本發明屬于創新藥物合成技術領域，具體涉及一種N-甲基依諾沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，同時還涉及一種N-甲基依諾沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物的制備方法，以及其在抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
新藥創新起源于先導物的發現，而基于結構的理性藥物設計是發現先導物的有效方法，同時藥物分子骨架的構建是關鍵。在結構多樣的藥效團中，具有廣泛藥理活性的五元唑雜環酮中，繞丹寧(2-硫代-噻唑烷-4-酮)已成為藥物化學的優勢骨架而被廣泛用于新藥分子化學骨架的構建。其主要包括5-位活潑亞甲基與醛的縮合反應形成C＝C鍵而構筑的α，β-不飽和酮衍生物，與此同時3-位氨基與羧酸類拼合形成氨基羧酸類或酰胺類等衍生物。另外，為改善繞丹寧衍生物的水溶性，在繞丹寧骨架取代基上再引入多酰胺基肽類的修飾側鏈，以提高其生物利用度、促進其向成藥性發展。另一方面，以1-取代-6-氟-喹啉(萘啶)-4-酮-3-羧酸為優勢骨架的抗菌氟喹諾酮藥物，因其作用靶點—拓撲異構酶也是抗腫瘤藥物的重要作用靶標，可將其抗菌活性轉化為抗腫瘤活性。結構修飾研究發現氟喹諾酮C-3羧基并非是抗腫瘤活性所必需的藥效團，以C-3酰氨基為連接鏈搭載另一抗腫瘤活性的藥效團，可實現不同藥效團活性的疊加，并發現了具有抗腫瘤活性的候選化合物。然而，氟喹諾酮骨架與繞丹寧骨架相拼合構建的不飽和酮酰胺類結構的化合物目前尚未見報道。
為此，本發明的目的是提供一種N-甲基依諾沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，具有抗腫瘤的作用和功效，同時提供一種N-甲基依諾沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物的制備方法。
為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：一種N-甲基依諾沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，其化學結構式如通式(I)所示：
Ar為苯環或取代苯環或呋喃環或吡啶環。該類化合物為以下的具體結構的化合物：
本發明的一種N-甲基依諾沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物的制備方法，以式(II)所示的N-甲基依諾沙星為原料制備而成，
具體制備步驟如下：
1)參照文獻(楊勇.喹諾酮C-3[1，3，4]三唑硫醚及衍生物的合成和抗腫瘤活性研究。碩士論文，河南大學，2011年。)的類似方法，由依諾沙星與甲酸和甲醛反應制得式(III)的N-甲基依諾沙星；
具體操作步驟為：將式(II)所示的依諾沙星(50g,156.0mmol)溶于85％的甲酸(300mL)和37％的甲醛(19.0g,234.0mmol)混合溶劑中，回流反應6小時。減壓蒸除溶劑，加水(300mL)溶解，用活性炭(2.0g)回流脫色1小時。過濾，濾液用濃氨水調中性。放置析出固體，過濾，去離子水洗滌3次。干燥，得黃色結晶式(III)，產率91.8％，mp 174～176℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:15.56(1H,s,COOH),8.95(1H,s,2-H),8.14(1H,d,5-H),4.62(2H,q,NCH2CH3),3.57～3.23(7H,m,piperazine-H),2.32(3H,s,N-CH3),1.46(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C16H19FN4O3:334.35[M]+；Found:335[M+H]+。
2)將式(III)所示的N-甲基依諾沙星與水合肼發生肼解反應制得式(IV)所示N-甲基依諾沙星酰肼；
具體操作步驟為：將式(III)所示的N-甲基依諾沙星(20g,60.0mmol)溶于85％的水合肼(50mL)和無水乙醇(200mL)的混合溶劑中，回流反應12小時。減壓蒸除溶劑，加水無水乙醇(100mL)和活性炭(1.0g)回流脫色1小時。過濾，濾液放置析出固體，過濾，無水乙醇洗滌2次。干燥，得黃色結晶式(IV)，產率72.3％，mp 164～166℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.68(1H,s,CONH),8.93(1H,s,2-H),8.12(1H,d,5-H),5.46(2H,s,NH2),4.58(2H,q,NCH2CH3),3.55～3.18(7H,m,piperazine-H),2.30(3H,s,N-CH3),1.43(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.forC16H21FN6O2:348.38[M]+；Found:349[M+H]+。
3)將式(IV)所示N-甲基依諾沙星酰肼與雙-(羧甲基)三硫代碳酸酯于水中回流反應12小時，放置室溫，氨水堿化，過濾，收集產生的固體，用無水乙醇重結晶，制得式(V)所示的N-甲基依諾沙星(繞丹寧)酰胺中間體；
具體操作步驟為：N-甲基依諾沙星酰肼(10.0g，29.0mmol)與雙-(羧甲基)三硫代碳酸酯(7.2g，31.0mmol)在水(300mL)回流反應至原料消失(TLC檢測，V氯仿：V甲醇＝5:1)。冷卻室溫，用濃氨水堿化至pH 8.0～9.0，放置冷卻至室溫。濾集產生的固體，干燥。粗品用無水乙醇重結晶，得黃色結晶式(V)，收率82.7％，mp 162～164℃。1H NMR(400MHz,CDCl3):11.43(1H,s,CONH),8.92(1H,s,2-H),8.16(1H,d,5-H),4.43(2H,q,NCH2),4.68(2H,s,SCH2),3.86(4H,t,piperazine-H),3.16(4H,t,piperazine-H),2.41(3H,s,N-CH3),1.45(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C19H21FN6O3S2:464.54[M]+；Found:465[M+H]+。
4)將式(V)所示N-甲基依諾沙星(繞丹寧)酰胺化合物與芳香醛在堿的催化下在冰乙酸中進行縮合反應，待反應完全后經處理得目標化合物如式(I)所示。
Ar為苯環或取代苯環或呋喃環或吡啶環。
通用的合成制備操作步驟為：取1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-(2-硫代-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(V)1.0g(2.2mmol)和無水乙酸鈉0.20g(2.4mmol)溶解于15mL冰乙酸中，加入芳香醛(2.4mmol)，混合反應物回流反應12h。減壓蒸除溶劑，殘留物用水(20mL)溶解，加入適量的活性炭在60℃脫色0.5h，過濾。濾液用濃氨水堿化至pH 9.0，用氯仿提取(3×15mL)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥。減壓回收溶劑至干，用乙醇-DMF(V:V＝5:1)重結晶，得淡黃色結晶物(I)。
作為進一步的改進，式V所示的N-甲基依諾沙星(繞丹寧)酰胺與芳香醛的摩爾為 1:1.0～1.2。
所述的一種N-甲基依諾沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
所述抗腫瘤藥物為治療肝癌、胰腺癌或白血病藥物。
本發明的一種N-甲基依諾沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物基于藥效團的拼合原理，將氟萘啶酮、酰胺及繞丹寧α，β-不飽和酮等不同藥效團間的進行有效的組合，進而構建了N-甲基依諾沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，實現了不同結構藥效團的互補和活性的疊加，從而達到了增效降毒的效果，可作為全新結構的抗腫瘤藥物開發。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
實施例1
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(I-1)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為苯基。
該化合物的制備方法為：以苯甲醛(0.25g,2.4mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得目標淡黃色結晶物(I-1),產率75.3％，m.p.174～176℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.45(1H,s,CONH),8.93(1H,s,2-H),8.22(s,1H,CH＝),8.18(1H,d,5-H),7.68～7.32(m,5H,Ph-H),4.46(2H,q,NCH2),3.87(4H,t,piperazine-H),2.73(4H,t,piperazine-H),2.42(3H,s,N-CH3),1.45(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C26H25FN6O3S2:552.65[M]+；Found:553[M+H]+。
實施例2
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-對甲氧基苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(I-2)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為對甲氧基苯基。
該化合物的制備方法為：以對甲氧基苯甲醛(0.28g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得目標淡黃色結晶物(I-2),產率76.4％，m.p.176～178℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.46(1H,s,CONH),8.97(1H,s,2-H),8.25(s,1H,CH＝),8.21(1H,d,5-H),7.84(2H,d,Ph-H),7.53(2H,d,Ph-H),4.48(2H,q,NCH2),3.94(3H,s,OCH3),3.87(4H,t,piperazine-H),2.76(4H,t,piperazine-H),2.43(3H,s,N-CH3),1.45(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C27H27FN6O4S2:582.68[M]+；Found:583[M+H]+。
實施例3
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-[2-硫代-5-(3,4-二氧亞甲基)苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(I-3)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為3，4-(二氧亞甲基)基苯基。
該化合物的制備方法為：以3,4-二氧亞甲基苯甲醛(0.39g,2.6mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得目標淡黃色結晶物(I-3),產率83.5％，m.p.181～183℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.46(1H,s,CONH),8.96(1H,s,2-H),8.23(s,1H,CH＝),8.18(1H,d,5-H),7.88～6.87(3H,m,Ph-H),6.32(2H,s,OCH2O),4.48(2H,q,NCH2),3.86(4H,t,Jpiperazine-H),2.82(4H,t,piperazine-H),2.44(3H,s,N-CH3),1.45(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C27H25FN6O5S2:596.66[M]+；Found:597[M+H]+。
實施例4
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-[2-硫代-5-(3,4,5-三甲氧甲基)苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(I-4)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為3，4，5-三甲氧亞甲基苯基。
該化合物的制備方法為：以3,4,5-三甲氧基苯甲醛(0.43g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結晶目標物(I-4),產率76.0％，m.p.165～167℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.48(1H,s,CONH),9.05(1H,s,2-H),8.27(s,1H,CH＝),8.21(1H,d,5-H),7.86(2H,s,Ph-H),4.52(2H,q,NCH2),3.92～3.87(13H,m,3×OCH3and piperazine-H), 2.86(4H,t,piperazine-H),2.45(3H,s,N-CH3),1.46(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C29H31FN6O6S2:642.73[M]+；Found:643[M+H]+。
實施例5
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-對氟苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-5)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為對氟苯基。
該化合物的制備方法為：以對氟苯甲醛(0.30g,2.4mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結晶目標物(I-5),產率78.3％，m.p.172～174℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.48(1H,s,CONH),9.03(1H,s,2-H),8.28(s,1H,CH＝),8.23(1H,d,5-H),7.86(2H,d,Ph-H),7.63(2H,d,Ph-H),4.51(2H,q,NCH2),3.88(4H,t,piperazine-H),2.83(4H,t,Jpiperazine-H),2.44(3H,s,N-CH3),1.46(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C26H24F2N6O3S2:570.64[M]+；Found:571[M+H]+。
實施例6
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-對硝基苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-6)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為對硝基苯基。
該化合物的制備方法為：以對硝基苯甲醛(0.36g,2.4mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結晶目標物(I-6),產率58.2％，m.p.186～188℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.53(1H,s,CONH),9.12(1H,s,2-H),8.36(s,1H,CH＝),8.27(1H,d,5-H),8.13(2H,d,Ph-H),7.87(2H,d,Ph-H),4.53(2H,q,NCH2),3.93(4H,t,piperazine-H),3.06(4H,t,piperazine-H),2.46(3H,s,N-CH3),1.48(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C26H24FN7O5S2:597.65[M]+；Found:598[M+H]+。
實施例7
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-吡啶-4-甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-7)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為4-吡啶基。
該化合物的制備方法為：以吡啶-4-甲醛(0.24g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結晶目標物(I-7),產率64.3％，m.p.171～173℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.57(1H,s,CONH),9.18(1H,s,2-H),8.87(2H,d,Py-H),8.76(2H,d,Py-H),8.38(s,1H,CH＝),8.30(1H,d,5-H),4.56(2H,q,NCH2),3.95(4H,t,piperazine-H),3.13(4H,t,piperazine-H),2.48(3H,s,N-CH3),1.51(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C25H24FN7O3S2:553.64[M]+；Found:554[M+H]+。
實施例8
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-呋喃-2-甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-8)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為2-呋喃基。
該化合物的制備方法為：以呋喃-2-甲醛(0.21g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結晶目標物(I-8),產率66.0％，m.p.176～178℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.55(1H,s,CONH),9.16(1H,s,2-H),8.35(s,1H,CH＝),8.26(1H,d,5-H),7.68～6.87(3H,m,furan-H),4.53(2H,q,NCH2),3.91(4H,t,piperazine-H),3.03(4H,t,piperazine-H),2.46(3H,s,N-CH3),1.48(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C24H23FN6O4S2:542.62[M]+；Found:543[M+H]+。
實施例9
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-對羧基苯基-2-甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-9)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為4-羧基苯基。
該化合物的制備方法為：以對羧基苯甲醛(0.33g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結晶目標物(I-9),產率65.4％，m.p.163～165℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:15.63(brs,1H,COOH),11.62(1H,s,CONH),9.23(1H,s,2-H),8.44～8.36(3H,m,Ph-H and CH＝),8.25(1H,d,5-H),7.86(2H,d,Ph-H),4.53(2H,q,NCH2),3.92(4H,t,piperazine-H),3.11(4H,t,piperazine-H),2.46(3H,s,N-CH3),1.52(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C27H25FN6O5S2:596.66[M]+；Found:597[M+H]+。
實施例10
1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-萘啶-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-對磺酰胺基苯基-2-甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-10)，其化學結構式為：
即式I中的Ar為4-磺酰胺基苯基。
該化合物的制備方法為：以對羧基苯甲醛(0.46g,2.5mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結晶目標物(I-10),產率74.6％，m.p.191～193℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.62(s,1H,CONH),9.25(s,1H,2-H),8.38～8.33(3H,m,Ph-H and CH＝),8.26(d,1H,5-H),7.89(2H,d,Ph-H),7.78(s,2H,NH2),4.56(2H,q,NCH2),3.97(4H,t,piperazine-H),3.15(4H,t,piperazine-H),2.51(3H,s,N-CH3),1.55(3H,t,CH3)；MS(m/z):Calcd.for C26H26FN7O5S2:631.73[M]+；Found:632[M+H]+。
試驗例
一、實施例1-10提供的一種N-甲基依諾沙星(饒丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物的體外抗腫瘤活性測定
1、供試樣品
以實施例1-10提供的一種N-甲基依諾沙星(饒丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，及經典抗腫瘤TOPO抑制劑10-羥基喜樹堿(HC)和依諾沙星(EN)為供試樣品，共12種，其中HC和 EN為對照組，實施例1-10樣品為實驗組；
實驗癌細胞株分別為人肝癌Hep-3B細胞、人胰腺癌Panc-1細胞和人白血病HL60細胞株均購買自中國科學院上海細胞庫。正常細胞采用VERO非洲綠猴腎細胞，購買于上海通派生物科技有限公司。
2、測定方法
測定方法的具體步驟為：
(1)首先將上述12種供試樣品分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成1.0×10-2mol·L-1濃度的儲備液，之后用質量百分比濃度為10％的小牛血清的RPMI-1640培養液將儲備液稀釋成具有5個濃度梯度(0.1、1.0、5.0、10.0、50.0μmol·L-1)的工作液；
取對數生長期的人肝癌Hep-3B細胞、人胰腺癌Panc-1細胞和人白血病HL60細胞及VERO細胞株，以每孔6000個細胞接種于96孔板，隨后分別加入上述12種樣品的具有5個濃度梯度的工作液，48小時后每孔加入5g·L–1MTT(噻唑藍)溶液10μL，繼續培養4小時后加入100μL質量百分比濃度為10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，再培養24小時，然后用酶標儀在570nm波長處測定各自的吸光度(OD)值；
(3)按下述所示公式計算不同濃度的供試樣品對癌細胞的抑制率，
癌細胞抑制率＝[(1－實驗組OD值)/對照組OD值]×100％，
然后以供試樣品的各濃度的對數值對各濃度對應的癌細胞抑制率作線性回歸，得到劑量-效應方程，從所得劑量-效應方程計算出各供試樣品對實驗癌細胞的半數抑制濃度(IC50)；每個數據平行測定三次，求其平均值，結果見表1所示。
表1各供試樣品的抗腫瘤活性(IC50)
從表1可以看出，實施例1-10提供的化合物對實驗3種癌細胞的抑制活性顯著強于母體化合物依諾沙星的活性，尤其是部分化合物對人肝癌Hep-3B細胞和人胰腺癌Panc-1細胞的活性強于對照羥喜樹堿的活性，其IC50值已達到或低于微摩爾濃度。更有意義的是，實施例1-10提供的化合物對VERO細胞顯示出較低的毒性，具有成藥性的潛力。因此，按照藥物開發的一般途徑是先進行常規的抗腫瘤體外篩選，然后進行針對性的研究，所以本發明的化合物具有強的抗腫瘤活性和較低的毒性，可通過與人體可接受的酸成鹽或與藥用載體混合制備 抗腫瘤藥物。