本發明涉及生物
技術領域：
：。具體地說，本發明涉及新型的shRNA表達載體及其制備和應用。
背景技術：
：：RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是真核生物中由雙鏈小RNA分子(smallinterferingRNA，siRNA)介導的RNA降解現象，最初在秀麗線蟲中被發現，此后發現RNAi現象在果蠅、擬南芥、斑馬魚和哺乳動物等多種真核生物中都是高度保守的。由于RNAi可以被用來特異性關閉靶基因的表達，具有極大的應用價值。因此，自1998年被發現以來，RNAi多次入選Science雜志評出的年度十大科學進展，并名列2002年十大科學進展之首。2006年，CraigMello和AndrewFire因發現RNAi現象而被授予諾貝爾生理醫學獎。目前大量生物技術公司和國際大制藥企業投資進入RNAi技術開發和應用領域，其中針對呼吸道合胞體病毒感染(Respiratorysyncytialvirusinfection)以及濕性年齡相關性黃斑變性病癥(Wetage-relatedmaculardegeneration)等幾種疾病的RNAi治療已進入二期和三期臨床試驗。另外針對乙型肝炎(HepatitisB)、實體瘤(solidtumors)以及先天性厚甲癥(Pachyonychiacongenita)等疾病的RNAi藥物也已進入一期或二期臨床試驗。RNAi中的關鍵功能分子是長度約為21個核苷酸的siRNA，最初應用時主要依靠化學方法合成，這種方法獲得的siRNA雖然能有效抑制目的基因的表達，但容易被細胞代謝清除，作用持續時間較短，且合成成本較高，每毫克siRNA的化學合成成本需要上千元。為了長期穩定表達siRNA，研究人員設計開發出了由細胞內自身的RNA聚合酶Ⅲ(RNApolymeraseⅢ)啟動子，如H1，U6等轉錄產生的siRNA表達載體。其中目前應用最廣的是shRNA(shorthairpinRNA)。轉錄產生的shRNA被細胞內的核酸酶Dicer進一步加工后產生成熟的siRNA，發揮沉默靶基因表達的效果。目前使用的shRNA載體由于其自身特點而在實際應用時存在一些缺點，主要包括：(1)效率不高。往往需要設計多個shRNA才能保證有1-2個shRNA能對靶基因達到70％以上的抑制效果。(2)脫靶作用(off-target)。siRNA通過與mRNA部分互補配對，以類似miRNA的作用方式非特異性抑制靶基因以外其它基因的表達。綜上所述，本領域急需開發對靶基因抑制效率更高的RNAi載體，從而更好地應用于科學研究和疾病治療。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種可以引發RNA干擾(RNAi)的新型shRNA表達載體及其制備方法和應用，所述shRNA表達載體的加工效率和對靶基因的抑制效率更高，因此在研究基因功能和基因治療等方面具有極大潛力。在第一方面，本發明提供一種核酶增強型shRNA，所述核酶增強型shRNA的核苷酸序列從5′端到3′端依次具有以下區域：(a)5′端配對區域，所述5′端配對區域長度大于或等于19nt；(b)頂端環區域，所述頂端環區域長度大于或等于2nt；(c)3′端配對區域，所述3′端配對區域長度大于或等于19nt，并且所述5′端配對區域與3′端配對區域形成雙鏈區域，所述雙鏈區域長度大于或等于19bp；(d)3′端未配對區域，所述3′端未配對區域長度為0-6nt；(e)與3′端未配對區域相連的核酶區，所述核酶區編碼具有自切割功能的核酶；其中，所述核酶增強型shRNA產生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列對應于所述3′端配對區域或5′端配對區域。在另一優選例中，所述5′端配對區域長度為19-28nt，更佳地為20-25nt。在另一優選例中，所述頂端環區域長度為2-12nt，更佳地為3-10nt。在另一優選例中，所述3′端配對區域長度為19-28nt，更佳地為20-25nt，并且所述5′端配對區域與3′端配對區域形成雙鏈區域，所述雙鏈區域長度為19-28bp，更佳地為20-25bp。在另一優選例中，所述的3′端配對區域為shRNA的靶向鏈(guidestrand)。在另一優選例中，所述的3′端未配對區域為2nt。在另一優選例中，所述的核酶的3′端具有4-6個連續的U。在另一優選例中，所述核酶增強型shRNA中頂端環長度為4-10nt。在另一優選例中，所述3′端未配對區域長度為1-6nt，更佳地為2-4nt。在另一優選例中，所述核酶選自下組：HDV核酶、發夾狀核酶、錘頭狀核酶。在另一優選例中，所述核酶是HDV核酶。在另一優選例中，所述的核酶是具有自切割功能的HDV核酶。在第二方面，本發明提供一種表達盒，所述表達盒包含本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA的編碼序列以及與所述編碼序列操作性相連的啟動子和終止信號。在另一優選例中，所述表達盒在轉錄后產生本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA。在第三方面，本發明提供一種構建物，所述構建物包含本發明第二方面所述的表達盒。在第四方面，本發明提供一種細胞，所述細胞包含本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA或本發明第二方面所述的表達盒或本發明第三方面所述的構建物。在另一優選例中，所述的細胞為哺乳動物細胞。在第五方面，本發明提供一種產生siRNA的方法，所述方法包括：1)將本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA或本發明第二方面所述的表達盒或本發明第三方面所述的構建物轉入哺乳動物細胞；和2)培養所述哺乳動物細胞，從而在所述哺乳動物細胞中產生siRNA。在另一優選例中，所述方法還包括從所述哺乳動物細胞中得到產生的siRNA。在另一優選例中，所述方法在體外、為非治療目的而實施。在另一優選例中，所述方法是非診斷和非治療的。在第六方面，本發明提供一種在哺乳動物細胞中實施RNAi的方法，所述方法包括：將本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA或本發明第二方面所述的表達盒或本發明第三方面所述的構建物轉入哺乳動物細胞。在第七方面，本發明提供一種組合或組合物，所述組合或組合物包含：1)本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA或本發明第二方面所述的表達盒或本發明第三方面所述的構建物；和2)適合將1)所述的核酶增強型shRNA或表達盒或構建物導入哺乳動物細胞的其它試劑；所述組合或組合物在導入哺乳動物細胞后產生siRNA或實施RNAi。在另一優選例中，所述組合物還包含Dicer蛋白。在第八方面，本發明提供一種用于實施RNA干擾或產生siRNA的試劑盒，所述試劑盒包括：1)容器，所述容器中裝有本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA或本發明第二方面所述的表達盒或本發明第三方面所述的構建物；和2)使用說明書，所述說明書記載了利用所述試劑盒產生siRNA或實施RNA干擾的方法。在第九方面，本發明提供本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA或本發明第二方面所述的表達盒或本發明第三方面所述的構建物在哺乳動物細胞中產生siRNA，從而實施RNA干擾，進而能特異性地調控靶基因表達中的應用。在第十方面，本發明提供本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA或本發明第二方面所述的表達盒或本發明第三方面所述的構建物在制備在哺乳動物細胞中實施RNA干擾的試劑或試劑盒中的應用。在第十一方面，本發明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：a)本發明第一方面所述的核酶增強型shRNA或本發明第二方面所述的表達盒或本發明第三方面所述的構建物；和b)藥學上可接受的載體。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了shRNA載體(Dicer依賴型)和另一種RNAi載體—saRNA(Ago2依賴型)的區別。其中，圖1a顯示了shRNA與saRNA發生途徑及作用機制的區別。圖1b顯示了shRNA與saRNA的結構區別。圖2顯示了本發明一個實例中的shRNA與HDV核酶的表達載體及結構特征。其中圖2a顯示了RNA聚合酶Ⅲ啟動子(如H1,U6啟動子)驅動的shRNA、HDV核酶以及6個T堿基(轉錄終止信號)組成的表達盒。圖2b顯示了本發明一個實例中新型shRNA載體在真核細胞內轉錄生成的shRNA+核酶RNA的序列和結構特征。圖3顯示了本發明一個實例中具有自切割活性的HDV核酶可以進行自切割，從而產生shRNA,HDV核酶的催化活性位點被突變后就不再具有自切割活性，也就不產生相應的shRNA。圖4顯示了本發明一個實例中，HDV核酶對shRNA抑制效率的增強作用。其中圖4a顯示了用于檢測shRNA對靶基因沉默效率的報告基因系統。圖4b和4c顯示了熒光素酶報告基因實驗檢測HDV核酶對shRNA(21bp)抑制活性的影響的結果。圖5顯示了HDV核酶對shRNA抑制效率的提高具有普適性。圖6顯示了HDV核酶對shRNA抑制效率的提高也適用于對細胞內源基因的沉默。具體實施方式發明人經過廣泛而深入的研究，發現了一種具有特殊結構的核酶增強型shRNA，與傳統的shRNA相比，本發明的新型核酶增強型shRNA可以顯著增 強Dicer依賴型的siRNA表達前體—shRNA對靶基因的抑制效率，具有表達效果更強、抑制效率更高等優點，從而能更好地應用于科學研究和疾病治療。在此基礎上完成了本發明。具體地，本發明的實驗表明，在shRNA結構的3′末端增加了一個核酶，優選為改造過的丁型肝炎病毒核酶(HepatitisDeltaVirusRibozyme，簡稱HDV核酶)，可以顯著提高現有的shRNA載體對靶基因的抑制效率，因此在研究基因功能和基因治療等方面具有較高的應用潛力。此外，當3′端配對區域為shRNA的靶向鏈(guidestrand)時，本發明的核酶增強型shRNA有助于提高最終siRNA產物中所需siRNA靶向鏈的比例。術語定義如本文所用，術語“RNAi”(RNAinterference,RNA干擾)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA)誘發的、高效特異性降解具有互補配對序列的RNA的現象。由于使用RNAi技術可以特異性關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及腫瘤的基因治療等領域。dsRNA介導的RNAi現象在真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中均有發現，而且在植物中的轉錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介導的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)現象也均屬于RNAi在不同物種的表現形式。如本文所用，術語“siRNA”(SmallinterferingRNA,siRNA)是指一種小RNA分子(約21-25個核苷酸)，可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)從其前體(比如dsRNA、shRNA等)加工而成，也可由化學方法合成或由其它蛋白加工產生。siRNA是siRISC的主要成員，激發與之序列互補的目標RNA被迅速切割降解，導致目標基因的沉默，因此成為RNAi中的關鍵功能分子。如本文所用，術語“siRNA前體”是指可以在哺乳動物細胞中被加工產生siRNA的RNA分子，具體地說，是由Dicer或其它類似蛋白選擇性加工從而產生成熟的siRNA，進而實施RNAi。類似地，如本文所用，術語“表達盒”是指包含本發明核酶增強型shRNA的編碼序列以及與所述編碼序列操作性相連的啟動子和終止信號的表達盒，所述表達盒在轉錄后產生本發明的核酶增強型shRNA；而如本文所用，術語“構建物”是包含所述表達盒的構建物。如本文所用，術語“miRNA”(microRNA)是一類由內源基因編碼的長度約20-24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在動植物中參與對大量基因的表達調控。到目前為止，在動植物以及病毒中已經發現四千多種miRNA分子。大多數miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇(cluster)的形式存在于基因組中。每種miRNA可以調控多個靶基因，而幾種miRNA也可以共同參與調節同一基因，組成復雜的調節網絡。據推測，miRNA調節著人類一半以上基因的表達。miRNA存在多種形式，最原始的是pri-miRNA；pri-miRNA經過Drosha加工后，成為pre-miRNA，即miRNA前體，長度大約為50-90個核苷酸；pre-miRNA再經過Dicer酶酶切后，成為長約20-24個核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通過抑制翻譯和加速mRNA的脫腺苷酸化抑制靶基因表達，其機制有別于siRNA介導的mRNA降解。如本文所用，術語“shRNA”是shorthairpinRNA的縮寫，即，“短發夾RNA”。shRNA包括兩個短反向互補序列，中間由一頂端環(loop)序列分隔的，組成發夾結構，通常由細胞內源的RNA聚合酶III(RNApolymeraseIII)啟動子控制轉錄，shRNA序列的末端連接5-6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉錄終止子。shRNA也可以由其它RNA聚合酶的啟動子轉錄產生。在活體中產生“小干擾RNA”(siRNA)的一種辦法是，將siRNA序列作為“短發夾”的一部分克隆進質粒載體中。當送入動物體內時，該發夾序列被表達出來，形成一個帶有頂端環結構的“雙鏈RNA”(shRNA)，被細胞內的Dicer蛋白所識別和加工，產生有功能的siRNA。核酶如本文所用，術語“核酶(ribozyme)”具有本領域技術人員通常理解的含義，其是指具有催化活性的RNA分子，即化學本質是核糖核酸(RNA)，卻具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能夠切割RNA、有的能夠切割DNA，有些還具有RNA連接酶、磷酸酶等活性。與蛋白質酶相比，核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。核酶的發現打破了酶是蛋白質的傳統觀念。本領域技術人員鑒于本發明的教導，不難理解，本發明可利用各種核酶，包括但不限于，HDV核酶、發夾狀核酶(hairpinribozyme)、錘頭狀核酶 (hammerheadribozyme)等。另外，其它可以自催化切割或通過蛋白因子介導進行切割的核苷酸序列，都可以用于本發明，并且典型地位于本發明核酶增強型shRNA的3′端一側。核酶增強型shRNA如本文所用，術語“本發明shRNA”、“核酶增強型shRNA”、“核酶自切割型shRNA”可互換使用，指在3′端連接有具有自切割功能的核酶的shRNA前體分子，從而當所述核酶增強型shRNA被轉錄后，位于3′端的核酶可進行自切割，從而產生具有特定長度3′端未配對區域的shRNA前體。本發明提供一種具有莖環結構的核酶增強型shRNA。本發明shRNA結構的3′末端與核酶相連。所述核酶包括但不限于：HDV核酶、發夾狀核酶(hairpinribozyme)、錘頭狀核酶(hammerheadribozyme)等；優選地，所述核酶是HDV核酶。另外，其它可以自催化切割或通過蛋白因子介導切割并產生該siRNA前體的核苷酸序列都可以加在該siRNA前體的3′末端。該發明中所指的siRNA前體指帶發夾結構的RNA序列，其雙鏈區長度大于或等于19bp并可以被細胞內的Dicer蛋白加工產生siRNA，發揮基因沉默的功能。本發明人發現，本發明核酶增強型shRNA可以更高效地生成siRNA，從而更高效地對靶基因進行抑制，抑制效率顯著高于現有技術的shRNA。例如，當3′末端連接有核酶編碼序列，例如丁型肝炎病毒核酶(HepatitisDeltaVirusRibozyme，簡稱HDV核酶)時，核酶自切割后產生具有特定長度3′端未配對區域的shRNA，可以更高效地被Dicer識別和加工，從而顯著提高用DNA載體表達的shRNA加工產生的siRNA量及其對靶基因的抑制效率。一種代表性的3′末端連接HDV核酶后的shRNA表達載體及結構示意圖如圖2所示。針對傳統的RNA聚合酶Ⅲ啟動子(如H1,U6等)表達載體，通過在shRNA3′末端連接HDV核酶來提高shRNA對靶基因的抑制效率(圖2a)，其中shRNA的雙鏈區長度大于或等于19bp(如20-25bp)，頂端環大于或等于2nt(如3-6nt)，3′末端懸垂為0-6個nt(較佳地為2nt)，HDV核酶末端連接6個U堿基(圖2b)。在本發明一個優選的實施方式中，本發明shRNA結構的3′末端與核酶相連，并且其中間隔了n個堿基，其中，n為0-6的正整數，較佳地n為1、2、3或4，更佳地n為2或3。在本發明中，合適的核酶例子包括但不限于：HDV核酶、發夾狀核酶(hairpinribozyme)、錘頭狀核酶(hammerheadribozyme)等；優選地，所述核酶是HDV核酶。另外，其它可以自催化切割或通過蛋白因子介導切割并產生該核酶增強型shRNA的核苷酸序列都可以加在該核酶增強型shRNA的3′端。在shRNA結構的3′末端增加HDV核酶后可以顯著提高用DNA載體表達的shRNA對靶基因的抑制效率。在轉錄時，shRNA和HDV核酶序列被一同轉錄出來，HDV核酶在shRNA的3′末端特異性位點發生自切割，從而高效產生了更適合Dicer加工的shRNA前體，加工效率明顯高于常規的shRNA，可產生了更多的成熟單鏈siRNA，顯著提高了對靶基因的抑制效率。一種特別優選的核酶增強型shRNA是核酶自切割后產生3′末端具有2-3個堿基懸垂的shRNA，這種3′末端帶有2-3個堿基懸垂的shRNA可以進一步高效地被細胞內Dicer蛋白識別并加工。鑒于本發明以及現有技術的教導，本領域技術人員還應明白，雖然本發明實施例中采用在細胞內轉錄的方法產生本發明的shRNA，但本發明的shRNA還可采用其它方法，例如體外轉錄或化學合成的方法獲得。表達盒、構建物和應用在本發明shRNA的基礎上，本發明還提供一種表達盒，所述表達盒包含本發明shRNA的編碼序列，以及與所述編碼序列操作性相連的啟動子和終止信號，所述表達盒在轉錄后產生本發明的shRNA，被細胞內的核酸酶Dicer進一步加工后產生成熟的siRNA。在表達盒的基礎上，本發明進一步提供一種構建物，所述構建物包含上述表達盒。本發明還提供一種細胞，所述細胞包含本發明的shRNA或表達盒或構建物。本發明還提供了一種產生siRNA的方法，所述方法包括：1)將本發明的shRNA或表達盒或構建物轉染入哺乳動物細胞；和2)培養所述哺乳動物細胞，從而在所述哺乳動物細胞中產生siRNA。在另一優選例中，所述方法還包括從所述哺乳動物細胞中獲得產生的siRNA。在另一優選例中，所述方法在體外、為非治療目的而實施。本發明還提供一種在哺乳動物細胞中實施RNAi的方法，所述方法包括：將本發明的shRNA或表達盒或構建物轉染入哺乳動物細胞。本發明還提供一種組合或組合物，所述組合或組合物包含：1)本發明的shRNA或表達盒或構建物；2)適合將1)所述的核酶增強型shRNA或表達盒或構建物導入哺乳動物細胞的其它試劑；所述組合或組合物在導入哺乳動物細胞后產生siRNA或實施RNAi。本發明還提供一種用于實施RNA干擾或產生siRNA的試劑盒，所述試劑盒包括：1)容器，所述容器中裝有本發明的shRNA或表達盒或構建物；和2)使用說明書，所述說明書記載了利用所述試劑盒產生siRNA或實施RNA干擾的方法。本發明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：a)本發明的核酶增強型shRNA或表達盒或構建物；和b)藥學上可接受的載體。shRNA與saRNA的區別如圖1所示,就發生途徑及作用機制而言，本發明的shRNA前體被細胞內的Dicer蛋白識別并加工產生成熟的siRNA(通常為21nt),并且多數情況下兩條鏈都會被保留下來。因此本發明的shRNA前體屬于Dicer蛋白依賴型的siRNA前體。該成熟siRNA可以被細胞內的Ago1,2,3,4結合并發揮沉默靶基因的作用。與此相反，現有的saRNA(或saiRNA)轉錄產生后，直接被細胞內的Ago2選擇性加工產生成熟的單鏈siRNA，而不依賴于Dicer蛋白。被Ago1,3,4結合的saRNA不能被進一步加工。換言之，saRNA前體不能被細胞內的Dicer蛋白識別而是直接被Ago2蛋白識別并加工，然后通過PARN家族的核酸外切酶對3′端做進一步的修剪(trimming)，產生成熟的單鏈siRNA，長度通常大于24nt，該成熟的單鏈siRNA只能與Ago2結合并發揮沉默靶基因的作用。就兩者的結構區別而言，本發明中shRNA前體的雙鏈區長度大于或等于19bp，靶向鏈(紅色所示)優選位于shRNA3′臂(但也可位于5′臂)。與此相反，saRNA雙鏈區長度僅為16-18bp，靶向鏈(紅色所示)只能位于saRNA5′臂和頂端環區域。本發明的主要優點包括：(1)與現有的shRNA載體相比，本發明單位分子的核酶增強型shRNA載體產生的siRNA更多，對靶基因的的抑制效率更高；(2)本發明的shRNA為利用RNAi技術選擇性沉默靶基因表達提供了比傳統shRNA更好的選擇，在研究基因功能和基因治療等方面具有極大的潛力。實施例材料與方法1.質粒構建所有實施例中用到的shRNA瞬時表達載體構建時都是將退火后的DNA雙鏈分子插入到H1啟動子下游的BamHⅠ和HindⅢ兩個限制性內切酶位點之間。所用到的針對siRNA的報告基因載體構建時都是將退火后的DNA雙鏈分子(含siRNA靶序列)插入到螢火蟲熒光素酶(Fireflyluciferase)基因3′UTR的NheⅠ和XbaⅠ兩個限制性內切酶位點之間。具體實施例中所用到的shp53和shLC序列如下：shp53:ccactacaactacatgtgtatctcgagatacacatgtagttgtagtggat(SEQIDNO.:5)shLC:aactggacttccagaagaactctcgagagttcttctggaagtccagttat(SEQIDNO.:6)所產生的siRNA序列如下：sip535′-AUACACAUGUAGUUGUAGUGG-3′(SEQIDNO.:2)siLC5′-AGUUCUUCUGGAAGUCCAGUU-3′；(SEQIDNO.:1)2.HDV核酶體外轉錄及切割實驗以含有shp53-RZ或shp53-mRZ的DNA片段(通過PCR方法獲得)為模板，通過T7RNA聚合酶(購自Thermo公司)體外轉錄可獲得shRNA與HDV核酶串聯的RNA分子，將其中一部分RNA產物用T4PNK(購自NEB公司)在37℃處理2小時(不加ATP)，然后65℃處理20分鐘。將處理過的RNA與體外轉 錄的RNA通過TRIzol-LS試劑(購自Invitrogen公司)提取出來，然后在20％的聚丙烯酰胺凝膠(含8M尿素)上進行電泳和溴化乙錠(EthidiumBromide)染色。3.細胞培養及報告基因實驗所有實施例中用到的HEK293細胞都是生長在含10％胎牛血清的DMEM培養基(購自GIBCO公司)中并于37℃、5％CO2的環境下培養。所有針對HEK293細胞的瞬時轉染實驗都是使用Lipofectamine2000(購自Invitrogen公司)轉染試劑并按其說明進行操作。熒光素酶活性的檢測采用Dual-Gloluciferaseassaysystem(購自Promega公司)并在BERTHOLDLB940儀器上進行操作。4.慢病毒包裝及感染實驗慢病毒的包裝是采用VSVG/ΔR8.91系統，將三種質粒(pCMV-VSV-G、pCMVΔR8.91以及載體質粒)按照一定比例混合并轉染HEK293T細胞，分別在轉染后48小時和72小時收取含慢病毒顆粒的細胞上清并用0.45μm的濾膜(購自Sigma公司)過濾。獲得病毒后感染目的細胞(本發明中采用HEK293細胞)，同時在細胞培液中加入8μg/mLHexadimethrinebromide(購自Sigma公司)，病毒感染后72小時，裂解細胞并做Westernblot。5.Westernblot實驗Westernblot實驗都是采用含SDS的10％的聚丙烯酰胺凝膠系統，針對p53基因的鼠源單克隆抗體(購自Sigma公司)采用1:1000比例稀釋并使用，針對β-actin基因的鼠源單克隆抗體(購自CoWinBiotech公司)采用1:2000比例稀釋并使用。底物顯色反應采用Immun-StarHRPchemiluminescence試劑盒(購自Thermo公司)并按其說明進行操作。6.實施例中所用到的瞬時表達載體序列：ggtaccatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccactcggatccggaaaagcttagatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcac tcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagcccaagctaccatgataagtaagtaatattaaggtacgggaggtacttggagcggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgaat cgatagtactaacatacgctctccatcaaaacaaaacgaaacaaaacaaactagcaaaataggctgtccccagtgcaagtgcaggtgccagaacatttctctatcgata(SEQIDNO:3)，其中下劃線所示序列為BamHⅠ和HindIII位點。7.HDV核酶的序列：ggccggcatggtcccagcctcctcgctggcgccggctgggcaacattccgaggggaccgtcccctcggtaatggcgaatgggacccactttttt(SEQIDNO.:4)實施例1核酶自切割型shRNA具有自切割功能制備的核酶自切割型shRNA的結構如圖2所示。在構建的DNA表達載體中，用RNA聚合酶Ⅲ啟動子(如H1)進行驅動的，表達盒包括shRNA、HDV核酶以及6個T堿基(轉錄終止信號)。在該實施例中，shRNA的雙鏈區長度大于或等于19bp(該示意圖中為21bp)，頂端環大于等于2nt(該示意圖中為6nt)，3′末端懸垂為2nt，HDV核酶末端連接6個U堿基。藍色箭頭處為HDV核酶切割位點。在本實施例中，檢驗HDV核酶的自切割活性。結果表明，如圖3所示，通過T7RNA聚合酶體外轉錄的shp53-RZ可以高效地切除HDV核酶自身，產生3′末端為2′，3′-環磷酸(>P)的shRNA前體(泳道1)，這種特殊的末端結構為核酶切割所固有的特性，經過T4PNK處理后可以將環磷酸轉變為羥基(OH),從而導致電泳遷移率變慢(泳道2)。通過點突變(C75U)使HDV核酶切割活性缺失后，其也就喪失了切割產生shRNA的能力(泳道3)。實施例2HDV核酶對shRNA抑制效率的作用在本實施例中，用于檢測siRNA對靶基因沉默效率的報告基因系統如圖4a所示。將單拷貝與siRNA(21nt)序列完全互補配對的靶序列裝在Fireflyluciferase(螢火蟲熒光素酶)報告基因的3′UTR中。siRNA表達載體質粒與報告基因共同轉染HEK293細胞后，siRNA表達載體產生的siRNA結合到靶序列后會對報告基因的表達產生抑制，通過檢測Fireflyluciferase活性的變化可 以靈敏反映siRNA的表達和活性高低。Fireflyluciferase活性下降得越多表明該siRNA的抑制效果越好。在下述試驗中都使用了Fireflyluciferase報告基因與shRNA共同轉染細胞，Renillaluciferase(海腎熒光素酶)作為內參用于排除由轉染效率和細胞生長差異等所造成的影響。分別針對人內源P53和laminC基因設計了3′末端帶有以及不帶有HDV核酶的shRNA，然后將帶有以及不帶有HDV核酶的shp53或shLC與含對應靶序列的報告基因共同轉染到HEK293細胞，24小時后檢測報告基因的表達，計算shRNA對靶報告基因的抑制倍數。抑制倍數越高，表明該載體產生的siRNA效率越高。結果如圖4b和4c所示，其中，抑制倍數為1說明沒有任何抑制效果，如負對照con。實驗結果表明，在shRNA結構的3′末端引入HDV核酶后，其對靶基因的抑制效率相比不帶HDV核酶的載體均顯著提高，提高幅度分別為104％和20％(圖4b、4c)。實施例3HDV核酶對shRNA抑制效率的提高具有普適性方法同實施例2，不同點在于：在HeLa和Huh7細胞內用熒光素酶報告基因實驗檢測HDV核酶對shRNA(21bp)抑制活性的影響。將帶有以及不帶有HDV核酶的shRNA與含對應靶序列的報告基因共同轉染到目的細胞中，24小時后檢測報告基因的表達。抑制倍數越高，表明該載體產生的siRNA效率越高。結果表明，shRNA+HDV核酶表達盒具有很好的普適性,在多種人類體外培養細胞(如HeLa、Huh7等)中都顯示增加HDV核酶后對shRNA的抑制效率有明顯的提高作用(圖5a、5b)。實施例4HDV核酶對shRNA抑制效率的提高適用于內源基因的沉默在本實施例中，將核酶增強型shRNA的表達盒構建到慢病毒表達載體中(圖6a)，通過包裝獲得相應慢病毒，將慢病毒形式的shp53和shp53-RZ以及對照病毒(con)分別加到HEK293細胞中，并通過Westernblot比較它們對細胞內源的p53基因表達的抑制作用。結果表明，shRNA+HDV核酶慢病毒形式表達盒相對于不加HDV核酶的表達盒，其對細胞內源基因(P53)的抑制作用有明顯的提高(圖6b)，其中shp53-RZ-1和shp53-RZ-2都比shp53的抑制作用提高了約60％。實施例5.3′端連接其它核酶的saRNA的制備及效果重復實施例2，但區別在于：用發夾狀核酶、錘頭狀核酶替換實施例2中核酶增強型shRNA中的HDV核酶。同樣，相比不帶核酶的shp53，在3′端引入上述核酶后，其對靶基因的抑制效率的提高幅度為＞20％。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。參考文獻：1.Fire,A.etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391,806-811(1998).2.Castanotto,DandRossi,J.J.ThepromisesandpitfallsofRNAinterference-basedtherapeutics.Nature457,426-433(2009).3.Brummelkamp,T.R.,Bernards,R.&Agami,R.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells.Science296,550-553(2002).4.Paddison,P.J.,Caudy,A.A.,Bernstein,E.,Hannon,G.J.&Conklin,D.S.ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.Genes&Development16,948-958(2002).5.O.Jr.andRossi,J.J.ExpressingshorthairpinRNAsinvivo.Nat.Methods3,689-695(2006).6.Ferré-D’Amaré,A.R.,Zhou,K.H.,andDoudna,J.A.Crystalstructureofahepatitisdeltavirusribozyme.Nature395,567-574(1998).當前第1頁1 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