融合蛋白IFN-ELP及其應用的制作方法

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及融合蛋白IFN-ELP及其應用。
背景技術：
：干擾素-α2(IFN-α2)具有抗病毒復制、抗腫瘤增殖和免疫調節作用，已被成功用于治療病毒性疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎、尖銳濕疣等)和相關癌癥(如白血病、腎癌、惡性黑色素瘤、多發性硬化癥等)。但是，IFN經系統注射給藥后容易被體內蛋白酶降解和腎排出，循環半衰期非常短，需要頻繁給藥以維持較高的血藥濃度，從而導致嚴重毒副作用，同時給患者帶來沉重的經濟負擔。用聚乙二醇(PEG)修飾IFN-α2，能有效改善其藥代動力學，改善藥物分布，提高其療效。然而，目前的PEG化干擾素存在如反應產率低、結合位點和偶聯化學計量難以控制、生物活性嚴重降低等弊端。現有技術中通過融合人血清白蛋白能夠有效延長干擾素循環半衰期并有效控制修飾位點，但活性保持僅有1％，且臨床試驗效果并不明顯。因此，研發反應條件溫和、步驟簡單、快速、高效的位點特異性修飾方法對干擾素及其他藥用蛋白質尤為重要。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何使蛋白質藥物在生物體內的半衰期延長和/或活性保持率增加。為解決上述問題，本發明首先提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白是如下b1)或b2)的蛋白質：b1)含有功能蛋白和彈性蛋白樣多肽的融合蛋白；所述彈性蛋白樣多肽，可為如下a1)—a8)中的任一種：a1)具有一個以上單拷貝乙的多肽，每個單拷貝乙中具有一個以上單拷貝甲；所述單拷貝甲的氨基酸序列為XGVPG，X代表一個脯氨酸殘基以外的任意氨基酸殘基；a2)所述a1)中，每個單拷貝乙中具有10個所述單拷貝甲；a3)所述a2)中，所述單拷貝乙如序列表序列2的第202位至第251位所示；a4)所述a1)中，所述彈性蛋白樣多肽具有9個所述單拷貝乙；a5)所述a4)中，每個單拷貝乙中具有10個所述單拷貝甲；a6)所述a5)中，所述單拷貝乙如序列表序列2的第202位至第251位所示；a7)所述a6)中，所述彈性蛋白樣多肽如序列表序列2的第202位至第651位所示；a8)所述a6)中，所述彈性蛋白樣多肽如序列表序列2的第202位至第653位所示；b2)將b1)的N端或C端連接標簽得到的帶標簽蛋白質。上述任一所述功能蛋白可為如下c1)-c20)中的任一種：c1)干擾素-α2；c2)序列表的序列2第1位至第166位所示的干擾素-α2；c3)干擾素-α；c4)干擾素；c5)胰高血糖素樣肽-1及其衍生物；c6)水蛭素；c7)胰島素；c8)單克隆抗體；c9)血液因子；c10)生長激素；c11)白介素；c12)生長因子；c13)治療性疫苗；c14)降鈣素；c15)腫瘤壞死因子；c16)酶；c17)選自醫藥、農業、科研以及其它工業領域相關的蛋白、小肽或抗體；c18)集落刺激因子；c19)瘦素；c20)c1)-c19)任一所述功能蛋白經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的功能蛋白。上述任一所述融合蛋白中，所述彈性蛋白樣多肽和所述功能蛋白的位置關系可為如下d1)、d2)或d3)：d1)所述彈性蛋白樣多肽位于所述功能蛋白的上游或下游；d2)所述彈性蛋白樣多肽融合于所述功能蛋白的C末端或N末端；d3)所述彈性蛋白樣多肽插入所述功能蛋白中；所述彈性蛋白樣多肽的插入位點可為遠離所述功能蛋白的活性位點的位置或不干擾所述功能蛋白的活性位點的位置。上述任一所述融合蛋白中，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第651位或序列表序列2的第1位至第653位所示。上述任一所述融合蛋白在制備產品中的應用也屬于本發明的保護范圍；所述產品的功能為抑制腫瘤細胞增殖和/或治療腫瘤。所述抑制腫瘤細胞增殖具體可為抑制人Burkitt’sB淋巴瘤細胞和/或人卵巢癌細胞(OVCAR-3)增殖。所述治療腫瘤可為治療由人Burkitt’sB淋巴瘤細胞和/或人卵巢癌細胞(OVCAR-3)引起的腫瘤。本發明還提供了一種產品，所述產品的活性成分為上述任一所述融合蛋白。編碼上述任一所述融合蛋白的核酸分子也屬于本發明的保護范圍。所述產品可為藥物。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述核酸分子中，編碼所述干擾素-α2的核苷酸序列可如序列表序列1的第5209位至第5706位所示；編碼所述彈性蛋白樣多肽的核苷酸序列可如序列表序列1的第5812位至第7161位或序列表序列1的第5812位至第7167位或序列表序列1的第5812位至第5961位所示。上述核酸分子中，所述核酸分子可為如下e1)-e10)任一所示的DNA分子：e1)核苷酸序列含有序列表的序列1第5812位至第7161位所示的DNA分子；e2)核苷酸序列含有序列表的序列1第5812位至第7167位所示的DNA分子；e3)核苷酸序列含有序列表的序列1第5812位至第5961位所示的DNA分子；e4)核苷酸序列含有序列表的序列1第5209位至第5706位和序列表序列1的第5812位至第7161位所示的DNA分子；e5)核苷酸序列含有序列表的序列1第5209位至第5706位和序列表序列1的第5812位至第7167位所示的DNA分子；e6)核苷酸序列含有序列表的序列1第5209位至第5706位和序列表序列1的第5812位至第5961位所示的DNA分子；e7)核苷酸序列可如序列表的序列1第5209位至第7161位所示的DNA分子；e8)核苷酸序列可如序列表的序列1第5209位至第7167位所示的DNA分子；e9)與e1)-e8)中任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述融合蛋白的DNA分子；e10)在嚴格條件下與e1)-e8)中任一限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述融合蛋白的DNA分子。含有上述任一所述核酸分子的表達盒、表達載體、重組微生物或轉基因細胞系也屬于本 發明的保護范圍。本發明還提供了一種制備半衰期延長和/或生物活性保持率增加的蛋白質藥物的方法。本發明所提供的制備半衰期延長和/或生物活性保持率增加的蛋白質藥物的方法，包括如下步驟：在功能蛋白中引入彈性蛋白樣多肽，得到半衰期延長和/或生物活性保持率增加的蛋白質藥物；所述彈性蛋白樣多肽可融合于所述功能蛋白的C末端或N末端，或所述彈性蛋白樣多肽位于所述功能蛋白的上游或下游，或所述彈性蛋白樣多肽插入所述功能蛋白中；所述彈性蛋白樣多肽的插入位點可為遠離所述功能蛋白的活性位點的位置或不干擾所述功能蛋白的活性位點的位置；上述方法中，所述彈性蛋白樣多肽，是如下a1)—a8)中的任一種：a1)具有一個以上單拷貝乙的多肽，每個單拷貝乙中具有一個以上單拷貝甲；所述單拷貝甲的氨基酸序列為XGVPG，X代表一個脯氨酸以外的任意氨基酸殘基；a2)所述a1)中，每個單拷貝乙中具有10個所述單拷貝甲；a3)所述a2)中，所述單拷貝乙如序列表序列2的第202位至第251位所示；a4)所述a1)中，所述彈性蛋白樣多肽具有9個所述單拷貝乙；a5)所述a4)中，每個單拷貝乙中具有10個所述單拷貝甲；a6)所述a5)中，所述單拷貝乙如序列表序列2的第202位至第251位所示；a7)所述a6)中，所述彈性蛋白樣多肽如序列表序列2的第1位至第651位所示；a8)所述a6)中，所述彈性蛋白樣多肽如序列表序列2的第1位至第653位所示。上述方法中，所述功能蛋白是如下c1)-c20)中的任一種：c1)干擾素-α2；c2)序列表序列2的第1位至第166位所示的干擾素-α2；c3)干擾素-α；c4)干擾素；c5)胰高血糖素樣肽-1及其衍生物；c6)水蛭素；c7)胰島素；c8)單克隆抗體；c9)血液因子；c10)生長激素；c11)白介素；c12)生長因子；c13)治療性疫苗；c14)降鈣素；c15)腫瘤壞死因子；c16)酶；c17)選自醫藥、農業、科研以及其它工業領域相關的蛋白、小肽或抗體；c18)集落刺激因子；c19)瘦素；c20)c1)-c19)任一所述功能蛋白經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的功能蛋白。上述任一所述干擾素可為干擾素α、干擾素β、干擾素γ或干擾素λ。實驗證明，以本發明所提供的融合蛋白IFN-ELP作為蛋白質藥物，可使生物活性保持率增加、體內半衰期延長、體內平均存留時間延長，并有效抑制腫瘤。同時，本發明所提供的一種制備半衰期延長和/或生物活性保持率增加的蛋白質藥物的方法為修飾蛋白藥物以提高藥物穩定性、改善藥物代謝動力學和增強治療功效的新方法。附圖說明圖1為反相轉變循環技術(Inversetransitioncycling，ITC)純化原理。圖2顯示了通過ITC純化獲得IFN-ELP。圖3為ELP合成及純化過程。圖4為IFN合成及純化過程。圖5為MALDI-TOF分析IFN-ELP和IFN的分子量。圖6為DLS分析IFN-ELP和IFN的水合半徑。圖7為酶標儀分析IFN-ELP和ELP的相轉變溫度測定。圖8為CD分析IFN-ELP和IFN的二級結構。圖9為MTT法測定IFN-ELP和IFN的體外生物活性。圖10為利用DAS軟件中房室消除模型分析IFN-ELP和IFN的藥物代謝動力學參數。圖11為IFN-ELP和IFN在組織中的分布情況。圖12為IFN-ELP、ELP和IFN抑制腫瘤生長情況。圖13為裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理鹽水后的生存曲線。圖14為裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理鹽水后的腫瘤生長實物圖。圖15為裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理鹽水后的體重變化情況。圖16為裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理鹽水后乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐和尿素氮等生理指標變化情況。圖17為裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理鹽水后紅細胞、白細胞、血紅蛋白和血小板等生理指標變化情況。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的質粒pET-25b(+)為生工生物工程(上海)股份有限公司產品。下述實施例中的TB培養基按照如下方法配置：向900mL水中加入蛋白胨12g、酵母提取物24g和甘油4mL，充分溶解后121℃高壓滅菌15min，滅菌后的混合液冷卻至60℃，然后加入100mL滅菌的含170mmol/LKH2PO4和0.72mol/LK2HPO4的水溶液。下述實施例中的人Burkitt’sB淋巴瘤細胞和人卵巢癌細胞(OVCAR-3)均購自中國科學院腫瘤細胞庫。下述實施例中的RMPI-1640培養基為Gibco公司產品。下述實施例中的雄性SD大鼠為北京維通利華實驗動物技術有限公司產品。雄性SD大鼠在下文中簡稱大鼠。下述實施例中的雌性無胸腺(Nude)裸鼠為北京維通利華實驗動物技術有限公司產品。雌性無胸腺(Nude)裸鼠在下文中簡稱裸鼠。下述實施例中，通過反相轉變循環技術(Inversetransitioncycling,ITC)提純獲得純化的IFN-ELP。利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)、酶標儀、動態光散射(DLS)、圓二色譜(CD)等分析手段表征IFN-ELP和IFN的分子量、相變溫度、水合半徑和二級結構等物理化學性能。選用人Burkitt’sB淋巴瘤細胞，測試IFN-ELP和IFN的體外生物活性，即其體外抗腫瘤細胞增殖的能力；使用大鼠模型，測試IFN-ELP和IFN在體內的藥物代謝動力學，利用DAS3.0藥物代謝動力學分析軟件計算出藥物代謝動力學參數；建立裸鼠腫瘤模型，測試IFN-ELP和IFN的抗腫瘤效果和藥物分布。下述實施例中的定量實驗，如無特殊說明均設置三次重復，結果取平均值。實施例1、IFN-ELP和轉肽酶Sortase的原核表達和純化一、重組質粒pET-25b-IFN-ELP的制備人工合成重組質粒pET-25b-IFN-ELP(雙鏈環形質粒)。重組質粒pET-25b-IFN-ELP的核苷酸序列如序列表序列1所示。重組質粒pET-25b-IFN-ELP中具有一個表達盒A。表達盒A的核苷酸序列如序列表序列1的自5’末端第5121至7314位所示，其中自5’末端第5121至5140位為T7啟動子，第5209至5706位為干擾素-α2的編碼基因，第5728 至5745位為轉肽酶A的識別區域，第5812至7161位為彈性蛋白樣多肽的編碼基因，第7265至7314位為T7終止子。干擾素-α2在下文中簡稱IFN。彈性蛋白樣多肽在下文中簡稱ELP。表達盒A表達的蛋白為IFN-ELP，在下文中簡稱IFN-ELP。IFN的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第166位所示。ELP的氨基酸序列如序列表序列2的第202位至第651位所示。IFN-ELP的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第651位所示。二、重組質粒pET-25b-Sortase的制備人工合成序列表序列3所示的DNA分子，編碼序列表序列4所示的轉肽酶Sortase。將pET-25b(+)的NdeI識別序列和EcoRI識別序列間的DNA替換為序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子，保持pET-25b(+)的其它序列不變，得到重組質粒pET-25b-Sortase。重組質粒pET-25b-Sortase表達序列表序列4所示的轉肽酶Sortase。轉肽酶Sortase在下文中簡稱為SrtA。三、蛋白的表達和純化1、ELP-ELP的表達和純化將重組質粒pET-25b-IFN-ELP導入大腸桿菌感受態Rosetta-gami(DE3)pLysS(Novagen公司產品)，得到含有pET-25b-IFN-ELP的重組大腸桿菌，將該重組大腸桿菌命名為Rosetta/pET-25b-IFN-ELP。按照下述步驟進行ELP-ELP的表達和純化：(1)將Rosetta/pET-25b-IFN-ELP單克隆接種于50mL含100μg/mL氨芐青霉素的TB培養基，37℃、250rpm振蕩培養8小時得到培養菌液1；將培養菌液1以1：20(體積比)接種到1L含100μg/mL氨芐青霉素的TB培養基中，200rpm振蕩培養5h，得到培養菌液2；向培養菌液2中加入IPTG，使IPTG在體系中的濃度為0.4mmol/L，18℃、200rpm振蕩培養16h，得到培養菌液3。(2)將上述步驟(1)得到的培養菌液3收集于離心瓶，以3000g離心力離心5min，收集菌體得到菌體1。(3)用冰冷pH7.4、10mMPBS緩沖液重懸步驟(2)得到的菌體1，4℃超聲破碎(超聲功率50W，超聲時間30min，5S破碎10S間隙)，得到菌體破碎液。(4)將步驟(3)得到的菌體破碎液4℃、14000g離心15分鐘，得到上清液1。(5)向步驟(4)得到的上清液1加入2mL10％(體積百分含量)聚乙烯亞胺水溶液，離心15分鐘，得到上清液2。(6)反相轉變循環技術(Inversetransitioncycling，ITC)第一次純化：向步驟(5)得到的上清液2中加入NaCl，使NaCl在體系中的濃度為3mol/L，37℃充分溶解后，14000g離心15分鐘，去上清A，得到沉淀1；用預冷的pH7.4、10mMPBS緩沖液溶解沉淀1，離心，得到上清液3。(7)反相轉變循環技術(Inversetransitioncycling，ITC)第二次純化：向步驟(6)得到的上清液3中加入NaCl，使NaCl在體系中的濃度為3mol/L，37℃充分溶解后，14000g離心15分鐘，去上清B，得到沉淀2；用預冷的pH7.4、50mMTris·HCl緩沖液溶解沉淀2，離心，得到上清液4。上清液4中含有IFN-ELP，因此命名為IFN-ELP溶液。將上清液4進行SDS-PAGE，測定IFN-ELP的純度。用NanoDrop2000分光光度計測定上清液4中IFN-ELP的濃度。反相轉變循環技術(Inversetransitioncycling，ITC)純化原理見圖1。IFN-ELP的表達與純化見圖2(圖2中，1為步驟(3)的菌體破碎液，2為步驟(6)的上清A，3為步驟(6)的沉淀1，4為步驟(7)的上清B，5為步驟(7)的沉淀2，6為蛋白標準品。結果表明，通過ITC純化后，上清液4中目的蛋白IFN-ELP的純度＞95％，IFN-ELP的產率達到250mg/L培養菌液3。2、SrtA的表達和純化(1)將上述步驟1中的重組質粒pET-25b-IFN-ELP替換為重組質粒pET-25b-Sortase，其它同步驟1的(1)，得到培養菌液4。(2)同步驟1的(2)。(3)同步驟1的(3)。(4)同步驟1的(4)，得到上清液,6。(5)向步驟(4)得到的上清液6加入2mL10％(體積百分含量)聚乙烯亞胺水溶液，離心15分鐘，得到上清液7。(6)將10mL上清液7經0.45μm濾膜過濾后上樣至鎳親和層析柱(HisTrapHP5mL，GE公司)，先用40mL平衡緩沖液(pH7.4、10mMPBS，500mMNaCl，5％甘油，10mM咪唑)洗脫，然后用20mL洗脫液(pH7.4、10mMPBS，500mMNaCl，5％甘油，500mM咪唑)進行洗脫，收集用洗脫液進行洗脫得到的過柱后溶液，然后將過柱后溶液經脫鹽柱(HiPrep26/10Desalting)除去咪唑，同時置換到pH7.4、50mMTris·HCl緩沖液中，獲得SrtA溶液(即含有SrtA的pH7.4、50mMTris·HCl緩沖液)。將SrtA溶液進行SDS-PAGE，測定SrtA的純度。用NanoDrop2000分光光度計測定上述純化樣品中SrtA的濃度。結果表明，SrtA溶液中SrtA的純度＞95％，產率達到200mg/L培養菌液4。實施例2、IFN和ELP的獲得獲得IFN和ELP的步驟如下：1、取實施例1的步驟三的2制備的100μMSrtA溶液10mL，加入CaCl2并使其濃度為10mM，得到溶液。2、取實施例1的步驟三的1中制備的200μMIFN-ELP溶液10mL，向其中加入5mM三甘氨酸(sigma公司產品)，然后與10mL步驟1得到的溶液混合，室溫反應過夜，得到混合液1。將混合液1用pH7.4、10mMPBS緩沖液經HiPrep26/10Desalting脫鹽柱(GE公司產品)去除小分子雜質得到溶液，得到混合液2。3、完成步驟2后，將混合液2在AKTA蛋白純化系統(AKTAPurifier10，GE公司產品)上經陰離子交換層析(HiTrapCaptoQ5mL)純化得到ELP溶液。陰離子交換層析的參數：陰離子交換層析柱為HiTrapCaptoQ5mL；先用平衡緩沖液(pH4.5、20mM醋酸溶液)洗脫柱子，然后上樣10mL混合液2，用洗脫液進行洗脫(洗脫過程：A液為pH4.5、20mM醋酸水溶液，B液為1MNaCl水溶液，洗脫液由A液和B液組成，使用流動相B逐漸遞增、流動相A逐漸遞減的線性洗脫條件，具體如下：在0-10min內，流動相中A液的體積百分含量由100％勻速降至0％。檢測波長為280nm。收集洗脫體積60mL-65mL的過柱后溶液，即為ELP溶液。經HiPrep26/10Desalting脫鹽柱(GE公司產品)置換到 含150mMNaCl的pH7.4、50mMTris·HCl緩沖液中。4、完成步驟2后，將混合液2在AKTA蛋白純化系統(AKTAPurifier10，GE公司產品)上經陰離子交換層析(HiTrapCaptoQ5mL)純化得到IFN溶液。陰離子交換層析的參數：陰離子交換層析柱為HiTrapCaptoQ5mL；先用平衡緩沖液(pH7.4、20mMTris·HCl)洗脫柱子，然后上樣10mL混合液2，用洗脫液進行洗脫(洗脫過程：A液為pH7.4、20mMTris·HCl水溶液，B液為1MNaCl水溶液，洗脫液由A液和B液組成，使用流動相B逐漸遞增、流動相A逐漸遞減的線性洗脫條件，具體如下：在0-10min內，流動相中A液的體積百分含量由100％勻速降至0％。檢測波長為280nm。收集洗脫體積90mL-100mL的過柱后溶液，即為IFN溶液。經HiPrep26/10Desalting脫鹽柱(GE公司產品)置換到含150mMNaCl的pH7.4、50mMTris·HCl緩沖液中。實驗結果見圖3、圖4。圖3(圖3中A為采用陰離子交換柱從混合液2中純化ELP的色譜圖，其中UV監測線性洗脫得到目標產物ELP；圖3中B為純化ELP過程中的SDS-PAGE分析結果，其中1為蛋白標準品，2為混合液1，3為混合液2，4為流穿液，5為收集洗脫體積43mL-50mL得到的洗脫蛋白IFN，6為收集洗脫體積52mL-58mL得到的洗脫蛋白IFN-ELP和IFN，7為收集洗脫體積60mL-65mL得到的洗脫蛋白ELP，8為收集洗脫體積70mL-80mL得到的洗脫蛋白SrtA，9為實施例1步驟1制備的上清液4)為ELP合成及純化過程。圖4(圖4中A為采用陰離子交換柱從混合液2中純化IFN的色譜圖，其中UV監測線性洗脫得到目標產物IFN；圖4中B為純化IFN過程中的SDS-PAGE分析結果，其中M為蛋白標準品，1為實施例1步驟2制備的SrtA溶液，2為實施例1步驟1制備的上清液4，3為混合液1，4為收集洗脫體積0mL-40mL得到的流穿蛋白ELP和SrtA，5為收集洗脫體積90mL-100mL得到的洗脫蛋白IFN)為IFN合成及純化過程。實施例3、IFN-ELP的物理化學表征1、分子量測定用基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF)測定上述步驟獲得的IFN-ELP、IFN和ELP的分子量，儀器為4800PlusMALDI-TOF/TOFTM分析儀(ABSCIEX)，具體測定方法及步驟參見儀器自帶說明書。結果表明(圖5)，通過SrtA催化和陰離子交換柱(AEX)純化獲得IFN、ELP和IFN-ELP。IFN-ELP的分子量測定結果為58236.1，IFN的分子量測定結果為20338.1，均與理論值基本一致。2、水合半徑用pH7.4、10mMPBS緩沖液溶解待測蛋白(IFN-ELP或IFN)，然后經0.22μm孔徑濾膜過濾得到待測樣品。將待測樣品在MalvernZetasizerNanoZS90納米粒徑電位分析儀上用動態光散射(DLS)方法(WeipingGao,etal.InsitugrowthofaPEG-likepolymerfromtheCterminusofaninteinfusionproteinimprovespharmacokineticsandtumoraccumulation.ProcNatlAcadSciUSA.2010Sep21；107(38):16432-7.)測量待測蛋白(IFN-ELP或IFN)的水合半徑。具體測量步驟參見儀器自帶說明書。DLS測試使用的是MalvernZetasizerNano-zs90。數據處理使用軟件Zetasizersoftware6.32。結果表明(圖6)，IFN的水合半徑為2.2nm，IFN-ELP的水合半徑為9.9nm。3、相轉變溫度運用濁度法測定相轉變溫度，具體步驟為：用pH7.4、10mMPBS緩沖液溶解待測蛋白(IFN-ELP或ELP)至待測蛋白在體系中的濃度為1mg/mL，然后用酶標儀(MolecularDevices公司產品)測定其在35-55℃(以0.5℃/min線性遞增)范圍內的OD350值。當待測蛋白的OD350值達到上述溫度范圍內OD350值最大值的一半時的溫度即為相轉變溫度。結果表明(圖7)，ELP的相轉變溫度為47.8℃，IFN-ELP的相轉變溫度為45.3℃。4、二級結構運用圓二色性色譜分析測得待測蛋白(IFN-ELP或IFN)的二級結構，具體步驟為：用水溶解待測蛋白(IFN-ELP或IFN)至待測蛋白在體系中的濃度為0.18mg/mL，然后用圓二色光譜儀(AppliedPhotophysics有限公司)在200-260nm波長范圍內進行紫外掃描分析。結果表明(圖8)，IFN-ELP和IFN在200-260nm波長范圍內的圓二色性色譜分析都呈現出同樣的208/222nm雙峰曲線，均為典型的α螺旋結構。IFN-ELP與IFN的曲線重疊良好，表明在IFN上修飾ELP后二級結構沒有明顯影響。實施例4、IFN-ELP的體外生物活性測定采用MTT方法測定待測蛋白(IFN-ELP或IFN)的體外生物活性。具體步驟如下：1、在含10％(體積百分比)FBS、50U/mL盤尼西林和50μg/mL鏈霉素的RMPI-1640培養基中培養人Burkitt’sB淋巴瘤細胞(簡稱DaudiB)獲得細胞懸浮液。2、取待測蛋白用含10％(體積百分比)FBS、50U/mL盤尼西林和50μg/mL鏈霉素的RMPI-1640培養基稀釋，得到濃度不同的待測蛋白溶液。3、取96孔細胞培養板，每孔加入50μL步驟1獲得的細胞懸浮液(每孔約104個細胞)，然后加入步驟2配置的待測蛋白溶液(每孔50μL，使待測蛋白在孔中的濃度為1、2、5、10、20、50、100、1000或10000pg/mL)，5％CO2、37℃培養72h，然后加入MTT溶解液(Promega公司產品)，3h后，采用酶標儀檢測490nm處的吸光值。在96孔細胞培養板中設置陽性對照孔，每個陽性對照孔加入50μL步驟1獲得的細胞懸浮液和50μL含10％(體積百分比)FBS、50U/mL盤尼西林和50μg/mL鏈霉素的RMPI-1640培養基。在96孔細胞培養板中設置陰性對照孔，每個陰性對照孔加入100μL含10％(體積百分比)FBS、50U/mL盤尼西林和50μg/mL鏈霉素的RMPI-1640培養基。采用酶標儀檢測陰性對照孔和陽性對照孔490nm處的吸光值。以待測蛋白在孔中的濃度為橫坐標，相對活性為縱坐標，比較待測蛋白處理后DaudiB細胞增殖的程度。相對活性根據下述公式計算：相對活性(100％)＝(待測蛋白溶液在490nm處的吸光值-陰性對照在490nm處的吸光值)/(陽性對照在490nm處的吸光值-陰性對照在490nm處的吸光值)*100％。實驗結果見表1和圖9。結果表明，IFN-ELP的半抑制濃度(IC50)為32.82pg/mL，相對活性為41％；IFN的半抑制濃度(IC50)為13.51pg/mL，相對活性為100％。結果表明，IFN經ELP修飾后并沒有嚴重降低IFN體外生物的活性。表1.IFN和IFN-ELP的體外抗細胞增殖活性測定樣品IC50(pg/mL)相對活性(％)IFN13.51100融合蛋白IFN-ELP32.8241實施例5、IFN-ELP的藥物代謝動力學測試IFN-ELP或IFN的藥物代謝動力學測試具體步驟如下：1、將6只8周齡體重為250g左右的雄性SD大鼠隨機分成兩組(每組3只)，分別處理如下：IFN組：尾靜脈注射IFN，注射劑量為125μg/kg體重；IFN-ELP組：尾靜脈注射IFN-ELP，注射劑量為125μg/kg體重。2、完成步驟1中的注射后開始計時，處理不同時間(IFN-ELP組時間點為1min，5min，15min，30min，1h，3h，6h，24h，48h，72h，96h，IFN組時間點為1min，5min，15min，30min，1h，3h，6h，24h)后的雄性SD大鼠分別用異氟烷麻醉，然后經眼內眥靜脈用收集管取血0.3mL(收集管提前用肝素鈉(江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司產品)浸潤并烘干)，室溫靜置1h，4℃、3000×g離心收集上層血漿，保存于-80℃低溫冰箱。3、完成步驟2后，用人IFN-α2ELISA試劑盒(PBLinterferonsource公司產品)測定步驟2中各雄性SD大鼠血漿中的IFN濃度。測定方法和步驟按自帶說明書進行。4、完成步驟3后，利用DAS軟件進行數據分析。利用DAS軟件中房室消除模型分析IFN-ELP和IFN的藥物代謝動力學參數，結果表明(表2和圖10)：1、IFN的半衰期為0.3h，在給藥幾分鐘后，血液中干擾素的濃度迅速下降到初始劑量的50％以下，給藥24h后，干擾素殘留濃度不足干擾素初始濃度的0.1％；IFN-ELP的半衰期為8.57h，其在血液中干擾素的濃度是逐漸減少的，給藥72h后，干擾素殘留濃度仍有干擾素初始濃度的10％以上。2、IFN-ELP的體內平均滯留時間(MRT0-∞)是IFN的體內平均滯留時間(MRT0-∞)的11.3倍。3、IFN-ELP的藥時曲線面積(AUC)是IFN的藥時曲線面積(AUC)的32.9倍。表明，與IFN相比，IFN-ELP的半衰期和體內平均存留時間明顯延長，藥時曲線面積顯著增加，生物利用率顯著提高。表2.IFN和IFN-ELP的藥物代謝動力學數據分析參數IFNIFN-ELPT1/2(h)0.30±0.038.57±3.88MRT0-∞(h)0.97±0.3310.93±2.84AUC(106pg/mL·h)0.20±0.036.58±0.75實施例6、IFN-ELP在組織中的分布情況IFN-ELP或IFN在組織中的分布情況具體步驟如下：1、將RMPI-1640培養基和BDMatrigelMatrix(Corning公司產品)等體積混得到混合物1。2、將在含有10％FBS、50U/mL盤尼西林和50g/mL鏈霉素的RMPI-1640培養基中培養的人卵巢癌細胞(OVCAR-3)用胰蛋白酶消化剝離，經pH7.4、10mMPBS緩沖液洗滌后，用步驟1得到的混合物1重懸，得到重懸液。3、將步驟2得到的重懸液接種與18只裸鼠左后肢股骨處背部皮下，接種量均為重懸液0.2mL(約5×106個細胞)/只，30天后6只裸鼠均形成大小約200mm3的實體瘤腫塊。將6只裸鼠隨機分成IFN組和IFN-ELP組，每組各9只。4、向步驟4中IFN-ELP組的裸鼠尾靜脈注射IFN-ELP，IFN組的裸鼠尾靜脈注射IFN。注射劑量均為10μg/20g體重。5、完成步驟4后，將IFN-ELP或IFN處理不同時間(2h、6h、或24h)后的裸鼠通過頸 椎脫臼法處死，收集心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、胰腺、胃、肌肉、小腸、血漿和腫瘤等組織器官。6、將步驟5收集的組織器官(心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、胰腺、胃、肌肉、小腸、血漿或腫瘤)用提取緩沖液破碎后，離心，得到上清提取液。提取緩沖液的溶質及其濃度為：1mMEDTA、0.5％TritonX-100、0.5％脫氧膽酸鈉、1mMPMSF，1％(體積百分比)蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-Aldrich公司產品)和1％磷酸酶抑制劑混合物(Sigma-Aldrich公司產品)；溶劑為pH7.4、10mMPBS緩沖液。7、用人IFN-α2ELISA試劑盒(PBLinterferonsource公司產品)定量測定步驟6中上清提取液中的IFN的濃度，測定方法和步驟按自帶說明書進行，進一步得到步驟5組織器官(心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、胰腺、胃、肌肉、小腸、血漿或腫瘤)中的IFN的濃度。結果表明(圖11)，IFN-ELP組的裸鼠注射IFN-ELP處理不同時間(2h、6h、或24h)后，IFN在心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、胰腺、胃、肌肉、小腸、血漿和腫瘤中均能夠有效累積。尤其是在腫瘤中，IFN-ELP組腫瘤中干擾素的濃度和IFN組腫瘤中干擾素的濃度相比，注射2h為29倍，注射6h為66倍，注射24h為21倍。表明，IFN-ELP能夠有效利用增強通透和滯留效應，使干擾素在腫瘤組織中聚集、在血液循環中半衰期延長，從而提高干擾素在體內的生物利用度和抗腫瘤功效。實施例7、IFN-ELP體內抗腫瘤活性測試IFN-ELP體內抗腫瘤活性測試具體步驟如下：1、取實施例6中經步驟1和2制備的重懸液，接種于26只裸鼠左后肢股骨處背部皮下，接種量為重懸液0.2mL(約5×106個細胞)/只，30天后，26只裸鼠均形成大小約40mm3的實體瘤腫塊。2、將26只裸鼠隨機分成四組，分別為IFN-ELP組(7只)、IFN組(7只)、ELP組(6只)和生理鹽水組(6只)。3、向步驟2中IFN-ELP組的裸鼠尾靜脈注射IFN-ELP，IFN組的裸鼠尾靜脈注射IFN，ELP組的裸鼠尾靜脈注射ELP，注射劑量均為60μg/20g體重。向步驟2中的生理鹽水組的裸鼠尾靜脈注射生理鹽水，注射等體積生理鹽水。各組均為每三天注射一次，直至生理鹽水組、IFN組和ELP組的裸鼠全部死亡。在本實驗中裸鼠死亡包括自然死亡和安樂處死，安樂處死是指裸鼠腫瘤生長超過1000mm3或體重下降超過15％，被注射巴比妥鈉類藥物處死。上述步驟3的實驗過程中，每三天測量各組裸鼠的體重和腫瘤體積；每15天通過眼球取血，測量乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、尿素氮、紅細胞、白細胞、血小板、血紅蛋白等基本生理指標。實驗結果表明(圖12、圖13和圖14)，實驗期間，生理鹽水組和ELP組的裸鼠的腫瘤體積逐漸增大，注射第39天生理鹽水組和ELP組的裸鼠腫瘤體積均超過1000mm3，生存中值僅為34.5天和36天；實驗期間，IFN組的裸鼠的腫瘤體積也逐漸增大，注射第45天IFN組的裸鼠腫瘤體積也超過1000mm3，生存中值為42天，沒有體現明顯的抗腫瘤活性；實驗期間，IFN-ELP組的裸鼠的腫瘤體積基本沒有變化，生存中值為87天。表明，IFN-ELP能夠有效地抑制腫瘤的生長，具有非常好的體內抗腫瘤活性。實驗結果還表明，實驗期間，IFN-ELP組的裸鼠體重略有增加(圖15)，表明IFN-ELP對 裸鼠沒有明顯的副作用。實驗結果表明(圖16和圖17)，實驗期間，與生理鹽水組、IFN組和ELP組的裸鼠相比，IFN-ELP組的裸鼠的乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、尿素氮、紅細胞、白細胞、血小板、血紅蛋白等基本生理指標沒有顯著差別。表明IFN-ELP不會對裸鼠體內器官造成明顯毒性。以本發明所提供的融合蛋白IFN-ELP作為蛋白質藥物，可使生物活性保持率增加、體內半衰期延長、體內平均存留時間延長，并有效抑制腫瘤。同時，本發明所提供的一種制備半衰期延長和/或生物活性保持率增加的蛋白質藥物的方法為修飾蛋白藥物以提高藥物穩定性、改善藥物代謝動力學和增強治療功效的新方法。當前第1頁1 2 3