本發明屬于植物基因工程
技術領域：
：，是一種以高粱幼穗誘導愈傷組織為外植體的遺傳轉化方法。
背景技術：
：：甜高粱是籽實高粱的一個變種，它的生長過程中需水量較低，僅為玉米的1/3，并且耐貧瘠耐鹽堿，且畝產可達3～5噸糧食，同時它的莖稈中的汁液含有豐富的糖類，是制造酒精的理想生物質原料。因此甜高粱是一種優秀的生物新能源作物，值得我們大力去發展。但是甜高粱產業的發展與突破關鍵在于新種質的選育與栽培。過去的幾十年傳統常規育種在甜高粱品質改良，產量提高等方面已經做了重要的貢獻，但由于高粱的遠源不親和性，只靠傳統的常規育種方法難以取得重大突破，需要與遺傳轉化技術結合。利用遺傳轉化技術進行高粱品種的遺傳改良早已引起廣泛的關注與研究。一個高效的遺傳轉化體系最主要的是賴于高效的再生體系，但是，離體組織培養進行高粱再生是一個公認的比較困難的過程(ZhuH,MuthukrishnanS,KrishnaveniS,JeoungJ,LiangG(1998)Biolistictransformationofsorghumusingaricechitinasegene.J.Genet.Breed.52,243-252)，特別是對甜高粱組織培養的研究更少。大量的關于高粱遺傳轉化的研究也已經進行。電擊法是第一個成功地將氯霉素乙酰轉移酶基因轉入高粱原生質體的方法(OU-LeeTM,TurgeonR,WuR(1986)Expressionofaforeigngenelinkedtoeitheraplant-virusoraDrosophilapromoter,afterelectroporationofprotoplastsofrice,wheat,andsorghumProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,6815-6819)。接著新霉素磷酸轉移酶和β-葡萄糖醛酸酶基因通過電擊法被轉入高粱基因組，但沒有獲得轉化單株(BatrrawM,HallT(1991)StabletransformationofSorghumbicolorprotoplastswithchimericneomycinphosphotransfereaseIIandβ-glucuronidasegenes.Theor.Appl.Genet.82,161-168.)。Casas在1993年首次用粒子轟擊法獲得高粱轉基因植株，他以高粱栽培品種p898012的幼胚盾片作為外植體，獲得轉化R和C1玉米花青素調控基因的轉化植株，轉化效率達0.33％(CasasA,KononowiczA,ZehrU,TomesD,AxtellJ,ButlerL,BressanR,HasegawaP(1993)Transgenicsorghumplantsviamicroprojectilebombardment.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,11212-11216.)。雖然電擊法和粒子轟擊法是將外源基因直接轉化進植物細胞，然而農桿菌介導的轉化方法仍然是最主要的植物轉化方法，主要是因為較高的轉化效率以及較低的拷貝數或者單拷貝。但是高粱對體外組織培養和遺傳轉化有拮抗作用，最近在高粱遺傳轉化的研究 中一直傾向于對再生體系和效率(JeoungJS,KrishnaveniS,MuthukrishnanH,GLT(2002)Optimizationofsorghumtransformationparametersusinggenesforgreenfluorescentproteinandβ-glucuronidaseasvisualmarkers.Hereditas137,20-28.；GirijashankarV,SwathisreeV(2009)GenetictransformationofSorghumbicolor.Physiol.Mol.Biol.Plants15,287-302.；RaghuwanshiA,BirchRG(2010)Genetictransformationofsweetsorghum.PlantCellRep.29,997-1005.；LiuG,GodwinID(2012)Highlyefficientsorghumtransformation.PlantCellRep.31,999-1007.)以及轉化程序和方法的優化上(JiQ,XuX,WangK(2013)Genetictransformationofmajorcerealcrops.Int.J.Dev.Biol.57,495-508.；KumarT,HoweA,SatoS,DweikatI,ClementeT(2013)Sorghumtransformation:overviewandutility.PlantGenet.Genomics11,205-221.；HieiY,IshidaY,KomariT(2014)Progressofcerealtransformationtechnologymediatedby.Front.PlantSci.5,628-638.)。2000年，Zhao等首次用農桿菌介導的方法獲得了高粱轉基因植株；利用p898012及PH1391兩個基因型的幼胚作為外植體，BAR基因作為篩選標記，通過優化培養基成分、共培養條件以及篩選培養基的繼代頻率等，使得轉化效率達到2.12％(ZhaoZY,CaiTS,TaglianiL,MillerM,WangN,PangH,RudertM,SherylSchroeder,HondredD,SeltzerJ,PierceD(2000)Agrobacterium-mediatedsorghumtransformation.PlantMol.Biol.44,789-798.)。隨后很多研究人員開始著手農桿菌介導的高粱轉化體系的研究工作(JeoungJS,KrishnaveniS,MuthukrishnanH,GLT(2002)Optimizationofsorghumtransformationparametersusinggenesforgreenfluorescentproteinandβ-glucuronidaseasvisualmarkers.Hereditas137,20-28.；CarvalhoCHS,ZehrUB,GunaratnaN,AndersonJ,KononowiczHH,HodgesTK,AxtellJD(2004)Agrobacterium-mediatedtransformationofsorghum:factorthataffecttransformationefficiency.Genet.Mol.Biol.27,259-269.；GaoZ,JayarajJ,MuthukrishnanS,ClaflinL,LiangGH(2005)EfficientgenetictransformationofSorghumusingavisualscreeningmarker.Genome48,321-333.GurelS,GurelE,KaurR,WongJ,MengL,TanHQ,LemauxPG(2009)Efficient,reproducibleAgrobacterium-mediatedtransformationofsorghumusingheattreatmentofimmatureembryos.PlantCellRep.28,429-444.WuE,LendertsB,GlassmanK,KaniewskaMB,ChristensenH,AsmusT,ZhenS,ChuU,ChoMJ,ZhaoZY(2013)OptimizedAgrobacterium-mediatedsorghumtransformationprotocolandmoleculardataoftransgenicsorghumplants.InVitroCell.Dev.Biol.:Plant50,9-18.)，轉化效率也在不斷提高，但高粱遺傳轉化技術相較于玉米、水稻等作物還不是很成熟，存在轉化效率低，基因型依賴嚴重等問題；特別是對甜高粱遺傳轉化的研究，只有Raghuwanshi等用基因槍法轉化甜高粱品種Ramada 獲得成功，但轉化效率只有0.09％(RaghuwanshiandBirch2010)。因此本研究的目的是建立一個高效的適宜甜高粱和籽實高粱的遺傳轉化體系，為高粱基因組學研究以及新品種培育等打下基礎，將優良的農藝學性狀通過生物技術手段引入高粱是非常重要的。技術實現要素：因此本發明的目的是建立一個適應性廣，對多數基因型效率高的甜高粱和籽實高粱(特別是甜高粱品種)再生體系；同時在這個基礎上建立一個效率較高的甜高粱和籽實高粱遺傳轉化體系。本發明提供一種農桿菌介導的以甜高粱和籽實高粱幼穗誘導的愈傷組織作為外植體的遺傳轉化方法，用于高粱新基因功能的研究以及新品種的培育。一種農桿菌介導的甜高粱和籽實高粱的遺傳轉化方法，包括如下順序步驟：1)選取幼穗，旗葉期長約1.5～5cm幼穗；2)將幼穗置于誘導愈傷培養基中培養，所述誘導愈傷培養基CIM：MS基礎培養基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，高壓滅菌前pH6.0；3)將幼穗誘導產生的胚性愈傷組織用農桿菌介導法將外源基因導入，所述農桿菌侵染培養基為IM：MS基礎培養基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+MES600mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS200μmol/L，pH5.2；4)外植體置于共培養基中共培養，所述共培養基COM：MS基礎培養基4.43g/L+MES600mg/L+半胱氨酸0.3g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+瓊脂8g/L+AS200μmol/L，高壓滅菌前pH5.6；5)再轉入篩選培養基上進行梯度篩選培養，所述篩選培養基為：MS基礎培養基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧芐青霉素200mg/L+草丁膦3～5mg/L+瓊脂8g/L，高壓滅菌前pH6.0，其中草丁膦的濃度為3和5mg/L梯度篩選；6)將存活的抗性愈傷組織轉接于分化培養基中培養至出苗，所述分化培養基為：MS基礎培養基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧芐青霉素100mg/L+草丁膦3mg/L+瓊脂8g/L，高壓滅菌前pH6.0；7)將苗移入生根培養基中培養出根，所述生根培養基為：MS培養基+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖15g/L+羧芐青霉素50～80mg/L+草丁膦3mg/L+瓊脂5g/L，高壓滅菌前pH6.0；8)轉移至土壤中(營養土：蛭石＝2:1)中培養1～2周后移栽至溫室花盆或大田。所述幼穗長度為2～5cm(此時植株外部形態，旗葉5～10cm，旗下一葉20cm左右)，切成3段左右。所述步驟3)導入為將愈傷浸泡于含有攜帶外源基因的植物表達載體農桿菌EHA105菌液中10分鐘。所述共培養為在20～22℃下暗培養3～5天。所述篩選培養的方法為先在無篩選壓的篩選培養基上避光恢復培養7天，再轉入篩選劑濃度為3mg/L的篩選培養基上，進行兩周低壓篩選，再轉入篩選劑濃度為5mg/L的篩選培養基上，進行兩周篩選。所述分化培養基中的培養條件為：在周期為16小時光照與8小時黑暗循環于22～25℃條件下培養，每兩周繼代培養一次。所述步驟7)移入之前，高粱植株苗為3～4cm高，所述步驟8)轉移之前，高粱植株壯根數3～5根，根長3cm。所述外源基因為GUS和GFP。所述甜高粱品種Keller，籽實高粱品種為JR105。本發明通過對誘導愈傷階段培養基成分、分化階段植物激素配比、不同基因型等因素對高粱組織培養的影響的研究，發現培養基中添加2,4-D2.0mg/L和CuSO4·5H2O0.25mg/L對于幼穗愈傷組織的誘導具有重要的作用，可以大幅度提高誘愈率；高粱再生培養基中最好的激素組合為1.0mg/LIAA+1.0mg/L6-BA，Keller和Mn-3025的再生效率達80％以上，說明這個激素組合在高粱離體再生方面非常適合；同時我們發現25個測試品種全部都能產生愈傷，并且有23個基因型再生出苗。其中以甜高粱品種Mn-3025和Keller以及籽實高粱品種871300和JR105愈傷誘導以及再生總體情況較好。本發明建立了適宜甜高粱和籽實高粱再生體系，以此再生體系為基礎，建立了農桿菌介導的高粱遺傳轉化體系，并通過農桿菌介導法成功的將外源基因GUS和GFP轉化幼穗誘導的愈傷組織，得到轉基因再生植株，經檢測表明，外源基因在不同的基因型中得到了不同程度的表達，說明本發明的再生體系可用于遺傳轉化。Keller遺傳轉化效率在3～7％之間，Mn-3025的轉化效率在8～20％之間，JR105的轉化效率在7～16％之間。本發明利用高梁幼穗為外植體在適當的再生培養基上，能得到較高的愈傷組織誘導率和 再生效率。但是，不同基因型來源的愈傷組織的胚性狀況及再生能力差別較大。實驗結果表明幼穗是建立高粱再生體系比較理想的一種外植體，可以用于進一步的轉化研究。本發明通過優化轉化條件，建立了一套農桿菌介導的適宜甜高粱和籽實高粱的遺傳轉化體系，為今后高粱新基因的功能研究以及培育高粱新品種奠定了基礎。附圖說明：圖1不同種植環境對幼胚誘導愈傷效果的影響圖中不同處理為每年7月初在大田或溫室取3～5株植株的幼胚，混合后隨機選取30枚進行愈傷誘導實驗；每個實驗重復3次。小寫字母a、b和c表示在0.05水平上差異顯著。圖2不同生長調節劑及不同培養基添加劑對Keller幼穗誘導愈傷的影響A，表2中各組合誘導愈傷情況；a：組合1、6、7；b：組合2；c：組合3；d：組合4、5，標尺＝1厘米。B，不同狀態愈傷組織的細胞狀態；a，c：圖A-a中箭頭所指胚性愈傷組織的細胞狀態，b，d：A-d中箭頭所指褐化，水漬化愈傷的細胞狀態；a，b是愈傷邊緣成熟細胞，c，d是愈傷組織內部整體結構，標尺＝50微米。圖3不同生長調節劑及不同培養基添加劑誘導出愈傷后對再生情況的影響X軸數字1～7對應于表1-2中7個組合。小寫字母a、b、c和d表示在0.05水平上差異顯著。圖4不同生長調節劑誘導愈傷后再生情況1～3：利用2,4-D作為生長調節劑誘導的愈傷再生苗的情況；4～6：利用Dic作為生長調節劑誘導的愈傷再生苗的情況。標尺＝1厘米。圖5不同生長調節劑誘導愈傷后再生苗單株高及株重差異每個處理取5株幼苗測量總重及株高，取其平均值，重復3次。小寫字母a、b和大寫字母A、B分別表示在0.05水平以及0.01水平上差異顯著性。圖6分化培養基中不同激素組合對三品種再生的影響同一品種內不同處理進行顯著性檢驗；小寫字母a、b和c表示在0.05水平上差異顯著。圖7分化培養基中不同PVP40濃度對Keller愈傷再生的影響A為再生培養皿底部圖，B為愈傷再生過程中褐化情況圖。a，未添加PVP40；b，添加1g/LPVP40；c，添加3g/LPVP40；d，添加5g/LPVP40；e，添加1g/LPVP40；f，添加10g/LPVP40。標尺＝1厘米。圖8分化培養基中不同PVP40濃度對Keller愈傷再生效率的影響小寫字母a和b表示不同處理在0.05水平上差異顯著。圖9不同基因型愈傷在繼代培養基上不同的時間對再生效率的影響每個處理各選取同一時間誘導的愈傷組織10～15枚用于再生實驗，計算再生效率；每個處理重復三次。大寫字母A、B和C表示在0.01水平上極顯著差異。圖10pCambia3300-GUS/GFP雙元載體T-DNA區結構示意圖圖11農桿菌介導的高粱遺傳轉化程序圖12轉基因植株bar基因PCR檢測A，部分T0和T1代轉基因植株bar基因PCR擴增結果；T0：M，markerIV；CK-，未轉化植株；CK+，質粒；1～12，部分T0代轉化單株。T1：M，marker100；CK-，未轉化植株；CK+，質粒；1～12，部分T1代轉化單株。B，部分T0代轉基因植株bar基因RT-PCR分析；M，markerIV；CK-，未轉化植株；CK+，質粒；1～8，部分T0代轉化單株cDNAPCR擴增結果。bar(箭頭所示)：bar基因的擴增；actin(箭頭所示)：actin基因擴增。圖13部分T0代單株bar試紙條檢測，1：陰性對照；2～6：T0陽性植株；箭頭所示檢測線為bar蛋白表達檢測線。圖14轉基因陽性愈傷和植株的GUS染色及GFP綠色熒光觀察A：轉基因陽性愈傷、植株GUS染色情況；標尺＝1毫米；B：轉基因陽性愈傷開始到出芽GFP表達情況。B-a箭頭所指為剛剛進入篩選階段的陽性愈傷，B-b箭頭所指為篩選過程中陽性愈傷生長變大，B-c箭頭所指為馬上要分化出芽的陽性愈傷。標尺＝100微米。圖15T0代陽性苗3mg/L草銨膦篩選及抗性苗葉片涂抹Basta實驗a：陽性植株，植株綠色(綠色箭頭)；陰性苗，褐化枯死(紅色箭頭)。b：1：未轉化單株涂抹H2O；6-7：未轉化單株涂抹basta；2-5：轉化單株涂抹basta。標尺＝1厘米。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。下面所涉及的不同基因型的高粱均表明來源了，公眾可以從申請人的實驗室免費得到高粱品種和載體。實施例1以甜高粱和籽實高粱幼穗組織為外植體的再生體系的建立1.1幼穗取樣標準確立利用幼胚作為外植體時的取樣標準一般是取授粉后9～12天的幼胚，取材前先取2～3個幼胚觀察大小，選取大小在1～2mm之間的幼胚。但幼穗被葉片包被，長度不易觀察，所以適合長度的幼穗所對應的植株外部形態就顯得尤為重要。由表1結果顯示：當旗葉露出長度小于10cm，且旗下一葉長度在8～25cm之間時，Keller和JR105的幼穗長度在1.5～5cm，大小合適；旗葉露出長度為5～15cm，旗下一葉長度為20～30cm時，Ji2731的幼穗長度為1.5～5cm，大小合適。結合三個品種的取樣標準我們發現在旗葉5～10cm，旗下一葉20cm左右時幾個品種所取幼穗大小均合適，因此，所有利用幼穗作為外植體的基因型取樣時均可參考此標準。表1不同基因型高粱幼穗取樣標準1.2幼穗材料選擇與準備本發明取旗葉剛剛露出時約2～5cm的幼穗，用70％酒精進行表面消毒30s～1min，25％的NaClO3(有效Cl-濃度8％)溶液滅菌20min，超凈臺中無菌水沖洗多次；用一只鑷子固定住幼穗莖稈基部，用3#刀柄(23#)刀片將莖稈從中間剖開，用鑷子將幼穗輕輕取出；在誘導培養基CIM上用刀切成大小幾小段[MS基礎培養基(大量元素+微量元素+有機物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)]置于22～25℃暗培養3～4周，使之開始脫分化，形成愈傷組織；之后選擇生長迅速、質地松脆、顏色鮮亮的愈傷組織繼代培養[誘導培養基+2,4-D1mg/L]，每兩周繼代一次。挑選生長狀態良好的愈傷組織接于分化培養基[MS基礎培養基(大量元素+微量元素+有機物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)]上22～25℃光培養2～3周，當苗高3～4cm時將再生出的苗移入生根培養基[MS培養基(大量+微量+有機物，其中大量元素減半)+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂5g/L，pH6.0(高壓滅菌前)]中，當長出根時(壯根數3～5根，長約3cm)，洗去培養基，轉移至土壤中(營養土：蛭石＝2:1)培養1～2周后移栽至溫室花盆或大田。1.3不同種植環境對幼胚誘導愈傷組織的影響本研究以甜高粱品種Mn-3025為實驗材料，統計了2013和2014兩年在溫室和大田種植條件下幼胚誘導愈傷組織的情況。如圖1所示，在溫室種植條件下，2013年和2014年Mn-3025幼胚誘導愈傷組織的效率都高達90％以上，而大田種植條件下，2013和2014年Mn-3025幼胚誘導愈傷組織的效率分別為50％和40％。此結果與Zhao等的研究結果相矛盾，但符合Kosambo-Ayoo 等人的觀點，在人工控制的溫室環境中，水肥條件好，病蟲害脅迫少，供體材料生長狀況好，因此愈傷的誘導效率更高更穩定。1.4不同生長調節劑和培養基添加物對幼穗誘導愈傷組織及愈傷組織再生能力的影響為提高愈傷組織誘導及分化出苗的效率，采用了多種組合進行實驗，結果如表2所示。用2mg/L2,4-D可誘導90％以上幼穗產生愈傷組織(表2組合1，圖2A-a)，用Dic可誘導50％幼穗產生愈傷組織(表2組合4和5，圖2A-d)；培養基中不添加Cu2+離子時，所得愈傷組織有水漬化等現象(表2組合2，圖2A-b)，添加AgNO3則對愈傷組織誘導無明顯作用(表2組合6和7，圖2A-a)。因此本研究中誘導愈傷組織最佳組合是2mg/L2,4-D+1μMCu2+(表2組合1，圖2A-a)。不同狀態愈傷組織(圖2中A-a和A-d黑色箭頭所指)細胞顯微結構如圖2B所示，其中B-a、c(A-a黑色箭頭所指)為胚性愈傷組織，細胞呈橢圓形，大而飽滿，細胞間排列緊密有序；其中B-b、d(A-d黑色箭頭所指)為水漬化或褐化愈傷組織，細胞體積縮小，細胞間連接消失，與周圍細胞脫離。表2不同生長調節劑及培養基添加物對Keller幼穗誘導愈傷的影響將不同組合誘導的胚性愈傷移至分化培養基上，研究其再生效率間的差異，統計結果如圖3所示，可以看出用Dic作為生長調節劑誘導出的愈傷組織再生效率非常高，與2mg/L2,4-D(添加Cu2+)相比無顯著差異，甚至還略高于2mg/L2,4-D(添加Cu2+)；而添加AgNO3誘導的愈傷組織再生效率反而顯著低于不添加AgNO3時的情況。同時發現用Dic誘導的愈傷組織產生的再生苗要比用2,4-D(添加Cu2+)誘導的愈傷組織產生的再生苗生長情況好(圖4)。通過測量其單株重和單株高發現利用Dic作為生長調節劑的再生苗單株重極顯著高于利用2,4-D (添加Cu2+)的情況，單株高也顯著高于2,4-D(添加Cu2+)的情況(圖5)。因此，本研究中誘導愈傷組織最佳組合是2mg/L2,4-D+1μMCu2+；Dic雖不利于愈傷組織誘導，但其誘導的愈傷組織再生壯苗情況遠優于2,4-D，考慮愈傷組織誘導階段可將2,4-D和Dic結合使用；AgNO3雖未抑制愈傷組織誘導，但抑制愈傷組織再生出苗，所以誘導培養基中不添加AgNO3。1.5不同激素組合對愈傷再生效率的影響在不同的激素處理條件下，對不同高粱品種愈傷組織再分化出苗效率進行統計，結果如圖6所示，JR105：組合1和4要顯著高于組合2和3；Ji2731：組合1、2及4間差異不顯著，但均顯著高于組合3；Keller：組合1顯著高于組合2、3及4。綜合以上結果：分化培養基添加1mg/LIAA和1mg/L6-BA更適合測試基因型Keller、JR105及Ji2731分化出苗，其中Keller和JR105分化出苗效率達80％。1.6PVP40對愈傷組織再生效率的影響本研究通過在分化培養基中添加0、1、3、5、8及10g/L不同濃度的PVP40，研究其對愈傷組織再生效率的影響。結果如下：分化培養基中添加PVP40并不能降低愈傷組織在分化過程中的褐化情況，相反，與未添加PVP40的培養基比較，添加了PVP40的培養基在一定程度上反而加劇了愈傷組織的褐化，并且隨著添加PVP40濃度的升高褐化情況加重(圖7)。通過對愈傷組織再生效率的統計發現,相比較未添加PVP40時，添加較低濃度的PVP40(1g/L)再生效率反而顯著提高，隨著濃度的增加，愈傷的再生率開始降低(圖8)。綜上，再生過程中PVP40可能并不能抑制愈傷褐化，但低濃度PVP40的添加可促進愈傷的再生。至于PVP40影響再生的機理還不清楚，需要我們更深入的研究。1.7繼代次數對Keller和JR105愈傷組織再生效率的影響我們對Keller和JR105兩個基因型愈傷組織繼代次數對再生效率的影響進行了研究，試驗設置每兩周繼代一次，分別繼代2次、6次和10次。發現這兩個品種的愈傷組織繼代2次的時候再生效率最高，JR105達90％以上，Keller也在85％以上；但愈傷組織繼代6次后，在0.01水平上，JR105的再生效率極顯著下降，僅為12％，Keller的再生效率下降不顯著，達80％；當愈傷組織繼代10次后，JR105再生效率幾乎為0，Keller的再生效率仍有70％左右(如圖9)。因此Keller愈傷組織可通過多次繼代來保存，為高粱遺傳轉化提供充足的外植體，在一定程度上克服了高粱遺傳轉化受季節因素的影響。每個處理各選取同一時間誘導的愈傷組織10～15枚用于再生實驗，計算再生效率；每個處理重復三次。大寫字母A、B和C表示在0.01水平上極顯著差異。1.8不同基因型高粱再生效率分析為驗證優化的再生體系的可行性，同時為提供遺傳轉化候選基因型，我們進行了高粱不同基因型的再生實驗。隨機選擇20個甜高粱品種和5個籽實高粱品種為實驗材料，結果如表1-3所示，25個品種均能產生愈傷組織；除E-Tian和2011這兩個品種，有23個品種可再生出苗；甜高粱品種Mn-3025和Keller，籽實高粱品種871300和JR105誘導愈傷組織和再分化效率均達到80％以上(表3)。結論：本發明通過對不同生長調節劑及不同培養基添加劑、分化階段植物激素配比、和不同基因型等因素對高粱組織培養的影響比較發現：誘導愈傷組織最佳的組合是2mg/L的2,4-D加1μM的Cu2+；如果利用Dic代替2,4-D作為生長調節劑，在誘導愈傷方面Dic的效果遠遠不及2,4-D，但是其誘導的愈傷的再生效率卻好于2,4-D；在產生壯苗方面，用Dic誘導的愈傷出苗后平均單株重以及單株高都要遠遠好于用2,4-D誘導的愈傷，原因可能是愈傷中高濃度的2,4-D可能會影響甚至抑制細胞的再分化。在愈傷再生過程中我們發現1mg/L6-BA+1mg/LIAA的激素組合對誘導愈傷再生出苗效果最好，25個測試品種中只有兩個沒有再生出苗，并且有13個品種再生效率在80％以上，說明這個激素組合在高粱離體再生方面非常適合。隨機選擇了20個甜高粱品種和5個籽實高粱品種對優化了的再生體系進行了驗證，我們發現25個測試品種全部都能產生愈傷，并且有23個基因型再生出苗。其中以甜高粱品種Mn-3025和Keller以及籽實高粱品種871300和JR105愈傷誘導以及再生總體情況較好。本發明建立了以甜高粱和籽實高粱幼穗愈傷組織為外植體的再生體系：其中愈傷組織誘導培養基為：MS基礎培養基(大量元素+微量元素+有機物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)；繼代培養基為：誘導培養基+2,4-D1mg/L；分化培養基為：MS基礎培養基(大量元素+微量元素+有機物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)；生根培養基為：MS培養基(大量+微量+有機物，其中大量元素減半)+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂5g/L，pH6.0(高壓滅菌前)。表3不同基因型高粱誘導愈傷及出苗情況統計注：a：褐化致死實施例2.農桿菌介導的適宜甜高粱和籽實高粱的遺傳轉化方法2.1農桿菌轉化所用培養基：農桿菌侵染培養基IM：MS基礎培養基(大量元素+微量元素+有機物)4.43g/L+水解酪 蛋白500mg/L+MES600mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS200μmol/L，pH5.2。共培養基培養基COM：MS基礎培養基(大量元素+微量元素+有機物)4.43g/L+MES600mg/L+半胱氨酸0.3g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+瓊脂8g/L+AS200μmol/L，pH5.6(高壓滅菌前)；篩選培養基SM：MS基礎培養基(大量元素+微量元素+有機物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧芐青霉素200mg/L+草丁膦3～5mg/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)其中，草丁膦的濃度為3和5mg/L梯度篩選；分化培養基RM：MS基礎培養基(大量元素+微量元素+有機物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧芐青霉素100mg/L+草丁膦3mg/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)；生根培養基RT：MS培養基(大量+微量+有機物，其中大量元素減半)+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖15g/L+羧芐青霉素50～80mg/L+草丁膦3mg/L+瓊脂5g/L，pH6.0(高壓滅菌前)。2.2轉化方法：將含p3300質粒(攜帶有GUS/GFP基因的雙元植物表達載體，見圖10；申請人的實驗室保存，可以免費對外發放)的農桿菌在YEB固體培養基(含50mg/L利福平rif+50mg/L卡那霉素Kan)上劃線，28℃下暗培養至出現單菌落；挑取單菌落接種于5mLYEB液體培養基(含50mg/Lrif+50mg/LKan)中振蕩培養(28℃、200rpm)過夜；將培養的菌液轉移到10mL新鮮YEB培養基中振蕩培養(28℃、200rpm)約4～6h；4℃、4000rpm離心6min收集菌體，并用IM培養基將菌體懸浮，用于甜高梁幼穗愈傷組織的農桿菌侵染。選取長勢良好的胚性愈傷組織在上述農桿菌懸浮液中浸泡10min；棄菌液，用無菌濾紙吸去幼穗愈傷組織塊表面多余菌液，接種于共培養基上20～22℃暗培養3～5d；將幼穗愈傷組織塊轉移到恢復培養基(篩選壓為0的SM培養基)上避光恢復1周后轉移至SM培養基上進行篩選培養。先在低濃度草丁膦(3mg/L)的篩選培養基SM1篩選兩周，然后將幼穗愈傷組織塊轉入含有濃度為5mg/L草丁膦膦的篩選培養基SM2上篩選兩周。將存活的抗性愈傷組織轉接于分化培養基上進行分化培養(22～25℃、16h光照/8h黑暗)，每隔2周繼代培養一次，直至有不 定芽出現；待不定芽成苗，苗長3～4cm時，將其轉移到生根培養基上，誘導生根；如有不定根出現，待長出3～5根壯根且根長3cm左右時，轉移到蛭石培養基上過渡培養1～2周，移栽溫室或大田(圖11)。2.3轉基因植株PCR檢測為驗證bar基因是否已轉入高粱基因組中，對T0和T1代轉化單株基因組用特異性引物barF(5’-TGCACCATCGTCAACCACTACAT-3’)和barR(5’-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3’)擴增bar基因，目的片段大小為433bp，同時對部分T0代單株進行RT-PCR檢測分析。如圖12A所示T0：1～3、4～6、7～9及10～12分別來自于4塊抗性愈傷分化的所出苗，我們可以看出這4塊愈傷組織均有陽性苗產生，但同一愈傷組織產生的苗并不都是陽性植株。主要原因可能是愈傷組織中抗性細胞對周圍細胞產生了保護作用，未被篩選劑殺死而分化出苗；圖12B所示bar基因在T0代單株中已開始轉錄；綜上所述，bar基因初步檢測已經整合到高粱基因組，還需要其它實驗驗證。2.4T0代轉基因植株蛋白水平的檢測利用bar檢測試紙條對轉基因單株bar蛋白表達情況進行檢測，如圖13所示，箭頭所指檢測線為bar蛋白表達檢測線；bar蛋白若有表達，則有條帶出現，bar蛋白若未表達則無條帶出現；由此圖可以清晰的觀察到與1號陰性對照相比，2～6號陽性單株均有bar蛋白表達。2.5不同基因型轉化效率統計通過對T0代轉化單株基因組進行bar基因PCR檢測(重復3次)及bar蛋白試紙條檢測，統計轉化效率，結果如表4所示，籽實高粱品種JR105利用愈傷組織作為外植體，轉化效率在10％左右，最高達到16％；甜高粱品種Keller利用愈傷組織作為外植體，轉化效率在3％～7％之間；甜高粱品種Mn-3025利用幼胚作為外植體，轉化效率穩定在10％左右，最高達到20％，而籽實高粱品種871300轉化效率較低(低于1％)。表4不同高粱品種轉化效率統計注：上述質粒都為公開質粒，本申請人的實驗室均有保藏，可以對外公開發放。2.6T0代轉基因植株自交后代分離比通過對bar基因進行PCR檢測以及bar試紙條檢測，我們統計了11個T0代單株自交后代的分離比。如表5所示，有部分T0代單株自交后代陽性株與陰性株的比值小于3:1(1個拷貝)，不符合孟德爾遺傳定律，說明這些T0代陽性株可能存在嵌合體的問題。為驗證是否有嵌合體的原因我們選擇了5個T0代轉化單株進行不同葉片的PCR檢測，由表6可以看出T0代d、f、i單株不是所有葉片都呈PCR檢測陽性，所以這3個單株應該存在嵌合體問題；雖然KC所有葉片PCR檢測陽性，但其T1代分離比為2:3，小于孟德爾遺傳定律3:1分離比，由于未進行細胞水平檢測，不能肯定它不存在嵌合體的問題；Kp24所有葉片PCR檢測陽性，其自交后代分離比符合孟德爾遺傳定律3:1分離比例，所以Kp24轉化bar基因的拷貝數應是1。表5T0代自交后代分離比的統計注：a：不符合孟德爾遺傳定律；b：T0代為純合體。表65株T0代單株不同葉片PCR檢測結果注：+，葉片PCR檢測陽性；-，葉片PCR檢測陰性。2.7T0代GUS染色及GFP綠色熒光檢測對T0代陽性愈傷和單株進行GUS染色，結果如圖14A所示，A-a陽性愈傷組織染成藍色；A-b,c陽性植株根部和葉鞘染成藍色。對T0代陽性愈傷組織GFP綠色熒光表達情況進行觀察如圖14B所示，B-a為愈傷組織轉化GFP基因后剛剛進入篩選階段綠色熒光表達情況，此時綠色熒光點比較小，如箭頭所示；B-b為經篩選后陽性愈傷組織生長變大，如箭頭所示；B-c為愈傷組織剛開始分化出芽時GFP基因表達情況觀察，箭頭所示為芽點位置。由此可以看出GUS基因和GFP基因都已經轉入高粱基因組中，并開始表達。2.8T0代單株抗除草劑檢測T0代單株生根階段用3mg/L草銨膦進行篩選，如圖15a所示，陽性植株經篩選后仍能生根，植株綠色(綠色箭頭)；陰性苗經篩選后褐化枯死(紅色箭頭)。T0代單株抗除草劑涂抹實驗：用100mg/LBasta涂抹4～5葉期抗性苗從上往下數第二片葉中部約1cm長；7天后觀察葉片受損情況，如圖15b所示，未轉化單株6、7經basta涂抹后7天葉片已經全部褐化枯死，而2～5轉化陽性株葉片經basta涂抹7天后，表現出不同的抗性，其中如3、4號所示葉片僅有所發黃，特別是4號抗性較好，5號葉片邊緣稍有損傷，2號損傷情況最嚴重，但也遠好于6、7號對照組。當前第1頁1 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