本發明涉及藥物化合物制備領域，具體地說，涉及一種新型β-羰基丙烯酰胺類化合物、其制備方法及應用。
背景技術：
結核病(TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一種傳染性疾病，從20世紀80年代開始，耐藥結核病，尤其是耐多藥結核的發病率不斷上升，以及HIV/AIDS并發結核導致結核病疫情再度上升，全世界每年大約有140萬人死于結核病，結核病成為全球關注的重大公共衛生問題和社會問題[Organization W H.[M].World Health Organization，2013]。目前臨床上使用的一線和二線抗結核藥物已經使用了半個世紀之久，治療周期長，對耐藥結核無效，同時對休眠結核作用不強，并且在過去的四十年中抗結核病藥物研究進展緩慢[許寅等[J].上海醫藥.2013(13):3-7]。因此，加強抗結核病藥物研究，積極研究開發抗結核病新藥，防止耐藥結核桿菌蔓延成為當今中國藥學家的當務之急。
近五年抗結核新藥研發工作取得了一定的進展，有一批處于臨床前研究的先導物和進入臨床研究的候選化合物，進入臨床研究的化合物主要有氟喹諾酮、硝基咪唑、二芳基喹啉、乙二胺、惡唑烷酮等五大類化合物；其中，貝達喹啉于2012年12月被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準上市用于治療耐藥結核病，Delamanid于2013年12月被歐洲藥品管理局批準治療耐藥結核病。盡管貝達喹啉組治療耐藥結核病比安慰劑組的治愈率高，但是貝達喹啉組出現高死亡率[Diacon AH等[J].N Engl J Med.2014,371(8):723-732]，這可能與它引起QT間期延長，肝相關的不良反應有關[Kakkar AK等[J].Tuberculosis. 2014,94(4):357-362]。Delamanid也與QT間期延長有關，和其他抗結核藥物聯合應用的臨床副作用也未明確[Szumowski JD等[J].Drug Des Devel Ther.2015,9:677-682]。因此，基于目前結核病發病情況，急需研發高效低毒的新型抗結核藥物以滿足臨床需求。
技術實現要素：
(一)要解決的技術問題
針對現有的抗結核藥物存在對耐藥結核無效，對休眠結核作用不強，并且抗結核病藥物研究進展緩慢的缺陷，本發明提供一種新的對結核病桿菌有抗性的化合物及其制備方法。
(二)技術方案
本發明的第一個目的是提供一種對結核病桿菌有抗性的β-羰基丙烯酰胺類化合物。
所述化合物的結構如式(I)所示：
式中：
R1可以在2、3、4、5、6位的任一位置上，所述R1獨立選自：H、C1-C10烷基、C1-C4鹵代烷基、C3-C7環烷基、C3-C9雜環烷基、C1-C4烷氧基、氰基、鹵素、N(R4)2、硝基、羧基、芳基、C5-C6芳雜環基、4-12個氨基酸的短肽、Y-D-En+(X-)n；
R2、R3獨立選自：H、C1-C14烷基、C3-C7環烷基、R4OH、C1-C4鹵代烷基、C3-C18雜環烷基、C5-C6芳雜環基、4-12個氨基酸的短肽、Y-D-En+(X-)n；
其中，所述取代基R4獨立選自：H、C1-C4烷基；
所述取代基Y-D-En+(X-)n結構式中，Y獨立代表硫原子或氧原子，D獨立代表C1-C12烷基或烷氧基，E獨立代表C1-C6的二級或三級的環 烷胺基、雜環胺基、直鏈胺基，X獨立代表鹵原子，n為1或2。
優選地R1選自H、C1-C10烷基、C3-C7環烷基、C3-C9雜環烷基、C1-C4烷氧基、鹵素、硝基、芳基、C5-C6芳雜環基；
R2、R3獨立選自H、C1-C14烷基、R4OH和C3-C18雜環烷基。
進一步優選，R1選自甲氧基、溴或苯基；R2選自H或甲基；R3選自H、甲基、乙基、羥乙基、利奈唑胺基、環絲氨酸基或芐基。
更進一步地優選，R1選自甲氧基、溴或苯基；R2選自H或甲基；R3選自H、甲基、利奈唑胺基、環絲氨酸或芐基。
其中，本發明所述所述β-羰基丙烯酰胺類化合物優選：
(E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N,N-N,N-二羥乙基-2-丁烯酰胺；
(R,E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺；
(S,E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N-甲基-N-環絲氨酸-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N-甲基-N-芐基-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(2,4二氯苯基)-N,N-二羥乙基-2-丁烯酰胺；
(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺。
本發明所述的化合物還可為：
(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-乙基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(2-硝基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(3-硝基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(4-硝基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(2,4-二氯苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(3,4-二氯苯基)-N-甲基-N-芐基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(3-氯苯基)-N-甲基-N-芐基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(4-氯苯基)-N-甲基-N-芐基-2-丁烯酰胺
(R,E)-4-氧代-4-(4-乙氧基苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺
(S,E)-4-氧代-4-(4-乙氧基苯基)-N-甲基-N-環絲氨酸-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺
(E)-4-氧代-4-(4-N,N-二甲胺甲酰基苯基)-N-甲基-N-芐基-2-丁烯酰胺
本發明的第二個目的是提供β-羰基丙烯酰胺類化合物的合成方法，其具體合成路線如下：
其中，R1、R2、R3定義如上所述。
具體地，所述合成方法包括如下步驟：
(1)式(II)化合物與乙醛酸生成式(III)化合物；
(2)式(III)化合物與胺類化合物進行縮合反應得到式(I)類化合物；
其中，步驟(1)中，反應條件是以冰醋酸為反應溶劑，在催化量的濃硫酸作用下回流反應制備化合物(III)。
其中，步驟(2)中，反應條件是，化合物(III)以無水二氯甲烷為溶劑，首先與氯甲酸異丁酯反應生成混合酸酐，然后與胺類化合物進行縮合得到化合物(I)；或者化合物(III)以N,N-二甲基甲酰胺為溶劑，經碳二亞胺類縮合劑1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺活化，然后與胺類化合物進行縮合得到化合物(I)。
本發明還提供所述β-羰基丙烯酰胺類化合物在制備抗結核藥物中的應用。
本發明進一步提供由所述β-羰基丙烯酰胺類化合物制備的抗結 核藥物或組合物，任選所述藥物中還含有藥學上可接受的載體。
本發明提供的新型β-羰基丙烯酰胺類化合物具有抗結核分枝桿菌(包括多重耐藥結核分枝桿菌)活性，因而該類化合物或其組合物，有望開發成為一類具有潛力的新型抗結核藥物。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
實施例1 β-聯苯甲酰基丙烯酸(III-1)的合成
向500mL反應瓶中加入聯苯乙酮(II-1)(62.48g，0.318mol)，一水合乙醛酸(28.85g，0.313mol)，濃度98％的乙酸(250mL)和濃度98％的濃硫酸(1mL)，攪拌，物料不能全溶，攪拌加熱至115℃，回流約0.5h，反應體系呈黃色清液，同溫繼續反應至原料基本反應完全(TLC檢測)，反應結束后減壓蒸除乙酸，析出大量白色固體，加入石油醚：乙酸乙酯(體積比2：1，50mL)，室溫攪拌0.5h后抽濾，40℃真空干燥，得49g類白色固體產物β-聯苯甲酰基丙烯酸(III-1)，熔點：226.3-227.4℃，收率：62％。
產物分析結果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.15(s,1H),8.14-8.12(m,2H),7.93(d,J＝15.6Hz,1H),7.90-7.88(m,2H),7.79-7.77(m,2H),7.54-7.50(m,2H),7.46-7.43(m,1H),6.76(d,J＝15.6Hz,1H)；HRMS-ESI(m/z):251.0714(M-H)-。
實施例2 (E)-4-氧代-4-(1,1’-聯苯基)-2-丁烯酰胺(I-1)的合成(R1為苯基，R2為H，R3為H)
向100mL三口瓶中依次加入實施例1中制備的化合物(III-1)(2.52g，10mmol)，50mL無水二氯甲烷，電磁攪拌得白色懸濁液。滴加1.4mL無水TEA(10.0mmol)后溶清，得無色溶液。在內溫-15℃及氮氣保護下，恒壓滴加2當量的氯甲酸異丁酯(IBCF)，控制反應溫度不超過-10 ℃。滴加完畢后，TLC跟蹤，5min反應完全。控制反應溫度0℃以下，通入氨氣，TLC跟蹤，15min反應完全。飽和食鹽水洗滌反應液3次，無水硫酸鈉干燥。過濾，減壓濃縮，經硅膠柱層析(PE:EA＝3:1)分離，真空干燥得黃色固體(E)-4-氧代-4-(4-聯苯基)-2-丁烯酰胺(I-1)，(1.90g，收率76％)，mp:225.3-227.8℃。
產物分析結果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.12(d,J＝8.4Hz,2H),7.99(s,1H),7.89(d,J＝8.4Hz,2H),7.85-7.74(m,3H),7.58-7.49(m,3H),7.49-7.42(m,1H),6.98(d,J＝15.6Hz,1H)；MS-ESI(m/z):274.16(M+Na)+。
實施例3 (E)-4-氧代-4-(1,1'--聯苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-2)的合成(R1為苯基，R2為甲基，R3為甲基)
向200mL圓底燒瓶中依次加入實施例1中制備的化合物(III-1)(6.68g，26.48mmol)，無水N,N-二甲基甲酰胺(DMF，30mL)，HOBt(6.06g，44.84mmol)，EDCI(11.8g，61.55mmol)，室溫電磁攪拌得棕色懸濁液A。另取一個25mL圓底燒瓶，依次加入二甲胺鹽酸鹽(3.0g，36.79mmol)，5mL無水DMF，DBU(6.0g，10mmol)，室溫電磁攪拌得無色溶液B。2h后將無色溶液B加入棕色懸濁液A中，TLC跟蹤，24h后基本反應完全。加入100mL水淬滅，250mL二氯甲烷萃取3次，飽和食鹽水洗滌3次，無水硫酸鈉干燥。過濾，常溫減壓濃縮，用乙酸乙酯與石油醚重結晶后真空干燥得黃色固體(E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-2)(3.90g，收率53.2％)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.13-8.12(m,2H),7.95(d,J＝15.0Hz,1H),7.72-7.74(m,2H),7.64-7.65(m,2H),7.54(d,J＝15.0Hz,1H),7.46-7.50(m,2H),7.40-7.43(m,1H),3.20(s，3H),3.10(s，3H)；MS-ESI(m/z):280.1。
實施例4 (R,E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺(I-3)的合成(R1為苯基，R2為甲基，R3利奈唑胺基)
同實施例3化合物的制備方法，以(III-1)與N-甲基利奈唑胺堿鹽酸鹽反應制得(R,E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺(I-3)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09-8.13(m,2H),7.79-7.90(m,2H),7.46-7.53(m,3H),7.18-7.23(m,5H),7.06-7.10(m,1H),7.01-7.05(m,1H),4.92-4.96(m,1H),4.11-4.17(m,2H),4.01-4.05(m,2H),3.72-3.74(m,5H),3.24(s，1H),3.05(s，1H),2.92-2.96(m,4H)；MS-ESI(m/z):544.22(M+H)+。
實施例5 (S,E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N-甲基-N-環絲氨酸-2-丁烯酰胺(I-4)的合成(R1為苯基，R2為甲基，R3為環絲氨酸)
同實施例3化合物的制備方法，以(III-1)與N-甲基環絲氨酸鹽酸鹽反應制得(S,E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N-甲基-N-環絲氨酸-2-丁烯酰胺(I-4)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09-8.11(m,2H),8.01(d,J＝15.0Hz,1H),7.72-7.73(m,2H),7.63-7.65(m,2H),7.48-7.49(m,2H),7.42-7.46(m,1H),7.10(d,J＝15.0Hz,1H),4.86-4.94(m,2H),4.04-4.08(m,1H),3.26(s，3H)；MS-ESI(m/z):351.12(M+H)+。
實施例6 (E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N-甲基-N-芐基-2-丁烯酰胺(I-5)的合成(R1為苯基，R2為甲基，R3為芐基)
同實施例3化合物的制備方法，以(III-1)和N-甲基芐胺鹽酸鹽反應制得(E)-4-氧代-4-(1,1'-聯苯基)-N-甲基-N-芐基-2-丁烯酰胺(I-5)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.10-8.09(m,2H),7.94(d,J＝15.0Hz,1H),7.73-7.75(m,2H),7.60-7.62(m,2H),7.50(d,J＝15.0Hz,1H),7.42-7.50(m,4H),7.33-7.38(m,4H),3.16(s，3H),2.78(m，2H)；MS-ESI(m/z):355.10。
實施例7 (E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-2-丁烯酸(III-2)的合成
同實施例1化合物的制備方法，以3-溴苯乙酮(II-2)和一水合乙醛酸為原料，反應制得黃色固體(E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-2-丁烯酸(III-2)(14.40g，收率64％)，mp:161.1-163.4℃。
產物分析結果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):13.18(s,1H),6.97(d,J＝15.6Hz,1H),7.84(d,J＝15.6Hz,1H),7.97-7.95(m,2H),7.79-7.77(m,2H)。
HRMS-ESI(m/z):252.9489(M-H)-。
實施例8 (E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-6)的合成(R1為溴，R2為甲基，R3為甲基)
同實施例3化合物的制備方法，以實施例7中制備的化合物(III-2)和二甲胺鹽酸鹽為原料制得目標化合物(E)-4-氧代-4-(3-溴苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-6)。
產物分析結果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04-8.12(m,2H),7.90(d,J＝15.6Hz,1H),7.36-7.40(m,2H),7.06(d,J＝15.6Hz,1H),3.20(s，3H),3.15(s，3H)；MS-ESI(m/z):281.07,283.09。
實施例9 (R,E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺(I-7)的合成(R1為甲氧基，R2為甲基，R3為利奈唑胺基)
同實施例3化合物的制備方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-2-丁烯酸(III-3)和N-甲基利奈唑胺堿鹽酸鹽為原料制得目標化合物(R,E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-利奈唑胺基-2-丁烯酰胺(I-7)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.01-8.05(m,2H),7.74-7.80(m,1H),7.39-7.47(m,2H),7.16-7.22(m,1H),7.03-7.10(m,3H),4.90-4.93(m,1H),4.11-4.14(m,1H),3.85-3.87(m,3H),3.78-3.79(m,2H),3.72-3.74(m,5H),3.22(s，1H),3.03(s,1H),2.94-2.95(m,4H)；MS-ESI(m/z):497.11。
實施例10 (S,E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-環絲氨酸-2-丁烯 酰胺(I-8)的合成(R1為甲氧基，R2為甲基，R3為環絲氨酸)
同實施例3化合物的制備方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-2-丁烯酸(III-3)和N-甲基環絲氨酸鹽酸鹽為原料制得目標化合物(S,E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-N-環絲氨酸-2-丁烯酰胺(I-8)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.01-8.03(m,2H),7.96(d,J＝15.0Hz,1H),7.10(d,J＝15.0Hz,1H),6.95-6.97(m,2H),4.87-4.92(m,2H),4.02-4.08(m,1H),3.89(s，3H),3.26(s，3H)；MS-ESI(m/z):305.08(M+H)+。
實施例11 (E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-9)的合成(R1為甲氧基，R2為甲基，R3為甲基)
同實施例3化合物的制備方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-2-丁烯酸(III-3)和二甲胺鹽酸鹽為原料制得目標化合物(E)-4-氧代-4-(4-甲氧基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-9)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.02-8.03(m,2H),7.95(d,J＝15.0Hz,1H),7.11(d,J＝15.0Hz,1H),6.93-6.97(m,2H),4.82-4.90(m,2H),4.01-4.05(m,1H),3.89(s，3H),3.25(s，3H),3.12(s，3H)；MS-ESI(m/z):233.07。
實施例12 (E)-4-氧代-4-(4-N,N-二甲胺基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-10)的合成(R1為二甲胺基，R2為甲基，R3為甲基)
同實施例3化合物的制備方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-N,N-二甲基苯基)-2-丁烯酸(III-4)和二甲胺鹽酸鹽為原料制得目標化合物(E)-4-氧代-4-(4-N,N-二甲基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-10)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.99-8.01(m,2H),7.99(d,J＝15.0Hz,1H),7.46(d,J＝15.0Hz,1H),6.69-6.71(m,2H),3.18(s，3H),3.09(s，6H),3.08(s，3H)；MS-ESI(m/z):246.12。
實施例13 (E)-4-氧代-4-(4-氧化吡啶基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺 (I-11)的合成(R1為氧化吡啶基，R2為甲基，R3為甲基)
同實施例3化合物的制備方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4-氧化吡啶基苯基)-2-丁烯酸(III-5)和二甲胺鹽酸鹽為原料制得目標化合物(E)-4-氧代-4-(4-氧化吡啶基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-11)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.29-8.30(m,3H),8.15-8.17(m,2H),7.96-7.99(m,1H),7.72-7.74(m,2H),7.57-7.58(m,2H),3.20(s，3H),3.10(s，3H)；MS-ESI(m/z):296.06。
實施例14 (E)-4-氧代-4-(4’-N-甲基哌嗪基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-12)的合成(R1為N-甲基哌嗪基，R2為甲基，R3為甲基)
同實施例3化合物的制備方法，以化合物(E)-4-氧代-4-(4’-N-甲基哌嗪基苯基)-2-丁烯酸(III-6)和二甲胺鹽酸鹽為原料制得目標化合物(E)-4-氧代-4-(4’-N-甲基哌嗪基苯基)-N,N-二甲基-2-丁烯酰胺(I-12)。
產物分析結果如下：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.95-8.00(m,3H),7.47(d,J＝15.0Hz,1H),6.88-6.90(m,2H),3.46-3.48(m,4H),3.17(s，3H),3.07(s，3H),3.08(s，3H),2.64(br.4H),2.41(br.3H)；MS-ESI(m/z):302.30(M+H)+。
實施例15 β-羰基丙烯酰胺類化合物的活性測試
化合物抗結核分枝桿菌活性的測定采用MABA法。
菌株:結核分枝桿菌標準株H37Rv(ATCC27294)、結核分枝桿菌臨床耐藥株5112、5120。5112對異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥。5120對異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥。
將結核分枝桿菌H37Rv和臨床耐藥株5112、5120接種于含0.2％(v/v)甘油、0.05％吐溫-80和10％OADC的7H9液體培養基中。待培養至對數生長期，經8μm孔徑的濾膜過濾后，3000r/min離心10min收集菌體并用新鮮的7H9培養基重懸。酶標儀測定菌在OD570nm的吸收值，并計算其菌濃度。在96孔黑壁透明底板中，化合物用7H9培養基(含10％ADC)二倍稀釋成各種所需濃度(100μl)。每孔加入結核 分枝桿菌100μl，使其終濃度為5×105cfu/ml。37℃孵育7天，第7天每孔加入12.5μl的20％吐溫-80和20μl阿爾瑪藍(Alamar blue)。孵育24h后，測定其在530nm激發光和590nm發射光下的熒光值。最低抑菌濃度(MIC)定義為降低測定菌陽性對照孔熒光值至少90％的最低濃度。
部分實施例中制備的化合物抗結核分枝桿菌活性測定結果如表1所示。
表1 所制備化合物的抗結核分枝桿菌活性
*：高活性的抗結核化合物(對照)
由上表可知，化合物I-1至I-12均具有較好的抗結核分枝桿菌活性，特別是化合物I-2、I-6，抗菌活性顯著，由此可見，本專利所述的化合物或其組合物可用于制備新型抗結核藥物。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。