miR-34c在體外誘導骨骼肌細胞分化中的應用的制作方法

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及miR-34c在體外誘導骨骼肌細胞分化中的應用。

背景技術：

MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼的單鏈小RNA，其長度約為20～25nt，在物種進化中非常保守，它們在特定發育階段或特定組織中表達。miR-34c是mir-34家族的一員，miR-34家族有3個成員(miR-34a，miR-34b，miR-34c)。其中，miR-34a由一個單獨的初級轉錄產物轉錄生成，而miR-34b和miR-34c共用一個初級轉錄產物。在人類基因組中，miR-34a位于1號染色體上，miR-34b和miR-34c位于11號染色體上。60％以上的人類編碼蛋白的基因都有miRNA的保守靶位點，因此，miRNA有多種多樣的生物學功能，包括信號轉導、組織分化、機體的發育等。

骨骼肌由中胚層的間充質干細胞發育而來，是胚胎發育過程中最早形成的組織之一。骨骼肌的發育受到一系列調控因子的精確調控，其中肌肉生成調控因子(MRFs)發揮了核心作用，此外，Wnt、Notch、TGF-β等信號通路也起到了主要的作用。除了上述調控因子外，miRNA在骨骼肌的損傷修復、衛星細胞的增殖與分化、成肌細胞的增殖與分化等骨骼肌的發育進程中發揮了重要的作用。

自1993年發現第一個miRNA后，隨后20年中已有10000多個miRNA被陸續發現。它們在細胞增殖、分化、凋亡等生物學進程中發揮了關鍵的作用。MiRNA調控的多樣性，使它們與很多人類疾病相關。因此了解miRNA在肌肉發育過程的作用，對預防和治療骨骼肌相關的疾病具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供miR-34c在體外誘導骨骼肌細胞分化中的應用。

為了實現本發明目的，本發明提供一種新的促骨骼肌分化因子—miR-34c。

本發明還提供miR-34c在體外誘導骨骼肌細胞分化中的應用，其是利用脂質體(例如脂質體2000)在成肌細胞中瞬時轉染miR-34c mimics，待細胞匯合度達到85％-95％(優選90％)時，將細胞用分化培養基培養，誘導細胞分化。

本發明中涉及的miR-34c mimics是指miR-34c擬似物，購自上海吉瑪制藥技術有限公司。所述miR-34c mimics的序列為：

正義鏈：5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’(SEQ ID No.1)

反義鏈：5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’(SEQ ID No.2)

本發明中涉及的成肌細胞為小鼠成肌細胞C2C12。

所述分化培養基培養為含有2％馬血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養基。

用分化培養基培養的條件為：37℃，5％CO₂。

在細胞分化第3天時，提取蛋白質，用Western blot技術檢測肌球蛋白重鏈(MYHC)的表達，發現轉染miR-34c mimics的細胞MYHC的表達量高于轉染Negative Control(NC)mimics(SEQ ID No.3和4)的細胞；另外，在細胞分化第3天時，取細胞樣品，進行細胞免疫熒光染色，發現轉染miR-34c mimics的細胞中MYHC陽性細胞數多于轉染NC mimics的細胞。以上結果說明過表達miR-34c能促進C2C12細胞的分化。

本發明還提供含有miR-34c mimics的轉基因細胞系、工程菌。

本發明首次發現一種新的促骨骼肌細胞分化因子—miR-34c，通過Western blot和免疫熒光染色技術檢測miR-34c對成肌細胞(C2C12 細胞)分化的影響，從而確定miR-34c在骨骼肌發育中的作用，對預防和治療骨骼肌相關疾病具有重要的意義。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中Western blot檢測miR-34c對C2C12細胞分化的影響。

圖2為本發明實施例1中免疫熒光檢測miR-34c對C2C12細胞分化的影響。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。

以下實施例中涉及的miR-34c mimics的序列為：

正義鏈：5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’

反義鏈：5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’

NC mimics的序列為：

正義鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’

反義鏈：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’

實施例1 miR-34c在體外誘導骨骼肌細胞分化中的應用

待C2C12細胞的匯合度為60％-70％時，利用脂質體2000(11668-019，Invitrogen)在C2C12細胞中瞬時轉染miR-34c mimics，待細胞匯合度達到90％時，將細胞用分化培養基培養，誘導細胞分化。

所述分化培養基為含有2％馬血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養基。

用分化培養基培養的條件為：37℃，5％CO₂。

1、Western blot檢測miR-34c對C2C12分化的影響

蛋白樣品收集：將轉染miR-34c mimics或NC mimics并分化3天的C2C12細胞倒掉培養基后，用PBS洗3遍細胞，棄去PBS，加 入含有1％PMSF的IP裂解液，冰上放置5min，用細胞刮刀將樣品刮至1.5ml EP管中，12000g，4℃，離心5min，取上清，按照BCA蛋白定量試劑盒(購自碧云天生物技術研究所)說明書對提取的蛋白進行定量。

Western blot檢測：

1)將蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液混合，于99℃變性10min，每個樣品上樣50ug。

2)電泳：濃縮膠時電壓恒定在60V左右，電泳45min。當進入分離膠時，電壓恒定在100V左右電泳1-2h，直到25KD marker跑至凝膠底部時，停止電泳；

3)轉膜：350mA恒流，4℃轉膜，蛋白MYHC(肌球蛋白重鏈)轉1小時40分鐘，蛋白GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，內參蛋白)轉膜1小時。

4)封閉：將膜放入5％脫脂奶粉中，室溫封閉1小時。

5)一抗：GAPDH(1：10000，購自CST公司，貨號2118L)；MYHC(1：3000,購自Sigma公司，貨號M4276)，4℃，過夜。

6)洗一抗：TBST在搖床上洗3次，每次10分鐘。

7)二抗：山羊抗小鼠(貨號ZB-2305)和(貨號ZB-2301)山羊抗兔，1:10000(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，室溫1小時。

8)洗二抗：TBST在搖床上洗3次，每次10分鐘。

9)顯影：將曝光過的膠片馬上放入顯影液中，顯影時間根據觀察而定。

10)停影：將顯影過的膠片放入水中停影。

11)定影：停影后的膠片放入定影液中定影至少5min。

圖1結果顯示，轉染miR-34c mimics的細胞MYHC的表達量明顯高于轉染NC mimics的細胞。

2、細胞免疫熒光檢測miR-34c對C2C12分化的影響

1)細胞固定：將轉染miR-34c mimics或NC mimics并分化3天的C2C12細胞倒掉培養基后，用PBS洗3遍細胞，棄去PBS，加入 4％多聚甲醛，室溫固定30分鐘。

2)細胞通透：倒掉固定液，PBS洗3遍，加入0.1％TritonX-100，室溫10分鐘。

3)細胞封閉：倒掉通透液，PBS洗3遍，加入免疫熒光封閉液(購自碧云天生物技術研究所)，室溫封閉1小時。

4)一抗：倒掉封閉液，加入MYHC一抗(1:500，Sigma公司)，4℃過夜。

5)洗一抗：PBS洗3次，每次10分鐘。

6)二抗：Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594(1:400，A-11034，購自Life公司)，室溫1小時，避光。

7)染DAPI：倒掉二抗，PBS洗一次，加入濃度為1μg/ml的DAPI，室溫避光染核5分鐘。

8)洗DAPI：PBS洗3次，每次10分鐘。

9)封片：加少量抗熒光淬滅機，放上蓋玻片，封片，鏡檢。

圖2結果顯示，轉染miR-34c mimics的細胞中MYHC陽性細胞數多于轉染NC mimics的細胞。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。