腫瘤”是指在細胞表面表達CEA的腫瘤細胞。在本發明中，要治療的CEA陽性腫瘤可以為胃腸道腺癌、乳腺癌或肺癌。胃腸道腺癌可以選自結直腸癌、胰腺癌、食道癌或胃腺癌。如前所述，本發明的雙特異抗體尤其適合治療具有進行性腫瘤、轉移性腫瘤、復發性腫瘤、晚期上皮腫瘤、高上皮腫瘤負荷的患者，或具有CEA血清濃度高于100ng/mL（例如通過ELISA測定）的患者。在某些這些腫瘤患者中，血漿中具有高水平的可溶性CEA抗原。或者，這些腫瘤細胞的周圍存在高水平的可溶性CEA。應當意識到的是，在許多基于抗體的治療方法中，血清CEA抑制抗體與腫瘤細胞膜上的CEA的結合，并且阻斷抗體的活性，從而阻礙抗腫瘤治療的成功。然而，得益于本發明雙特異抗體的特殊結構，本發明的雙特異抗體不再受限于此。藥物組合物“藥物組合物”是指用于人的藥物制劑。該藥物組合物包含本發明的雙特異抗體以及載體、穩定劑和/或賦形劑的合適制劑。所述藥物組合物可通過適當的方式施用給患者，包括但不限于，灌注、注射、經皮、經鼻、腸胃外、動脈內、靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內、局部施用。本發明的藥物組合物還可包含藥學上可接受的載體。合適的載體是本領域眾所周知的，包括例如磷酸鹽緩沖液、水或脂質體等。可以通過本領域的常規方法配制包含這類載體的組合物。本發明的藥物組合物可與其他蛋白質或非蛋白質類抗癌藥聯合使用，例如本發明的藥物組合物包含所述其他蛋白質或非蛋白質類抗癌藥。在另外的實施方式中，所述其他抗癌藥可與本發明的雙特異抗體同時施用，或單獨地在所述雙特異性抗體的施用之前或之后以確定的時間間隔和劑量施用。臨床醫務人員可根據具體情況確定合理的給藥方案。臨床的劑量依賴于多種因素，包括患者的體重、年齡、性別、給藥途徑、總體健康狀況等。例如，所述抗癌藥為5-氟尿嘧啶、卡培他濱、奧沙利鉑、伊立替康、吉西他濱、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、順鉑、卡鉑、紫衫烷類（如多西他賽、紫杉醇）。此外，本發明的組合物可以包括蛋白質載體，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，優選是人源性的。還可以預期到，所述藥物組合物還可以包含更多的生物活性物質，例如抑制免疫反應的藥物（如皮質類固醇）、調節炎性反應的藥物、細胞生長抑制劑、防止高尿酸血癥的藥物等。作為優選的方案，所述雙特異抗體是以緩沖液、穩定劑和表面活性劑配制。該緩沖液可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或醋酸鹽緩沖液。穩定劑可以是氨基酸和/或糖。表面活性劑可以是增溶劑、PEG等。接頭序列或連接肽本發明的雙特異抗體還包括位于第一結合結構域和第二結合結構域之間的接頭序列，通常為4-20個氨基酸構成的短肽。這些接頭序列使得各組分之間被合理地定位而實現各組分的功能活性。優選地，接頭序列包括2至20個氨基酸序列，更優選為5至20個氨基酸。接頭序列優選為柔性接頭序列，因而其不會限制效應分子或多肽在單個不期望的構象中。接頭序列優選主要由具有小側鏈的氨基酸構成，例如甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸，從而提供所述柔性。優選地，接頭序列的約80%以上或更多比例的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸殘基，特別是甘氨酸和絲氨酸殘基。合適的接頭序列的例子有GGGGS（G4S），即GlyGlyGlyGlySer；或G4SG4SG4S，例如用于連接本發明中的抗人CEAVHH和抗人CD16VHH。也可以使用其他不同的接頭序列，包括已被成功地用于連接不同抗體可變區的多種柔性接頭設計。接頭序列的大小和序列組成可通過常規的電腦建模及技術來確定。在本發明中，“多肽”是指基本上由20種天然氨基酸中的任何幾個所組成的任何長度的聚合物。雖然“蛋白質”或“蛋白”通常是指氨基酸長度較大的聚合物，而“肽”通常是指氨基酸長度較小的聚合物，但是這兩個術語之間通常沒有明顯的界限，而且經常范圍上有重疊。在本發明中，“載體”為能夠在宿主細胞中自主復制且可接受外源DNA的核酸分子。載體帶有其自身的復制起始位點，可用于插入外源DNA的限制性內切酶識別位點，以及通常的選擇性標記（如編碼抗生素抗性的基因），常常還包括用于表達插入的DNA的識別序列（如啟動子和增強子）。常見的載體包括質粒載體和噬菌體載體。抗CD16-CEA雙特異納米抗體核苷酸序列的設計和合成1.結構設計根據該雙特異抗體的序列和連接形式，重新設計和優化核苷酸序列，并在該序列的5’端加入NcoI酶切位點，在其3’端加入HindIII酶切位點。直接合成DsbA-anti-CEAVHH-(GGGGS)3-anti-CD16VHH-6His，并通過雙酶切連接到載體pETDuet中，形成pETDuet-bsAb表達質粒。雙特異納米抗體的結構示意圖見圖1，其中DsbA代表二硫鍵形成蛋白A（DisulfidebondformationproteinA），是存在于大腸桿菌周質胞腔內的一種參與新生蛋白質折疊過程中催化二硫鍵形成的折疊酶。2.載體轉化BL21（DE3）將該質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞株，選取陽性克隆，在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基（3mL）中37℃過夜培養，菌液5000rpm常溫離心棄上清，所得的大腸桿菌用Qiagen公司的質粒提取試劑盒裂解并提取質粒，獲得表達載體。3.抗CEA-抗CD16的表達與純化純化后的pETDuet-bsAb表達載體，轉化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，選取陽性克隆，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養基（3mL）中37℃過夜培養，轉移到含有100μg/mL氨芐青霉素的300mLLB中，37℃培養至OD600在0.6-0.8，加入終濃度為0.05mM的IPTG，16℃誘導16小時。4000rpm，離心棄上清，沉淀按照1:4的重量體積比加入20mMTris-HCl,pH8.0,25%蔗糖，1mMEDTA溶液，重懸后冰浴30min，8500g，4℃離心20分鐘，保留上清。沉淀按照1：5的重量體積比加入5mMMgCl2，1mg/mL的溶菌酶溶液重懸，冰浴20min，8500g，4℃離心20分鐘，取上清。結合：合并兩次上清，過2mLNi-NTA（Qiagen公司）重力沉降柱。除雜：依次以20mL20mMTris-HClpH8.0，15mM咪唑，1MNaCl和20mL20mMTris-HClpH8.0，25mM咪唑，1MNaCl進行除雜。洗脫：依次以10mL20mMTris-HClpH8.0，50mM咪唑，0.15MNaCl、10mL20mMTris-HClpH8.0，100mM咪唑，0.15MNaCl、10mL20mMTris-HClpH8.0，200mM咪唑，0.15MNaCl、10mL20mMTris-HClpH8.0，500mM咪唑，0.15MNaCl進行洗脫。合并50mM咪唑、100mM咪唑以及200mM咪唑洗脫組分，以20mMPB，pH7.6，10%甘油4℃透析過夜。1mLQ-HP純化：透析過夜后含目標組分溶液，20000g，4℃離心20min后上樣，上樣流速1mL/min，收集流穿組分進行超濾濃縮。實驗結果見圖2。雙特異抗體體外結合CEA測試1.流式細胞術檢測雙特異抗體對CEA的結合體外培養LS174T和SKOV3細胞；0.25%胰蛋白酶消化成單細胞，1000rpm離心10min后，收集細胞沉淀，以冰冷PBS+0.2%BSA重懸。離心，4℃，1000rpm，5分鐘，棄上清。以冰冷PBS+0.2%BSA重懸，配置成濃度為2*106/mL的細胞懸液。按下表1分別加入一抗：mouseanti-CEA/CD66emAb（1:200）；bsAb（10ug/mL）后4℃孵育1小時。加入5mL冰冷PBS+0.2%BSA。1000rpm，離心5分鐘，4℃；細胞沉淀以冰冷1mLPBS+0.2%BSA重懸；1000rpm，離心5分鐘，4℃；細胞沉淀以0.5mL冰冷PBS+0.2%BSA重懸；依表1，對應加入二抗，4℃孵育1小時；1000rpm，離心5分鐘，4℃；細胞沉淀以冰冷1mLPBS+0.2%BSA重懸；1000rpm，離心5分鐘，4℃；細胞沉淀以1mL冰冷PBS+0.2%BSA重懸；1000rpm，離心5分鐘，4℃；細胞沉淀以1mL冰冷PBS+0.2%BSA重懸，上機測試。實驗結果見圖3，顯示bsAb可結合腫瘤細胞表面的CEA。表1各管一抗和二抗組分管號一抗二抗A無Goat-Anti-mouseIgG-FITC（1:500）BAnti-CEA（1:200）Goat-Anti-mouseIgG-FITC（1:500）C無Anti-His-FITC（1:500）DbsAb（10ug/mL）Anti-His-FITC（1:500）2.Westernblot檢測雙特異抗體對CEA的結合體外培養LS174T，HT29以及SKOV3和SKOV3-CEA細胞，RIPA裂解后用BCA法測定蛋白質含量。SDS-PAGE電泳：分離膠濃度8%。每種細胞系裂解物上樣量為30μg，120V，恒壓45分鐘后轉膜。轉膜：取SDS-PAGE電泳后的分離膠，放在負極，PVDF膜放在正極，進行濕轉，100V，90分鐘。封閉：取轉膜后的PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉TBST中，封閉1小時；一抗孵育：雙特異抗體（1mg/mL）以1:1000比例稀釋于含5%脫脂奶粉TBST中，室溫孵育1小時；陽性對照用商品化抗CEA兔單克隆抗體（Abcam公司，貨號：），稀釋比例1:1000，孵育1小時。內參用兔抗GAPDH單克隆抗體（Abcam公司，貨號：）洗膜：TBST洗滌三次，每次10分鐘；二抗孵育：抗HisIgG-HRP以1：3000比例稀釋于TBST中，室溫孵育1小時；陽性對照二抗用抗兔IgGHRP，稀釋比例為1:5000，孵育1小時。洗膜：TBST洗滌三次，每次10分鐘；顯色：將膜置于伯樂的化學發光成像系統中，均勻滴加millipore顯色劑，避光進行顯影拍照。結果見圖4，顯示雙特異抗體可特異結合LS174T、HT29以及SKOV3-CEA等細胞表達的CEA，而與SKOV3中總蛋白無結合；陽性對照具有相同的實驗結果。說明雙特異抗體與抗原的結合能力與商品化抗CEA抗體均可結合CEA。體外細胞毒性實驗1.體外細胞毒性試驗將SKOV3、HT29以及LS174T腫瘤細胞，加0.25%胰蛋白酶消化成單個細胞后，鋪96孔板，每孔5000個細胞。37℃，5%二氧化碳培養6個小時。每孔加入5*104個NK細胞，分別加入0，0.28μg/mL，2.8μg/mL的bsAb。37℃，5%二氧化碳培養48個小時。吸取培養基，以PBS輕輕清洗兩次。加入CCK8試劑，孵育2小時。用酶標儀以620nm為參比，測定OD450的讀數。裂解率用如下公式進行計算：裂解率=1-（As-Ab）/（A0-Ab），其中Ab為空白對照吸收值，As為實驗組吸收值，A0為未加藥孔吸收值。實驗結果見圖5。2.EC50測試將HT29以及LS174T腫瘤細胞，加0.25%胰蛋白酶消化成單個細胞后，鋪96孔板，每孔5000個細胞。37℃，5%二氧化碳培養6個小時。每孔加入5*104個NK細胞，分別加入0，0.28μg/mL，2.8μg/mL的bsAb。37℃，5%二氧化碳培養48個小時。吸取培養基，以PBS輕輕清洗兩次。加入CCK8試劑，孵育2小時。用酶標儀以620nm為參比，測定OD450的讀數。裂解率用如下公式進行計算：裂解率=1-（As-Ab）/（A0-Ab），其中Ab為空白對照吸收值，As為實驗組吸收值，A0為未加藥孔吸收值。實驗結果見圖6。Anti-CD16VHH以及anti-CEAVHH體外干擾試驗將SKOV3以及LS174T腫瘤細胞，加0.25%胰蛋白酶消化成單個細胞后，鋪96孔板，每孔5000個細胞。37℃，5%二氧化碳培養6個小時。每孔加入5*104個PBMC，分別加入0.1nMbsAb和0、0.5nM、5nM的anti-CD16VHH或者anti-CEAVHH，置于37℃，5%二氧化碳培養48個小時。吸取培養基，以PBS輕輕清洗兩次。按每孔90μL培養基和10μLCCK8，加入CCK8試劑，孵育2小時。用酶標儀以620nm為參比，測定OD450的讀數。裂解率用如下公式進行計算：裂解率=1-（As-Ab）/（A0-Ab），其中Ab為空白對照吸收值，As為實驗組吸收值，A0為未加藥孔吸收值。實驗結果見圖7、8，其中CEA表達陰性SKOV3細胞系中，bsAb介導的NK細胞對其不產生殺傷效應，且anti-CEAVHH以及anti-CD16VHH也無干擾效應。在CEA陽性細胞系LS174T中，0.1nM的bsAb可明顯介導NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。且對bsAb介導的殺傷作用無干擾。可溶性CEA干擾試驗將SKOV3以及LS174T腫瘤細胞，加0.25%胰蛋白酶消化成單個細胞后，鋪96孔板，每孔5000個細胞。37℃，5%二氧化碳培養6個小時。每孔加入5*104個PBMC，分別加入0.1nMbsAb和0、0.028nM、0.28nM的anti-CD16VHH或者anti-CEAVHH，置于37℃，5%二氧化碳培養48個小時。吸取培養基，以PBS輕輕清洗兩次。按每孔90μL培養基和10μLCCK8，加入CCK8試劑，孵育2小時。用酶標儀以620nm為參比，測定OD450的讀數。裂解率用如下公式進行計算：裂解率=1-（As-Ab）/（A0-Ab），其中Ab為空白對照吸收值，As為實驗組吸收值，A0為未加藥孔吸收值。實驗結果見圖9：可溶性CEA對bsAb介導的NK細胞殺傷作用，無干擾作用。體內抗腫瘤活性實驗培養LS174T細胞至對數生長期LS174T，加0.25%胰蛋白酶消化成單細胞，200g離心5分鐘，收集細胞沉淀，以PBS重懸后計數，配置成107個/mL的細胞懸液。背部皮下注射NOD/SCID小鼠0.1mL。收集健康志愿者全血，采用Ficoll法分離PBMC，以PBS重懸計數，配置成106個/mL的細胞懸液。于種植腫瘤細胞24小時后，每只小鼠腹腔注射0.1mL。對照組給予PBS單獨注射，實驗組為20ug/kg劑量的bsAb。小鼠腫瘤用游標卡尺測量直徑。使用測量瘤徑的方法，動態觀察被試動物抗腫瘤的效應。腫瘤直徑的測量次數為2-3天1次，每次測量同時還需稱重體重。實驗組采用腹腔注射0.1mL抗CEA-抗CD16雙特異抗體，每天1次，連續7天，陰性組同時給予等量生理鹽水。腫瘤體積計算公式：V=長*寬2/2。實驗結果見圖10。陰性對照組與模型組的試驗末期，腫瘤體積相差不大。而給藥組體積與對照組與模型組相比，僅為其腫瘤體積的10%。此外，在觀察期內，小鼠體重持續增長，說明藥物毒性較小，副作用低。本領域技術人員會容易意識到，本發明可容易改造而獲得本文所述的那些目的和優點以及隱含在本文中的那些目的和優點。在本文中以當前優選實施方式的代表的形式描述的方法、變體和組合物是示例性的，并不意在限制本發明的范圍。對于本領域技術人員來說，可對它們做出改變或將其用于其他用途，但這都包括在如所附權利要求定義的本發明的范圍內。雖然本發明已通過優選實施方式和任選的特征具體公開，但本領域技術人員可對本文公開的想法做出修改和變化，而這些修改和變化仍屬于所附權利要求定義出的本發明的范圍之內。<110>中山大學<120>用于治療CEA陽性表達腫瘤的雙特異納米抗體<130>14196CN<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>121<212>PRT<213>人工序列<400>1LeuGluGluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnPro151015GlyGluSerLeuThrLeuSerCysValValAlaGlySerIlePheSer202530PheAlaMetSerTrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluLeu354045ValAlaArgIleGlySerAspAspArgValThrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnIleLysArgThrAlaGly65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AsnAlaGlnThrAspLeuArgAspTrpThrValArgGluTyrTrpGly100105110GlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120<210>2<211>120<212>PRT<213>人工序列<400>2GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyPheValGlnAlaGlyGlu151015SerLeuThrLeuSerCysThrSerSerThrLeuThrPheThrProTyr202530ArgMetAlaTrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGlnArgAspLeuVal354045AlaAspIleSerSerGlyAspGlyArgThrThrAsnTyrAlaAspPhe505560AlaLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnIleLysAsnThrVal65707580PheLeuArgMetThrAsnLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyr859095CysAsnThrPheValSerPheValGlyIleAlaArgSerTrpGlyGln100105110GlyThrGlnValThrValSerSer115120<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>3GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer151015<210>4<211>20<212>PRT<213>人工序列<400>4MetGlyLysLysIleTrpLeuAlaLeuAlaGlyLeuValLeuAlaPhe151015SerAlaSerAla20當前第1頁1 2 3